Name: Kulki modyfikowane porfiryną do stosowania jako regulatory kompensacji w cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T12:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Poznaj metodę przygotowania kulek polistyrenowych modyfikowanych porfiryną TCPP jako regulatorów kompensacji w wielokolorowej cytometrii przepływowej. Technika ta zapewnia stabilną fluorescencję porównywalną z barwionymi komórkami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Davidowi Rodriguezowi za pomoc w przygotowaniu figury oraz Precision Pathology Services (San Antonio, TX) za korzystanie z cytometru przepływowego Navios EX.

Wszystkie procedury muszą być wykonywane przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.
1. Przygotowanie roztworu podstawowego TCPP, 1,0 mg/ml
UWAGA: To można przygotowywać co miesiąc.
<ol>
	<li>Za pomocą wagi analitycznej, szpatułki i bibuły wagowej odważyć 49,0-50,9 mg TCPP. Zaokrąglij wagę do 1/10 miligrama. Odłóż odmierzoną ilość TCPP na bok, aby chronić przed światłem. 
	UWAGA: Użyj pistoletu statycznego, jeśli odczyt masy jest niestabilny.</li>
	<li>Określić wymagane ilości oczyszczonej wody i izopropanolu (IPA) z tabeli 1 na podstawie ilości TCPP zważonej w kroku 1.1. Dodać oczyszczoną wodę i izopropanol do szklanej zlewki o pojemności 100 ml i przykryć parafilmem w celu ochrony przed parowaniem.</li>
	<li>Określić wymaganą ilość wodorowęglanu sodu z tabeli 1 na podstawie ilości TCPP zważonej w kroku 1.1.</li>
	<li>Za pomocą wagi analitycznej, szpatułki i bibuły wagowej zważyć wymaganą ilość wodorowęglanu sodu oznaczoną w kroku 1.3. Zaokrąglić wagę do 1/10 miligrama. 
	UWAGA: Użyj pistoletu statycznego, jeśli odczyt masy jest niestabilny.</li>
	<li>Dodać wodorowęglan sodu do 100 ml zlewki zawierającej oczyszczoną wodę i izopropanol. Przykryj roztwór parafilmem, aby chronić przed parowaniem.</li>
	<li>Umieść roztwór z kroku 1.5 na talerzu do mieszania i mieszaj, aż się rozpuści (ok. 10 min)</li>
	<li>Zmierzyć pH, aby upewnić się, że roztwór zawierający wodorowęglan sodu z kroku 1.6 ma pH między 9 a 10.</li>
	<li>Powoli dodawać TCPP zważony w kroku 1.1 do roztworu z kroku 1.7 i kontynuować mieszanie, aż się rozpuści (~30 min). Na tym etapie należy chronić przed światłem.</li>
	<li>Przechowywać w szklanym lub polipropylenowym pojemniku w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu buforowego kwasu 2-(N-morpholino)-etanosulfonowego (MES) i soli hemisodowej, 0,1 M, pH 6,0-6,2 ("bufor MES")
UWAGA: To musi być przygotowane w dniu użycia i przechowywane w temperaturze pokojowej.
<ol>
	<li>Odważ 2,50 g soli hemisodowej MES i dodaj ją do plastikowej butelki o pojemności 150 ml.</li>
	<li>Dodać 121 ml oczyszczonej wody i rozpuścić ręcznie, potrząsając, aż nie będzie widać ciała stałego.</li>
	<li>Zmierz pH buforu MES, aby upewnić się, że wynosi od 6 do 6,2.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze pokojowej do użycia tego samego dnia.</li>
</ol>
3. N-(3-dimetanolaminopropylo)-N'-etylokarbodimid (EDC) w proszku
<ol>
	<li>Wyjmij proszek EDC z zamrażarki i pozostaw w temperaturze pokojowej do użycia w kroku 5.</li>
</ol>
4. Łączenie kulek polistyrenowych funkcjonalizowanych aminami z roztworem TCPP
<ol>
	<li>Dodać 4,3 ml 0,1 M roztworu buforowego MES przygotowanego w kroku 2 do probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wirować funkcjonalizowaną aminami zawiesinę kulek polistyrenowych (10 μm, 2,5% w/v) przez 60 s z maksymalną prędkością.</li>
	<li>Dodaj 288 μl tej świeżo wirowanej zawiesiny perełkowej do bufora MES z kroku 4.1.</li>
	<li>Wiruj roztwór MES/ściegu przez 15 sekund z maksymalną prędkością.</li>
	<li>Wirować roztwór TCPP o stężeniu 1 mg/ml przygotowany w kroku 1 przez 60 s z maksymalną prędkością.</li>
	<li>Dodać 1,20 ml świeżo zawirowanego roztworu podstawowego TCPP do zawiesiny MES/kulek z kroku 4.4.</li>
	<li>Obracaj zawieszenie MES/stopka/TCPP przez 15 s z maksymalną prędkością.</li>
	<li>Przykryj probówkę folią na czas przygotowywania roztworu EDC.</li>
</ol>
5. Przygotowanie roztworu podstawowego hydrochololidu (HCl) N-(3-dimetyloaminopropylo)-N'-etylokarbodimidu (EDC)
UWAGA: Roztwór EDC łatwo się psuje i powinien być użyty natychmiast po przygotowaniu.
<ol>
	<li>Dodaj 20,0 ml oczyszczonej wody do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odważyć 200 mg EDC HCl z kroku 3 i dodać go do wody (krok 5.1).</li>
	<li>Wiruj EDC HCL przez 15 s z maksymalną prędkością, aby uzyskać klarowny roztwór.</li>
</ol>
6. Przygotowanie rozwiązania roboczego EDC HCl/MES
UWAGA: Roztwór EDC HCl/MES łatwo się psuje i powinien być użyty natychmiast po przygotowaniu.
<ol>
	<li>Dodaj 54,0 ml roztworu buforowego MES (przygotowanego w kroku 2) do plastikowej butelki o pojemności 150 ml.</li>
	<li>Dodać 6,0 ml roztworu podstawowego HCl EDC (przygotowanego w kroku 5) do roztworu buforowego MES i mieszać przez wytrząsanie przez 10 s.</li>
</ol>
7. Oznaczanie koralików za pomocą TCPP
<ol>
	<li>Dodać 4,5 ml roztworu roboczego EDC (z kroku 6) do 15 ml probówki polipropylenowej zawierającej kulki i TCPP w buforze MES (krok 4.7).</li>
	<li>Umieścić rurkę w rotatorze odwracającym przy 35 obr./min na 16 godzin w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem.</li>
	<li>Odwirować probówkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut w stężeniu 1 000 × g.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić kulki w 0,8 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS).</li>
	<li>Przenieść roztwór granulek do fiolki z pomarańczowego polipropylenu za pomocą pipety o pojemności 1 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia. 
	UWAGA: W tym momencie koraliki są stabilne przez co najmniej 3 miesiące.</li>
</ol>
8. Kontrola jakości (QC) kulek TCPP za pomocą cytometrii przepływowej
UWAGA: QC powinna być skoncentrowana na tym, czy mediana intensywności fluorescencji (MFI) koralików TCPP jest wystarczająco jasna dla ich zamierzonego zastosowania i ilości cząstek generowanych przez procedurę. Więcej informacji można znaleźć w sekcji reprezentatywnych wyników.
<ol>
	<li>Oznacz jedną probówkę z polistyrenu o pojemności 5 ml jako "Kulki ujemne TCPP" 
	UWAGA: Koraliki ujemne różnią się od kulek funkcjonalizowanych aminami używanych do etykietowania. Zobacz tabelę materiałów.</li>
	<li>Oznacz inną rurkę jako "Koraliki dodatnie TCPP".</li>
	<li>Oznacz inną tubę jako "Tęczowe koraliki".</li>
	<li>Porcjować 300 μl lodowatego HBSS do probówek oznaczonych "Kulki ujemne TCPP" i "Kulki dodatnie TCPP".</li>
	<li>Dodaj 500 μl lodowatego HBSS do probówki oznaczonej jako "Tęczowe koraliki".</li>
	<li>Krótko przemieszaj niefunkcjonalizowaną zawiesinę kulek polistyrenowych (nieoznakowanych) z maksymalną prędkością (2-3 s) i dodaj 10 μl do probówki oznaczonej "Kulki ujemne TCPP".</li>
	<li>Krótko przemieszać zawiesinę kulek oznaczoną TCPP (zakończoną w kroku 7.5) z maksymalną prędkością i dodać 3 μl do probówki "TCPP dodatnie kulki".</li>
	<li>Krótko wymieszaj zawieszenie Rainbow Bead z maksymalną prędkością i dodaj dwie krople do rurki "Rainbow beads".</li>
	<li>Trzymaj wszystkie probówki na lodzie, przykryte i chronione przed światłem.</li>
	<li>Zainicjuj odpowiednie codzienne procedury uruchamiania cytometru przepływowego i wykonaj kontrolę jakości, aby zweryfikować optymalne płyny i wyrównanie lasera. 
	UWAGA: W tej części protokołu zakłada się, że operator jest przeszkolony w zakresie korzystania z dostępnego cytometru przepływowego, w tym procedur standaryzacji rozproszenia światła i intensywności fluorescencji, a także podstawowych zasad obliczania prawidłowej macierzy kompensacji.</li>
	<li>Uruchom koraliki tęczowe i koraliki TCPP bez zmiany ustawień napięcia między różnymi przebiegami.
	<ol>
		<li>Uruchom i zbierz 10 000 wydarzeń z tęczowymi koralikami.</li>
		<li>Wykonaj płukanie wodą i zbierz 10 000 zdarzeń koralików TCPP-ujemnych.</li>
		<li>Wykonaj płukanie wodą i zbierz 10 000 zdarzeń koralików TCPP-dodatnich.</li>
		<li>Wykonaj 1-minutowe płukanie wodą. 
		UWAGA: Ważne jest, aby po uruchomieniu koralików TCPP wykonać płukanie wodą. Jeśli TCPP nie zostanie wypłukany z linii w cytometrze, istnieje możliwość, że resztki TCPP mogą oznaczyć komórki w następnej probówce, która ma zostać pobrana.</li>
		<li>Wykonaj odpowiednie protokoły czyszczenia i wyłączania zgodne z instrukcjami producenta cytometru. 
		UWAGA: Aby uzyskać reprezentatywne wyniki, zobacz Rysunek 1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. Filtracja perełkowa
UWAGA: Jeśli kontrola jakości kulek za pomocą cytometrii przepływowej (krok 8) wykazuje wysoki udział cząstek stałych (70% lub więcej), rozważ przefiltrowanie zawiesiny kulek za pomocą poniższego protokołu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).
<ol>
	<li>Dodać 3,20 ml lodowatego HBSS do 0,8 ml zawiesiny kulek TCPP zakończonej w kroku 7.5 (tworząc pięciokrotne rozcieńczenie).</li>
	<li>Wirować rozcieńczoną zawiesinę stopki z maksymalną prędkością przez 15 s.</li>
	<li>Wyjąć tłok z jednorazowej strzykawki o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Wyposażyć strzykawkę w filtr z końcówką z włókna szklanego (5 μm, średnica 13 mm).</li>
	<li>Dodać 4 ml HBSS do strzykawki.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml rozcieńczonej zawiesiny perełek (krok 9.2).</li>
	<li>Za pomocą tłoka przefiltrować zawiesinę przez zestaw strzykawka/filtr z prędkością około 2 kropli/s.</li>
	<li>Przemyć kulki, pobierając 5 ml świeżego HBSS do strzykawki przez filtr w ilości około 2 kropli/s.</li>
	<li>Wypchnij HBSS z powrotem do pojemnika na odpady z prędkością około 2 kropli/s.</li>
	<li>Aby usunąć kulki z filtra, należy pobrać kolejne 5 ml świeżego HBSS do strzykawki przez filtr.</li>
	<li>Ostrożnie wyjąć filtr ze strzykawki.</li>
	<li>Wysunąć zawiesinę kulek ze strzykawki do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Umieścić filtr z powrotem na strzykawce i powtórzyć kroki 9.10-9.12 jeszcze cztery razy. Następnie wyrzuć filtr i strzykawkę.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 9.2-9.13, aż wszystkie koraliki z kroku 9.1 zostaną przefiltrowane. Za każdym razem używaj nowej strzykawki i filtruj.</li>
	<li>Odwirować przefiltrowane zawiesiny kulek przez 10 minut w temperaturze 1 000 × g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać supernatant z każdej probówki o pojemności 50 ml i delikatnie zawiesić kulki, łącząc je w 0,5 ml świeżego HBSS.</li>
	<li>Przenieść kulki za pomocą mikropipety p1 000 do nowej fiolki z bursztynem, szkłem lub polipropylenem i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Powtórz krok 8, aby określić, czy udział cząstek stałych związanych z TCPP w przefiltrowanej zawiesinie kulek zmniejszył się. Aby uzyskać reprezentatywne wyniki, zobacz Rysunek 3.</li>
</ol>

Porphyrin-Modified Beads in Flow Cytometry

<ol><li>Josefsen, L. B., Boyle, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+diagnostic+and+therapeutic+roles+of+porphyrins+and+phthalocyanines+in+photodynamic+therapy%2C+imaging+and+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics.</a> Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).</li>
<li>Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyrin+as+diagnostic+and+therapeutic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent.</a> Molecules. 24 (14), 2669(2019).</li>
<li>Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+for+the+treatment+and+diagnosis+of+cancer-A+review+of+the+current+clinical+status%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-A review of the current clinical status.</a> Frontiers in Chemistry. 9, 686303(2021).</li>
<li>Berg, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyrin-related+photosensitizers+for+cancer+imaging+and+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications.</a> Journal of Microscopy. 218, 133-147 (2005).</li>
<li>Kessel, D., Reiners, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+pharmaceuticals%3A+Mechanisms+and+detection%29%5BTitle%5D)+AND+%22Israel+Journal+of+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Light-activated pharmaceuticals: Mechanisms and detection).</a> Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 674-680 (2012).</li>
<li>Didamson, O. C., Abrahamse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+photodynamic+diagnosis+and+therapy+for+esophageal+cancer%3A+Potential+role+of+functionalized+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Targeted photodynamic diagnosis and therapy for esophageal cancer: Potential role of functionalized nanomedicine.</a> Pharmaceutics. 13 (11), 1943(2021).</li>
<li>Harada, Y., Murayama, Y., Takamatsu, T., Otsuji, E., Tanaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Aminolevulinic+acid-induced+protoporphyrin+IX+fluorescence+imaging+for+tumor+detection%3A+Recent+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX fluorescence imaging for tumor detection: Recent advances and challenges.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6478(2022).</li>
<li>Bochenek, K., Aebisher, D., Międzybrodzka, A., Cieślar, G., Kawczyk-Krupka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+bladder+cancer+diagnosis+-+The+role+of+autofluorescence+and+photodynamic+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Methods for bladder cancer diagnosis - The role of autofluorescence and photodynamic diagnosis.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 141-148 (2019).</li>
<li>Iwaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry-based+photodynamic+diagnosis+with+5-aminolevulinic+acid+for+the+detection+of+minimal+residual+disease+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Tohoku+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry-based photodynamic diagnosis with 5-aminolevulinic acid for the detection of minimal residual disease in multiple myeloma.</a> The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 249 (1), 19-28 (2019).</li>
<li>Patriquin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+of+lung+cancer+with+meso+tetra+%284-carboxyphenyl%29+porphyrin-labeled+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Early detection of lung cancer with meso tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum.</a> Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).</li>
<li>Pan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+introduction+to+porphyrin+compounds+used+in+tumor+imaging+and+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Mini+Reviews+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A brief introduction to porphyrin compounds used in tumor imaging and therapies.</a> Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 21 (11), 1303-1313 (2021).</li>
<li>Nishida, K., Tojo, T., Kondo, T., Yuasa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+correlation+between+porphyrin+accumulation+in+cancer+cells+and+functional+positions+for+application+as+a+drug+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the correlation between porphyrin accumulation in cancer cells and functional positions for application as a drug carrier.</a> Scientific Reports. 11 (1), 2046(2021).</li>
<li>Lin, Y., Zhou, T., Bai, R., Xie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+approaches+for+the+enhancement+of+porphyrin+skeleton-based+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Enzyme+Inhibition+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical approaches for the enhancement of porphyrin skeleton-based photodynamic therapy.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 35 (1), 1080-1099 (2020).</li>
<li>Kou, J., Dou, D., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyrin+photosensitizers+in+photodynamic+therapy+and+its+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications.</a> Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).</li>
<li>Wezgowiec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field-assisted+delivery+of+photofrin+to+human+breast+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Electric field-assisted delivery of photofrin to human breast carcinoma cells.</a> The Journal of Membrane Biology. 246 (10), 725-735 (2013).</li>
<li>Palasuberniam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+kinase+inhibitors+enhance+aminolevulinic+acid-mediated+protoporphyrin+IX+fluorescence+and+PDT+response+in+triple+negative+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Small molecule kinase inhibitors enhance aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX fluorescence and PDT response in triple negative breast cancer cell lines.</a> Journal of Biomedical Optics. 26 (9), 098002(2021).</li>
<li>Kim, B., Bohandy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopy+of+porphyrins%5BTitle%5D)+AND+%22Johns+Hopkins+APL+Technical+Digest%22%5BJournal%5D)">Spectroscopy of porphyrins.</a> Johns Hopkins APL Technical Digest. 2 (3), 153-163 (1981).</li>
<li>Uttamlal, M., Sheila Holmes-Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+excitation+wavelength+dependent+fluorescence+of+porphyrins%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">The excitation wavelength dependent fluorescence of porphyrins.</a> Chemical Physics Letters. 454 (4), 223-228 (2008).</li>
<li>Zhang, Y. Z., Kemper, C., Bakke, A., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+flow+cytometry+compensation+standards%3A+internally+stained+fluorescent+microspheres+with+matched+emission+spectra+and+long-term+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Novel flow cytometry compensation standards: internally stained fluorescent microspheres with matched emission spectra and long-term stability.</a> Cytometry. 33 (2), 244-248 (1998).</li>
<li>Monard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+spectral+cytometry+toolbox%3A+Coupling+fluorescent+proteins+and+antibodies+to+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Building a spectral cytometry toolbox: Coupling fluorescent proteins and antibodies to microspheres.</a> Cytometry. Part A. 101 (10), 846-855 (2022).</li>
<li>Byrd, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polystyrene+microspheres+enable+10-color+compensation+for+immunophenotyping+of+primary+human+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Polystyrene microspheres enable 10-color compensation for immunophenotyping of primary human leukocytes.</a> Cytometry. Part A. 87 (11), 1038-1046 (2015).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Compensation in flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.14 (2002).</li>
<li>Kabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyrin+accumulation+in+mitochondria+is+mediated+by+2-oxoglutarate+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Porphyrin accumulation in mitochondria is mediated by 2-oxoglutarate carrier.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (42), 31729-31735 (2006).</li>
<li>Bederka, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sputum+analysis+by+flow+cytometry%3B+An+effective+platform+to+analyze+the+lung+environment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sputum analysis by flow cytometry; An effective platform to analyze the lung environment.</a> PLoS One. 17 (8), e0272069(2022).</li>
<li>Garwin, J. L. US6838248B2 - Compositions and methods for detecting pre-cancerous conditions in cell and tissue samples using 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxyphenyl) porphine. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2">https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2</a> (2005).</li>
<li>Cole, D. A., Moody, D. C., Ellinwood, L. E., Klein, M. G. Method of using 5,10,15,20-tetrakis(carboxyphenyl)porphine for detecting cancers of the lung. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152">https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152</a> (1992).</li>
<li>Grayson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality-controlled+sputum+analysis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quality-controlled sputum analysis by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (174), e62785(2021).</li>
<li>Anjali, K., Christopher, J., Sakthivel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruthenium-based+macromolecules+as+potential+catalysts+in+homogeneous+and+heterogeneous+phases+for+the+utilization+of+carbon+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Ruthenium-based macromolecules as potential catalysts in homogeneous and heterogeneous phases for the utilization of carbon dioxide.</a> ACS Omega. 4 (8), 13454-13464 (2019).</li>
<li>Yadav, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+preparation+and+applications+of+organo-functionalized+porous+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the preparation and applications of organo-functionalized porous materials.</a> Chemistry. 15 (17), 2588-2621 (2020).</li>
<li>Garwin, J. L. US7670799B2 - Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en">https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en</a> (2023).</li>
<li>Shimizu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+affinity+beads+for+identifying+drug+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-performance affinity beads for identifying drug receptors.</a> Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).</li>
<li>Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+esters+of+N-hydroxysuccinimide+in+peptide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis.</a> Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).</li>
<li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+GT+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).</li>
<li>El-Faham, A., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+coupling+reagents%2C+more+than+a+letter+soup%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Peptide coupling reagents, more than a letter soup.</a> Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).</li>
<li>Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+the+control+of+background+fluorescence+in+clinical+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B%22%5BJournal%5D)">Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry.</a> Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).</li>
<li>Hoffman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization%2C+calibration%2C+and+control+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Standardization, calibration, and control in flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.3 (2005).</li>
<li>Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+porphyrin+chemistry+in+tumor+imaging+and+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy.</a> Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).</li>
<li>Beharry, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+photodynamic+therapy%3A+New+probes+for+cancer+imaging+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment.</a> Biochemistry. 57 (2), 173-174 (2018).</li>
<li>El-Far, M., Pimstone, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+28+porphyrins+and+their+abilities+to+localize+in+mammary+mouse+carcinoma%3A+Uroporphyrin+I+superior+to+hematoporphyrin+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Clinical+and+Biological+Research%22%5BJournal%5D)">A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy są pracownikami firmy bioAffinity Technologies.

Pomimo wielu zastosowań porfiryn w diagnostyce i terapii nowotworów2, istnieje ograniczona literatura na temat ich potencjalnego zastosowania jako odczynnika cytometrii przepływowej do identyfikacji populacji komórek nowotworowych i nienowotworowych w pierwotnych tkankach ludzkich 24,25,26. Nasze badania nad analizą cytometrii przepływowej ludzkiej plwociny24,27<sup clas...

Porfiryny są przedmiotem zainteresowania w dziedzinie biomedycyny od wielu lat ze względu na ich właściwości fluorescencyjne i celujące w nowotwory1,2,3. Zastosowania terapeutyczne, takie jak terapia fotodynamiczna (PDT) i terapia sonodynamiczna (SDT), polegają na ogólnoustrojowym podawaniu porfiryny pacjentowi z rakiem, gromadzeniu się leku w guzie i miejscowej ekspozycji guza na światło laserowe o określonej długości fali lub ultradźwiękach. Wystawienie na działanie światła laserowego lub ultradźwięków prowadzi do wytworzenia przez porfirynę reaktywnych form tlenu, a następnie do śmierci komórki4,5. W diagnostyce fotodynamicznej (PDD) fluorescencja porfiryn jest używana do odróżniania komórek nowotworowych od normalnych komórek6. W tym kontekście, protoporfiryna IX, naturalna fluorescencyjna porfiryna, która gromadzi się w guzach po ogólnoustrojowym lub miejscowym wstrzyknięciu jej prekursora, kwasu 5-aminolewulinowego (5-ALA), jest używana do identyfikacji guzów podścielisk przewodu pokarmowego, raka pęcherza moczowego i raka mózgu7,8. Niedawno leczenie 5-ALA było badane jako podejście do wykrywania minimalnej choroby resztkowej w szpiczaku mnogim9. Nasze laboratorium wykorzystuje tetraaryloporfirynę TCPP (5,10,15,20-tetrakis-(4-karboksyfenylo)-21,23 H-porfinę) ze względu na jej zdolność do selektywnego barwienia komórek raka płuc i komórek związanych z rakiem w próbkach ludzkiej plwociny, co jest właściwością, która została wykorzystana w testach diagnostycznych opartych na szkiełkach i cytometrii przepływowej<klasa sup = "xref">10.
Niektóre porfiryny są dwufunkcyjne, ponieważ mogą być używane jako środki terapeutyczne i diagnostyczne2,11. W badaniach biomedycznych takie dwufunkcyjne porfiryny są wykorzystywane do oceny, w jaki sposób ich zdolność do selektywnego namierzania i zabijania komórek nowotworowych jest funkcją ich struktury, a także jak wpływa na nią obecność innych związków12,13,14,15,16. Zarówno wychwyt komórkowy porfiryn, jak i ich cytotoksyczność można mierzyć na platformie cytometrii przepływowej w sposób wysokoprzepustowy. Widma absorpcyjne i emisyjne fluorescencyjnych porfiryn są złożone, ale większość platform cytometrii przepływowej jest wyposażona w urządzenia umożliwiające ich prawidłową identyfikację. Widmo absorpcyjne porfiryn fluorescencyjnych charakteryzuje się silnym pasmem absorpcji w zakresie 380-500 nm, znanym jako pasmo Soreta. Dwa do czterech słabszych pasm absorpcji są zwykle obserwowane w zakresie 500-750 nm (pasma Q)17. Niebieski laser o długości fali 488 nm, obecny w większości cytometrów przepływowych, lub laser fioletowy (405 nm) może generować światło o odpowiedniej długości fali do wzbudzenia porfiryn. Widma emisyjne porfiryn zazwyczaj wykazują piki w zakresie 600-800 nm18, co skutkuje bardzo małym pokrywaniem się widmowym z izotiocyjanianem fluoresceiny lub fluoroforami fikoerytryny (PE), ale znacznym nakładaniem się z innymi często stosowanymi fluoroforami, takimi jak allofikocyjanina (APC), a także fluorofory tandemowe, takie jak PE-Cy5 i inne. Dlatego w przypadku stosowania porfiryn w testach wielobarwnej cytometrii przepływowej, kontrole z pojedynczym fluoroforem są niezbędne, aby odpowiednio skorygować rozlanie się fluorescencji w kanałach innych niż ten wyznaczony do pomiaru fluorescencji porfiryny.
Idealnie, kontrole z pojedynczym fluoroforem używane do obliczania matrycy rozlewania dla panelu fluoroforów (zwane również "kontrolami kompensacyjnymi") powinny składać się z tego samego typu komórek co próbka. Jednak wykorzystanie próbki do tego celu nie jest optymalne, jeśli na początku jest bardzo mała próbka lub jeśli populacja docelowa w próbie jest bardzo mała (na przykład, jeśli chce się przyjrzeć minimalnej liczbie chorób resztkowych lub komórek rakowych we wczesnych stadiach choroby). Użyteczną alternatywą dla komórek są kulki sprzężone z tym samym fluoroforem, który jest używany do analizy próbki. Wiele takich koralików jest dostępnych na rynku; Te kulki są albo wstępnie oznaczone pożądanym fluoroforem (wstępnie znakowane kulki specyficzne dla fluoroforu)19,20, albo można do nich dołączyć fluorescencyjnie znakowane przeciwciało (koraliki wychwytujące przeciwciała)20,21. Podczas gdy komercyjne kulki kompensacyjne są dostępne dla wielu fluoroforów, takie kulki są niedostępne dla porfiryn, pomimo ich coraz częstszego stosowania w badaniach podstawowych i klinicznych.
Oprócz zachowania próbki i odpowiedniej wielkości populacji pozytywnych i negatywnych, inne zalety używania koralików jako kontroli kompensacji to łatwość przygotowania, niska fluorescencja tła i doskonała stabilność w czasie22. Potencjalną wadą stosowania kulek jako kontroli kompensacyjnej jest to, że widmo emisyjne przeciwciała fluorescencyjnego wychwyconego na kulkach może różnić się od widma emisji tego samego przeciwciała, które jest używane do znakowania komórek. Może to mieć szczególne znaczenie w przypadku korzystania z cytometru spektralnego przepływu20. W związku z tym opracowanie kulek jako kontroli kompensacji musi być przeprowadzone na cytometrze przepływowym, który będzie używany do testu, dla którego opracowywane są kulki. Co więcej, opracowanie kulek musi obejmować porównanie z komórkami znakowanymi tym samym fluorescencyjnym odczynnikiem barwiącym.
Tutaj opisujemy przygotowanie funkcjonalizowanych aminami kulek kompensacyjnych z polistyrenu TCPP, których mediana intensywności fluorescencji w kanale detekcji była porównywalna do intensywności komórek znakowanych TCPP w plwocinie, oraz ich użycie jako kontroli kompensacji cytometrii przepływowej. Autofluorescencja równoważnych, niefunkcjonalizowanych kulek była wystarczająco niska, aby można było je stosować jako kontrole z ujemną kompensacją fluorescencji. Ponadto koraliki te wykazały stabilność w przechowywaniu przez prawie 1 rok.

<table><tbody><tr><td>Fiolki z tworzywa sztucznego bursztynowego, 2 mL, dno w kształcie litery U, polipropylen</td><td>Research Products International&nbsp; &nbsp;</td><td>ZC1028-500</td><td></td></tr><tr><td>Kulki usieciowane z polistyrenu polistyrenowego (PS/DVB) z funkcjonalizacji aminy, 10,6 i mu; m średnica, 2,5% w/v zawiesina wodna, 3,82 x 107 kulki/ml, 7,11 x 1011 grupy aminowe/ kulka</td><td>Spherotech</td><td>APX-100-10</td><td>Średnica spec. 8,0-12,9 um, zawiesina 2,5% w/v 3,82 x 107 koraliki/ml, 7,11 x 1011 grupy aminowe/ koralik</td></tr><tr><td>Rurki stożkowe, 50 mL, Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td>z odpowiednim rotorem</td></tr><tr><td>Jednorazowa butelka polistyrenowa z nakrętką, 150 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-140</td><td></td></tr><tr><td>EDC (chlorowodorek N- (3-dimetyloaminopropylo)-N'-etylokarbodimidu), &ge; 98%</td><td>Sigma</td><td>03450-1G</td><td>Nr CAS:&nbsp; 25952-53-8</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy pojedynczych komórek FlowJo (v10.6.1)</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe, 22 x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540-BP</td><td></td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe z włókna szklanego (Finneran, 5 i mikro; m, średnica 13 mm)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1190M60</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe, 275 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Zrównoważony roztwór soli (HBSS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-175-095</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol, klasa ACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC423830010</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta mechaniczna, 1-kanałowa, 100-1000 uL z końcówkami</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>3123000918</tr><tr><td>MES (kwas 22- (N-mopholino)-N'-etanosulfonowy, sól hemifosdowa</td><td>Sigma</td><td>M0164</td><td>Nr CAS:&nbsp; 117961-21-4</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Navios EX</td><td>Mikroskop Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX-40 z kamerą DP73 i obiektywem 40X z oprogramowaniem cellSens</td><td>Olympus</td><td></td><td>lub podobne</td></tr><tr><td>pipety Pasteura, szklane, 5,75"</td><td>Fisher Miernik pH Scientific</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>(UB 10 Ultra Basic)</td><td>Denver Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kontroler pipet (Drummond)</td><td>Pipete.com</td> Plastikowa strzykawka <td>DP101</td><td></td></tr><tr><td>, 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955452</td><td></td></tr><tr><td>Cząsteczki polistyrenu (niefunkcjonalizowane), SPHERO,&nbsp; 2,5% w/v, 8,0-12,9 i mikro; m</td><td>Spherotech</td><td>PP-100-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rurki polipropylenowe, 15mL, stożkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A Rurki</td><td></td></tr><tr><td>polistyrenowe, okrągłe dno&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-2A</td><td></td></tr><tr><td>Tęczowe koraliki (Spherotech URCP-50-2K)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9207381</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne, jednorazowe - 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-574</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne, jednorazowe - 25 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-576</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td>Nr CAS:&nbsp; 144-55-8</td></tr><tr><td>TCPP (mezo-tetra(4-karboksyfenylo)porfina)&nbsp; Frontier Scientific&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-393-68</td><td>Nr CAS:&nbsp; 14609-54-2</td></tr><tr><td>Czytnik płytek zapłonowych Tecan (lub podobny)</td><td>Tecan Life Sciences</td> Rewolwer/rotator rurowy <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>88881001</td><td></td></tr><tr><td>Mikser Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr></tbody></table>

kulki modyfikowane porfiryną do stosowania jako regulatory kompensacji w cytometrii przepływowej

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry

Cytometria przepływowa może szybko scharakteryzować i określić ilościowo różne populacje komórek na podstawie pomiarów fluorescencji. Komórki są najpierw barwione jednym lub kilkoma odczynnikami fluorescencyjnymi, z których każdy jest funkcjonalizowany inną cząsteczką fluorescencyjną (fluoroforem), która wiąże się z komórkami selektywnie w oparciu o ich cechy fenotypowe, takie jak ekspresja antygenu na powierzchni komórki. Intensywność fluorescencji z każdego odczynnika związanego z komórkami można zmierzyć na cytometrze przepływowym za pomocą kanałów, które wykrywają określony zakres długości fal. Gdy stosuje się wiele fluoroforów, światło z poszczególnych fluoroforów często rozlewa się do niepożądanych kanałów detekcji, co wymaga korekty danych dotyczących intensywności fluorescencji w procesie zwanym kompensacją. 
Cząstki kontrolne kompensacji, zazwyczaj koraliki polimerowe związane z pojedynczym fluoroforem, są potrzebne dla każdego fluoroforu użytego w eksperymencie znakowania komórek. Dane z cząstek kompensacyjnych z cytometru przepływowego są wykorzystywane do zastosowania poprawki do pomiarów intensywności fluorescencji. Protokół ten opisuje przygotowanie i oczyszczanie kulek kompensacyjnych polistyrenu kowalencyjnie funkcjonalizowanych odczynnikiem fluorescencyjnym mezo-tetra(4-karboksyfenylo)porfiną (TCPP) oraz ich zastosowanie w kompensacji cytometrii przepływowej. W niniejszej pracy funkcjonalizowane aminami kulki polistyrenowe poddano działaniu TCPP i odczynnika sprzęgającego amid EDC (chlorowodorek N-(3-dimetyloaminopropylo)-N′-etylokarbodimidu) o pH 6 i w temperaturze pokojowej przez 16 godzin z mieszaniem. Kulki TCPP wyizolowano przez odwirowanie i ponownie zawieszono w buforze o pH 7 w celu przechowywania. Jako produkt uboczny zaobserwowano cząstki związane z TCPP. Liczbę tych cząstek można zmniejszyć za pomocą opcjonalnego protokołu filtracji. Powstałe w ten sposób kulki TCPP z powodzeniem wykorzystano na cytometrze przepływowym w celu kompensacji w eksperymentach z ludzkimi komórkami plwociny znakowanymi wieloma fluoroforami. Koraliki TCPP okazały się stabilne po przechowywaniu w lodówce przez 300 dni.

Niniejszy protokół znakowania kulek TCPP jest stosunkowo szybki i wydajny. Rysunek 1 przedstawia reprezentatywny wynik procesu znakowania kulek TCPP, określony za pomocą cytometrii przepływowej. Rysunek 1A pokazuje znormalizowany profil kulek Rainbow, wykryty w odpowiednim kanale detekcji TCPP. Kulki te służą jako kontrola jakości (QC) do standaryzacji napięć lasera w celu detekcji TCPP przez cytometr przepływowy. Rysunek 1B przedst...

Protokół opisuje, jak koraliki kompensacyjne na bazie porfiryny do cytometrii przepływowej są przygotowywane przez reakcję funkcjonalizowanych aminą kulek polistyrenowych z porfiryną TCPP i odczynnikiem sprzęgającym amid EDC. Procedura filtracji jest stosowana w celu zmniejszenia produktów ubocznych cząstek stałych.

Kulki modyfikowane porfiryną do stosowania jako regulatory kompensacji w cytometrii przepływowej

Flow cytometry can rapidly characterize and quantify diverse cell populations based on fluorescence measurements. The cells are first stained with one or ...

Opracowaliśmy kulki polistyrenowe modyfikowane porfiryną TCPP jako kontrole kompensacji w wielobarwnej cytometrii przepływowej. Koraliki użyte w tym protokole mają intensywność fluorescencji porównywalną z komórkami barwionymi TCPP i nadal przechodzą przez cytometr przepływowy. Udało nam się to i obecnie pracujemy nad lepszymi metodami usuwania produktów ubocznych w postaci cząstek stałych.Kulki kompensacyjne modyfikowane porfiryną były preferowane zamiast komórek barwiących TCPP jako kontrola kompensacji. Koraliki te były stabilne przez miesiące bez znaczącej utraty fluorescencji. Wiadomo, że porfiryny selektywnie barwią komórki rakowe.Badania łączą selektywność porfiryn z ilościową cytometrią przepływową, tworząc potężną platformę do wysokoprzepustowej analizy próbek ludzkich. Na początek zważ od 49,0 do 50,9 miligramów TCPP za pomocą wagi analitycznej. Zaokrąglij wagę do jednej dziesiątej miligrama.Odłóż odmierzoną ilość TCPP na bok, chroniąc przed światłem. W zależności od ilości TCPP dodaj wymagane ilości oczyszczonej wody i izopropanolu do 100-mililitrowej szklanej zlewki i przykryj ją parafilmem, aby chronić ją przed parowaniem. Następnie zważyć wymaganą ilość wodorowęglanu sodu w oparciu o ilość TCPP i dodać ją do 100-mililitrowej zlewki zawierającej oczyszczoną wodę i izopropanol.Przykryj roztwór parafilmem, aby chronić go przed parowaniem i umieść go na płytce mieszającej na około 10 minut. Po rozpuszczeniu zawartości upewnij się, że pH roztworu wynosi od dziewięciu do 10. Następnie ostrożnie dodaj obciążony TCPP, chroń roztwór przed światłem i mieszaj go przez około 30 minut, aż się rozpuści.Roztwór należy przechowywać w pojemniku polipropylenowym w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Zacznij od dodania 4,3 mililitra 0,1-molowego roztworu buforowego MES do 15-mililitrowej probówki polipropylenowej. Następnie dodaj 288 mikrolitrów funkcjonalizowanej zawiesiny polistyrenowej z puli wirowej do 15-mililitrowej probówki polipropylenowej zawierającej bufor MES.Wiruj roztwór kulki MES przez 15 sekund z maksymalną prędkością. Następnie wiruj jeden miligram na mililitr roztworu TCPP przez 60 sekund z maksymalną prędkością. Następnie dodaj 1,2 mililitra tego roztworu do zawiesiny kulek MES.Po wirowaniu powstałej zawiesiny przez 15 sekund przykryć rurkę folią. Na początek dodaj świeżo przygotowane 4,5 mililitra roztworu roboczego EDC do 15-mililitrowej probówki polipropylenowej zawierającej kulki polistyrenowe funkcjonalizowane aminą i TCPP w buforze MES. Umieść rurkę w rotatorze odwracającym przy 35 obr./min na 16 godzin w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.Następnie odwiruj go przez 10 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić kulki w 0,8 mililitra zbilansowanego roztworu soli Hanka. Następnie za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra przenieś roztwór kulek do fiolki z bursztynowego polipropylenu i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Związek między powstawaniem cząstek stałych, medianą intensywności fluorescencji lub MFI i stosunkiem TCPP/EDC do perełek wykazał, że wraz ze wzrostem współczynników MFI wzrastał, aż utworzył plateau. Cząstki stałe pojawiały się tylko wtedy, gdy EDC był używany jako odczynnik sprzęgający podczas procedury etykietowania. Znakowanie koralików samym TCPP skutkowało znacznie niższą intensywnością fluorescencji.Gdy kulki z oznaczeniem TCPP zostały przetestowane po 300 dniach, nie zaobserwowano żadnych znaczących zmian w MFI ani w zawartości cząstek stałych. Sprzężenie TCPP z kulkami miało minimalny wpływ na jego widmo emisji fluorescencji. Jednak jego widmo różniło się bardziej od komórek raka płuc oznaczonych TCPP A549.W próbce plwociny znakowanej czterema roślinami, kulki oznaczone TCPP działały równie dobrze, jak komórki A549 barwione TCPP. Rozpocznij kontrolę jakości kulek oznaczonych jako mezo-tetra(4-karboksyfenylo)porfina lub kulki TCPP w cytometrze przepływowym, uruchamiając i zbierając 10 000 zdarzeń tęczowych kulek. Następnie wykonaj płukanie wodą i zbierz 10 000 zdarzeń ujemnych kulek TCPP.Po ponownym spłukaniu wodą zbierz 10 000 zdarzeń dodatnich kulek TCPP. Następnie wykonaj jednominutowe płukanie wodą przed odpowiednim czyszczeniem i wyłącz cytometr przepływowy. Reprezentatywny wynik procesu znakowania kulek TCPP określony za pomocą cytometrii przepływowej przedstawiono tutaj ze znormalizowanym profilem kulek tęczowych.Koraliki te służą jako kontrole jakości w celu standaryzacji napięć laserowych w celu wykrycia TCPP. Zaobserwowano profil rozproszenia światła polistyrenu funkcjonalizowanego aminą, kulek oznaczonych TCPP. Profil rozproszenia światła niefunkcjonalizowanych koralików wykorzystano jako ujemną kontrolę ściegu do obliczenia macierzy kompensacji.Populacja wskazana przez czerwony prostokąt w kulkach oznaczonych TCPP była nieobecna w zawiesinie nieoznakowanych kulek, co oznacza, że cząstki związane z TCPP nie powstały pod nieobecność TCPP i EDC. Intensywność fluorescencji oznaczonych koralików wybranych przez czarną bramkę była o kilka kłód wyższa niż w przypadku młodych oznaczonych koralików. Rozpocznij filtrację kulkową TCPP od rozcieńczenia 0.8 mililitra zawiesiny kulek TCPP 3.20 mililitrami lodowatego roztworu soli Hanka lub HBSS.Wirować rozcieńczoną zawiesinę kulki z maksymalną prędkością przez 15 sekund. Następnie wyjąć tłok z jednorazowej pięciomililitrowej strzykawki i wyposażyć strzykawkę w pięciomikrometrowy filtr z końcówką z włókna szklanego o średnicy 13 milimetrów. Następnie dodaj cztery mililitry HBSS do strzykawki przed dodaniem 0,5 mililitra wirowanej rozcieńczonej zawiesiny kulek.Za pomocą tłoka przefiltrować zawiesinę kulek przez filtr strzykawkowy z prędkością około dwóch kropli na sekundę. Następnie umyj kulki, pobierając pięć mililitrów świeżego HBSS do strzykawki przez filtr i wypychając HBSS do pojemnika na odpady z prędkością około dwóch kropli na sekundę. Aby usunąć kulki z filtra, wciągnij kolejne pięć mililitrów świeżego HBSS do strzykawki przez filtr.Następnie ostrożnie wyjąć filtr ze strzykawki. Po wyrzuceniu zawiesiny kulek ze strzykawki do 50-mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej, umieść świeży filtr z powrotem na strzykawce i powtórz czterokrotne płukanie pięciomililitrowym HBSS. Po zakończeniu wyrzuć filtr i strzykawkę.Odwirować przefiltrowane zawiesiny kulek w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 1000 G. Odessać supernatant z każdej probówki o pojemności 50 mililitrów. Delikatnie ponownie zamieszaj kulki i 0,5 mililitra świeżego HBSS. Przenieś połączone kulki za pomocą mikropipety P1000 do nowej fiolki ze szkła w kolorze bursztynowym i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Efekt filtracji na zawiesinę perełkową składającą się z około 66% cząstek stałych jest widoczny tutaj. Po filtracji zawartość cząstek stałych zmniejszyła się do około 25%Niekorzystnymi skutkami filtracji są utrata kulek i niewielka utrata intensywności fluorescencji.

porphyrin-modified-beads-for-use-as-compensation-controls-flow

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Wykrywanie minimalnej lub mierzalnej choroby resztkowej (MRD) jest ważnym biomarkerem prognostycznym do udoskonalania oceny ryzyka i przewidywania nawrotu ostrej białaczki szpikowej (AML). Te kompleksowe wytyczne i zalecenia wraz z najlepszymi praktykami w zakresie spójnej i dokładnej identyfikacji i wykrywania MRD mogą pomóc w podejmowaniu skutecznych decyzji dotyczących leczenia AML.

Kompleksowy protokół pobierania i przetwarzania szpiku kostnego do pomiaru mierzalnej choroby resztkowej i białaczkowych komórek macierzystych w ostrej białaczce szpikowej

Diagnoza MDS jest trudna ze względu na brak kryteriów morfologicznych lub cytogenetyki bez informacji. MFC może pomóc udoskonalić proces diagnostyczny MDS. Aby analiza MFC stała się przydatna w praktyce klinicznej, musi opierać się na parametrach o wystarczającej swoistości i czułości, a dane powinny być powtarzalne dla różnych operatorów.

Cytometria przepływowa sterowana bazą danych do oceny dojrzewania komórek szpiku kostnego

Zoptymalizowaliśmy protokół izolacji i oczyszczania mysich perycytów serca do podstawowych badań i badania ich potencjału biologicznego i terapeutycznego.

Izolacja i oczyszczanie perycytów serca myszy

Tutaj prezentujemy mikrofragmentację ludzkiej tkanki tłuszczowej bez enzymów przy użyciu urządzenia systemu zamkniętego. Ta nowa metoda pozwala na uzyskanie submilimetrowych skupisk tkanki tłuszczowej nadających się do przeszczepu in vivo, hodowli in vitro oraz dalszej izolacji i charakterystyki komórek.

Mikrofragmentacja ludzkiej tkanki tłuszczowej do fenotypowania komórek i charakterystyki sekretomu

Izolacja komórek z wypreparowanych implantów i ich charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej może znacząco przyczynić się do zrozumienia wzorca odpowiedzi immunologicznej przeciwko implantom. W pracy opisano dokładną metodę izolacji komórek z wypreparowanych implantów i ich barwienia do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Wysokowymiarowa cytometria przepływowa do analizy funkcji immunologicznej wypreparowanych tkanek implantów

Ten protokół opisuje skuteczną metodę dysocjacji plwociny na zawiesinę pojedynczej komórki i późniejszą charakterystykę podzbiorów komórkowych na standardowych platformach cytometrycznych przepływu.

Analiza plwociny pod kontrolą jakości za pomocą cytometrii przepływowej

To badanie wykorzystuje cytometrię przepływową i dwie różne strategie bramkowania na izolowanych perfundowanych splotach naczyniówkowych mózgu myszy; ten protokół identyfikuje główne podzbiory komórek odpornościowych, które wypełniają tę strukturę mózgu.

Izolacja i charakterystyka komórek odpornościowych z mikropreparowanych splotów naczyniówkowych myszy

Opisana tutaj jest metoda, która może być użyta do zobrazowania pięciu lub więcej parametrów fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Przedstawiono proces analityczny służący do wyodrębniania pojedynczych komórek z tych obrazów i przeprowadzania analizy pojedynczych komórek za pomocą strategii bramkowania podobnych do cytometrii przepływowej, które mogą identyfikować podzbiory komórek w sekcjach tkanki.

Generowanie i analiza wysokoparametrowych obrazów histologicznych za pomocą cytometrii przepływowej

Wielokolorowa cytometria przepływowa dla płytek krwi może zidentyfikować nowe podtypy płytek krwi w klasycznych subpopulacjach płytek krwi, takie jak płytki spoczynku, agregacyjne, prokoagulacyjne i apoptotyczne. Pozwala to na porównanie różnych wzorców subpopulacji indukowanych przez różnych agonistów płytek krwi. Tutaj szczegółowo opisano procedurę tworzenia wielokolorowego panelu cytometrii przepływowej.

Analiza subpopulacji płytek krwi za pomocą wielobarwnej cytometrii przepływowej

Protokół ten łączy cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki w celu wyizolowania i scharakteryzowania stanów komórek mikrogleju w móżdżku wczesnych postnatalnych mózgów myszy. Wykorzystuje dysocjację enzymatyczną, wirowanie Percoll i barwienie immunologiczne, aby ujawnić heterogeniczność mikrogleju i poprawić zrozumienie ich roli w rozwoju i chorobie móżdżku.

Cytometria przepływowa i analiza pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania aktywacji mikrogleju we wczesnym pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy

Poznaj metodę przygotowania kulek polistyrenowych modyfikowanych porfiryną TCPP jako regulatorów kompensacji w wielokolorowej cytometrii przepływowej. Technika ta zapewnia stabilną fluorescencję porównywalną z barwionymi komórkami.

Kulki modyfikowane porfiryną do stosowania jako regulatory kompensacji w cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów