Name: Normothermiczna perfuzja płuc ex vivo w wątrobie u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-25T14:25:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: Poznaj normotermiczną perfuzję wątroby myszy ex vivo do badania mechanizmów molekularnych i naprawy narządów. System NEVLP umożliwia powtarzalne wyniki oraz identyfikację nowych dodatków do perfuzatu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Przez cały czas pisania tego artykułu otrzymałem wiele wsparcia i pomocy. Chciałbym szczególnie podziękować mojemu koledze z zespołu, XinPei Chenowi, za jego wspaniałą współpracę i cierpliwe wsparcie podczas mojej operacji.

Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z obowiązującymi niemieckimi przepisami i wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt oraz wytycznymi ARRIVE dotyczącymi zgłaszania badań na zwierzętach. Protokół doświadczenia na zwierzętach został zatwierdzony przez Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Turyngia, Niemcy (numer zatwierdzenia: UKJ - 17 - 106).
UWAGA: Samce myszy C57BL/6J o wadze 34 ± 4 g (średnia ± błąd standardowy średniej [SEM]) zostały użyte jako dawcy wątroby. Utrzymywano je w kontrolowanych warunkach środowiskowych (50% wilgotności i 18 - 23 °C) ze swobodnym dostępem do standardowej karmy dla myszy i wody. Przez cały czas trwania zabiegu chirurgicznego utrzymywano częstość oddechów przekraczającą 60 oddechów/min, a temperatura ciała utrzymywała się powyżej 34 °C.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Ustawianie stołu operacyjnego
	<ol>
		<li>Autoklaw wszystkich narzędzi chirurgicznych i materiałów eksploatacyjnych do celów sterylizacji.</li>
		<li>Włącz wszystkie urządzenia, w tym płytę grzewczą i elektrokoagulację.</li>
		<li>Umieścić jedną strzykawkę o pojemności 50 ml z 25 ml soli fizjologicznej w kolorze heparyny (2 500 j/l) w ciepłym inkubatorze (37 °C).</li>
		<li>Na stole operacyjnym należy odpowiednio umieścić narzędzia chirurgiczne, jedwabny szew 6 - 0, sterylny mały bawełniany aplikator, sól fizjologiczną weterynaryjną (500 ml) i gąbki z włókniny (10 cm x 10 cm).</li>
		<li>Umieść igłę 26 G na stole operacyjnym, aby utworzyć mały otwór w pokrywie probówki do mikrowirówki o pojemności 0,5 ml, aby otrzymać rurkę żółciową do zbierania żółci.</li>
		<li>Na stole operacyjnym umieścić kaniulę (kaniulę poliuretanową 1 Fr lub kaniulę polietylenową UT - 03) i wysterylizowaną probówkę mikrowirówkową o pojemności 0,5 ml do pobrania żółci.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Samodzielnie wykonana kaniula żyły wrotnej
	<ol>
		<li>Chwyć kaniulę 2 Fr kleszczami i nakłuj ścianę igłą 30 G w odległości 1 cm od końca kaniuli. Przepchnij igłę przez kaniulę, aż końcówka igły stanie się widoczna.</li>
		<li>Przytnij końcówkę kaniuli, tworząc ostry trójkąt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie soli fizjologicznej poddanej heparynizacji
	<ol>
		<li>Przygotować 25 ml soli fizjologicznej w postaci heparyny o końcowym stężeniu 2 500 j.m./ml.</li>
		<li>Usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza i umieścić strzykawkę w inkubatorze o temperaturze 40 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Demonstracja systemu perfuzyjnego
	<ol>
		<li>Zobacz Rysunek 1 dla głównych elementów systemu perfuzji maszyny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyposażenie sali organowej
	<ol>
		<li>Zobacz Rysunek 2 dla układu komory organowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja systemu perfuzyjnego
	<ol>
		<li>Włącz program wykresu laboratoryjnego do monitorowania ciśnienia.</li>
		<li>Podłączyć kalibrator ciśnienia i czujnik ciśnienia na poziomie komory organowej.</li>
		<li>Ustaw kalibrator ciśnienia tak, aby wskazywał 0 mmHg i sprawdź odpowiednią wartość w oprogramowaniu do kontroli ciśnienia.</li>
		<li>Ustaw kalibrator ciśnienia tak, aby odczytywał 20 mmHg i ponownie sprawdź odpowiednią wartość w oprogramowaniu do kontroli ciśnienia.</li>
		<li>Włączyć łaźnię wodną i ogrzać komorę organową do 40 °C.</li>
		<li>Przepłucz całą instalację wodno-kanalizacyjną dwukrotnie destylowaną wodą dejonizowaną przez 30 minut, zapewniając całkowite usunięcie roztworu odkażającego.</li>
		<li>Zainicjować cyrkulację roztworu dezynfekującego w całym systemie na czas 20 minut, aby zapewnić dokładną dezynfekcję.</li>
		<li>Włączyć mieszaninę gazów (95% tlenu (O2) i 5% dwutlenku węgla (CO2 ).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypełnienie perfuzyjne
	<ol>
		<li>Uzupełnij 250 ml pożywki E Williamsa 50 ml płodowej surowicy bydlęcej, 3 ml penicyliny/streptomycyny (1 mg / ml), 0,17 ml insuliny (100 IE / ml), 0,34 ml heparyny (5000 U / ml) i 0,07 ml hydrokortyzonu (100 mg / 2 ml), aby przygotować kompletną pożywkę E Williamsa.</li>
		<li>Dodać równe objętości (150 ml) perfuzatu do zbiornika i komory organowej, aby zalać system. 
		UWAGA: Należy zwrócić szczególną uwagę na zachowanie sterylności podczas procesu napełniania. Perfuzat jest stale pompowany przez te dwa kluczowe elementy zamkniętej perfuzji maszyny recyrkulacyjnej.</li>
		<li>Włącz pompę perystaltyczną ze średnią prędkością (15 ml/min), aby zalać system perfuzyjny natlenionym medium.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Eksplantacja wątroby
<ol>
	<li>Przygotowanie przedoperacyjne
	<ol>
		<li>Zważ zwierzę. Przygotować przeciwbólową buprenorfinę (0,3 mg/ml) (0,05 mg/kg masy ciała).</li>
		<li>Podłącz komorę indukcyjną do gniazdka ściennego. Ustaw tlen na 0,5 l/min. Zmień poziom izofluranu na 3%.</li>
		<li>Umieść zwierzę w komorze do momentu osiągnięcia znieczulenia głębokiego (dodatniego odruchu prostującego).</li>
		<li>Za pomocą mikrostrzykawki nanieść podskórnie dawkę środka przeciwbólowego dostosowaną do masy ciała.</li>
		<li>Użyj golarki elektrycznej, aby przyciąć sierść na skórze brzucha.</li>
		<li>Przenieś mysz na stół operacyjny i włącz parownik izofluranu do 2,5%, aby utrzymać znieczulenie. Potwierdź głębokość znieczulenia, badając odruch międzypalcowy palca u nogi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie brzucha myszy
	<ol>
		<li>Umieść mysz w pozycji leżącej.</li>
		<li>Przetestuj odruch międzypalcowy, aby dwukrotnie potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia. Przymocuj wszystkie cztery kończyny taśmą.</li>
		<li>Zdezynfekuj obie strony brzucha do środkowej linii pachowej za pomocą trzech kolejnych rund alkoholu jodowego. Użyj włókniny sterylizowanej gazy, aby pokryć obszar wokół pola operacyjnego.</li>
		<li>Wykonaj 3 cm poprzeczne nacięcie 1 cm poniżej mieczyka mieczykowatego w okolicy brzucha myszy za pomocą nożyczek dla niemowląt Metzenbaum i kleszczy chirurgicznych.</li>
		<li>Przedłuż nacięcie skóry obustronnie do linii środkowej pachy po obu stronach.</li>
		<li>Ostrożnie wykonaj 2 cm podłużne nacięcie wzdłuż linii alba za pomocą nożyczek sprężynowych.</li>
		<li>Przetnij warstwę mięśni brzucha za pomocą elektrokoagulacji i nożyczek sprężynowych Vannas.</li>
		<li>Ostrożnie umieść kawałek mokrej gazy, aby chronić wątrobę przed elektrokoagulacją.</li>
		<li>Użyj jedwabnego szwu 6 - 0 z okrągłą igłą, aby cofnąć wyrostek mieczykowaty w celu lepszego odsłonięcia więzadła wieńcowego.</li>
		<li>Użyj dwóch zwijaczy żeber, aby całkowicie odsłonić jamę brzuszną myszy.</li>
		<li>Ostrożnie wyjmij jelito cienkie z jamy brzusznej za pomocą mokrego wacika, aby całkowicie odsłonić wnękę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparat do wspólnych dróg żółciowych
	<ol>
		<li>Przeciąć więzadła sierpowe, przeponowe i żołądkowo-wątrobowe ostrymi nożyczkami.</li>
		<li>Ostrożnie udrożnij wspólny przewód żółciowy za pomocą cienkich zakrzywionych kleszczyków bez zębów. 
		UWAGA: Przewód żółciowy wspólny bardzo łatwo ulega uszkodzeniu i pęka. Po pęknięciu nie można go kaniulować. Ze względu na kierunek pozycji anatomicznej lepiej jest stosować zakrzywione kleszcze.</li>
		<li>Umieść dwie pętle szwów jedwabnych 6 - 0 nad wspólnym przewodem żółciowym, przygotowując się do następnego kroku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kaniulacja dróg żółciowych wspólnych
	<ol>
		<li>Ostrożnie nakłuć przewód żółciowy igłą 30 G. Użyj spiczastych, zakrzywionych kleszczy, aby powiększyć mały otwór, aby pasował do kaniulacji przewodu żółciowego.</li>
		<li>Użyj kleszczy kaniulacyjnych naczyń, aby chwycić kaniulę przewodu żółciowego i wepchnąć ją do przewodu żółciowego.</li>
		<li>Podwójnie zabezpiecz kaniulę za pomocą wstępnie ustawionych pętli do szwów 6 - 0. 
		UWAGA: Podczas kaniulacji odczuwalny jest opór żółci. Jeśli siła nie jest dobrze kontrolowana, kaniula zostanie wypchnięta z dróg żółciowych przez ciśnienie odpływu żółci. Ostrożnie wyreguluj głębokość kaniuli. Jeśli jest zbyt głęboki, może uszkodzić przewód żółciowy, a jeśli nie jest wystarczająco głęboki, może się wyślizgnąć.</li>
		<li>Obserwuj przepływ żółci w kaniuli po udanej kaniulacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie żyły wrotnej
	<ol>
		<li>Zacisnąć żyłę wrotną za pomocą płaskich kleszczy i ostrożnie uwolnić tkankę łączną za pomocą zakrzywionych kleszczyków. Nie ciągnij mocno, aby nie spowodować rozerwania żyły wrotnej. Po uszkodzeniu żyły wrotnej trudno jest ponownie kaniulować żyłę wrotną.</li>
		<li>Rozetnij PV tuż nad rozwidleniem i umieść pierwszą pętlę szwu za pomocą jedwabnego szwu 6 - 0 na PV w pobliżu zbiegu, aby można było go później użyć.</li>
		<li>Umieść drugą pętlę do szwów w celu późniejszego zamocowania PV jak najbliżej wnęki wątroby.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kaniulacja żyły wrotnej
	<ol>
		<li>Użyj klipsa tętniczego, aby zamknąć dystalną żyłę wrotną.</li>
		<li>Bardzo ostrożnie przebij żyłę wrotną jedną z powyższych kaniul żyły wrotnej. Po udanym nakłuciu można wyraźnie zaobserwować przepływ krwi w kaniuli.</li>
		<li>Zabezpiecz kaniulę PV za pomocą wstępnie założonej pętli do szwów 6 - 0.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uderzenie wątroby
	<ol>
		<li>Zwiększ poziom izofluranu do 5% i poddaj mysz eutanazji z powodu przedawkowania inhalacji izofluranu.</li>
		<li>Pobrać wstępnie podgrzany roztwór soli fizjologicznej heparyny z inkubatora. Usuń wszystkie pęcherzyki powietrza powstałe wewnątrz heparynizowanej soli fizjologicznej.</li>
		<li>Umieścić strzykawkę z podgrzanym roztworem soli fizjologicznej w pompie strzykawkowej.</li>
		<li>Podłącz rurkę przedłużającą pompy strzykawkowej do kaniuli żyły wrotnej, ustaw prędkość na 2 ml/min i rozpocznij płukanie wątroby.</li>
		<li>Obserwuj kolor wątroby pod koniec procedury płukania. Wytnij wątrobę, gdy kolor zmieni się na jednorodny żółty.</li>
		<li>Przeciąć przeponę, żyłę główną nadwątrobową dolną, żyłę główną podwątrobową, tętnicę wątrobową, dystalną żyłę wrotną i pozostałą tkankę łączną.</li>
		<li>Umieść wątrobę na szalce Petriego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Połączenie wątroby i komory
<ol>
	<li>Przeszczep wątroby
	<ol>
		<li>Ostrożnie przenieś wątrobę do komory narządów za pomocą szalki Petriego.</li>
		<li>Na szalce Petriego należy przechowywać niewielką ilość soli fizjologicznej, aby zapobiec wysuszeniu wątroby. 
		UWAGA: Żyła wrotna i przewód żółciowy mogą zostać łatwo skręcone podczas tego zabiegu, co może wpływać na perfuzję wątroby i zbieranie żółci.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłączenie kaniuli żyły wrotnej
	<ol>
		<li>Powoli wlej zwykłą sól fizjologiczną do kaniuli żyły wrotnej za pomocą strzykawki, aby usunąć pęcherzyki powietrza z kaniuli.</li>
		<li>Podłącz kaniulę żyły wrotnej do rurki odpływowej perfuzatu w komorze narządu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłączenie kaniuli przewodu żółciowego
	<ol>
		<li>Przeprowadź kaniulę przewodu żółciowego myszy przez zawór gumowej nasadki, która jest połączona z komorą narządu.</li>
		<li>Włożyć kaniulę przewodu żółciowego do wcześniej przygotowanej mikroprobówki o pojemności 0,5 ml z małym otworem w pokrywce.</li>
		<li>Umieść mikroprobówkę na glinie na zewnątrz komory organowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Dostosuj natężenie przepływu zgodnie z ciśnieniem PV
<ol>
	<li>Włączyć pompę perystaltyczną od 1 ml/min.</li>
	<li>Sprawdź odczyt ciśnienia w żyłach portalowych, aby dostosować natężenie przepływu.</li>
	<li>Utrzymuj ciśnienie w żyle wrotnej w fizjologicznym zakresie od 7 do 10 mmHg, regulując natężenie przepływu. 
	UWAGA: Nominalne natężenie przepływu może się nieznacznie różnić w zależności od zastosowania i umiejscowienia rur.</li>
</ol>
5. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Pobrać próbki perfuzjatu wlotowego z rurki wlotowej żyły wrotnej i wylotowe próbki perfuzjatu z komory narządowej w odstępach 3-godzinnych.</li>
	<li>Pobrać próbki ze wszystkich płatów wątroby do analizy histologicznej pod koniec okresu perfuzji wynoszącego 12 godzin.</li>
</ol>

Nie ma żadnych finansowych konfliktów interesów, które można by ujawnić.

Krytyczne kroki w protokole Dwa kluczowe etapy eksplantacji wątroby to kaniulacja żyły wrotnej (PV) i późniejsza kaniulacja przewodu żółciowego (BD). Kroki te mają ogromne znaczenie dla zapewnienia pomyślnego pobrania narządu i późniejszych procedur perfuzji lub przeszczepu.
Wyzwania i rozwiązania Kaniulacja PV wiąże się z trzema wyzwaniami: uszkodzeniem ściany naczynia, przemieszczeniem cewnika i praktycznością procesu wprowadzania. Delikatna natura...

Przeszczep wątroby stanowi złoty standard leczenia dla osób ze schyłkową niewydolnością wątroby. Niestety, popyt na narządy od dawców przewyższa dostępną podaż, co prowadzi do znacznego niedoboru. W 2021 roku około 24 936 pacjentów znajdowało się na liście oczekujących na przeszczep wątroby, podczas gdy tylko 9 234 przeszczepy zostały pomyślnie wykonane1. Znaczna dysproporcja między podażą a popytem na przeszczepy wątroby podkreśla pilną potrzebę zbadania alternatywnych strategii w celu poszerzenia puli dawców i zwiększenia dostępności przeszczepów wątroby. Jednym ze sposobów na rozszerzenie puli darczyńców jest użycie marginalnych darczyńców2. Dawcami marginalnymi są osoby w podeszłym wieku, z umiarkowanym lub ciężkim stłuszczeniem. Chociaż przeszczepienie narządów brzeżnych może przynieść korzystne wyniki, ogólne wyniki pozostają nieoptymalne. W związku z tym obecnie trwają prace nad strategiami terapeutycznymi mającymi na celu poprawę funkcji dawców marginalnych3,4.
Jedną ze strategii jest wykorzystanie perfuzji maszynowej, zwłaszcza normotermicznej natlenionej perfuzji maszynowej, w celu poprawy funkcji tych marginalnych narządów5. Jednak nadal istnieje ograniczona wiedza na temat mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw korzystnych skutków normotermicznej utlenionej perfuzji maszynowej (NEVLP). Myszy, ze względu na dużą dostępność genetycznie modyfikowanych szczepów, służą jako cenne modele do badania szlaków molekularnych. Na przykład coraz częściej dostrzega się znaczenie szlaków autofagii w łagodzeniu uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego wątroby6,7. Jednym z ważnych szlaków molekularnych w uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym wątroby jest szlak miR-20b-5p/ATG78. Obecnie dostępnych jest wiele szczepów myszy ATG z nokautem i warunkowym nokautem, ale nie ma odpowiadających im szczepów szczurów9.
Na podstawie tego tła, celem było wygenerowanie zminiaturyzowanej platformy NEVLP do przeszczepów wątroby myszy. Platforma ta ułatwiłaby eksplorację i ocenę potencjalnych strategii modyfikowanych genetycznie mających na celu poprawę funkcjonalności wątroby dawcy. Ponadto istotne było, aby system był odpowiedni do długotrwałej perfuzji, umożliwiając leczenie ex vivo wątroby, powszechnie określane jako "naprawa narządów".
Biorąc pod uwagę ograniczoną dostępność istotnych danych in vitro na temat perfuzji wątroby myszy, przegląd literatury skupił się na badaniach przeprowadzonych na szczurach. Systematyczne przeszukiwanie literatury z lat 2010-2022 przeprowadzono przy użyciu słów kluczowych, takich jak "normotermiczna perfuzja wątroby", "ex vivo lub in vitro" oraz "szczury". Poszukiwania te miały na celu zidentyfikowanie optymalnych warunków u gryzoni, co pozwoliło nam określić najbardziej odpowiednie podejście.
System perfuzyjny składa się z szczelnego szklanego zbiornika buforowego z płaszczem wodnym, perystaltycznej pompy rolkowej, dotleniacza, pułapki bąbelkowej, wymiennika ciepła, komory organowej i systemu rurek o zamkniętym obiegu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). System zapewnia precyzyjne utrzymanie stałej temperatury perfuzji wynoszącej 37 °C za pomocą dedykowanej maszyny termostatycznej. Perystaltyczna pompa rolkowa napędza przepływ perfuzatu w całym obwodzie. Obwód perfuzyjny rozpoczyna się w izolowanym zbiorniku z płaszczem wodnym. Następnie perfuzat jest kierowany przez natleniacz, który otrzymuje mieszaninę gazów składającą się w 95% z tlenu i 5% dwutlenku węgla z dedykowanej butli gazowej. Po natlenieniu perfuzat przechodzi przez pułapkę pęcherzykową, w której wszelkie uwięzione pęcherzyki są przekierowywane z powrotem do zbiornika przez pompę perystaltyczną. Pozostały perfuzat przepływa przez wymiennik ciepła i dostaje się do komory organowej, skąd wraca do zbiornika.
Tutaj opisujemy nasze doświadczenia związane z tworzeniem NEVLP dla wątroby myszy i dzielimy się obiecującymi wynikami eksperymentu pilotażowego przeprowadzonego przy użyciu natlenionej pożywki bez nośników tlenu.

<table><tbody><tr><td>0,5 ml Mikroprobówka PP</td><td>Sarstedt</td><td>72699</td><td></td></tr><tr><td>1 Fr Kaniula gumowa Kaniula</td><td>Vygon</td><td>Próbka</td><td></td></tr><tr><td>10 &mikro; L Mikrostrzykawka</td><td>Hamilton</td><td>701N</td><td></td></tr><tr><td>2 Fr Gumowa kaniula</td><td>Vygon</td><td>Próbka</td><td></td></tr><tr><td>24 G Kaniula motylkowa</td><td>Terumo</td><td>SR+OF2419</td><td></td></tr><tr><td>26 G Kaniula motylkowa</td><td>Terumo</td><td>SR+DU2619WX</td><td></td></tr><tr><td>30 G Igła podskórna</td><td>Sterican</td><td>100246</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Pompka strzykawkowa</td><td>Braun</td><td>110356</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Perma-Hand Seide</td><td>Ethicon</td><td>639H</td><td></td></tr><tr><td>Klips tętniczy</td><td>Braun</td><td>BH014R</td><td></td></tr><tr><td>Autoklawowalna komora nawilżana</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>73-4733</td><td></td></tr><tr><td>Duży aplikator bawełniany&nbsp;</td><td>NOBA Verbandmittel Danz GmbH</td><td>974018</td><td></td></tr><tr><td>Pułapka bąbelkowa</td><td>Hugo-Sachs-Elektronik</td><td>V83163</td><td></td></tr><tr><td>Buprenovet (0,3 mg / ml)</td><td>Elanco</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>CIDEX OPA roztwór (2 L)</td><td>Cilag GmbH</td><td>20391</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka elektrochirurgiczna do cięcia monopolarnego VIO&reg; 50 C</td><td>ERBE</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca(500 ml)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina gazów (95% tlenu i 5% dwutlenku węgla)</td><td>Zaopatrzenie domu</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>ogrzewanie Łaźnie obiegowe</td><td>Harvard-Apparatus</td><td>75-0310</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna 5000 (I.E. /5 ml)</td><td>Braun</td><td>1708.00.00</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon (100 mg / 2 ml)</td><td>Pfizer</td><td>15427276</td><td></td></tr><tr><td>Insulina (100 IE / ml)</td><td>Sigma</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do irysów&nbsp;</td><td>Fine Science Instruments</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (250 ml)</td><td>Cp-Pharma</td><td>1214</td><td></td></tr><tr><td>Natleniacz membranowy</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>T18728</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop mikrochirurgiczny&nbsp;</td>Zestaw zwijacza myszy <td>Leica</td><td>M60</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Carfil Quality</td><td>180000056</td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer 2.0 HT</td><td>Hamamatsu</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Gąbki włókninowe&nbsp;</td><td>Kompressen</td><td>866110</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna (1 mg / ml)&nbsp;</td><td>C.C.Pro</td><td>Z-13-M</td><td></td></tr><tr><td>Rurka przedłużająca perfuzji (30 cm)Pompa perystaltyczna</td> <td>Braun</td><td>4256000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Harvard-Apparatus</td><td>P-70</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego 100x15 mm</td><td>VWR&reg;</td><td>391-0578</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-Jod (Vet-Sep Spray)</td><td>Livisto</td><td>799-416</td><td></td></tr><tr><td>Symulator przetwornika ciśnienia</td><td>UTAH Produkty medyczne</td><td>650-950</td><td></td></tr><tr><td>Przetworniki ciśnienia krwi wielokrotnego użytku</td><td>AD Instruments</td><td>MLT-0380/D</td><td></td></tr><tr><td>S & Kleszcze do kaniulacji naczyń T</td><td>Fine Science Instruments</td><td>00608-11</td><td></td></tr><tr><td>Mały aplikator bawełniany</td><td>NOBA Verbandmittel Danz GmbH</td><td>974116</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze proste 10 cm&nbsp;</td><td>Fine Science Instruments</td><td>00632-11</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do wiązania szwów</td><td>Fine Science Instruments</td><td>11063-07</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 50ml Oryginalny Perfusor</td><td>Braun</td><td>8728810F-06</td><td></td></tr><tr><td>UT - 03 Kaniula</td> Unikalne nożyczki <td>sprężynowe Medical, Japonia</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Vannas</td><td>Fine Science Instruments</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna weterynaryjna (500 ml)</td><td>WDT</td><td>18X1807</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik z płaszczem wodnym&nbsp; 2 L</td><td>Aparat Harvard</td><td>73-3441</td><td></td></tr><tr><td>William's E Medium (500 ML)</td><td>Thermofischer</td><td>Scientific A1217601</td><td></td></tr></tbody></table>

normothermiczna perfuzja płuc ex vivo w wątrobie u myszy

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

Ten protokół przedstawia zoptymalizowany system NEVLP wolny od erytrocytów przy użyciu mysich wątrob. Konserwację ex vivo wątroby myszy osiągnięto dzięki zastosowaniu zmodyfikowanych kaniul i technik zaadaptowanych z konwencjonalnych komercyjnych urządzeń do perfuzji ex vivo. System wykorzystano do oceny wyników konserwacji po 12 godzinach perfuzji. Myszy C57BL/6J służyły jako dawcy wątroby, a wątroby były eksplantowane przez kaniulację żyły wrotnej (PV) i przewodu żółciowego (BD), a następnie przepłukiwanie narządu ciepłą (37 °C) heparynizowaną solą fizjologiczną. Następnie eksplantowane wątroby przeniesiono do komory perfuzyjnej i poddano normotermicznej perfuzji maszynowej z tlenem (NEVLP). Próbki perfuzatu wlotowego i wylotowego pobierano w odstępach 3-godzinnych do analizy perfuzatu. Po zakończeniu perfuzji pobrano próbki wątroby do analizy histologicznej, z integralnością morfologiczną ocenianą za pomocą zmodyfikowanego Suzuki-Score poprzez barwienie Hematoxylin-Eosin (HE). Eksperymenty optymalizacyjne przyniosły następujące wyniki: (1) myszy ważące ponad 30 g uznano za bardziej odpowiednie do eksperymentu ze względu na większy rozmiar ich przewodu żółciowego (BD). (2) kaniula poliuretanowa 2 Fr (średnica zewnętrzna = 0,66 mm) lepiej nadawała się do kaniulacji żyły wrotnej (PV) w porównaniu z kaniulą polipropylenową. Przypisano to lepszej przyczepności materiału poliuretanowego, co skutkowało zmniejszeniem ślizgania się cewnika podczas przenoszenia z ciała do komory narządu. (3) w przypadku kaniulacji przewodu żółciowego (BD) stwierdzono, że kaniula poliuretanowa 1 Fr (średnica zewnętrzna = 0,33 mm) jest bardziej skuteczna w porównaniu z kaniulą polipropylenową UT - 03 (średnica zewnętrzna = 0,30 mm). Dzięki temu zoptymalizowanemu protokołowi wątroby myszy zostały z powodzeniem zachowane przez 12 godzin bez znaczącego wpływu na strukturę histologiczną. Zabarwienie hematoksyliną-eozyną (HE) ujawniło dobrze zachowaną architekturę morfologiczną wątroby, charakteryzującą się przewagą żywotnych hepatocytów z wyraźnie widocznymi jądrami i łagodnym poszerzeniem sinusoid wątrobowych.

Ustalenie procedury chirurgicznej 
W eksperymencie wykorzystano łącznie 17 zwierząt: 14 myszy posłużyło do optymalizacji procesu pozyskiwania organów, w tym kaniulacji żyły wrotnej (PV) i przewodu żółciowego (BD), natomiast 3 myszy wykorzystano do walidacji procedury (Tabela 1). Wyniki histologiczne (Rycina 3) porównano w celu ułatwienia identyfikacji optymalnych warunków perfuzji.
Wybór perfuzatu 
Do niniej...

Dla mysich wątrob stworzono normotermiczny system perfuzji wątroby ex vivo (NEVLP). System ten wymaga doświadczenia w mikrochirurgii, ale pozwala na uzyskanie powtarzalnych wyników perfuzji. Możliwość wykorzystania wątroby myszy ułatwia badanie szlaków molekularnych w celu identyfikacji nowych dodatków perfuzatu i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów skoncentrowanych na naprawie narządów.

Normothermiczna perfuzja płuc ex vivo w wątrobie u myszy

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing ...

Normothermiczna perfuzja płuc ex-vivo u myszy. Normothermiczna natleniona perfuzja wątroby jest obiecującą strategią ratowania narządów brzeżnych i została niedawno wprowadzona do praktyki klinicznej. Jednak podstawowe mechanizmy molekularne nie są dobrze poznane.Do dalszych badań szlaków molekularnych potrzebny jest model mysim, wykorzystujący genetycznie modyfikowane zwierzęta, takie jak myszy transgeniczne, czekając w ten sposób na ustanowienie normotermicznego systemu perfuzji maszynowej z tlenem dla wątroby myszy. Oto schemat całego naszego systemu. Po pierwsze, cały system jest sterowany w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą regulatora termostatycznego poprzez obieg wody.Perfuzat jest pompowany ze zbiornika przez pompę perystaltyczną do natleniacza. W oksygenatorze występuje nieprzerwany przepływ gazu składający się z 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Perfuzat przechodzi następnie przez pułapkę bąbelkową.Perfuzat z pęcherzykami powietrza jest pompowany z powrotem do zbiornika pod ciśnieniem. Pozostały perfuzat przepływa do komory narządu, gdzie rurka jest połączona z żyłą wrotną. Perfuzat jest odprowadzany z wątroby przez jamę nadwątrobową do komory narządu.Odpływ perfuzatu z komory narządowej kierowany jest z powrotem do zbiornika przez pompę perystaltyczną. Rurka drenażowa jest podłączona do komory narządowej w celu zbierania żółci. To jest nasz stół operacyjny.Wszystkie operacje wykonywane są pod mikroskopem. Utrzymujemy półsterylne warunki operacyjne przez cały czas trwania zabiegu chirurgicznego. Przytrzymaj kaniulę francuskiej rurki za pomocą kleszczy.Przebić ścianę kaniuli igłą 30G w odległości jednego centymetra od końca kaniuli. Przepchnij igłę przez kaniulę, aż końcówka igły stanie się widoczna. Oto zdjęcie porównawcze cewnika 26G i samodzielnie wykonanej kaniuli; Oba nadają się do kaniulacji portalu myszy.Przygotuj 25 mililitrów heparynizowanej soli fizjologicznej o końcowym stężeniu 2 500 jednostek międzynarodowych na mililitr i umieść strzykawkę w inkubatorze ustawionym na 40 stopni Celsjusza. Oto główne elementy normotermicznego systemu perfuzji maszynowej ex-vivo. Komponenty obejmują głównie komorę organową, maszynę termostatyczną, pompę rolkową, natleniacz i zbiornik.Tutaj można zobaczyć szczegółowy układ naszej komory organowej. Zasadniczo składa się z korpusu komory narządowej, czujnika ciśnienia, wymiennika ciepła i pułapki bąbelkowej. Ustawiamy wlot perfuzatu, wylot perfuzatu i port odprowadzania żółci.Jest to system monitorowania ADI, którego używamy do monitorowania ciśnienia w żyle wrotnej. System ADI składa się z czujnika ciśnienia, centralnego sterownika i wyświetlaczy. Włącz program LabChart do monitorowania ciśnienia.Kalibracja i zerowanie są wymagane przed każdym użyciem czujnika ciśnienia. Użyj rtęci zeromilimetrowej i rtęci 20-milimetrowej jako oznaczeń do kalibracji czujnika ciśnienia do kalibracji dwuetapowej. Opierając się na stałym monitorowaniu ciśnienia w portalu, możemy dostosować fluran portalowy do zmian ciśnienia.Przy równych objętościach perfuzatu do zbiornika i komory narządowej w celu zalania systemu, należy zwrócić szczególną uwagę na utrzymanie sterylności podczas procesu napełniania. Podłącz komorę indukcyjną do gniazdka ściennego. Zmień tlen na 0,5 litra na minutę.Ustaw izofluran na 3%Umieść zwierzę w komorze, aż do osiągnięcia głębokiego znieczulenia. Za pomocą mikrostrzykawki nanieść dawkę środka przeciwbólowego dostosowaną do masy ciała. Tutaj siedem mikrolitrów buprenorfiny.Teraz przystępujemy do operacji chirurgicznej. Wykonaj poprzeczne nacięcie w okolicy brzucha myszy. Nacięcie skóry rozciąga się do obustronnej mięsnej linii pachowej po obu stronach.Ostrożnie wykonaj podłużne nacięcie wzdłuż linea alba. Przeciąć warstwę mięśni brzucha za pomocą elektrokoagulacji i nożyczek. Ostrożnie umieść kawałek mokrej gazy, aby chronić wątrobę przed elektrokoagulacją.Całkowicie odsłoń jamę brzuszną myszy. Ostrożnie wyjmij jelito cienkie z jamy brzusznej za pomocą mokrego wacika, aby całkowicie odsłonić wnękę. Pokazano tutaj schematyczny schemat kaniulacji żyły wrotnej i kaniulacji dróg żółciowych.Zasadniczo dobieramy odpowiednią kaniulę w zależności od wielkości myszy, a do zamocowania kaniuli używamy jedwabnego szwu 6-0. Ostrożnie uwolnij wspólny przewód żółciowy za pomocą cienkich zakrzywionych kleszczyków bez zębów. Wspólny przewód żółciowy bardzo łatwo ulega uszkodzeniu i pęknięciu.Po pęknięciu nie można go kaniulować. Ze względu na kierunek anatomicznej pozycji, zakrzywione kleszcze są łatwiejsze w obsłudze. Umieść dwie jedwabne pętle do szwów 6-0 nad wspólnym przewodem żółciowym, przygotowując się do następnego kroku.Ostrożnie nakłuć przewód żółciowy igłą 30G. Użyj spiczastych zakrzywionych kleszczy, aby powiększyć małe otwory, aby mogły zasilać kaniulację dróg żółciowych. Użyj kleszczyków do kaniulacji naczyń w poprzek kaniuli dróg żółciowych i wepchnij ją do przewodu żółciowego. Nuta.W momencie kaniulacji poczujesz opór, jaki niesie ze sobą żółć. Jeśli siła nie jest dobrze kontrolowana, kaniula zostanie wypchnięta z dróg żółciowych przez ciśnienie odpływu żółci. Ostrożnie wyreguluj głębokość kaniuli.Jeśli jest zbyt głęboki, może uszkodzić przewód żółciowy, a jeśli nie jest wystarczająco głęboki, może się wyślizgnąć. Przepływ żółci można zaobserwować w kaniuli po udanej kaniulacji. Zacisnąć żyłę wrotną za pomocą płaskich kleszczy i ostrożnie uwolnić tkankę łączną za pomocą zakrzywionych kleszczyków.Nie ciągnij tutaj mocno, aby nie spowodować rozerwania żyły wrotnej. Gdy żyła wrotna jest uszkodzona, trudno jest ją ponownie kaniulować. Umieść dwie jedwabne pętle szwów 6-0 nad wolną żyłą wrotną.Użyj klipsa tętniczego, aby zamknąć dystalną żyłę wrotną. Bardzo ostrożnie nakłuj żyłę wrotną jedną z powyższych kaniuli żyły wrotnej. Po udanym nakłuciu można wyraźnie zaobserwować przepływ krwi w kaniuli.Weź wstępnie podgrzany roztwór soli fizjologicznej heparyny z inkubatora. Usuń wszystkie pęcherzyki powietrza. Włożyć strzykawkę z podgrzanym roztworem soli fizjologicznej do pompy strzykawkowej.Podłączyć rurkę przedłużającą pompy strzykawkowej do kaniuli żyły wrotnej. Dostosuj prędkość do dwóch mililitrów na minutę i rozpocznij płukanie wątroby. Zwiększ poziom izofluranu do 5% i poddaj mysz eutanazji za pomocą inhalacji z przedawkowaniem izofluranu.Obserwuj kolor wątroby pod koniec procedury płukania. Wytnij wątrobę, gdy kolor zmieni się na jednorodny żółty. Ostrożnie przenieś wątrobę do komory narządów za pomocą szalki Petriego.Trzymaj niewielką ilość soli fizjologicznej na szalce Petriego, aby zapobiec zmiażdżeniu wątroby. Nuta. Żyła wrotna i przewód żółciowy mogą zostać łatwo skręcone podczas tego zabiegu, co może wpływać na perfuzję wątroby i zbieranie żółci. Powoli wlej zwykłą sól fizjologiczną do kaniuli żyły wrotnej za pomocą strzykawki, aby usunąć pęcherzyki powietrza z kaniuli.Podłącz kaniulę żyły wrotnej do rurki odpływowej perfuzatu w komorze narządu. Kaniula przewodu żółciowego myszy jest prowadzona przez zawór komory narządu, który jest zamknięty gumową nasadką. Następnie rurkę żółciową wkłada się do wcześniej przygotowanej mikrorurki o pojemności 0,5 mililitra z małym otworem w przewodzie.Po podłączeniu wszystkiego włącz pompę perystaltyczną. Sprawdź odczyt ciśnienia w żyłach portalowych, aby dostosować natężenie przepływu. Utrzymuj ciśnienie w żyle wrotnej między 7 a 10 milimetrów słupa rtęci, regulując natężenie przepływu. Nuta.Nominalne natężenie przepływu może się nieznacznie różnić w zależności od wieku i umiejscowienia rur. Jest to wybór pożywki perfuzacyjnej, objętości perfuzatu i ciśnienia perfuzji w oparciu o przegląd literatury normotermicznych badań perfuzji natlenionej wątroby szczura. Jest to próba krok po kroku mająca na celu ustalenie modelu perfuzji myszy.Potrzeba było około 14 eksperymentów, aby wybrać najbardziej odpowiednie cewniki. W naszych rękach użycie dwóch francuskich cewników gumowych do żyły wrotnej, wraz z jednym francuskim cewnikiem gumowym do przewodu żółciowego, jest najlepszą kombinacją, aby uzyskać jednorodną perfuzję ze wszystkimi cewnikami na miejscu. Poziom pH i poziom potasu były stabilne przez całą 12-godzinną perfuzję.Poziom pH wahał się od 7,26 do 7,71, a poziom potasu od 5,9 do 6,8 milimola na litr. Barwienie HE pokazuje, że po 12 godzinach perfuzji integralność histologiczna wątroby myszy była stosunkowo dobrze zachowana. Podsumowując, zademonstrowaliśmy tutaj pomyślne ustanowienie normotermicznego systemu perfuzji maszynowej z tlenem dla wątroby myszy.Perfuzja wątroby myszy przez 12 godzin spowodowała dobre zachowanie morfologii wątroby, choć nie w całym narządzie. Konieczne są dalsze wysiłki, aby osiągnąć całkowicie jednorodną perfuzję w dłuższym okresie czasu. Gdy to zostanie osiągnięte, można rozważyć wykorzystanie genetycznie zmodyfikowanych zwierząt, takich jak wykorzystanie myszy z nokautem IL-2 do zbadania roli stanu zapalnego.

normothermic-ex-vivo-liver-machine-perfusion-in-mouse

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Przeszczepy marginalne, takie jak stłuszczone wątroby, przeszczepy od starszych dawców lub wątroby pobrane po śmierci sercowej (DCD) źle znoszą tradycyjne, zimne przechowywanie statyczne. Opracowaliśmy nowatorski model subnormotermicznej perfuzji wątroby ex vivo w celu zachowania, oceny i naprawy brzeżnych przeszczepów wątroby przed przeszczepem.

Technika subnormotermicznej perfuzji wątroby ex vivo do przechowywania, oceny i naprawy brzeżnych przeszczepów wątroby

Tutaj prezentujemy protokół opisujący natlenioną perfuzję ex situ przeszczepów wątroby dawcy. Ten artykuł zawiera protokół krok po kroku dotyczący pozyskania i przygotowania przeszczepu wątroby do perfuzji maszynowej, przygotowania płynu perfuzyjnego, zalania maszyny perfuzyjnej i przeprowadzenia natlenionej normotermicznej perfuzji maszynowej przeszczepu wątroby.

Ex situ Perfuzja maszynowa Normothermiczna wątroby dawcy

Opisujemy metodę perfuzji ex vivo ludzkich przeszczepów wątroby w temperaturze subnormotermicznej (21 °C).

Funkcjonalne zachowanie i regeneracja wątroby człowieka za pomocą subnormotermicznej perfuzji maszynowej

Istnieje znaczny niedobór dawców wątroby, a kryteria dla dawców wątroby zostały rozszerzone. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) został opracowany w celu oceny i modyfikacji funkcji narządów. Badanie to demonstruje szczurzy model NEVLP i testuje zdolność pegylowanej katalazy do łagodzenia uszkodzeń wątroby.

Mały zwierzęcy model normacyjnej perfuzji wątroby ex vivo

Normothermic ex situ heart perfusion (ESHP), utrzymuje serce w bijącym, półfizjologicznym stanie. W przypadku wykonywania w trybie roboczym ESHP daje możliwość przeprowadzenia zaawansowanych ocen funkcji serca dawcy i żywotności narządów. W tym miejscu opisujemy naszą metodę oceny wydolności mięśnia sercowego podczas ESHP.

Normothermiczna perfuzja serca ex situ w trybie pracy: ocena czynności serca i metabolizmu

Protokół jest opisany dla perfuzji in situ dolnej części ciała myszy, w tym pęcherza, prostaty, narządów płciowych, kości, mięśni i skóry stóp.

Ustalanie in situ perfuzji w obiegu zamkniętym dolnych narządów jamy brzusznej i kończyn tylnych u myszy

Protokół opisuje prostą metodę resekcji nienaruszonej wątroby myszy do badań metabolicznych poprzez perfuzję żyły wrotnej.

Ex vivo Perfuzja wątrobowa przez żyłę wrotną u myszy

Opisany tutaj świński model normotermicznej perfuzji maszynowej wątroby (NMP) może być z powodzeniem wykorzystany do badania NMP jako strategii zachowania, narzędzia do oceny żywotności i platformy do naprawy narządów. Ma wysoką wartość translacyjną, jednak jest trudny technicznie i pracochłonny.

Chorobowa normemmiczna izolowana perfuzja wątroby u świń

Tutaj prezentujemy solidną metodę perfuzji in situ wątroby myszy do badania ostrej i bezpośredniej regulacji metabolizmu wątroby bez naruszania architektury wątroby, ale przy braku czynników pozawątrobowych.

Produkcja glukozy w wątrobie, mocznicozna, i lipoliza oznaczone ilościowo przy użyciu perfundowanego modelu wątroby myszy

Klirens insuliny wątrobowej jest kluczowy dla regulacji homeostazy glukozy. W tym artykule opisano przyjazną dla użytkownika procedurę perfuzji wątroby do bezpośredniej oceny szybkości klirensu insuliny w wątrobie in situ u myszy.

Ocena klirensu insuliny u myszy za pomocą perfuzji wątrobowej in situ

W tym miejscu przedstawiamy protokół dla otwartego, modyfikowalnego normotermicznego systemu perfuzji ex vivo , zaprojektowanego w celu przezwyciężenia wysokich kosztów i ograniczonej elastyczności istniejących platform, umożliwiając bardziej dostępne, opłacalne i iteracyjne wykorzystanie w przedklinicznych badaniach biomedycznych.

System perfuzji normamicznej o otwartym kodzie źródłowym przeznaczony dla naukowców

Poznaj normotermiczną perfuzję wątroby myszy ex vivo do badania mechanizmów molekularnych i naprawy narządów. System NEVLP umożliwia powtarzalne wyniki oraz identyfikację nowych dodatków do perfuzatu.

Normothermiczna perfuzja płuc ex vivo w wątrobie u myszy

Przeglądaj więcej filmów