Obrazowanie ATG9A, wielozakresowego białka błonowego

W naszym laboratorium jesteśmy zainteresowani zrozumieniem, które lipidy i mechanizmy białkowe są zaangażowane w transport pęcherzyków ATG9A. ATG9A ma kluczowe znaczenie w szlaku autofagii dla tworzenia i dojrzewania fagoforu. Jednak ostatnio badaliśmy wpływ ATG9A na homeostazę organelli.

Największym wyzwaniem jest odkrycie molekularnych szczegółów funkcjonowania białek i maszynerii białkowych. Technologie takie jak inżynieria białkowa oparta na fałdowaniu alfa i krio-EM in situ o wysokiej rozdzielczości zapewniają obecnie największe postępy. Praca w moim laboratorium zapewniła fundamentalny wgląd w to, jak powstają autofagosomy.

Spostrzeżenia te zostały poparte zaawansowanymi technikami biologii molekularnej komórki, takimi jak ta opisana tutaj. Opisujemy niektóre wady używania niektórych znaczników białkowych i to, jak zachowanie ATG9A może się zmieniać w zależności od lokalizacji znacznika, a więc albo N, albo C-końca. Podpowiadamy również, jak wykryć te wady i jak ich uniknąć.

Oprócz tego zapewniamy również przepływ pracy polegający na ilościowym określaniu dyspersji ATG9A w powtarzalny sposób. Tutaj zapewniamy przepływ pracy od immunofluorescencji i obrazowania na żywo po akwizycję i analizę obrazu w celu analizy dyspersji ATG9A między różnymi przedziałami komórkowymi. Uważamy, że standaryzacja potoków do analizy obrazu jest priorytetem dla biologów komórkowych, aby móc zwiększyć ich wiarygodność i odtwarzalność naszych wyników.

Na początek komórki HEK293A nasiennej na szklanej pokrywie umieszcza się na 24-dołkowej płytce zawierającej DMEM o wysokiej zawartości glukozy, aż staną się zlewające się w 80%. Następnego dnia głodz komórki przez dwie godziny w zrównoważonym roztworze soli Earle'a. Po zabiegu odessać pożywkę i dodać 500 mikrolitrów 4% roztworu formaldehydu do PBS i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia komórek.

Po utrwaleniu zastąp roztwór formaldehydu 500 mikrolitrami PBS. Następnie wygasić wolną grupę aldehydową, dodając 500 mikrolitrów 50-milimolowego roztworu chlorku amonu w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Zastąp roztwór chlorku amonu 500 mikrolitrami roztworu digitoniny o stężeniu 50 mikrogramów na mililitr w PBS przez pięć minut, aby przeniknąć do komórek.

Po przepuszczalności zastąp roztwór digitoniny 500 mikrolitrami PBS, powtarzając trzykrotne płukanie PBS. Po ostatnim myciu inkubować komórki w 500 mikrolitrach roztworu blokującego przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji zastąp roztwór blokujący 500 mikrolitrami PBS.

Następnie za pomocą pęsety zbierz szkiełka nakrywkowe ze studzienki i usuń nadmiar PBS za pomocą cienkich chusteczek higienicznych. W wilgotnej komorze delikatnie połóż szkiełko nakrywkowe stroną z komórkami do dołu na 50-mikrolitrowej kropli roztworu przeciwciała pierwotnego. Inkubować komórki w wilgotnej komorze przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji zebrać szkiełka nakrywkowe i odsączyć nadmiar roztworu przeciwciał pierwszorzędowych. Umieść szkiełka pokrywy z powrotem w 24-dołkowej płytce komórką do góry i umyj je trzykrotnie PBS. Po ostatnim praniu zbierz szkiełka nakrywkowe i odcedź nadmiar PBS.

Przed umieszczeniem każdego szkiełka nakrywkowego stroną z komórką do dołu na 50-mikrolitrowej kropli roztworu przeciwciał wtórnych, inkubować w wilgotnej komorze przez godzinę. Po inkubacji odcedzić nadmiar roztworu przeciwciał drugorzędowych i trzykrotnie przemyć szkiełko nakrywkowe 500 mikrolitrami PBS na płytce 24-dołkowej. Po odsączeniu nadmiaru PBS umieść każde szkiełko nakrywkowe stroną z komórkami do dołu na 50-mikrolitrowej kropli roztworu Hooke'a rozcieńczonej od jednego do 4 000 w PBS w wilgotnej komorze.

Inkubować w wilgotnej komorze przez pięć minut. Następnie usuń nadmiar roztworu Hooke'a i umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy PBS i raz wodą dejonizowaną w 24-dołkowej płytce. Po spuszczeniu nadmiaru wody dejonizowanej umieść każde szkiełko nakrywkowe na kropli roztworu montażowego o pojemności od 10 do 20 mikrolitrów narysowanej na szkiełku mikroskopowym, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza.

W przypadku obrazowania żywych komórek konstruktów ATG9A, wysiewaj HEK293A komórki w dwóch mililitrach DMEM o wysokiej zawartości glukozy do 60-milimetrowej naczynie do hodowli tkankowej, aż osiągną konfluencję od 65 do 70%. Następnego dnia przygotuj i dodaj mieszaninę lipofektaminy DNA do płytki do hodowli komórkowej zawierającej cztery mililitry pożywki wzrostowej i delikatnie kołysz płytką w przód iw tył, aby równomiernie rozprowadzić mieszankę. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 10% dwutlenku węgla.

Po czterech godzinach transfekcji zastąp pożywkę wzrostową świeżą pożywką i inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 10% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia trypsynizuj komórki, dodając trypsynę EDTA. Następnie policz oderwane komórki i ponownie zasiej je na szalce hodowlanej nadającej się do żywej mikroskopii przez noc.

Następnego dnia zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego. W warunkach podstawowych ATG9A jest głównie zlokalizowany w sieci Golgiego, na co wskazuje immunofluorescencja endogennego białka i pokrywa się z GM130, markerem cis-Golgiego. eGFP-N oznaczone terminalnie ATG9A i mRFP-N terminalnie oznaczone ATG9A były mniej zlokalizowane w Golgi i znajdowały się głównie w pęcherzykach.

W przeciwieństwie do tego, ATG9A oznaczone ostatecznie eGFP-C jest bardziej podatne na agregację w komórce. Fuzja sekwencji 3xFLAG między N-końcowym fluoroforem a ATG9A pomogła nadekspresji białka zachowywać się podobnie do endogennego. Nadekspresja mCherry3xFLAG-ATG9A kolokalizuje się z markerem Golgiego GM130 w warunkach karmienia.

Ta lokalizacja i przedział pęcherzykowy ATG9A zostały zachowane w czasie, co pozwoliło na przestrzenne badanie czasowe transportu ATG9A.