Name: Przewlekła przerywana ekspozycja na opary etanolu w połączeniu z wyborem dwóch butelek w celu modelowania zaburzeń związanych z używaniem alkoholu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Poznaj model zależności alkoholowej CIE z wyborem dwóch butelek u myszy. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę zachowań picia i badanie zmian neurobiologicznych związanych z uzależnieniem od alkoholu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) AA027301 i AA029985.

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Purdue. W niniejszym badaniu wykorzystano 8-tygodniowe myszy C57BL/6J. Grupa CIE miała 5 myszy (3 samce, 2 samice), a grupa powietrzna miała 10 myszy (5 samców i 5 samic). Zwierzęta pozyskano ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów) i umieszczono je w grupowym cyklu trwającym 12 godzin w ciemności i świetle, z dostępem do pożywienia. Masa ciała myszy była mierzona raz w tygodniu przez cały czas trwania eksperymentu.
1. Ogólny projekt eksperymentalny
UWAGA: Wybór dwóch butelek (2BC)/przewlekłe przerywane narażenie na opary etanolu (CIE) to przedkliniczny model myszy do zbadania zależności od etanolu51.
<ol>
	<li>W ciągu 2 tygodni BC upewnij się, że myszy mają dostęp do butelki zawierającej etanol (15% w/v) i butelki zawierającej wodę przez 2 godziny dziennie (od poniedziałku do piątku), rozpoczynając 2 godziny w cyklu ciemności.</li>
	<li>Na początku pozwól myszom na co najmniej 2 tygodnie wyjściowego picia 2BC, aż do osiągnięcia stabilnego poziomu spożycia etanolu. W zależności od potrzeb eksperymentalnych podziel myszy na dwie grupy (grupę CIE i grupę powietrzną) lub więcej, jeśli uwzględniono dodatkowe leczenie w oparciu o średnie wyjściowe spożycie etanolu.</li>
	<li>Po linii bazowej 2BC tygodnie wystawiaj myszy z grupy CIE na działanie oparów etanolu (CIE) przez cztery kolejne dni (od poniedziałku do czwartku) z 16 kolejnymi godzinami włączonej pary i 8 kolejnymi godzinami wyłączonej pary. Aby zapewnić stabilne i utrzymujące się stężenie etanolu we krwi przez cały okres ekspozycji, pirazol podawano jednocześnie jako inhibitor dehydrogenazy alkoholowej, zapobiegając w ten sposób szybkiemu metabolizmowi etanolu i promując stałe ogólnoustrojowe poziomy etanolu. 
	UWAGA: Aby kontrolować potencjalne zmienne specyficzne dla komory, takie jak oświetlenie, wibracje, hałas i temperatura, myszy w grupie powietrznej trzymano w identycznej komorze w tych samych warunkach środowiskowych co grupa CIE, ale bez ekspozycji na opary alkoholu.</li>
	<li>Podczas tygodnia CIE/Air upewnij się, że nie występuje 2BC. Po 1 tygodniu CIE/Air wznów myszy na 2BC od poniedziałku do piątku.</li>
	<li>Pozwól myszom na naprzemienne tygodnie CIE/Air i 2BC przez pozostałą część procedury, aż dojdzie do eskalacji picia alkoholu u myszy CIE. Pobieraj krew od myszy co najmniej raz w tygodniu CIE, aby określić stężenie etanolu we krwi (BEC)52.</li>
</ol>
2. Przygotowanie eksperymentalne
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem badania należy zaopatrzyć się we wszystkie następujące materiały: myszy, klatki/metalowe blaty klatek, butelki do picia, które zmieszczą się po dwie w klatce obok siebie, ściółka, jedzenie, waga, przewlekła przerywana komora parowa i maszyna Analox lub inna metoda analizy BEC (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Upewnij się, że wszystkie wymagane chemikalia są gotowe do eksperymentu: woda pitna, 95% etanol, pirazol, heparyna i sterylna sól fizjologiczna.</li>
</ol>
3. Przyzwyczajenie zwierząt
<ol>
	<li>Jeśli myszy nie są jeszcze trzymane w tym samym miejscu, w którym przeprowadzane są eksperymenty, należy odczekać co najmniej 1 tydzień, aby przyzwyczaiły się do nowego środowiska. 
	UWAGA: W tym okresie myszy powinny być również przyzwyczajone do delikatnego obchodzenia się z nimi, aby zminimalizować zakłócenia związane ze stresem i poprawić dobrostan zwierząt. Sesje obchodzenia się z nim prowadzono raz dziennie przez pięć kolejnych dni, z których każda trwała około 2–3 minuty na zwierzę. Myszy były obejmowane lub delikatnie wprowadzane w ręce eksperymentatora bez podnoszenia ogona, co pozwalało im dobrowolnie badać rękę przewodnika. Technika ta ułatwia rutynową interakcję, zmniejsza stres podczas kolejnych procedur eksperymentalnych i zapewnia bardziej wiarygodne dane behawioralne. Dodatkowo zwierzęta przenoszono na obszar eksperymentalny na 30 minut dziennie, aby jeszcze bardziej zaaklimatyzować je w środowisku testowym.</li>
	<li>Upewnij się, że myszy mają 1 tydzień wyboru dwóch butelek, przy czym obie butelki są wypełnione wodą, aby umożliwić im dostosowanie się do różnych ustawień klatki i umieszczenie ich w indywidualnej klatce do picia.</li>
</ol>
4. Wybór dwóch butelek z 15% w/v etanolu i wodą
<ol>
	<li>Przyzwyczajenie do wyboru dwóch butelek
	<ol>
		<li>Paradygmat testowania wyboru dwóch butelek jest taki sam przez cały tydzień, przy czym wybór dwóch butelek z wodą i późniejsze testowanie jest z wodą i etanolem. Przenieś myszy trzymane w grupie do ich indywidualnych klatek do picia 30 minut przed wyłączeniem świateł, a następnie pozwól myszom pić przez 2 godziny.</li>
		<li>Zapisuj objętość każdej butelki do picia przed i po 2-godzinnym okresie picia. Każda grupa przechodzi 2BC przez 5 dni, od poniedziałku do piątku. 
		UWAGA: Celem tygodnia przyzwyczajenia jest umożliwienie zwierzętom przyzwyczajenia się do dwóch butelek znajdujących się w klatce, aby zminimalizować wszelkie odchylenia spowodowane naturalnym bocznym położeniem pojedynczej butelki. W tym tygodniu obie butelki są napełniane wodą. Jeśli dostarczony metalowy zbiornik jest przeznaczony do przechowywania tylko jednej butelki, ostrożnie wykorzystaj przestrzeń między prętami przylegającymi do pierwszej butelki, aby zrobić miejsce na drugą butelkę. Butelki używane do eksperymentów z piciem są wykonane na zamówienie przy użyciu pipet o pojemności 10 ml i 25 ml z końcami ściętymi tak, aby umożliwić włożenie prostego łyka z łożyskiem kulkowym, z którego myszy mogą pić. Użycie klipsów do segregatorów do przypięcia butelek do drucianej pokrywy zapewni, że butelki nie będą się przesuwać w okresie picia (rysunek uzupełniający 1 i rysunek uzupełniający 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podstawowy wybór dwóch butelek
	<ol>
		<li>Po przyzwyczajeniu pozwól myszom przejść co najmniej 2 tygodnie wyjściowego picia 2BC, aby ustalić stabilne spożycie etanolu. Podczas picia podstawowego testuj myszy przez 2 godziny dziennie i 5 dni w tygodniu (od poniedziałku do piątku) za pomocą jednej butelki wody i drugiej butelki z 15% w/v etanolem. Zapisuj objętość każdej butelki do picia przed i po 2-godzinnym okresie picia. 
		UWAGA: Aby ustalić stabilny punkt wyjściowy spożycia etanolu, powtarzaj tygodnie 2BC, aż każda mysz będzie miała mniej niż 15% różnicy w spożyciu między dniami.</li>
		<li>Po tym, jak myszy osiągną stabilny poziom wyjściowy spożycia etanolu, równomiernie podziel myszy na podstawie spożycia etanolu na grupy niezależne od etanolu (leczenie powietrzem) i zależne od etanolu (leczenie CIE). Po ustaleniu wyjściowego spożycia etanolu myszy przechodzą CIE (lub ekspozycję na powietrze) w następnym tygodniu. 
		UWAGA: Nie wszystkie eksperymenty wymagają włączenia grupy niezależnej i musi to być określone na podstawie celu badania. Na przykład myszy zależne od etanolu ze specyficznym leczeniem i bez niego mogą być bardziej odpowiednim porównaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybór dwóch butelek (2BC)
	<ol>
		<li>Wznowić procedurę 2BC wykonywaną podczas picia wyjściowego po pierwszym tygodniu CIE. 
		UWAGA: Formuła do picia dla myszy z dwiema butelkami to 15% w/v mieszanina etanolu (1 l): 95% etanolu (195 ml) i wody pitnej dla myszy (805 ml).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przewlekłe okresowe narażenie na opary etanolu (CIE)
<ol>
	<li>Ułóż następujące materiały: wykonane na zamówienie komory parowe CIE (rysunek uzupełniający 3), 95% etanol, roztwór etanolu i pirazolu (68,1 mg/kg pirazolu zmieszany z 20% etanolem), roztwór soli fizjologicznej i pirazolu (68,1 mg/kg pirazolu zmieszany z solą fizjologiczną), strzykawki (1 ml) i igły.</li>
	<li>Procedura przewlekłego przerywanego wydzielania par etanolu (CIE)
	<ol>
		<li>Przed umieszczeniem w komorach parowych dla CIE, wstrzyknij myszom dootrzewnowo roztwór etanolu i pirazolu (0,0075 ml / g), który jest używany do wywołania początkowego zatrucia etanolem, zahamowania dehydrogenazy etanolu i zablokowania metabolizmu etanolu53.</li>
		<li>Wstrzyknąć wszystkie grupy kontrolne powietrza i inne grupy tą samą dawką pirazolu zmieszaną z solą fizjologiczną (0,0075 ml / g) zamiast etanolu. Zaleca się podawanie połowy dawki (0,00375 ml/g) roztworów pirazolu w pierwszym i ostatnim dniu CIE każdego tygodnia.</li>
		<li>Po wstrzyknięciach należy umieścić myszy powietrzne/kontrolne z powrotem w ich klatkach domowych i umieścić klatki dla grupy CIE w komorze parowej. 
		UWAGA: Biorąc pod uwagę potencjalne zagrożenia dla zdrowia związane z przewlekłym narażeniem na opary etanolu, zwierzęta były ściśle monitorowane przez cały czas trwania protokołu, aby zapewnić ich dobrostan i wykryć wszelkie niepożądane skutki. Myszy ważono co najmniej dwa razy w tygodniu, a oceny stanu zdrowia obejmowały obserwację klinicznych objawów niepokoju. Zwierzęta wykazujące utratę masy ciała przekraczającą 20% w stosunku do wartości wyjściowej lub wykazujące takie objawy, jak zgarbiona postawa, letarg, piloerekcja lub zaniedbana sierść, zostały uznane za osiągnięte humanitarne punkty końcowe i zostały niezwłocznie usunięte z badania zgodnie z zatwierdzonymi instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywania. Podczas CIE myszy są najbardziej podatne na złe wyniki zdrowotne pod koniec tygodnia, kiedy wchodzą w przedłużony okres odstawienia po ustaniu ekspozycji na etanol. Aby zminimalizować nasilenie odstawienia, w ostatnim dniu ekspozycji na parę podaje się połowę dawki pirazolu każdego tygodnia. Dodatkowo, połowa dawki jest podawana na początku każdego nowego cyklu CIE, aby ułatwić zwierzętom powrót do ekspozycji na etanol. Pirazol, inhibitor dehydrogenazy alkoholowej, jest stosowany do stabilizacji i przedłużania stężenia etanolu we krwi; Dawki zazwyczaj wahają się od 0,00375 ml/g do 0,0075 ml/g i mogą być dostosowywane w celu osiągnięcia pożądanego stężenia etanolu we krwi.</li>
		<li>Po umieszczeniu myszy w komorach parowych zablokuj drzwi i ustaw pompę na odpowiedni poziom pary (np. 1-3). Ustaw czas trwania eksperymentu. W niniejszym badaniu eksperyment rozpoczął się o godzinie 17:00 i zakończył o godzinie 09:00, a zastosowano ustawienie pompy 1-2 (używane przez cały czas).</li>
		<li>Następnie naciśnij przycisk Start na ekranie sterowania komorą parową CIE, aby rozpocząć eksperyment. 
		UWAGA: Ten krok może się różnić w zależności od używanej komory i różnic w konfiguracji. Tutaj, po wstrzyknięciu wszystkich myszy i umieszczeniu ich w komorze etanolowej, komora powinna rozpocząć pompowanie 95% etanolu do szklanej kolby i podgrzać ciekły etanol do pary. Para przepływa przez komorę, w której myszy są przetrzymywane przez 16 godzin dziennie przez 4 dni (od poniedziałku wieczorem do piątku rano). Każdego dnia myszy doświadczają 8 godzin przerwy w upuszczaniu pary. Myszy są następnie usuwane z komory pod koniec czwartego dnia (piątek rano) i rozpoczynają 2 BC w następny poniedziałek. W zależności od konkretnego systemu i konfiguracji komory parowej, mogą wystąpić różnice w BEC spowodowane różnymi ustawieniami/poziomami pary. Mogą to powodować różne czynniki, takie jak niewielkie różnice w elementach systemu, przepływ powietrza, spaliny itp. Regulacja poziomu par etanolu zamiast dawki pirazolu jest odpowiednia do utrzymania BEC w docelowym zakresie. Wraz z rozwojem tolerancji BEC mogą być zbyt niskie, a poziom pary może wymagać regulacji. Jeśli gradient między poziomami pary jest zbyt duży, aby zwiększyć BEC, zaleca się odpowiednie dostosowanie dawki pirazolu w celu zmiany BEC.</li>
		<li>Mierz BEC (patrz krok 5.3) myszy co najmniej raz w tygodniu podczas CIE. Wykonaj pobieranie krwi 30 minut przed zatrzymaniem pary, aby upewnić się, że BEC nie zaczęły opadać. 
		UWAGA: Poziom pary może wymagać regulacji podczas eksperymentu, ponieważ tolerancja etanolu narasta w ciągu kilku tygodni. BEC należy testować przed i po regulacji ustawień pary.</li>
		<li>Wróć myszy do testu 2BC w tygodniu następującym po CIE. Powtórz krok 4 i krok 5. Utrzymuj myszy na przemian między CIE i 2BC przez cztery do ośmiu cykli (8-16 tygodni), aż do znacznego wzrostu spożycia etanolu w porównaniu z ich wyjściową objętością picia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiary krwi
	<ol>
		<li>Ułóż następujące materiały: sprzęt do pomiaru BEC, taki jak system Analox, ostrze, probówka (0,2 ml), heparyna/EDTA i wirówka (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Obetnij ogon myszy CIE raz w ciągu tygodnia CIE, 30 minut przed wyłączeniem systemu parowego, aby pobrać krew do określenia BEC. Pobranie krwi może być przeprowadzone przy użyciu kilku metod w zależności od preferencji lab54. 
		UWAGA: Krew zbiera się do probówek o pojemności 0,5 ml pokrytych heparyną lub EDTA (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Pobrane próbki krwi należy utrzymywać w temperaturze 4 °C do czasu ich przetworzenia.</li>
		<li>Aby przetworzyć próbki, należy najpierw odwirować osocze o sile 208 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu oddzielenia osocza.</li>
		<li>Określić stężenie etanolu we krwi za pomocą analizatora dawki tlenu i etanolu (patrz tabela materiałów) lub innych systemów zdolnych do określania BEC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Modeling Alcohol Use Disorder Using Chronic Intermittent Ethanol Vapor Exposure

Maury Cole jest właścicielem i operatorem La Jolla Alcohol Research Inc.

Zaburzenia związane z używaniem alkoholu stanowią globalny problem zdrowia publicznego, który jest bardzo rozpowszechniony i kosztowny dla społeczeństwa56. Aby zbadać AUD w przedklinicznych modelach zwierzęcych, powszechną metodą u myszy jest 2BC / CIE 20,34,43,44,51,57,58,59.<sup class="xre...

Zaburzenie związane z nadużywaniem alkoholu (AUD), które polega na chronicznym nadmiernym spożywaniu alkoholu, jest jednym z najczęstszych zaburzeń psychicznych i stanowi problem globalny. Objawy AUD obejmują powtarzające się cykle odurzenia, odstawienia i głodu i charakteryzują się ciągłym spożywaniem alkoholu bez względu na konsekwencje społeczne, zawodowe i zdrowotne1,2,3,4,5,6,7. Zaburzenia związane z używaniem alkoholu często występują w połączeniu z innymi wszechobecnymi, uporczywymi i upośledzającymi zaburzeniami psychicznymi8, takimi jak ADHD9, anxiety10 lub depresja11 i jest odpowiedzialne za około 88 000 zgonów rocznie w samych Stanach Zjednoczonych2. Nadmierne lub częste spożywanie alkoholu może wpływać na status zawodowy i relacje społeczne12 i może prowadzić do wzrostu przemocy13. Fizycznie, ostre odstawienie alkoholu może powodować niepokój, pobudzenie, drżenie, nadmierne pocenie się, zaburzenia świadomości i halucynacje14,15. Co więcej, ludzie mogą odczuwać objawy odstawienia podczas ograniczania lub zaprzestania picia i stawać się drażliwi lub marudni16. Dodatkowo, przewlekłe spożywanie alkoholu może powodować utratę pamięci17 i może powodować niedobór tiaminy, znany również jako zespół Wernickego-Korsakoffa (WKS), który znacząco przyczynia się do demencji wywołanej alkoholem18.
Aby dalej rozwijać badania nad AUD, konieczne jest posiadanie odpowiednich translacyjnie modeli zwierzęcych choroby. Najczęstszym modelem AUD u gryzoni jest przewlekła przerywana ekspozycja na opary etanolu (CIE), która jest dobrze ugruntowanym podejściem do wywoływania uzależnienia od alkoholu poprzez wielokrotne wdychanie oparów alkoholu4,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Procedury CIE u gryzoni wywołują objawy odstawienia, takie jak drgawki wywołane obsługą31, nadpobudliwość, zachowanie podobne do drażliwości, zachowanie podobne do lęku i zaburzenia snu i powodują eskalację picia alkoholu22,32,33,34,35. Co więcej, CIE prowadzi do znacznej eskalacji dobrowolnego spożycia alkoholu, co odzwierciedla kompulsywne spożycie obserwowane u ludzi AUD36. Podczas faz zatrucia myszy wykazują objawy behawioralne i fizjologiczne zgodne z zatruciem alkoholowym u ludzi, w tym ataksję, uspokojenie i upośledzoną hipotermię37,38,39. Wyniki te podkreślają użyteczność modelu CIE w uchwyceniu zarówno neurobiologicznych, jak i behawioralnych aspektów uzależnienia od alkoholu, co czyni go cennym narzędziem do wyjaśniania mechanizmów AUD i testowania potencjalnych interwencji terapeutycznych. W przedklinicznych modelach AUD, takich jak przewlekła przerywana ekspozycja na opary etanolu (CIE), myszy wykazują objawy behawioralne i fizjologiczne, które odpowiadają zatruciu alkoholem i uzależnieniu od alkoholu. Podczas faz zatrucia myszy mogą wykazywać objawy, takie jak ataksja, uspokojenie, zmniejszone zachowanie eksploracyjne i upośledzony odruch prostowania. Biorąc pod uwagę te zagrożenia, zwierzęta były ściśle monitorowane w trakcie i po ekspozycji na opary etanolu w celu zidentyfikowania oznak ciężkiego zatrucia lub pogorszenia stanu zdrowia.
U szczurów model CIE często polega na operatywnym samodzielnym podawaniu alkoholu w celu zmierzenia eskalacji spożycia40,41,42, podczas gdy model mysi obejmuje CIE i wybór dwóch butelek (2BC) picie43,44. Przedkliniczne modele uzależnienia od alkoholu konsekwentnie wykazały, że zwierzęta zwiększają spożycie etanolu po długotrwałym narażeniu na opary etanolu23,45,46,47. W szczególności u myszy wykazano, że powtarzające się cykle CIE eskalują dobrowolne przyjmowanie etanolu3,21,48,49,50. Ogólnie rzecz biorąc, wcześniejsze badania pokazują, że model CIE jest wystarczający do zwiększenia zużycia etanolu i modelowania AUD u gryzoni.
To badanie ma na celu podkreślenie metody CIE do badania AUD, a dokładniej skupienie się na modelu myszy 2BC/CIE. Przechodzimy przez szczegółowy proces kroków niezbędnych do wykonania 2BC/CIE i przedstawiamy przykład eskalacji picia alkoholu po CIE.

<table><tbody><tr><td>500 probówek Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>L203896J</td><td></td></tr><tr><td>95% etanolu</td><td>Decon laboratories</td><td>2816</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna Analox</td><td>Instrumenty Analox Waga</td> do ważenia zwierząt <td>Analox-AM1</td><td></td></tr> Kent <tr><td></td><td>Scientific</td><td>SCL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Spinacze do segregatorów</td><td>Office Depot</td><td>560394</td><td></td></tr><tr><td>myszy C57BL / 6J</td><td> Wirówka do</td><td>000664</td><td></td>laboratoryjnej Jackson</tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5418R</td><td></td></tr><tr><td>Przewlekła przerywana komora parowa</td><td>La Jolla Alcohol Research Inc</td><td></td><td>Materiały na zamówienie</td></tr><tr><td>Heparyna/EDTA</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>TS/DRUGS/2/2015</td><td></td></tr><tr><td>Pościel dla myszy</td><td>Bed-o' Cobs</td><td>8B</td><td>wypełnij butelką</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> do picia dla myszy o głębokości 1/8 cala <td>Materiały wykonane na zamówienie</td></tr><tr><td>Pirazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>bccc6397</td><td></td></tr><tr><td>Teklad global 18% białka (pokarm dla myszy)</td><td>Teklad global</td><td>Envigo 2018</td><td></td></tr></tbody></table>

przewlekła przerywana ekspozycja na opary etanolu w połączeniu z wyborem dwóch butelek w celu modelowania zaburzeń związanych z używaniem alkoholu

Chronic Intermittent Ethanol Vapor Exposure Paired with Two-Bottle Choice to Model Alcohol Use Disorder

Zaburzenie związane z używaniem alkoholu (AUD) to przewlekłe zaburzenie związane z alkoholem, które zazwyczaj objawia się niekontrolowanym piciem i zaabsorbowaniem alkoholem. Kluczowym elementem badań nad AUD jest wykorzystanie odpowiednich translacyjnie modeli przedklinicznych. W ciągu ostatnich kilku dekad do badania AUD wykorzystano różne modele zwierzęce. Jednym z wyróżniających się modeli AUD jest model przewlekłej przerywanej ekspozycji na opary etanolu (CIE), który jest dobrze ugruntowanym podejściem do wywoływania uzależnienia od alkoholu u gryzoni poprzez powtarzające się cykle ekspozycji na etanol przez wdychanie. Aby modelować AUD u myszy, ekspozycja na CIE jest łączona z dobrowolnym wyborem dwóch butelek (2BC) picia alkoholu i wody w celu zmierzenia eskalacji picia alkoholu. Procedura 2BC/CIE polega na naprzemiennym piciu 2BC i CIE, które powtarzają się aż do osiągnięcia eskalacji picia alkoholu. W niniejszym badaniu przedstawiamy procedury wykonywania 2BC / CIE, w tym codzienne korzystanie z komory parowej CIE, i podajemy przykład eskalacji picia alkoholu u myszy C57BL / 6J przy użyciu tego podejścia.

W niniejszym reprezentatywnym badaniu spożycie etanolu (g/kg) podczas 2BC raportowano w okresie bazowym oraz po tygodniach CIE (po ekspozycji na opary). Krótko mówiąc, zgodnie z opisem w protokole, podczas 2BC myszy miały dostęp do dwóch butelek: jednej zawierającej wodę i drugiej zawierającej 15% (w/v) etanolu. Po ustaleniu spożycia bazowego osobniki podzielono i równomiernie przypisano do grupy CIE lub Air. Początkowe bazowe spożycie etanolu w okresie 3 tygodni ustabilizowało się na poziomie 2,00 g/kg ± 0,21 g/kg (n = ...

Prezentowany tutaj jest protokół dla modelu 2BC/CIE uzależnienia od alkoholu u myszy do badania zaburzeń związanych z używaniem alkoholu.

Przewlekła przerywana ekspozycja na opary etanolu w połączeniu z wyborem dwóch butelek w celu modelowania zaburzeń związanych z używaniem alkoholu

Alcohol use disorder (AUD) is a chronic alcohol-related disorder that typically presents as uncontrolled drinking and preoccupation with alcohol. A key ...

Nasze badania dotyczyły zaburzeń związanych z używaniem alkoholu. Badanie to podkreśla metodologię powszechnie stosowaną w ustalonym modelu myszy uzależnienia od Alco. Ten model to przewlekła, przerywana para etanolu w połączeniu z paradygmatem wyboru dwóch butelek.Paradygmat wyboru dwóch butelek CIE. Zautomatyzowany sprzęt do wyboru dwóch butelek pozwala na monitorowanie zachowań myszy związanych z piciem poprzez rejestrowanie częstotliwości super dotknięć. Dzięki temu możemy uzyskać dodatkowe informacje wykraczające poza objętość spożytego, takie jak czas napadów picia w trakcie sesji picia.W badaniach przedklinicznych zaburzeń związanych z używaniem alkoholu, podejścia takie jak obrazowanie całego mózgu, chemogenetyka i optogenetyka z różnymi wirusowymi myszami transgenetycznymi są często wykorzystywane do postępu badań w tej dziedzinie. Stosowane są również inne podejścia, takie jak modelowanie obliczeniowe. Model CIE z dwoma butelkami do wyboru w przypadku uzależnienia od alkoholu jest stosowany od wielu lat.Mamy jednak nadzieję, że przyjęcie tego podejścia będzie łatwiej dostępne dla szerszej społeczności naukowej. Porównaj z innymi technikami używanymi do badania zaburzeń związanych z używaniem alkoholu. Wybór dwóch butelek i paradygmat CIE ma kilka zalet, które zwiększają znaczenie translacyjne, takie jak indukcja istotnych objawów odstawienia i rozwój eskalacji spożycia alkoholu.Takie podejście idealnie nadaje się do wykorzystania do badania odpowiednich zmian neurobiologicznych spowodowanych uzależnieniem od alkoholu. Aby rozpocząć zamieszkiwanie, przenieś myszy trzymane w grupie do ich indywidualnych klatek do picia na 30 minut przed wyłączeniem świateł. Zapisz objętość każdej butelki do picia, a następnie pozwól myszom pić przez dwie godziny.Zapisz objętość butelek po okresie picia. Teraz wystaw myszy na co najmniej dwa tygodnie podstawowego picia w dwóch butelkach, aby ustalić stabilne spożycie etanolu. Przetestuj myszy, podając im butelkę z wodą i drugą butelkę zawierającą 15% etanolu.Zapisz objętość każdej butelki przed i po dwugodzinnym okresie picia. Gdy myszy osiągną stabilny poziom spożycia etanolu, podziel je na dwie grupy w zależności od ich spożycia i umieść je z powrotem w klatce domowej. Dootrzewnowo wstrzyknąć myszom roztwór etanolu i pirazolu.Wstrzyknąć wszystkie urządzenia kontrolujące powietrze i inne grupy tą samą dawką pirazolu zmieszaną z solą fizjologiczną. Po wstrzyknięciach umieść myszy kontrolujące powietrze w ich domowych klatkach i umieść klatki CIE w komorze parowej. Zablokuj drzwi i ustaw pompę na odpowiedni poziom pary.Następnie ustaw czas trwania eksperymentu, a następnie naciśnij start na ekranie sterowania komorą parową CIE na 30 minut przed wyłączeniem systemu parowego. Określ stężenie etanolu we krwi myszy. Po pobraniu krwi zwróć myszy do testu wyboru dwóch butelek tydzień po CIE.Odwirować próbki krwi o sile 208 G przez 1,0 minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu oddzielenia osocza. Użyj analizatora dawki tlenu etylowego, aby określić stężenie etanolu we krwi. Początkowe wyjściowe spożycie etanolu w okresie trzech tygodni ustabilizowało się na poziomie 2,00 plus minus 0,21 grama na kilogram przed CIE.Test post hoc Bonferroni wykazał, że myszy CIE znacznie zwiększyły spożycie etanolu w szóstym tygodniu po parowaniu w porównaniu z ich wyjściową objętością picia. Myszy CIE spożywały znacznie więcej etanolu niż myszy niezależne od PV6. Test post hoc Bonferroni wykazał również, że przy PV6 myszy zależne od etanolu miały znacznie wyższe spożycie etanolu w porównaniu z ich własnymi myszami wyjściowymi i niezależnymi.Analizowane stężenia etanolu we krwi grupy CIE wykazały średnią tygodniową 173,12 miligramów na decylitr.

chronic-intermittent-ethanol-vapor-exposure-paired-with-two-bottle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Zaburzenie związane z używaniem alkoholu (AUD) jest poważnym problemem zdrowotnym w kraju i konieczne jest opracowanie bardziej skutecznych metod leczenia, aby zrównoważyć potrzeby tej populacji pacjentów. W tym celu poniższy protokół wykorzystuje dwa proste modele picia gryzoni do oceny przedklinicznej skuteczności ołowiowych związków przeciwalkoholowych.

Mysie modele picia w rozwoju farmakoterapii alkoholizmu: picie w ciemności i wybór dwóch butelek

Ten protokół opisuje standardowy paradygmat picia w domowej klatce z przerywanym dostępem do dwóch butelek do modelowania spożycia alkoholu u szczurów. Ponadto zawiera instrukcje krok po kroku, aby rozszerzyć standardowy protokół o system wykrywania lizawek DIY, który umożliwia analizę mikrostrukturalną zachowań związanych z piciem.

Modelowanie spożycia alkoholu u gryzoni przy użyciu dwóch butelek do wyboru w klatce domowej i analizy mikrostrukturalnej

Opisano prosty test służący do pomiaru działania sedatywnego etanolu na muszki Drosophila, oparty na utracie odruchu prostowania.

Prosty sposób pomiaru wrażliwości much na etanol

Niniejszy raport demonstruje technikę mechanicznej izolacji pojedynczych żywych neuronów z zachowaniem przytwierdzonych boutonów presynaptycznych. Neurony poddane wibrodysocjacji charakteryzują się zaletami takimi jak szybki czas przygotowania, doskonała kontrola farmakologiczna oraz usprawniona stabilizacja potencjału błonowego (space-clamp) bez wpływu komórek sąsiednich. Metoda ta może być wykorzystywana do obrazowania elementów synaptycznych oraz rejestracji metodą patch-clamp.

Wibrodysocjacja neuronów z plastrów mózgu gryzoni w celu badania transmisji synaptycznej i obrazowania terminali presynaptycznych

Opisano metodę określania przebiegu czasowego stężenia etanolu w mózgach szczurów podczas operantowej samopodaży etanolu. Do ilościowego oznaczenia etanolu w próbkach dialyzatu zastosowano chromatografię gazową z detekcją płomieniowo-jonizacyjną, ponieważ charakteryzuje się ona czułością wymaganą dla generowanych małych objętości.

Mikrodializa etanolu podczas operacyjnego samopodawania etanolu oraz oznaczanie etanolu metodą chromatografii gazowej

Pionowy olfaktometr labiryntu w kształcie litery T jest opisany do badania reakcji behawioralnej stawonogów. Olfaktometr pozwala eksperymentatorowi zmierzyć wybory dokonywane przez osoby badane pod wpływem dwóch potencjalnych pól zapachowych. Za pomocą tego urządzenia można zmierzyć zarówno przyciąganie, jak i odpychanie od substancji zapachowych.

Pionowy test wyboru labiryntu w kształcie litery T dla reakcji stawonogów na substancje zapachowe

Drosophila stała się znaczącym modelowym systemem do analizowania komórkowych i molekularnych podstaw behawioralnych reakcji na alkohol. W tym miejscu przedstawiamy protokół zbierania danych dotyczących wrażliwości na alkohol w kontekście okołodobowym, który można łatwo zastosować w innych eksperymentach i dobrze nadaje się do badań licencjackich.

FlyBar: podawanie muchom alkoholu

Nagrania par to równoczesne nagrania klamrów całych komórek z dwóch synaptycznie połączonych neuronów, umożliwiające precyzyjną elektrofizjologiczną i farmakologiczną charakterystykę synaps między poszczególnymi neuronami. Poniżej opisujemy szczegółową metodologię i wymagania dotyczące ustalenia tej techniki w organotypowych kulturach plastrów hipokampa w dowolnym laboratorium wyposażonym do elektrofizjologii.

Sparowane nagrania całych komórek w organotypowych wycinkach hipokampa

Proste testy do pomiaru wrażliwości etanolu i szybkiej tolerancji u Drosophila ułatwiają wykorzystanie tego organizmu modelowego do badania tych ważnych zachowań związanych z etanolem. W tym miejscu opisano stosunkowo prosty, skalowalny test do pomiaru wrażliwości etanolu i szybkiej tolerancji u much.

Niedrogi, skalowalny test behawioralny do pomiaru wrażliwości i szybkiej tolerancji sedacji etanolem u Drosophila

C. elegans jest przydatnym modelem do badania wpływu alkoholu etylowego na zachowanie. Prezentujemy test behawioralny, który ilościowo określa wpływ alkoholu etylowego na szybkość poruszania się pełzających dżdżownic; zarówno początkową wrażliwość, jak i rozwój ostrej tolerancji funkcjonalnej na alkohol etylowy można zmierzyć za pomocą tego testu.

Badanie wpływu alkoholu etylowego na prędkość poruszania się Caenorhabditis elegans

Poznaj model zależności alkoholowej CIE z wyborem dwóch butelek u myszy. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę zachowań picia i badanie zmian neurobiologicznych związanych z uzależnieniem od alkoholu.

Przewlekła przerywana ekspozycja na opary etanolu w połączeniu z wyborem dwóch butelek w celu modelowania zaburzeń związanych z używaniem alkoholu (Wideo) | JoVE Journal

Przewlekła przerywana ekspozycja na opary etanolu w połączeniu z wyborem dwóch butelek w celu modelowania zaburzeń związanych z używaniem alkoholu

Przeglądaj więcej filmów