Name: Obrazowanie ATG9A, wielozakresowego białka błonowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Poznaj techniki obrazowania ATG9A w komórkach HEK293A w celu badania autofagii i homeostazy organelli. Metoda ta umożliwia analizę lokalizacji białka i dynamiki pęcherzyków w komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Rocco D'Antuono za korektę manuskryptu, a także wszystkim obecnym i byłym członkom laboratorium Molecular Cell Biology of Autophagy (MCBA) za dyskusje, które doprowadziły do udoskonalenia tych protokołów. A. v.V., S.d.T., E.A., S.A.T, były wspierane przez Instytut Francisa Cricka, który otrzymuje swoje główne fundusze od Cancer Research UK (CC2134), Brytyjska Rada ds. Badań Medycznych (CC2134). Badania te zostały sfinansowane w całości lub w części przez Wellcome Trust (CC2134). Dla celów otwartego dostępu autor zastosował publiczną licencję CC BY na podstawie praw autorskich do każdej wersji Manuskryptu zaakceptowanej przez Autora powstałej w wyniku tego zgłoszenia.

Wszystkie odczynniki użyte w tym badaniu są dostępne na rynku, z wyjątkiem konstruktów DNA ATG9A i domowego przeciwciała STO-215 (zobacz Tabelę Materiałów), które są dostępne na życzenie. Opisane tutaj narzędzia analityczne są oparte na oprogramowaniu typu open source (FIJI/ImageJ)18.
1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Utrzymuj HEK293A komórek w kolbie poddanej hodowli tkankowej T150 do 80%-90% konfluencji w DMEM o wysokiej zawartości glukozy (Dulbecco's Modified Eagle Medium) uzupełnionym 10% FBS (płodowa surowica bydlęca) i 4 mM L-glutaminy (patrz tabela materiałów). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 10% CO2, 
	UWAGA: Komórki HEK293A są używane w niniejszym badaniu, ponieważ mają silną kanoniczną odpowiedź autofagii na głód aminokwasów, który jest w szczególności wykrywany przez wzrost lipidowanego, związanego z błoną LC31,9,19 i nadają się do obrazowania.</li>
	<li>Przejść przez przejście komórek przez zasysanie pożywki z kolby za pomocą pipety serologicznej. Umyj komórki raz 15 ml 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem) lub podobnym roztworem przed dodaniem 2 ml roztworu Trypsyna-EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) w celu odłączenia komórek. Zbierz oderwane komórki za pomocą 8 ml DMEM i zasiej z powrotem pewną liczbę komórek, tak aby po 2 dniach osiągnięto zbieżność 80%-90% dla opisanych tutaj eksperymentów.</li>
</ol>
2. Endogenne barwienie ATG9A
<ol>
	<li>Nasiona HEK293A komórek (lub komórek z wyboru) na sterylnych szkiełkach nakrywkowych nr 1,5 umieszczonych na 24-dołkowej płytce tak, aby następnego dnia zlewały się w ~80%. Zazwyczaj daje to 7 x 104 komórek/studzienkę w 500 μl DMEM. 
	UWAGA: W przypadku komórek HEK293A lub innych luźno przylegających linii komórkowych szkiełka nakrywkowe należy pokryć poli-D-lizyną w stężeniu 0,1 mg/ml w wodzie dejonizowanej. Dodać 500 μl poli-D-lizyny (patrz tabela materiałów) na wierzch szkiełek nakrywkowych umieszczonych w studzienkach na 10 minut w temperaturze pokojowej (RT), a następnie trzy płukania wodą dejonizowaną i ostatnie płukanie w DMEM. Przystąp do wysiewu komórek po powlekaniu i upewnij się, że są równomiernie rozłożone w naczyniu hodowlanym.</li>
	<li>Traktuj komórki zgodnie z określonymi warunkami eksperymentalnymi (tj. głód przez 2 godziny w EBSS [Earle's Balanced Salt Solution]). 
	UWAGA: Skład EBSS to 1 g/L D-glukozy, 6,8 g/L NaCl, 0,4 g/L KCl, 0,151 g/L CaCl2,2H 2O, 0,2 g/L mM MgSO, 4,7H2O, 0,124 g/L NaH2HPO4,2H 2O i 2,2 g/L NaHCO3 (patrz tabela materiałów) rozpuszczone w wodzie destylowanej.</li>
	<li>Odessać pożywkę i ostrożnie zastąpić ją 500 μl 4% roztworu formaldehydu w PBS uzupełnionym 0,1 mM CaCl2 i 0,1 mM MgCl2 przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia komórek.</li>
	<li>Odessać 4% roztwór formaldehydu z każdej studzienki, zastępując go 500 μl PBS. Powtórz ten krok prania trzy razy. Nie pozwól, aby szkiełka nakrywkowe wyschły lub pozostały bez płynu.</li>
	<li>Stłumić wolne grupy aldehydowe przy użyciu 500 μl 50 mM roztworu NH4Cl w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać PBS i zastąpić go 500 μl roztworu digitoniny o stężeniu 50 μg/ml w PBS (roztwór podstawowy 1 mg/ml w wodzie dejonizowanej, patrz Tabela materiałów) przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu przepuszczalności komórek.</li>
	<li>Odessać roztwór digitoniny z każdej studzienki i zastąpić go 500 μl PBS. Powtórz ten krok prania trzy razy.</li>
	<li>Odessać PBS z każdej studzienki i zastąpić ją 500 μl roztworu blokującego (5% BSA [albumina surowicy bydlęcej] rozcieńczona w PBS) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać roztwór blokujący i zastąpić go 500 μl PBS.</li>
	<li>Za pomocą pęsety zbierz szkiełka nakrywkowe z dołka, ostrożnie usuń nadmiar roztworu PBS za pomocą cienkich chusteczek higienicznych lub celulozowej bibuły filtracyjnej i delikatnie połóż każde szkiełko nakrywkowe, stroną z komórkami do dołu, na 50 μl kropli roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (np. chomik ormiański 14F2 rozcieńczony do 0,9 μg/ml w 1% roztworze BSA/PBS, patrz tabela materiałów). Inkubować w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze RT. 
	UWAGA: W celu łatwej obsługi, krople roztworu przeciwciał można umieścić na arkuszu samouszczelniającej się folii termoplastycznej (patrz Tabela materiałów) w innym pojemniku zamiast bezpośrednio na twardej powierzchni.</li>
	<li>Zebrać szkiełka nakrywkowe za pomocą pęsety i, po delikatnym odsączeniu nadmiaru roztworu przeciwciała pierwszorzędowego za pomocą cienkich chusteczek tkankowych, umieścić szkiełka nakrywkowe (komórką do góry) na płytce 24-dołkowej i umyć je trzykrotnie PBS.</li>
	<li>Powtórz krok 2.10. Za pomocą pęsety zbierz szkiełka nakrywkowe z każdej studzienki, ostrożnie odsączając nadmiar PBS za pomocą cienkich chusteczek higienicznych, i delikatnie połóż każde szkiełko nakrywkowe (stroną komórkową do dołu) na 50 μl kropli roztworu przeciwciał wtórnych rozcieńczonego w stosunku 1:1000 w 1% roztworze BSA/PBS (np. Cy3 Goat Anti-Armenian Hamster IgG, który ma minimalną reaktywność krzyżową z bydłem, białka surowicy ludzkiej, myszy, królika i szczura, patrz tabela materiałów). Inkubować w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze RT. 
	UWAGA: Opcjonalnie: Oprócz przeciwciała drugorzędowego można użyć markera cytoszkieletu do późniejszej analizy obrazu (tj. Alexa Fluor 647 Phalloidin rozcieńczony w stosunku 1:1,000, patrz Tabela materiałów). Aby ułatwić obsługę, krople roztworu przeciwciał można umieścić na arkuszu folii uszczelniającej w innym pojemniku, a nie bezpośrednio na twardej powierzchni.</li>
	<li>Zebrać szkiełka nakrywkowe za pomocą pęsety i po odsączeniu nadmiaru roztworu przeciwciał wtórnych umieścić szkiełka nakrywkowe na płytce 24-dołkowej (komórką do góry) i przemyć je trzykrotnie 500 μl PBS.</li>
	<li>Za pomocą pęsety zbierz szkiełka nakrywkowe, ostrożnie odsączając nadmiar PBS za pomocą cienkich chusteczek higienicznych i delikatnie połóż każde szkiełko nakrywkowe (komórką do dołu) na 50 μl kropli roztworu Hoechsta w stosunku 1:4 000 (Hoechst 33342) w PBS. Inkubować w komorze wilgotnościowej przez 5 minut w temperaturze RT. 
	UWAGA: Aby ułatwić obsługę, krople roztworu przeciwciał można umieścić na arkuszu folii uszczelniającej w innym pojemniku zamiast bezpośrednio na twardej powierzchni.</li>
	<li>Zebrać szkiełka nakrywkowe za pomocą pęsety i po delikatnym odsączeniu nadmiaru roztworu Hoechst za pomocą cienkich chusteczek chusteczkowych, umieścić szkiełka nakrywkowe w płytce 24-dołkowej i przemyć trzykrotnie PBS i raz wodą dejonizowaną (500 μl na pranie).</li>
	<li>Ostrożnie spuść nadmiar dejonizowanej wody za pomocą cienkich chusteczek higienicznych i delikatnie połóż każde szkiełko nakrywkowe (komórką do dołu) na kropli 10-20 μl roztworu montażowego (patrz Tabela materiałów) naniesionej na szkiełko mikroskopowe w celu immunofluorescencji, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza. 
	UWAGA: Zastosowane tutaj podłoże montażowe ma taki sam współczynnik załamania światła jak olejek immersyjny i twardnieje po kilku godzinach w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Można stosować nietwardniejące roztwory montażowe, ale należy zachować ostrożność, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci.</li>
	<li>Usunąć nadmiar roztworu montażowego przez aspirację i pozostawić próbki do wyschnięcia, leżąc płasko w temperaturze pokojowej przez noc w ciemności, w uchwycie na szkiełko lub przykryte folią aluminiową.</li>
</ol>
3. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Włącz mikroskop konfokalny. Otwórz oprogramowanie do obrazowania (patrz Sp. z materiałami), aby rozpocząć konfigurację akwizycji obrazu.</li>
	<li>Na karcie Function (Funkcja) wybierz obiektyw Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27, aby przechwycić obrazy do analizy.</li>
	<li>W zakładce Funkcja akwizycji włącz odpowiednie lasery w strefie Laser Panelu Sterowania (Argon, Diode-405-30, DPSS 561-10 i HeNe633).</li>
	<li>W obszarze Imaging Setup (Ustawienia obrazowania) w Panelu sterowania utwórz cztery ścieżki, z których każda odpowiada jednemu kanałowi, aby przeprowadzić sekwencyjną akwizycję.</li>
	<li>Ustaw odpowiednią rozdzielczość obrazów w oknie Tryb akwizycji. Ustaw rozdzielczość na 1 024 x 1 024 (rozmiar klatki) i wybierz głębię bitową 16 bitów.</li>
	<li>Dla każdego kanału dostosuj moc i wzmocnienie lasera, aby uzyskać dobry sygnał bez nasyconych pikseli, które utrudniałyby analizę intensywności obrazu. Za pomocą przycisku Live (Na żywo) ustaw poziom wyjściowy lasera i Gain (Master). 
	UWAGA: Użycie opcji wskaźnika zasięgu jest zalecane do wykrywania nasyconych pikseli. Utrzymuj moc lasera w zakresie od 1% do 10%, a wzmocnienie (Master) poniżej 850, aby uniknąć szumów tła.</li>
	<li>W strefie Kanały w Panelu sterowania ustaw ten sam otwór otworkowy dla każdego kanału, biorąc pod uwagę 1 jednostkę Airy (AU) dla kanału o najwyższej długości fali.</li>
	<li>Zdobądź 10 losowych pól zawierających podobną liczbę komórek (20-30 komórek na pole). Akwizycja 100-200 komórek na warunek zapewni dobrą moc do późniejszej analizy obrazu.</li>
</ol>
4. Analiza obrazu dyspersji ATG9A
<ol>
	<li>Pobierz oprogramowanie FIJI z Internetu (patrz Spis materiałów). Otwórz obraz za pomocą FIJI, klikając Plugins > Bio-Formats > BioFormats Importer.</li>
	<li>Kliknij Analizuj > Ustaw pomiary, a następnie wybierz Średnią wartość szarości w oknie pomiarów do analizy intensywności.</li>
	<li>Kliknij Obraz > Kolor > Podziel kanały i podziel kanały na trzy obrazy (marker Golgiego, cytoszkielet, sygnał ATG9A).</li>
	<li>Przejdź do opcji Obraz > Dostosuj próg > i zdefiniuj próg w kanale odpowiadający znacznikowi Golgiego.</li>
	<li>Kliknij Edytuj > Zaznaczenie > Utwórz zaznaczenie i utwórz zaznaczenie z obrazu binarnego.</li>
	<li>Przejdź do opcji Edytuj > zaznaczenie > Dodaj do Menedżera > Zmień nazwę (Golgi), zapisz zaznaczenie w menedżerze ROI i zmień jego nazwę na Golgi.</li>
	<li>Kliknij Obraz > Dostosuj próg > i zdefiniuj próg w kanale odpowiadający markerowi cytoszkieletu, aby zdefiniować kontur komórki.</li>
	<li>Przejdź do opcji Edytuj > zaznaczenie > Utwórz zaznaczenie i utwórz zaznaczenie z obrazu binarnego.</li>
	<li>Kliknij Edytuj > zaznaczenie > Dodaj do Menedżera > Zmień nazwę (Suma), zapisz wybór w menedżerze ROI i zmień jego nazwę na Suma.</li>
	<li>Wybierz obraz odpowiadający barwieniu ATG9A.</li>
	<li>W Analizuj > mierz zastosuj ROI Golgi, klikając go, i zmierz intensywność obszaru Golgiego.</li>
	<li>Kliknij Analizuj > mierz, zastosuj całkowity zwrot z inwestycji, klikając na niego, i zmierz intensywność całkowitego regionu.</li>
	<li>Powtórz procedurę na wszystkich obrazach, zapisz wyniki jako pliki .csv i przetwórz dane przy użyciu następującej formuły: 
	Szybkość dyspersji ATG9A = intensywność Golgiego/Całkowita intensywność</li>
</ol>
5. Obrazowanie żywych komórek konstruktów ATG9A
<ol>
	<li>Wysiewaj HEK293A komórki (lub komórki z wyboru) w 2 ml pożywki do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm, aby następnego dnia osiągnęły ~65%-70% konfluencji; zwykle daje to 1 x 106-2 x 106 komórek.</li>
	<li>Następnego dnia należy przygotować mieszaniny lipofetamina:DNA (lub odpowiedni alternatywny odczynnik do transfekcji DNA, patrz Tabela Materiałów) w następujący sposób:
	<ol>
		<li>W zależności od wydajności ekspresji konstruktu, rozcieńczyć 0,5-2 μg plazmidowego DNA w 100 μl odpowiedniego podłoża bez surowicy i delikatnie wymieszać roztwór, pipetując w górę iw dół. Inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze RT. 
		UWAGA: Konstrukt plazmidowego DNA jest specyficzny dla eksperymentu. Badacze mogą klonować samodzielnie lub uzyskać od autorów na żądanie.</li>
		<li>Rozcieńczyć odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000 w stosunku 3:1 Lipofectamina:DNA w 100 μl odpowiedniej pożywki wolnej od surowicy i delikatnie wymieszać roztwór, pipetując w górę i w dół. Inkubuj tę mieszankę przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wymieszać oba roztwory razem, delikatnie pipetując w górę i w dół, a następnie inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj mieszaninę Lipofectamina:DNA do każdej płytki do hodowli komórkowej zawierającej 4 ml pożywki wzrostowej i delikatnie kołysz płytką w przód iw tył, aby równomiernie rozprowadzić mieszankę. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 10% CO2 .</li>
	<li>Zastąp pożywkę świeżą pożywką 4 godziny po transfekcji i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych przy 10% CO2 przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia trypsynizuj, policz i ponownie zasiaj komórki na szalkach hodowlanych odpowiednich do mikroskopii żywych komórek (szalki hodowlane ze szkiełkiem nakrywkowym nr 1,5, patrz Tabela Materiałów). Umieść 0,4 x 10 6-0,7 x 106 komórek na szalkach, aby osiągnąć ~60%-75% konfluencji na szkiełku nakrywkowym w momencie obrazowania. 
	UWAGA: Powlekanie poli-D-lizyną, jak wyjaśniono w kroku 2.1, jest zalecane dla komórek HEK293A.</li>
	<li>Następnego dnia (48 godzin po transfekcji) zobrazuj komórki.</li>
</ol>
6. Badanie stanu glikozylacji ATG9A
<ol>
	<li>Wysiewaj HEK293A komórki (lub komórki z wyboru) w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej, aby osiągnęły ~ 80% konfluencji następnego dnia, jeśli planujesz zbadać endogenny ATG9A, który zwykle daje 1,5 x 10 6-2,5 x 106 komórek w 10 ml. Alternatywnie, zasiej komórki, aby osiągnęły ~ 65% -70% konfluencji podczas transfekcji konstruktów ATG9A, co zwykle daje 1 x 10 6-1,5 x 106 komórek w 10 ml.</li>
	<li>Następnego dnia należy potraktować komórki cykloheksamidem o stężeniu 100 μg/ml (CHX, patrz tabela materiałów) lub podłożem. Inkubować przez 24 godziny (lub do pożądanego punktu czasowego).</li>
	<li>Usunąć komórki z inkubatora, odessać pożywkę i umieścić na lodzie. Zastąp go 5 ml lodowatego 1x PBS. Fizycznie odłączyć komórki od naczynia za pomocą skrobaka do komórek i odpipetować roztwór komórek PBS do probówki o stożkowym dnie o pojemności 15 ml. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w ~100 μl (w zależności od wielkości osadu komórkowego) lodowatego buforu do lizy TNTE (1% Triton, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 mM EDTA) uzupełnionym tabletkami koktajlowymi inhibitorów proteazy (patrz tabela materiałów) i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
	<ol>
		<li>Inkubować lizat na lodzie przez 15 minut. Następnie odwirować lizat o stężeniu 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia jąder i nierozpuszczalnych zanieczyszczeń, a następnie przenieść supernatant do świeżej probówki do mikrowirówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ ilościowo stężenie białka w lizacie za pomocą metody Bradforda20 i spektrofotometru, który może mierzyć przy długości fali 595 nm.</li>
	<li>Znormalizuj ilość białka i połącz 16 μl lizatu (zawierającego łącznie nie więcej niż 100 μg białka) z 5x buforem PNGase F (peptyd: N-glikozydaza F) zgodnie z instrukcjami producenta przed dodaniem 1 μl enzymu PNGazy F (patrz tabela materiałów). Inkubować zgodnie z instrukcją producenta PNGazy F.</li>
	<li>Dodać objętość 3x buforu próbki Laemmli, aby uzyskać stężenie 1x, i inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut przed załadowaniem do elektroforezy przy użyciu żelu Tris-acetat, aby zmaksymalizować separację białek. Przenieść białka z żelu do odpowiedniej błony (tj. PVDF [polifluorku winylidenu]) przy użyciu standardowych protokołów western blot21 (patrz Tabela Materiałów). 
	UWAGA: Gotowanie próbek w temperaturze 95 °C spowoduje agregację ATG9A, zmniejszając w ten sposób wykrywalność ATG9A.</li>
	<li>Wykonaj western blot przy użyciu specyficznych przeciwciał dla ATG9A (przeciwciało STO-215, produkowane we własnym zakresie1) (patrz tabela materiałów). Pozostaw nieprzeciętą część membrany o większej masie cząsteczkowej, aby uwidocznić gatunki o wyższej masie cząsteczkowej ATG9A.</li>
</ol>

Investigating ATG9A Localization in Cells

<ol><li>Young, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starvation+and+ULK1-dependent+cycling+of+mammalian+Atg9+between+the+TGN+and+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Starvation and ULK1-dependent cycling of mammalian Atg9 between the TGN and endosomes.</a> Journal of Cell Science. 119, 3888-3900 (2006).</li>
<li>Maeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lipid+scrambling+activity+and+role+in+autophagosome+formation+of+ATG9A%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">lipid scrambling activity and role in autophagosome formation of ATG9A.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1194-1201 (2020).</li>
<li>Matoba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg9+is+a+lipid+scramblase+that+mediates+autophagosomal+membrane+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Atg9 is a lipid scramblase that mediates autophagosomal membrane expansion.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1185-1193 (2020).</li>
<li>Mercer, T. J., Gubas, A., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+perspective+of+mammalian+autophagosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A molecular perspective of mammalian autophagosome biogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (15), 5386-5395 (2018).</li>
<li>Yamamoto, H., Zhang, S., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+genes+in+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">Autophagy genes in biology and disease.</a> Nature Reviews: Genetics. , (2023).</li>
<li>Sawa-Makarska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+autophagosome+nucleation+defines+Atg9+vesicles+as+seeds+for+membrane+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of autophagosome nucleation defines Atg9 vesicles as seeds for membrane formation.</a> Science. 369 (6508), (2020).</li>
<li>Melia, T. J., Lystad, A. H., Simonsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagosome+biogenesis%3A+From+membrane+growth+to+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Autophagosome biogenesis: From membrane growth to closure.</a> Journal of Cell Biology. 219 (6), 202002085(2020).</li>
<li>Orsi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+transient+interactions+of+Atg9+with+autophagosomes%2C+but+not+membrane+integration%2C+are+required+for+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic and transient interactions of Atg9 with autophagosomes, but not membrane integration, are required for autophagy.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (10), 1860-1873 (2012).</li>
<li>Judith, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATG9A+shapes+the+forming+autophagosome+through+Arfaptin+2+and+phosphatidylinositol+4-kinase+IIIbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ATG9A shapes the forming autophagosome through Arfaptin 2 and phosphatidylinositol 4-kinase IIIbeta.</a> Journal of Cell Biology. 218 (5), 1634-1652 (2019).</li>
<li>Karanasios, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+initiation+by+ULK+complex+assembly+on+ER+tubulovesicular+regions+marked+by+ATG9+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Autophagy initiation by ULK complex assembly on ER tubulovesicular regions marked by ATG9 vesicles.</a> Nature Communications. 7, 12420(2016).</li>
<li>Koyama-Honda, I., Itakura, E., Fujiwara, T. K., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+analysis+of+recruitment+of+mammalian+ATG+proteins+to+the+autophagosome+formation+site%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Temporal analysis of recruitment of mammalian ATG proteins to the autophagosome formation site.</a> Autophagy. 9 (10), 1491-1499 (2013).</li>
<li>Guardia, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+human+ATG9A%2C+the+only+transmembrane+protein+of+the+core+autophagy+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Structure of human ATG9A, the only transmembrane protein of the core autophagy machinery.</a> Cell Reports. 31 (13), 107837(2020).</li>
<li>Soreng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNX18+regulates+ATG9A+trafficking+from+recycling+endosomes+by+recruiting+Dynamin-2%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">SNX18 regulates ATG9A trafficking from recycling endosomes by recruiting Dynamin-2.</a> EMBO Reports. 19 (4), e44837(2018).</li>
<li>Staudt, C., Gilis, F., Boonen, M., Jadot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+that+mediate+the+sorting+of+human+ATG9A+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants that mediate the sorting of human ATG9A from the endoplasmic reticulum.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1863 (9), 2299-2310 (2016).</li>
<li>Knaevelsrud, H., Carlsson, S. R., Simonsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNX18+tubulates+recycling+endosomes+for+autophagosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">SNX18 tubulates recycling endosomes for autophagosome biogenesis.</a> Autophagy. 9 (10), 1639-1641 (2013).</li>
<li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bif-1-Dynamin+2+membrane+fission+machinery+regulates+Atg9-containing+vesicle+generation+at+the+Rab11-positive+reservoirs%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The Bif-1-Dynamin 2 membrane fission machinery regulates Atg9-containing vesicle generation at the Rab11-positive reservoirs.</a> Oncotarget. 7 (15), 20855-20868 (2016).</li>
<li>Imai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg9A+trafficking+through+the+recycling+endosomes+is+required+for+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Atg9A trafficking through the recycling endosomes is required for autophagosome formation.</a> Journal of Cell Science. 129 (20), 3781-3791 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>van Vliet, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATG9A+and+ATG2A+form+a+heteromeric+complex+essential+for+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">ATG9A and ATG2A form a heteromeric complex essential for autophagosome formation.</a> Molecular Cell. 82 (22), 4324-4339 (2022).</li>
<li>Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bradford+assay+for+determining+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Bradford assay for determining protein concentration.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (4), 102269(2020).</li>
<li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validating+antibody+specificities+for+immunohistochemistry+by+protein+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Validating antibody specificities for immunohistochemistry by protein blotting.</a> Methods in Molecular Biology. 2593, 21-33 (2023).</li>
<li>Lamb, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TBC1D14+regulates+autophagy+via+the+TRAPP+complex+and+ATG9+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">TBC1D14 regulates autophagy via the TRAPP complex and ATG9 traffic.</a> EMBO Journal. 35 (3), 281-301 (2016).</li>
<li>Longatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TBC1D14+regulates+autophagosome+formation+via+Rab11-+and+ULK1-positive+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TBC1D14 regulates autophagosome formation via Rab11- and ULK1-positive recycling endosomes.</a> Journal of Cell Biology. 197 (5), 659-675 (2012).</li>
<li>Ravussin, A., Brech, A., Tooze, S. A., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phosphatidylinositol+3-phosphate-binding+protein+SNX4+controls+ATG9A+recycling+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The phosphatidylinositol 3-phosphate-binding protein SNX4 controls ATG9A recycling and autophagy.</a> Journal of Cell Science. 134 (3), (2021).</li>
<li>DesMarais, V., Eddy, R. J., Sharma, V. P., Stone, O., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+leading+edge+F-actin+labeling+using+multiple+actin+probes%2C+fixation+methods+and+imaging+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Optimizing leading edge F-actin labeling using multiple actin probes, fixation methods and imaging modalities.</a> BioTechniques. 66 (3), 113-119 (2019).</li>
<li>Ennis, H. L., Lubin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cycloheximide%3A+Aspects+of+inhibition+of+protein+synthesis+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cycloheximide: Aspects of inhibition of protein synthesis in mammalian cells.</a> Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).</li>
<li>Webber, J. L., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+regulation+of+autophagy+by+p38alpha+MAPK+through+mAtg9+and+p38IP%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Coordinated regulation of autophagy by p38alpha MAPK through mAtg9 and p38IP.</a> EMBO Journal. 29 (1), 27-40 (2010).</li>
<li>Claude-Taupin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATG9A+protects+the+plasma+membrane+from+programmed+and+incidental+permeabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ATG9A protects the plasma membrane from programmed and incidental permeabilization.</a> Nature Cell Biology. 23 (8), 846-858 (2021).</li>
<li>Aaron, J. S., Taylor, A. B., Chew, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+co-localization+-+Co-occurrence+versus+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Image co-localization - Co-occurrence versus correlation.</a> Journal of Cell Science. 131 (3), 211847(2018).</li>
<li>D'Antuono, R. Basic digital image acquisition, design, processing, analysis, management, and presentation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aD%27Antuono%2C+R+%22Principles+of+Light+Microscopy%3A+From+Basic+to+Advanced%22">Principles of Light Microscopy: From Basic to Advanced</a>. Nechyporuk-Zloy, V. , Springer. Cham, Switzerland. 77-104 (2022).</li>
</ol>

S.A.T. zasiada w naukowej radzie doradczej Casma Therapeutics.

Badanie to ilustruje różne narzędzia, które można wykorzystać do zbadania lokalizacji ATG9A. Po pierwsze, badanie to opisuje, w jaki sposób ATG9A można uwidocznić za pomocą immunofluorescencji i jak można to określić ilościowo. Po drugie, porównano strategie, które można wykorzystać do oznaczania ATG9A markerem fluorescencyjnym w celu wizualizacji w stałych lub żywych komórkach. Wreszcie, ta praca opisuje, jak badać i wykorzystywać stan glikozylacji ATG9A do określenia, czy ATG9A opuścił ostry dyżur i przedostał się przez Golgiego.
Jeśli chodzi o charakterystykę endogennej lokalizacji ATG9A za pomocą immunofluorescencji, należy zachować ostrożność przy metodach utrwalania i przepuszczalności zastosowanych w doświadczeniu. Zgodnie z opisanymi tutaj standardowymi procedurami, wiązanie paraformaldehydu w połączeniu z przepuszczalnością digitoniny jest dobrym warunkiem do wizualizacji zarówno pęcherzyków ATG9A związanych z Golgim, jak i ATG9A-dodatnich7. Wraz z utrwalaniem i przenikaniem krytyczny jest również czas inkubacji z pierwotnym roztworem przeciwciała. Zaobserwowaliśmy, ale nie udokumentowaliśmy, że wyższe stężenia pierwotnego roztworu przeciwciała i dłuższe czasy inkubacji mogą prowadzić do błędnie reprezentatywnego wzrostu barwienia ATG9A metodą Golgiego, co ostatecznie utrudnia wykrywanie redystrybucji ATG9A do innych przedziałów błonowych. Dodatkowo, ponieważ ATG9A jest obecny w wielu przedziałach wewnątrzkomórkowych 1,13,17,22,23,24,27,28, ważne jest, aby użyć określonych markerów błonowych wraz z ATG9A, aby określić, gdzie znajduje się ATG9A. W przeszłości stosowano kilka podejść do ilościowego określania lokalizacji ATG9A, w tym współczynnik korelacji Pearsona dla kolokalizacji29. Jednak częściowe nakładanie się ATG9A z Golgim i wyraźnym przedziałem pęcherzykowym prowadzi do dużej liczby wartości odstających pikseli, co może zniekształcić interpretację współczynnika korelacji. Z tego powodu preferowane jest bardziej uproszczone podejście oparte na stosunku średniej fluorescencji w dwóch analizowanych przedziałach, a podejście to jest mniej wrażliwe na zmienność między komórkami. Więcej informacji na temat analizy obrazu za pomocą mikroskopii można znaleźć w rozdziale30 tej książki.
Podczas badania statusu glikozylacji ATG9A ważny jest dobór żeli do prowadzenia western blot. W przypadku tego protokołu preferowane są żele Tris-acetate o stężeniu 3%-8%, ponieważ oferują one najwyższą rozdzielczość dla większych białek, ale można również stosować alternatywne kompozycje żeli lub biegowe, które zapewniają dobrą separację białek o dużej masie cząsteczkowej. Eksperymentator może zapewnić maksymalną separację białek poprzez wydłużenie czasu elektroforezy.
Przygotowując próbki do wizualizacji ATG9A na Western Blot, należy zachować ostrożność, aby nie zagotować próbek po dodaniu buforu Laemmli; gotowanie w temperaturze 95 °C indukuje tworzenie się agregatów ATG9A, a następnie ATG9A nie migruje efektywnie do żelu1. Zaleca się podgrzewanie próbek w temperaturze 65 °C przez 5 minut27.
Wysokie poziomy transfekcji zwykle prowadzą do większej akumulacji ATG9A w ER, podczas gdy umiarkowane poziomy ekspresji pomagają w fizjologicznej lokalizacji białka. Anegdotycznie czas inkubacji wynoszący 72 godziny zamiast 48 godzin często pomaga zmniejszyć artefakty lokalizacyjne ER. Warto zauważyć, że mRFP-ATG9A może dokładnie informować o transporcie ATG9A i funkcjonować, jeśli poziomy są kontrolowane przez poziomy ekspresji lub przy użyciu stabilnych linii komórkowych 8,9,22,27.
Niepowodzenie populacji nadmiernie eksprymowanej ATG9A w uzyskaniu dojrzałych glikanów sprzężonych z N może być wykorzystane jako odczyt dla zaburzonego transportu ATG9A. Podczas mutacji lub usuwania niektórych regionów ATG9A istnieje ryzyko zwiększonej retencji ER, co może prowadzić do niepowodzenia w uzyskaniu dojrzałych glikanów sprzężonych z N, a tym samym do szybszej migracji pasma ATG9A na western blot. Badacze pracujący z okrojonymi konstruktami ATG9A powinni sprawdzić retencję ER, stany glikozylacji i lokalizację Golgiego.
Do obrazowania ATG9A na żywych komórkach mikroskop Airyscan, oparty na szybkiej funkcji Airyscan, zapewnia optymalną rozdzielczość zwykle około 120 nm. Aby zapewnić dokładność lokalizacji, liczba klatek na sekundę wynosząca około 1-2 klatki na sekundę (fps) w trybie superrozdzielczości jest optymalna w zależności od liczby wyświetlanych kanałów. Podobne mikroskopy konfokalne, które mogą obrazować z dużą prędkością, mogą być również używane do obrazowania pęcherzyków ATG9A; Należy jednak zauważyć, że szybkość obrazowania może bezpośrednio wpływać na wykrywanie zdarzeń, a tym samym wpływać na interpretację danych.
Podsumowując, przedstawione protokoły opisują sposoby ilościowego oznaczania i charakteryzowania lokalizacji ATG9A za pomocą immunofluorescencji, mikroskopii żywych komórek i jej statusu glikozylacji. Protokoły te mogą pomóc naukowcom pracującym z ATG9A i pomóc uniknąć niektórych pułapek.

ATG9A jest jedynym białkiem transbłonowym głównej maszynerii autofagii i jest transportowane między kompartmentem Golgiego a cytozolowym przedziałem pęcherzykowym ATG9A, przechodząc przez kompartment endosomalny 1. Będąc od dawna enigmatycznym, ATG9A został niedawno opisany jako działający jako scramblaza lipidowa, ponieważ równoważy lipidy w dwuwarstwach błony2,3. Teraz jest jasne, że ATG9A znajduje się na szczycie hierarchii w tworzeniu autofagosomów, a zatem jego badanie jest niezbędne do zrozumienia autofagii4,5. W związku z tym pęcherzyki ATG9A zostały niedawno zaproponowane jako "ziarno" autofagosomu6,7. Jednak wcześniejsze badania wykazały, że ATG9A tylko przejściowo oddziałuje z tworzącym się autofagosomem na różnych etapach jego dojrzewania i nie integruje się z błoną autofagiczną6,8,9,10,11. W związku z tym potrzebne są dalsze badania, aby całkowicie rozwikłać rolę i potencjalne wielorakie funkcje ATG9A w tworzeniu autofagosomów. Jednak rozbieżność między obecnymi modelami a poprzednimi danymi może zostać rozwiązana tylko poprzez ukierunkowane eksperymenty dotyczące transportu ATG9A przy użyciu zwalidowanych podejść ilościowych i markerów wewnątrzkomórkowych.
Do badania ATG9A używane są różne narzędzia, każde z nich ma zalety i wady, a korzystanie z tych narzędzi komplikuje struktura ATG9A, jego funkcja molekularna i transport komórkowy2,8,12. ATG9A tworzy homotrimer, jest glikozylowany i jest transportowany przez komórkę do przedziałów takich jak Golgi, endosomy i błona plazmatyczna13,14. Biorąc pod uwagę jego złożoną trasę, istnieje kilka wyzwań związanych z interpretacją odczytów, takich jak rozprzestrzenianie się ATG9A z Golgiego po określonych zabiegach lub bodźcach (takich jak głód składników odżywczych i surowicy). ATG9A jest niezwykle dynamiczny pod względem transportu pęcherzykowego; rzeczywiście, pęcherzyki zawierające ATG9A zostały zdefiniowane jako przedział ATG9A w kontekście autofagii wywołanej głodem. Przedział ATG9A, utworzony przez te dynamiczne pęcherzyki, przejściowo oddziałuje z kilkoma organellami wewnątrzkomórkowymi8,15,16,17. Opisane tutaj techniki, w tym immunofluorescencja, obrazowanie na żywo i testy glikozylacji, powinny pomóc w wykryciu i zrozumieniu biologii ATG9A. W szczególności podejścia opisane w tym artykule pomogą odpowiedzieć na pytania dotyczące lokalizacji w określonych przedziałach komórkowych i interakcji z określonymi partnerami białkowymi i/lub przedziałami błonowymi. Ponieważ hydrofobowa konserwowana domena rdzeniowa ATG9A (domena PFAM PF04109) ma unikalną topologię i cykle ATG9A między kilkoma przedziałami błony, naukowcy powinni zdawać sobie sprawę z pewnych pułapek i artefaktów podczas przejściowej nadekspresji ATG9A, w tym między innymi retencji retikulum endoplazmatycznego (ER). Inne możliwe problemy mogą pojawić się z powodu nieprawidłowego fałdowania białka, sztucznej agregacji w normalnych warunkach wzrostu lub niewystarczającego wykrywania przedziału pęcherzykowego z powodu nieoptymalnych protokołów przepuszczalności dla immunofluorescencji.
Podczas obrazowania endogennego ATG9A, należy zachować ostrożność podczas przygotowywania próbki i akwizycji obrazu, aby zapewnić jakość późniejszej analizy ilościowej i poprawną interpretację danych. Połączenie technik opisanych w tym artykule ze standardowymi podejściami biochemicznymi (takimi jak immunoprecypitacja lub eksperymenty typu pull-down, które nie zostały tutaj opisane) powinno poprawić nasze zrozumienie funkcji ATG9A. Ten eksperymentalny zestaw narzędzi ma na celu pomóc nowym badaczom w poruszaniu się po niektórych testach wymaganych do określenia funkcji ATG9A w ich systemie biologicznym.

<table><tbody><tr><td>24 płytki wielodołkowe&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td>Do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>35 mm Naczynie | Nr 1.5 Szkiełko nakrywkowe | Średnica szkła 14 mm | Niepowlekane</td><td>MATTEK</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Naczynie do hodowli komórkowych do mikroskopii żywych komórek</td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>60 mm naczynie do hodowli tkankowych&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10099170</td><td>Do hodowli</td></tr><tr><td>tkankowych Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A22287</td><td>Przeciwciało anty-ATG9A barwienia aktynowego</td></tr><tr><td></td><td>domowej roboty</td><td>STO-215</td><td>Króliczy peptyd anty N-końcowy ATG9A</td></tr><tr><td>anty-króliczy IgG, związany z peroksydazą&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10794347/NA934-1ml</td><td>Przeciwciało drugorzędowe dla króliczego poliklonalnego przeciwciała anty-RFP STO-215</td></tr><tr><td></td><td>Evrogen</td><td>AB233</td><td>dla przeciwciała monoklonalnego Western Blot</td></tr><tr><td>ATG9A (14F2 8B1), Invitrogen</td><td>Invitrogen</td><td>15232826</td><td>Przeciwciało immunofluorescencji</td></tr><tr><td>ATG9A-eGFP</td><td>domowej roboty</td><td></td><td>Konstrukt, który wyraża oznaczony ATG9A</td></tr><tr><td>Bemis Parafilm</td><td>Termokurczliwa</td><td>folia</td> termoplastyczna Thermofisher Scientific 11747487<td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Koncentrat odczynnika</td><td>barwnikowego Bio-Rad</td><td>5000006</td><td>Do oznaczania stężenia białka</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>10735086001</td><td>Do blokowania niespecyficznego znakowania</td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O</td><td>/</td><td></td><td>Dla PBS i EBSS</td></tr><tr><td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td>Suplement w buforze do lizy zapobiegający degradacji białek</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Goat Anti-Armenian Chomik IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>127-165-099</td><td>Przeciwciało drugorzędowe dla przeciwciała i14F2 8B1 dla mmunofluorescencji</td></tr><tr><td>Cykloheksamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>66-81-9</td><td>Aby zatrzymać translację białek</td></tr><tr><td>D-Glukoza</td><td>/</td><td></td><td>Dla EBSS</td></tr><tr><td>Digitonina&nbsp;</td><td>Merck</td><td>300410</td><td>Do komórek przepuszczalnych</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Merck</td><td>D6546-6x500ml</td><td>Do hodowli tkankowej</td></tr><tr><td>eGFP-ATG9A</td><td>domowy</td><td></td><td>konstrukt, który wyraża oznaczone ATG9A</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Suplement do DMEM do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ)</td><td>/</td><td>https:/fiji.sc/</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazów typu open source</td></tr><tr><td>Hoechst&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Barwiący jądro</td></tr><tr><td>KCl</td><td>/</td><td></td><td>Dla EBSS</td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>67513</td><td>Do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>do transfekcji komórek</td></tr><tr><td>Mikroskop LSM880 Airyscan&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>/</td><td>Mikroskopia konfokalna</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>/</td><td></td><td>Dla PBS</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>/</td><td></td><td>Dla EBSS</td></tr><tr><td>Mowiol rozwiązanie montażowe</td><td>Millipore</td><td>475904</td><td>do stałego montażu szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>/</td><td></td><td>Dla EBSS</td></tr><tr><td>NaH2PO4.2H2O</td><td>/</td><td></td><td>Dla EBSS</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>/</td><td></td><td>Dla EBSS</td></tr><tr><td>NuPAGE 3 do 8%, Tris-Acetate, 1,5 mm, Mini żele białkowe</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>EA0378BOX</td><td>do Western Blotting</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td><td>Life Tech</td><td>NP0002</td><td>do Western Blotting</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowana surowica Medium</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Do transfekcji komórkowej</td></tr><tr><td>paraformaldehydu&nbsp;</td><td>Agar Scientific</td><td>R1026</td><td>Do utrwalania komórek</td></tr><tr><td>pcDNA3.1-mCherry-3xFlag-ATG9A domowy</td><td></td><td></td><td>konstrukt, który wyraża oznaczone ATG9A</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>/</td><td></td><td>Do hodowli tkankowej</td></tr><tr><td>PNGaseF</td><td>NEB</td><td>&nbsp; P0710S</td><td>Do usuwania glikanów związanych z N</td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-D-lizyny mol wt 70 000-150 000</td><td>Merck</td><td>P0899</td><td>Do powlekania szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>Szybki enzym PNGazy F</td><td>NEB</td><td>P07105</td><td>Aby usunąć glikany sprzężone z N</td></tr><tr><td>RFP-ATG9A</td><td>domowy</td><td></td><td>konstrukt, który wyraża oznaczone ATG9A</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>13454259</td><td>Detergent do komórek liza</td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>Do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman</td><td>WHA1001325</td><td>Merck do Western Blot i IF</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td>Do Western Blotting</td></tr><tr><td>Zen Black edition</td><td>Zeiss</td><td>/</td><td>Używany do obsługi LSM 880</td></tr></tbody></table>

obrazowanie atg9a, wielozakresowego białka błonowego

Imaging ATG9A, a Multi-Spanning Membrane Protein

Autofagia to wysoce zachowana ścieżka, którą komórka wykorzystuje do utrzymania homeostazy, degradacji uszkodzonych organelli, zwalczania atakujących patogenów i przetrwania w stanach patologicznych. Zestaw białek, zwanych białkami ATG, składa się na rdzeń maszynerii autofagii i współpracuje ze sobą w określonej hierarchii. Badania przeprowadzone w ostatnich latach poszerzyły naszą wiedzę na temat szlaku autofagii. Ostatnio zaproponowano, że pęcherzyki ATG9A są sercem autofagii, ponieważ kontrolują szybką syntezę de novo organelli zwanej fagoforem. Badanie ATG9A okazało się trudne, ponieważ ATG9A jest białkiem transbłonowym i jest obecne w różnych przedziałach błonowych. W związku z tym zrozumienie jego handlu jest ważnym elementem zrozumienia autofagii. W tym miejscu przedstawiono szczegółowe metody, które można wykorzystać do badania ATG9A, a w szczególności jego lokalizacji za pomocą technik immunofluorescencyjnych, które można ocenić i określić ilościowo. Omówiono również pułapki związane z przejściową nadekspresją. Prawidłowa charakterystyka funkcji ATG9A i standaryzacja technik analizy jego transportu są kluczowe dla dalszego scharakteryzowania zdarzeń rządzących inicjacją autofagii.

ATG9A jest białkiem transbłonowym związanym z kilkoma wewnątrzkomórkowymi przedziałami błonowymi8,17,22,23,24. W warunkach bazalnych ATG9A lokalizuje się głównie w sieci trans-Golgi (TGN), co wykazano za pomocą immunofluorescencji białka endogennego oraz nakładania się z GM130, markerem cis-Golgi (Rysunek 1A), a także w małych pęcherzykach, które częściowo pokrywają się z endocytycznym przedziałem recyklingowym (ERC)23. Lokalizację ATG9A w aparacie Golgiego można wykryć, stosując różne protokoły immunofluorescencji. Jednakże frakcja pęcherzykowa ATG9A, a także zmiana jego lokalizacji, w szczególności wzrost puli pęcherzykowej w odpowiedzi na specyficzne bodźce, takie jak głodzenie z substancji odżywczych i surowicy, mogą być bardzo zmienne pod względem intensywności i trudne do zwizualizowania za pomocą konwencjonalnych metod obrazowania. Stosunek ATG9A zlokalizowanego w aparacie Golgiego do ATG9A zlokalizowanego w frakcji pęcherzykowej określa się mianem stopnia dyspersji ATG9A. Aby wykryć zmiany w stopniu dyspersji ATG9A, na przykład po traktowaniu EBSS, które służy do usunięcia zarówno surowicy, jak i aminokwasów, przydatne do szybkiego ilościowego określenia dyspersji ATG9A są markery aparatu Golgiego, takie jak GM130 lub TGN46, oraz marker cytoszkieletu, taki jak faloidyna, która barwi kontur komórki25 (Rysunek 1B). Ważne jest, że analiza średniego stosunku fluorescencji może być interpretowana jedynie jako miara porównawcza między warunkami, a nie jako stały stopień dyspersji. Stosunek między przedziałami jest wysoce zależny od czynników biologicznych i niebiologicznych, takich jak zastosowana linia komórkowa, jakość barwienia lub zastosowane metody progowania (Rysunek 1B). Z tego powodu badacz musi opracować procedurę zdolną do wykrywania wzbogacenia ATG9A w aparacie Golgiego w swoich specyficznych warunkach doświadczalnych, a następnie rozszerzyć analizę z tymi samymi parametrami na wszystkie obrazy w zestawie do analizy. Reprezentatywne obrazy binarne i obszary wybrane do analizy średniej fluorescencji ATG9A przedstawiono jako wskazówkę na Rysunku 1B.
ATG9A posiada kilka domen transbłonowych flankowanych przez dwie stosunkowo elastyczne i nieustrukturyzowane domeny N- i C-końcowe, z których sekwencja C-końcowa obejmuje niemal połowę białka12. Co ważne, wzorzec lokalizacji nadeksprymowanego białka ATG9A może zależeć od tego, który koniec białka zostanie oznakowany (Rysunek 2A). W szczególności, przy zastosowaniu systemów ekspresji przejściowej i oznakowaniu ATG9A bezpośrednio na N-końcu znacznikiem fluorescencyjnym (np. eGFP, mRFP lub ich pochodnymi), jego lokalizacja w aparacie Golgiego może być częściowo zaburzona, z mniejszym wzbogaceniem obserwowanym w warunkach bazalnych (tj. po karmieniu), podczas gdy pęcherzyki ATG9A są wciąż wyraźnie widoczne (Rysunek 2A). Oznakowanie ATG9A na C-końcu wydaje się w niewielkim stopniu indukować większe klastry dodatnie dla GFP, które mogą być agregatami. Wreszcie, monomeryczna wersja mRFP-ATG9A wykazuje również podobne fluorescencyjne klastry pęcherzyków i słabe barwienie aparatu Golgiego w komórkach z nadekspresją (Rysunek 2A).
ATG9A składa się w błonie retikulum endoplazmatycznego (ER), zanim zostanie przetransportowany do aparatu Golgiego i pęcherzyków ATG9A. Podczas przebywania w ER, ATG9A ulega modyfikacji poprzez glikany N-łańcuchowe w Asparaginianie 99, a po dotarciu do aparatu Golgiego nabywa złożone, dojrzałe glikany N-łańcuchowe1,14. Modyfikacja ta poprzez glikozylację może zostać wykryta w analizie western blot poprzez pojawienie się podwójnego prążka14. Zgodnie z jego lokalizacją wewnątrzkomórkową, większość endogennego ATG9A posiada złożone glikany N-łańcuchowe, w związku z czym przeważa prążek o wyższej masie cząsteczkowej, przy czym widoczny jest również słaby prążek o niższej masie cząsteczkowej (Rysunek 2B). Obecność podwójnego prążka jest najlepiej widoczna przy zastosowaniu żeli Tris-octanowych w celu poprawy rozdzielczości białek o wyższej masie cząsteczkowej (Rysunek 2B, kontrola, t = 0). Gdy białko endogenne zostanie poddane działaniu PNGazy F (Peptide:N-glycosidase F), która usuwa większość złożonych glikanów N-łańcuchowych, białko wędruje jako pojedynczy prążek (Rysunek 2B, PNGase F, t = 0). Zatem stan glikozylacji N-łańcuchowej ATG9A może służyć jako wskaźnik monitorujący transport ATG9A z ER do aparatu Golgiego, co odzwierciedla względny stosunek obu prążków.
Podczas przejściowej transfekcji konstruktów mRFP-ATG9A, nadekspresowane białko początkowo gromadzi się w ER, prawdopodobnie dlatego, że mechanizm transportu nie jest w stanie sfałdować i przetransportować całego ATG9A, a przeważa prążek o niższej masie cząsteczkowej (Rysunek 2C, kontrola t = 0). Co istotne, po 24 h ekspresji mRFP-ATG9A występuje w przybliżeniu równy rozkład pomiędzy prążkami górnym i dolnym, co sugeruje, że pula mRFP-ATG9A przemieszcza się do aparatu Golgiego (Rysunek 2C, kontrola, t = 24). Jeśli komórki zostaną potraktowane cykloheksymidą (CHX), która blokuje syntezę białek de novo26, można wyjaśnić proces fałdowania i wyjścia ATG9A z ER. Ponieważ białko endogenne jest sfałdowane, glikozylowane i zlokalizowane w aparacie Golgiego, traktowanie CHX nie zmienia znacząco stosunku prążków o niskiej i wysokiej masie cząsteczkowej (Rysunek 2B, kontrola). Jednak w przypadku przejściowej ekspresji mRFP-ATG9A, traktowanie CHX sprzyja akumulacji prążka o wyższej masie cząsteczkowej (Rysunek 2C, kontrola, CHX t = 24). Prążek nadekspresowanego mRFP-ATG9A o wyższej masie cząsteczkowej znika, przekształcając się w prążek dolny po traktowaniu PNGasą F (Rysunek 2C, PNGase F, t = 24). Dane te pokazują, że białko endogenne szybko nabywa dojrzałe glikany, co odzwierciedla przewaga prążka o wyższej masie cząsteczkowej, a analiza z użyciem CHX nie wpływa na stosunek podwójnych prążków (Rysunek 2B). W przypadku przejściowo nadekspresowanego mRFP-ATG9A, traktowanie CHX indukuje akumulację górnego prążka, co wskazuje na nabywanie większej liczby dojrzałych glikanów w miarę fałdowania i przemieszczania się puli z ER do aparatu Golgiego (Rysunek 2C).
Dodanie łącznika pomiędzy sekwencją ATG9A a znacznikami fluorescencyjnymi może być pomocne w promowaniu bardziej fizjologicznej lokalizacji i transportu białka. Fuzja sekwencji 3x-FLAG (24 aminokwasy) pomiędzy fluoroforem N-końcowym a ATG9A pomaga sprawić, że nadekspresjonowane białko zachowuje się podobnie do białka endogennego (Rycina 3). Rzeczywiście, nadekspresjonowane mCherry-3xFLAG-ATG9A kolokalizuje z markerem aparatu Golgiego GM130 w warunkach sytości (Rycina 3A). Co istotne, lokalizacja ta oraz pęcherzykowy przedział ATG9A są zachowane w czasie, co umożliwia spatiotemporalne badanie transportu ATG9A (Rycina 3B).
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna; znakowanie ATG9A, GM130, aktyny; schemat przetwarzania obrazu; analiza dystrybucji białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65349/65349fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Analiza obrazu lokalizacji endogennego białka ATG9A. (A) Reprezentatywny obraz immunofluorescencyjny endogennego ATG9A (czerwony), GM130 jako marker aparatu Golgiego (zielony) oraz falloidyny do wizualizacji cytoszkieletu aktynowego (cyjan). Pasek skali = 10 μm. (B) Schemat analizy obrazu w celu określenia frakcji endogennego ATG9A lokalizującego się w obszarze aparatu Golgiego. Pasek skali = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65349/65349fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna i analiza western blot białka ATG9A w celu określenia lokalizacji komórkowej i ekspresji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65349/65349fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Analiza konstruktów ATG9A znakowanych fluorescencyjnie pod kątem lokalizacji i glikozylacji. (A) ATG9A znakowany eGFP na N-końcu wykazuje mniejszą lokalizację w aparacie Golgiego i znajduje się głównie w pęcherzykach. ATG9A znakowany eGFP na C-końcu wykazuje agregaty wewnątrz komórki (niektóre przykłady zaznaczono białymi grotami strzałek; eGFP-ATG9A i ATG9A-eGFP są w kolorze zielonym). ATG9A znakowany mRFP na N-końcu wykazuje mniejszą lokalizację w aparacie Golgiego i znajduje się głównie w pęcherzykach. N oznacza przybliżoną lokalizację jądra komórkowego, a mRFP-ATG9A jest w kolorze czerwonym. Pasek skali = 5 μm. (B) Endogenne ATG9A pojawia się jako dwa prążki podczas analizy western blot (groty strzałek): prążek górny (złożone glikany sprzęgane N-glikozydowo) i prążek dolny (brak dojrzałych glikanów sprzęganych N-glikozydowo). Obróbka cykloheksamidem (CHX) nie wpływa na stosunek prążka górnego do dolnego. Obróbka PNGaza F powoduje zanik prążka górnego. (C) Po przejściowej transfekcji ATG9A znakowanego mRFP w komórkach HEK293A, na western blot widoczne są dwa wyraźne prążki (groty strzałek). Obróbka PNGaza F powoduje zanik prążka górnego. Obróbka CHX po transfekcji prowadzi do zwiększenia glikozylacji, ponieważ pula transfekowanego ATG9A jest transportowana z ER do aparatu Golgiego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65349/65349fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej dynamiki mCherry-3xFLAG-ATG9A, GM130 podkreśla kolokalizację." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65349/65349fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Analiza lokalizacji mCherry-3xFLAG-ATG9A za pomocą immunofluorescencji i obrazowania na żywo. (A) Eksperymenty immunofluorescencyjne komórek HEK293A z przejściową nadekspresją mCherry-3xFLAG-ATG9A, barwionych markerem aparatu Golgiego GM130. Pasek skali = 10 μm. mCherry-3xFLAG-ATG9A zaznaczono kolorem czerwonym, a marker aparatu Golgiego GM130 kolorem zielonym. (B) Montaż z eksperymentów obrazowania na żywo w komórkach HEK293A z przejściową nadekspresją mCherry-3xFLAG-ATG9A. N oznacza przybliżoną lokalizację jądra. Interwał czasowy = 1 fps. Pasek skali = 10 μm. mCherry-3xFLAG-ATG9A zaznaczono kolorem czerwonym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65349/65349fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół opisuje różne metody, które mogą pomóc w badaniu biologii ATG9A, w tym immunofluorescencję, po której następuje analiza obrazu, rozważania dotyczące przejściowej nadekspresji i badanie statusu glikozylacji ATG9A za pomocą western blot.

Obrazowanie ATG9A, wielozakresowego białka błonowego

Autophagy is a highly conserved pathway that the cell uses to maintain homeostasis, degrade damaged organelles, combat invading pathogens, and survive ...

W naszym laboratorium jesteśmy zainteresowani zrozumieniem, które lipidy i mechanizmy białkowe są zaangażowane w transport pęcherzyków ATG9A. ATG9A ma kluczowe znaczenie w szlaku autofagii dla tworzenia i dojrzewania fagoforu. Jednak ostatnio badaliśmy wpływ ATG9A na homeostazę organelli.Największym wyzwaniem jest odkrycie molekularnych szczegółów funkcjonowania białek i maszynerii białkowych. Technologie takie jak inżynieria białkowa oparta na fałdowaniu alfa i krio-EM in situ o wysokiej rozdzielczości zapewniają obecnie największe postępy. Praca w moim laboratorium zapewniła fundamentalny wgląd w to, jak powstają autofagosomy.Spostrzeżenia te zostały poparte zaawansowanymi technikami biologii molekularnej komórki, takimi jak ta opisana tutaj. Opisujemy niektóre wady używania niektórych znaczników białkowych i to, jak zachowanie ATG9A może się zmieniać w zależności od lokalizacji znacznika, a więc albo N, albo C-końca. Podpowiadamy również, jak wykryć te wady i jak ich uniknąć.Oprócz tego zapewniamy również przepływ pracy polegający na ilościowym określaniu dyspersji ATG9A w powtarzalny sposób. Tutaj zapewniamy przepływ pracy od immunofluorescencji i obrazowania na żywo po akwizycję i analizę obrazu w celu analizy dyspersji ATG9A między różnymi przedziałami komórkowymi. Uważamy, że standaryzacja potoków do analizy obrazu jest priorytetem dla biologów komórkowych, aby móc zwiększyć ich wiarygodność i odtwarzalność naszych wyników.Na początek komórki HEK293A nasiennej na szklanej pokrywie umieszcza się na 24-dołkowej płytce zawierającej DMEM o wysokiej zawartości glukozy, aż staną się zlewające się w 80%. Następnego dnia głodz komórki przez dwie godziny w zrównoważonym roztworze soli Earle'a. Po zabiegu odessać pożywkę i dodać 500 mikrolitrów 4% roztworu formaldehydu do PBS i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia komórek.Po utrwaleniu zastąp roztwór formaldehydu 500 mikrolitrami PBS. Następnie wygasić wolną grupę aldehydową, dodając 500 mikrolitrów 50-milimolowego roztworu chlorku amonu w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Zastąp roztwór chlorku amonu 500 mikrolitrami roztworu digitoniny o stężeniu 50 mikrogramów na mililitr w PBS przez pięć minut, aby przeniknąć do komórek.Po przepuszczalności zastąp roztwór digitoniny 500 mikrolitrami PBS, powtarzając trzykrotne płukanie PBS. Po ostatnim myciu inkubować komórki w 500 mikrolitrach roztworu blokującego przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji zastąp roztwór blokujący 500 mikrolitrami PBS.Następnie za pomocą pęsety zbierz szkiełka nakrywkowe ze studzienki i usuń nadmiar PBS za pomocą cienkich chusteczek higienicznych. W wilgotnej komorze delikatnie połóż szkiełko nakrywkowe stroną z komórkami do dołu na 50-mikrolitrowej kropli roztworu przeciwciała pierwotnego. Inkubować komórki w wilgotnej komorze przez godzinę w temperaturze pokojowej.Po inkubacji zebrać szkiełka nakrywkowe i odsączyć nadmiar roztworu przeciwciał pierwszorzędowych. Umieść szkiełka pokrywy z powrotem w 24-dołkowej płytce komórką do góry i umyj je trzykrotnie PBS. Po ostatnim praniu zbierz szkiełka nakrywkowe i odcedź nadmiar PBS.Przed umieszczeniem każdego szkiełka nakrywkowego stroną z komórką do dołu na 50-mikrolitrowej kropli roztworu przeciwciał wtórnych, inkubować w wilgotnej komorze przez godzinę. Po inkubacji odcedzić nadmiar roztworu przeciwciał drugorzędowych i trzykrotnie przemyć szkiełko nakrywkowe 500 mikrolitrami PBS na płytce 24-dołkowej. Po odsączeniu nadmiaru PBS umieść każde szkiełko nakrywkowe stroną z komórkami do dołu na 50-mikrolitrowej kropli roztworu Hooke'a rozcieńczonej od jednego do 4 000 w PBS w wilgotnej komorze.Inkubować w wilgotnej komorze przez pięć minut. Następnie usuń nadmiar roztworu Hooke'a i umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy PBS i raz wodą dejonizowaną w 24-dołkowej płytce. Po spuszczeniu nadmiaru wody dejonizowanej umieść każde szkiełko nakrywkowe na kropli roztworu montażowego o pojemności od 10 do 20 mikrolitrów narysowanej na szkiełku mikroskopowym, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza.W przypadku obrazowania żywych komórek konstruktów ATG9A, wysiewaj HEK293A komórki w dwóch mililitrach DMEM o wysokiej zawartości glukozy do 60-milimetrowej naczynie do hodowli tkankowej, aż osiągną konfluencję od 65 do 70%. Następnego dnia przygotuj i dodaj mieszaninę lipofektaminy DNA do płytki do hodowli komórkowej zawierającej cztery mililitry pożywki wzrostowej i delikatnie kołysz płytką w przód iw tył, aby równomiernie rozprowadzić mieszankę. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 10% dwutlenku węgla.Po czterech godzinach transfekcji zastąp pożywkę wzrostową świeżą pożywką i inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 10% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia trypsynizuj komórki, dodając trypsynę EDTA. Następnie policz oderwane komórki i ponownie zasiej je na szalce hodowlanej nadającej się do żywej mikroskopii przez noc.Następnego dnia zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego. W warunkach podstawowych ATG9A jest głównie zlokalizowany w sieci Golgiego, na co wskazuje immunofluorescencja endogennego białka i pokrywa się z GM130, markerem cis-Golgiego. eGFP-N oznaczone terminalnie ATG9A i mRFP-N terminalnie oznaczone ATG9A były mniej zlokalizowane w Golgi i znajdowały się głównie w pęcherzykach.W przeciwieństwie do tego, ATG9A oznaczone ostatecznie eGFP-C jest bardziej podatne na agregację w komórce. Fuzja sekwencji 3xFLAG między N-końcowym fluoroforem a ATG9A pomogła nadekspresji białka zachowywać się podobnie do endogennego. Nadekspresja mCherry3xFLAG-ATG9A kolokalizuje się z markerem Golgiego GM130 w warunkach karmienia.Ta lokalizacja i przedział pęcherzykowy ATG9A zostały zachowane w czasie, co pozwoliło na przestrzenne badanie czasowe transportu ATG9A.

imaging-atg9a-a-multi-spanning-membrane-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Żywotność komórek zależy od szybkiego i skutecznego radzenia sobie z nieprawidłowym fałdowaniem białek.  W tym miejscu opisujemy metodę wizualizacji różnych potencjalnych losów nieprawidłowo sfałdowanego białka: ponownego fałdowania, degradacji lub sekwestracji w inkluzjach. Demonstrujemy zastosowanie czujnika składania, Ubc9ts, do monitorowania proteostazy i kontroli jakości agregacji w żywych komórkach za pomocą mikroskopii 4D.

Obrazowanie 4D agregacji białek w żywych komórkach

Przedstawiamy protokół zbierania i przetwarzania krio-tomogramów elektronowych całych mitochondriów. Technika ta zapewnia szczegółowy wgląd w strukturę, funkcję i organizację dużych kompleksów białek błonowych w natywnych błonach biologicznych.

Wizualizacja dimerów syntazy ATP w mitochondriach za pomocą kriotomografii elektronowej

Mikroskopia fluorescencyjna z pełnym wewnętrznym odbiciem (pTIRFM) oparta na polaryzacji umożliwia wykrywanie dynamiki błony komórkowej w czasie rzeczywistym. W artykule opisano implementację pTIRFM do badania przebudowy błony podczas regulowanej egzocytozy. Technikę tę można uogólnić na inne procesy w biologii komórki, które bezpośrednio lub pośrednio wiążą się ze zmianami kształtu błony.

Obrazowanie deformacji błony plazmatycznej za pomocą pTIRFM

Chorobotwórcze mutacje w aktynie mogą zmienić funkcję cytoszkieletu. Dynamikę cytoszkieletu określa się ilościowo poprzez obrazowanie białek znakowanych fluorescencyjnie przy użyciu całkowitej wewnętrznej mikroskopii fluorescencyjnej. Na przykład białko cytoszkieletu, Aip1p, ma zmienioną lokalizację i ruch w komórkach wyrażających zmutowaną izoformę aktyny, R256H.

Dynamika Aip1p jest zmieniona przez mutację R256H w aktynie

Podczas gdy transport białek na powierzchni komórki jest stosunkowo łatwy do zbadania, wizualizacja transportu białek wewnątrzkomórkowych jest znacznie trudniejsza. Tutaj używamy konstruktów zawierających fotoaktywowany GFP i demonstrujemy metodę dokładnego śledzenia białka prekursorowego amyloidu z aparatu Golgiego do dalszych przedziałów i śledzenia jego klirensu.

Obrazowanie wewnątrzkomórkowego transportu APP za pomocą fotoaktywowalnego GFP

Przedstawione tutaj są dwie techniki badań interakcji białko-białko oparte na przeciwciałach: immunofluorescencja i immunoprecypitacja. Techniki te nadają się do badania fizycznych interakcji między białkami w celu odkrycia nowych składników komórkowych szlaków sygnałowych i zrozumienia dynamiki białek.<br...

Badanie interakcji białko-białko w badaniach nad autofagią

Opisujemy protokół specyficznej dla typu komórki ekspresji genetycznie kodowanego czujnika opartego na FRET ATeam1.03YEMK w organotypowych kulturach warstwowych przodomózgowia myszy. Ponadto pokazujemy, jak wykorzystać ten czujnik do dynamicznego obrazowania komórkowych poziomów ATP w neuronach i astrocytach.

Obrazowanie wewnątrzkomórkowego ATP w organotypowych wycinkach tkanki mózgu myszy przy użyciu czujnika ATeam1.03YEMK opartego na FRET

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Funkcje białek nadrodziny dynamin zależą od zmian konformacyjnych sprzężonych z hydrolizą GTP. System opisano za pomocą techniki jednocząsteczkowego FRET (smFRET) do monitorowania dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy w różnych stanach obciążenia nukleotydami.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek FRET do obserwacji dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy

Poznaj techniki obrazowania ATG9A w komórkach HEK293A w celu badania autofagii i homeostazy organelli. Metoda ta umożliwia analizę lokalizacji białka i dynamiki pęcherzyków w komórkach.

Obrazowanie ATG9A, wielozakresowego białka błonowego

Przeglądaj więcej filmów