Name: Iniekcje domózgowo-komorowe z wolnej ręki u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T12:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Naucz się techniki iniekcji domózgowo-komorowych z wolnej ręki u myszy bez użycia urządzenia stereotaktycznego. Ta metoda umożliwia szybkie dostarczanie substancji do komory bocznej w badaniach neuroendokrynologii reprodukcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować dr Kellie Breen Church, Panu Michaelowi Kreisman i Pani Jessice Jang za ich wkład w zbieranie danych pokazanych w reprezentatywnych wynikach. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health (NIH) R00 HD104994 (RBM).

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Uniwersytet Stanowy Kolorado (#3960) oraz Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Diego, gdzie zebrano reprezentatywne dane (S13235, PI Kellie Breen Church). Dane dotyczące pięciu dorosłych samic i dwóch dorosłych samców myszy C57/BL6 (w wieku 9-16 tygodni) przedstawiono w sekcji danych reprezentatywnych. Samice myszy poddano owariektomii 3-4 tygodnie przed wstrzyknięciem ICV i pobraniem krwi, jak opisano wcześniej7. Przed eksperymentami myszy te były trzymane w cyklu 12 godzin światła/12 godzin ciemnego światła i miały swobodny dostęp do paszy i wody zgodnie z Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Wykonywanie kraniotomii
UWAGA: Kraniotomia może być wykonana jeden lub więcej dni przed faktycznym wstrzyknięciem, co przyspiesza proces iniekcji w dniu eksperymentu.
<ol>
	<li>Przygotuj materiały do kraniotomii zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Umieść czystą podkładkę stołową lub materiał do układania na powierzchni roboczej. Przyklej stożek nosowy waporyzatora izofluranu do powierzchni roboczej (blisko, ale odwrócony od eksperymentatora; patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Umieść rurkę silastyczną na końcu sterylnej ostrej igły 18 G tak, aby wystawał ~1 mm końcówki igły. Umieść rurkę silastyczną na końcu sterylnej, igły tak, aby wystawał ~1 mm końcówki igły. 
		UWAGA: Do każdej myszy należy używać oddzielnych i sterylnych, wstępnie zapakowanych igieł (ostrych i).</li>
		<li>Zaopatrz się w golarkę elektryczną, peeling jodowy, sterylną gazę i waciki nasączone alkoholem, aby przygotować miejsce wstrzyknięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ćwicz przesuwanie igły 2 mm bocznie i 1 mm ogonowo, jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Za pomocą linijki i długopisu zaznacz kartkę papieru punktem początkowym (będzie to bregma), znacznikiem 2 mm w lewo lub w prawo, a następnie kolejnym znakiem 1 mm powyżej ostatniego (będzie to miejsce wstrzyknięcia; patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Ćwiczyć przesuwanie igły od punktu początkowego do oznaczenia punktu 1 do oznaczenia punktu 2 (od bregma do miejsca wstrzyknięcia), aż do upewnienia się, że ruch jest powtarzalny bez prowadnic. 
		UWAGA: Opisane tutaj współrzędne są skuteczne u dorosłych myszy C57/BL6, ale inne szczepy lub grupy wiekowe mogą wymagać korekty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj mysz do kraniotomii zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej i znieczul mysz 3%-4% izofluranem w tlenie medycznym. Wraz z praktyką i znajomością procedury, skróć całkowity czas ekspozycji na izofluran do mniej niż 10 minut podczas zabiegu kraniotomii. 
		UWAGA: Narażenie na izofluran jest niebezpieczne dla zdrowia ludzkiego; Używaj zatwierdzonego i sprawdzonego parownika izofluranu w dobrze wentylowanym pomieszczeniu za pomocą środków do usuwania gazów odlotowych.</li>
		<li>Gdy odruch palców u nóg jest nieobecny, ogol głowę zwierzęcia. Nałóż smar do oczu.</li>
		<li>Umieść mysz na powierzchni roboczej z głową w stożku nosowym, aby utrzymać znieczulenie.</li>
		<li>Podawać lek przeciwbólowy, taki jak buprenorfina (0,6-0,8 mg/kg masy ciała myszy, podskórnie), zgodnie z zaleceniami dostawcy.</li>
		<li>Oczyścić miejsce wstrzyknięcia, przecierając głowę sterylną gazą zamoczoną w roztworze jodu (wykonaj trzy peelingi), a następnie przetrzyj nasączonym gazikiem nasączonym alkoholem (wykonaj trzy razy). 
		UWAGA: Usuń sierść i oczyść skórę wokół miejsca wstrzyknięcia i użyj sterylnych narzędzi i igieł, zgodnie z zaleceniami Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynarii w celu zapobiegania infekcjom.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mocno chwyć głowę myszy ręką niedominującą. Ustaw głowę tak płasko na powierzchni roboczej, jak to możliwe.</li>
	<li>Zlokalizować miejsce wstrzyknięcia.
	<ol>
		<li>Użyj przygotowanej ostrej igły 18 G, aby najpierw zidentyfikować bregmę; w tym celu przeciągnij igłę po skórze głowy wzdłuż linii środkowej, poruszając się w płaszczyźnie rostralno-ogonowej. Wyobraźmy sobie trójkąt równoboczny, w którym dwa wierzchołki to oczy, a trzeci wierzchołek to przybliżone położenie bregmy (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
		<li>Z bregmy przesunąć igłę 2 mm bocznie i 1 mm ogonowo do miejsca wstrzyknięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trzymając igłę pionowo, mocno wepchnij igłę przez skórę i kość, aż rurka zrówna się ze skórą.</li>
	<li>Wycofać igłę, obrócić igłę i ponownie przecisnąć się przez skórę i kość. Powtarzaj proces, aż w kości utworzy się mały otwór.</li>
	<li>Użyj igły, aby sprawdzić, czy w kości została wykonana wystarczająca. Staraj się zrobić otwór w kości wystarczająco duży, aby igła mogła przez niego przejść.</li>
	<li>Wyjmij mysz ze stożka nosowego, oczyść krew z miejsca wstrzyknięcia sterylną gazą i umieść mysz w klatce na podgrzewaczu do czasu przebudzenia. Ponieważ otwór wykonany przez kraniotomię jest mały (igła 18 G), miejsce to nie musi być zamykane szwem lub klipsami do ran. 
	UWAGA: Otwór wykonany w tym miejscu jest mały (18 G), dlatego wiele instytucji uważa tę procedurę za zastrzyk, a nie operację. Co więcej, chociaż przez skórę i kości do mózgu powstaje otwór, utrzymywanie napiętej skóry powoduje, że otwory nie są wyrównane, co prawdopodobnie pomaga w zapobieganiu kontaktowi flory skórnej lub ściółki klatki z mózgiem.</li>
</ol>
2. Wykonanie iniekcji
<ol>
	<li>Przygotować materiały do wstrzyknięcia zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Umieść czystą podkładkę stołową lub materiał do układania na powierzchni roboczej. Przyklej stożek nosowy waporyzatora izofluranu do powierzchni roboczej (blisko, ale odwrócony od eksperymentatora; patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Założyć igłę o długości 10 mm i nachylenie 27° do szklanej strzykawki o pojemności 5 μl. Umieścić rurkę silastyczną na igle tak, aby wystawało 3,5 mm końcówki igły; użyj taśmy laboratoryjnej, aby przymocować rurkę do korpusu strzykawki (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
		<li>Przygotować podłoże do wstrzykiwań (lek, wirus lub inny płyn do wstrzykiwań) w probówce. Aby uzyskać reprezentatywne wyniki w tym badaniu, wstrzyknięto sterylną izotoniczną sól fizjologiczną. 
		UWAGA: Wybierz probówkę, która umożliwia dostęp szklaną strzykawką i igłą, taką jak probówka do mikrowirówki o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Pobrać 3 μl pożywki do wstrzykiwań do szklanej strzykawki. Najpierw należy pobrać więcej niż żądana objętość i wyrzucać, aż w strzykawce pozostanie 3 μl.</li>
		<li>Zebrać peeling jodowy, jałową gazę i waciki nasączone alkoholem w celu przygotowania miejsca wstrzyknięcia.</li>
		<li>Uruchom minutnik laboratoryjny w trybie odliczania i umieść minutnik tak, aby był widoczny dla eksperymentatora podczas wykonywania zastrzyków.</li>
		<li>Ćwicz przesuwanie igły 2 mm bocznie i 1 mm ogonowo, tak jak poprzedniego dnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować mysz do wstrzyknięcia w sposób opisany poniżej.
	<ol>
		<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej i znieczulij ją izofluranem. Gdy odruch palców u nóg zniknie, nałóż smar do oczu i umieść mysz na powierzchni roboczej z głową w stożku nosowym.</li>
		<li>Oczyścić miejsce wstrzyknięcia trzema chusteczkami nasącymi z jodu i alkoholu. Zidentyfikować miejsce wstrzyknięcia za pomocą igły 18 G (lub igły) zgodnie z opisem w punkcie 1.8. powstała podczas kraniotomii powinna być wykrywalna. 
		UWAGA: Jeśli kraniotomia nie została wykonana wcześniej lub jeśli otwór w czaszce nie jest wykrywalny, kraniotomię można wykonać tutaj.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknięcie należy wykonać szklaną strzykawką w sposób opisany poniżej.
	<ol>
		<li>Mocno chwyć głowę myszy ręką niedominującą. Ustaw głowę tak płasko na powierzchni roboczej, jak to możliwe.</li>
		<li>Umieścić igłę szklanej strzykawki przez otwór w czaszce, aż rurka umieszczona na igle przygotowanej w kroku 2.1.2 spocznie na skórze myszy.</li>
		<li>Trzymać strzykawkę tak pionowo, jak to możliwe, zwracając uwagę zarówno na płaszczyznę czołową, jak i strzałkową. Powoli wstrzykiwać pożywkę przez 1 minutę.</li>
		<li>Trzymać strzykawkę i igłę na miejscu przez kolejną minutę po zakończeniu wstrzyknięcia, aby zminimalizować przepływ wsteczny. Powoli wycofaj igłę z główki myszy.</li>
		<li>Wyjmij mysz ze stożka nosowego, oczyść krew z miejsca wstrzyknięcia sterylną gazą (jeśli jest obecna) i umieść mysz w klatce na podgrzewaczu do czasu przebudzenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Potwierdzanie miejsca wstrzyknięcia
<ol>
	<li>Głęboko znieczulij i przeprowadź perfuzję myszy solą fizjologiczną i 4% paraformaldehydem w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), jak wcześniej opisano8. Przechowuj mózg w 30% sacharozie w PBS w temperaturze 4 °C, aż mózg zatonie (zwykle 2 dni).</li>
	<li>Wytnij 20-50 μm przekroje koronalne na kriostacie, jak opisano wcześniej9. Podczas cięcia należy obserwować drogę iniekcji w bloku tkankowym. Odnotować, czy droga iniekcyjna wyraźnie przecina komorę boczną.</li>
</ol>

Performing Intracerebroventricular Injection in Mice Using a Free-Hand Approach

<ol><li>Roseweir, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+potent+kisspeptin+antagonists+delineate+physiological+mechanisms+of+gonadotropin+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation.</a> Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).</li>
<li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51863(2014).</li>
<li>Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+intracerebroventricular+injection+of+CD4%28%2B%29+T+cells+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100725(2021).</li>
<li>Russo, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+control+of+the+female+reproductive+axis+through+gated+responsiveness+of+the+RFRP-3+system+to+VIP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling.</a> Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).</li>
<li>Laursen, S. E., Belknap, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+injections+in+mice.+Some+methodological+refinements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+Methods%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements.</a> Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).</li>
<li>Haley, T. J., McCormick, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+effects+produced+by+intracerebral+injection+of+drugs+in+the+conscious+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse.</a> British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).</li>
<li>McCosh, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-induced+hypoglycaemia+suppresses+pulsatile+luteinising+hormone+secretion+and+arcuate+Kiss1+cell+activation+in+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice.</a> Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813(2019).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>Comba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+glioma+subregions+for+spatial+and+molecular+characterization+of+intratumoral+heterogeneity%2C+oncostreams%2C+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion.</a> Journal of Visual Experiments. (158), e60939(2020).</li>
<li>Porteous, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reformulation+of+PULSAR+for+analysis+of+pulsatile+LH+secretion+and+a+revised+model+of+estrogen-negative+feedback+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice.</a> Endocrinology. 162 (11), (2021).</li>
<li>Hohmann, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+melanocortins+in+mediating+leptin%27s+central+effects+on+feeding+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Regulatory%2C+Integrative%2C+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Differential role of melanocortins in mediating leptin's central effects on feeding and reproduction.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).</li>
<li>Gottsch, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+kisspeptins+in+the+regulation+of+gonadotropin+secretion+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse.</a> Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).</li>
<li>Krasnow, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+galanin-like+peptide+in+the+integration+of+feeding%2C+body+weight+regulation%2C+and+reproduction+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse.</a> Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj opisano prosty i skuteczny sposób wykonywania zastrzyków ICV u myszy. Ponieważ technika ta nie wymaga ramy stereotaktycznej, to podejście do centralnego dostarczania leków i środków eksperymentalnych jest dostępne dla większej liczby badaczy. Dodatkowo takie podejście charakteryzuje się stosunkowo wysoką przepustowością, ponieważ procedurę przygotowania i iniekcji można przeprowadzić szybko.
Ponieważ procedura ta wymaga ręcznego manipulowania igłami i szklaną strzykawką przy użyciu przyb...

Dostarczanie do mózgu czynników eksperymentalnych, takich jak leki1, wirusy2, lub komórki3, do mózgu jest często konieczne do badań neuroendokrynnych. Jeśli środek nie przenika łatwo przez barierę krew-mózg lub celem eksperymentalnym jest specyficzne przetestowanie centralnego działania środka, ważne jest, aby mieć wiarygodną metodę dostarczania zastrzyków do mózgu. Co więcej, wstrzyknięcie do przestrzeni śródmózgowej (ICV) daje możliwość szerokiego rozprowadzenia środka w mózgu i zapewnia duży obszar docelowy, zwiększając w ten sposób prawdopodobieństwo udanego wstrzyknięcia2. 
Powszechna metoda wykonywania iniekcji ICV polega na umieszczeniu na stałe stałej kaniuli. W tym podejściu rama stereotaktyczna jest niezbędna do umieszczenia dostępnej na rynku lub wykonanej na zamówienie kaniuli, ponieważ kaniula jest klejona lub cementowana na miejscu. Często, po wyzdrowieniu, suprafizjologiczna dawka angiotensyny II jest podawana przez kaniulę, a jeśli natychmiast obserwuje się zachowanie związane z piciem, kaniulę uważa się za prawidłowo umieszczoną4. Takie podejście ma wiele zalet, w tym możliwość wykonywania długotrwałej infuzji i możliwość wielokrotnego wstrzykiwania tego samego zwierzęcia; dodatkowo, jeśli stosuje się angiotensynę II, prawidłowe umieszczenie można potwierdzić przed podaniem eksperymentalnych związków. Istnieją jednak pewne ograniczenia w umieszczaniu kaniuli na stałe, w tym wymóg drogiego sprzętu (rama stereotaktyczna), możliwość uszkodzenia kaniuli po umieszczeniu (np. myszy mogą żuć kaniulę partnera w klatce) oraz możliwość infekcji wokół stałej kaniuli. Pojedyncze iniekcje ICV mogą być wykonywane przy użyciu stereotaktycznego frame3, który, choć skuteczny, wymaga znacznej ekspozycji na znieczulenie, a tym samym może zaciemnić niektóre ostre fizjologiczne i behawioralne skutki leczenia. Dodatkowo, umieszczenie myszy w ramie stereotaktycznej wymaga znacznego treningu, aby osiągnąć stabilne umiejscowienie i zapobiec pęknięciu kanałów słuchowych.
Tutaj opisana jest sprawdzona metoda wykonywania zastrzyków z wolnej ręki u myszy. Ta metoda jest oparta na poprzednich raportach5,6. Zaletą tej techniki jest to, że jest prosta, szybka i nie wymaga specjalistycznego sprzętu, takiego jak rama stereotaktyczna. Jak opisano poniżej, procedura ta polega na manipulowaniu szklaną strzykawką względem punktów orientacyjnych na głowie myszy w celu wykonania zastrzyków, które można wykonać szybko, a zatem wymaga tylko kilku minut znieczulenia gazowego w dniu eksperymentu.

<table><tbody><tr><td>Igły 18G</td><td>SAI Infusion</td><td>B18-150</td><td></td></tr><tr><td>Igły o rozmiarze 18 BD</td><td>Medical</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki nasączone alkoholem</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka pod ławkę</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-206-62AC22</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór betadyny</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1696484</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Patterson Vet Supply</td><td>07-892-5235</td><td>Substancja kontrolowana</td></tr><tr><td>Eyelube</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-218-8442</td><td></td></tr><tr><td>Szklana strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>7634-01</td><td></td></tr><tr><td>Igła do wstrzykiwań</td><td>Hamilton</td><td>7803-01</td><td>o rozmiarze 27, Mała igła Hub RN, styl punktowy: 4, Długość igły: 10 cm, Kąt: 45</td></tr><tr><td>Izofluran&nbsp; &nbsp;</td><td>Patterson Vet Supply</td><td>07-893-8441</td><td></td></tr><tr><td>Waporyzator izofluranowy</td><td>Vet Equip</td><td>V-10</td><td></td></tr><tr><td>Taśma laboratoryjna</td><td>VWR</td><td>89098-128</td><td></td></tr><tr><td>Tlen klasy medycznej</td><td></td><td>Airgas OX USPEA</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Millipore-Sigma</td><td>8.18715.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Fisher Scientific</td><td>J67802. K2</td><td></td></tr><tr><td>PulsaR</td><td>Software Open source, University of Otago</td><td></td><td>Patrz ref 9</td></tr><tr><td>Ruler</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-00-152</td><td></td></tr><tr><td>Rurki Silastic (0,040" ID)</td><td>DOW</td><td>508-005</td><td></td></tr><tr><td>Rurki krzemiastyczne (średnica wewnętrzna 0,078")</td><td>DOW</td><td>508-009</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny sól fizjologiczna</td><td>VWR</td><td>101320-574</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr></tbody></table>

iniekcje domózgowo-komorowe z wolnej ręki u myszy

Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice

Badanie układów neuroendokrynnych często wymaga dostarczania leków, wirusów lub innych eksperymentalnych środków bezpośrednio do mózgów myszy. Wstrzyknięcie do komory mózgowej (ICV) umożliwia szerokie dostarczanie eksperymentalnego czynnika do całego mózgu (szczególnie w strukturach w pobliżu komór). W tym miejscu opisano metody wykonywania wstrzyknięć ICV z wolnej ręki u dorosłych myszy. Wykorzystując wizualne i dotykowe punkty orientacyjne na głowach myszy, zastrzyki do komór bocznych mogą być wykonywane szybko i niezawodnie. Zastrzyki wykonuje się szklaną strzykawką trzymaną w dłoni eksperymentatora i umieszczaną w przybliżonej odległości od punktów orientacyjnych. W związku z tym technika ta nie wymaga ramy stereotaktycznej. Co więcej, technika ta wymaga jedynie krótkiego znieczulenia izofluranem, co pozwala na późniejszą ocenę zachowania i/lub fizjologii myszy u przytomnych, swobodnie zachowujących się myszy. Wstrzyknięcie ICV z wolnej ręki jest potężnym narzędziem do skutecznego dostarczania środków eksperymentalnych do mózgów żywych myszy i może być łączone z innymi technikami, takimi jak częste pobieranie krwi, manipulacja obwodami neuronalnymi lub rejestracja in vivo w celu zbadania procesów neuroendokrynnych.

Prawidłowe wykonanie tej techniki pozwala na szybkie wprowadzenie czynnika eksperymentalnego do układu komorowego. Profil pulsacji hormonu luteinizującego (LH) u myszy po owariektomii, która otrzymała wtrysk ICV 3 µL sterylnej soli fizjologicznej (nośnika wielu związków farmakologicznych), przedstawiono na Rysunku 2A. Przykład ten pokazuje, że krótka ekspozycja na anestezję gazową oraz samo wstrzyknięcie 3 µL płynu do układu komorowego nie zmieniły pulsacyjnego wydzielania LH. W 3 h po wtrys...

Tutaj opisane jest proste i szybkie podejście do wykonywania iniekcji domózgowo-komorowych u myszy metodą wolnej ręki (czyli bez urządzenia stereotaktycznego).

Iniekcje domózgowo-komorowe z wolnej ręki u myszy

The investigation of neuroendocrine systems often requires the delivery of drugs, viruses, or other experimental agents directly into the brains of mice. ...

Interesuje nas neuronalna kontrola funkcji rozrodczych, a w szczególności to, jak mózg reguluje uwalnianie hormonów kontrolujących gonady, zarówno w zdrowych warunkach, jak i w odpowiedzi na stres. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest stosunkowo prosta i szybka. Dostarczanie leków do komory bocznej to świetny sposób na zarzucenie szerokiej sieci w testowaniu szlaku sygnałowego w celu wsparcia bardziej szczegółowych eksperymentów kontrolnych.Wciąż jest wiele do nauczenia się na temat neuroendokrynnej kontroli rozrodczości, w tym molekularnych mechanizmów generowania impulsów hormonu luteinizującego, mechanizmów modulowania częstotliwości impulsów podczas stresu i generowania przedowulacyjnej wyrzutu LH. W przyszłości jesteśmy szczególnie zainteresowani integracją rozbieżnych wyników w modelach. Zacznij od przygotowania się do kraniotomii, kładąc czystą podkładkę na stole na powierzchni roboczej.Przyklej stożek nosowy waporyzatora izofluranu do powierzchni roboczej. Następnie umieść rurkę silastyczną na końcu igły o rozmiarze 18, upewniając się, że wystaje 1 milimetr końcówki igły. Ćwicz ruch igły, zaznaczając kartkę papieru punktem początkowym dla bregmy, kolejne 0,2 milimetr

free-hand-intracerebroventricular-injections-in-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisany w niniejszym protokole model wstrzykiwania autologicznej krwi w celu wywołania krwotoku wewnątrzczaszkowego u myszy wykorzystuje technikę podwójnego wstrzyknięcia, aby zminimalizować ryzyko refluksu krwi wzdłuż kanału igły, nie stosuje przeciwkrzepliwych w systemie pompowania oraz eliminuje całą przestrzeń martwą i rozszerzalne przewody w układzie.

Wtryskiwanie autologicznej krwi w celu modelowania spontanicznego krwotoku wewnątrzczaszkowego u myszy

W niniejszym artykule zaprezentowano dwie bardzo różne metody iniekcji: 1) do mózgu (do komór mózgu) oraz 2) systemową (dożylną), w celu wprowadzenia czynników terapeutycznych do ośrodkowego układu nerwowego noworodków myszy.

Podawanie substancji terapeutycznych poprzez wstrzyknięcia dopłaczkowe (ICV) i dożylne (IV) u myszy

Ten film pokazuje wstrzyknięcie domózgowo-komorowe za pośrednictwem ommaya na modelu mysim. Metoda umożliwia miejscowe dostarczanie potencjalnych kandydatów na leki i omija barierę krew-mózg.

Wstrzyknięcie do komory mózgowej u myszy: metoda bezpośredniego podawania leków za pośrednictwem firmy Ommaya w celu dostarczania leków do komór mózgowych mózgu myszy

Źródło: Li, D., et al. Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę dokanałowego wstrzykiwania wirusów związanych z adenowirusem (AAV) do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) obudzonej myszy, obejmującą przygotowanie strzykawki, wyrównanie kręgosłupa i precyzyjne wprowadzenie igły. Metoda ta weryfikuje celowane dostarczanie genów, potwierdzając jej potencjał w terapiach OUN.

Dokanałowe podawanie wirusów w modelu mysim w leczeniu chorób ośrodkowego układu nerwowego

Źródło: Liou, C. et al. Domózgowo-komorowe dostarczanie metabolitów mikrobiologicznych pochodzących z jelit u swobodnie poruszających się myszy. J. Vis. Exp. (2022).Ten film pokazuje wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA) swobodnie poruszającej się myszy w celu zbadania ich wpływu na zachowanie za pośrednictwem mózgu. Kaniula iniektorowa jest wprowadzana do kaniuli prowadzącej wszczepionej do mózgu myszy. Po wyzdrowieniu mysz aklimatyzuje się w nowej...

Wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie metabolitów mikrobiologicznych pochodzących z jelit w modelu mysim

Tutaj demonstrujemy technikę rozległej transdukcji neuronalnej poprzez dokomorowe wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do mózgu noworodka myszy.  Metoda ta zapewnia szybki i łatwy sposób na osiągnięcie trwającej całe życie ekspresji transgenów dostarczanych przez wirusa.

Śródmózgowe wstrzyknięcie wirusa do mózgu nowonarodzonego myszy w celu trwałej i rozległej transdukcji neuronalnej

Zwierzęce modele chorób dziecięcych mogą doświadczyć wczesnego początku i agresywnego postępu choroby. Klinicznie istotne podanie terapii młodym modelom myszy może być technicznie trudne. Protokół ten opisuje nieinwazyjną metodę wstrzykiwań dożylnych dla nowonarodzonych myszy w ciągu pierwszych dwóch dni życia po urodzeniu.

Wstrzyknięcia dożylne u nowonarodzonych myszy

Tutaj opisujemy prostą metodę domózgowego i wewnątrznaczyniowego wstrzykiwania cząsteczek wirusa lub fluorescencyjnych mikrogranulek do mózgu noworodka myszy. Wzorzec lokalizacji wirusa i nanocząstek można wykryć za pomocą oceny mikroskopowej lub hybrydyzacji in situ.

Domózgowo-komorowe i wewnątrznaczyniowe wstrzykiwanie cząstek wirusowych i mikrogranulek fluorescencyjnych do mózgu noworodka

Opisujemy tutaj protokół mikroiniekcji do mózgu gryzonia, który wykorzystuje igły kwarcowe. Igły te nie powodują wykrywalnych uszkodzeń tkanek i zapewniają niezawodne dostarczanie nawet w głębokich obszarach. Co więcej, mogą być dostosowywane do potrzeb badawczych poprzez spersonalizowane projekty i mogą być ponownie wykorzystywane.

Spersonalizowane igły do mikroiniekcji w mózg gryzoni

Metabolity mikrobiologiczne pochodzące z jelit mają wieloaspektowe działanie, prowadząc do skomplikowanych zachowań u zwierząt. Naszym celem jest opracowanie metody krok po kroku, która pozwoli określić wpływ metabolitów mikrobiologicznych pochodzenia jelitowego na mózg poprzez dostarczanie domózgowo-komorowe za pomocą kaniuli prowadzącej.

Domózgowo-komorowe dostarczanie metabolitów mikrobiologicznych pochodzenia jelitowego u swobodnie poruszających się myszy

Atakie rdzeniowo-móżdżkowe poliglutaminowe są spowodowane ekspansjami CAG prowadzącymi do tworzenia białek predysponowanych do agregacji. Ten protokół opisuje produkcję wektorów, stereotaksyczne wprowadzenie oraz analizę inkluzji i utraty markerów neuronowych, zapewniając kontrolowaną platformę do badania mechanizmów i oceny ukierunkowanych terapii chorób neurodegeneracyjnych.

Choroba zwojów wzrokowych wywołana wirusem lentywirusowym jako prekliniczny model poliglutaminowyej rdzeniowo-móżdżkowej ataksji

Naucz się techniki iniekcji domózgowo-komorowych z wolnej ręki u myszy bez użycia urządzenia stereotaktycznego. Ta metoda umożliwia szybkie dostarczanie substancji do komory bocznej w badaniach neuroendokrynologii reprodukcji.

Iniekcje domózgowo-komorowe z wolnej ręki u myszy

Przeglądaj więcej filmów