In vitro Mapowanie chemiczne struktur DNA G-Quadruplex za pomocą bis-3-chloropiperydyn
12 maja 2023
Bis-3-chloropiperydyny (B-CePs) są użytecznymi sondami chemicznymi do identyfikacji i charakteryzowania struktur G-kwadrupleksu w matrycach DNA in vitro. Protokół ten szczegółowo opisuje procedurę przeprowadzania reakcji sondowania z B-i rozpuszczania produktów reakcji za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym o wysokiej rozdzielczości.
G-kwadrupleksy to drugorzędowe struktury kwasów nukleinowych, które zwykle powstają w sekwencjach DNA bogatych w guaninę. Mapowanie chemiczne G4 za pomocą B-CePs ma na celu scharakteryzowanie G4 in vitro i pozwala na identyfikację specyficznych guanin tworzących G-tetrady. Identyfikacja i eksperymentalna walidacja G4 w potencjalnych sekwencjach tworzących G-kwadrupleks jest biologicznie istotnym zagadnieniem, które jest obecnie rozwiązywane głównie za pomocą narzędzi obliczeniowych.
Aby wesprzeć takie przewidywania i wykryć nieprzewidzianego G4, mapowanie chemiczne za pomocą B-CePs stanowi dostępną metodę identyfikacji G4 w sekwencjach DNA. Mapowanie chemiczne za pomocą B-CePs jest wygodną alternatywą dla szeroko stosowanego protokołu śladowania siarczanu dimetylu do charakterystyki G-kwadrupleksów. Kluczową zaletą B-CePs jest to, że zmniejszył liczbę kroków w protokole i zmniejszył początkową ilość substratu DNA.
Mapowanie chemiczne za pomocą B-CePs jest opisane tutaj z sekwencją TBA jako dowód słuszności koncepcji. Protokół doprowadzi do nowych eksperymentów mających zastosowanie do każdej innej potencjalnej sekwencji tworzącej G-kwadrupleks, badając zarówno konstrukty DNA, jak i RNA. Zacznij od pipetowania jednoniciowych i dwuniciowych roztworów TBA G4-TBA do trzech różnych probówek do składania.
Podgrzewać próbki do temperatury 95 °C przez pięć minut. Pozwól im powoli ostygnąć do temperatury pokojowej. Gdy probówki ostygną do temperatury pokojowej, odwirować probówki.
Następnie uporządkuj trzy zestawy po siedem pustych autoklawowanych probówek o pojemności 0,5 ml. Do każdej probówki dodaj 3 l ultraczystej wody. Odpipetować 5 L złożonego kwasu nukleinowego do każdej probówki z zestawu.
Następnie dodaj 2 litry 25 lub 250 M B-1, aby uzyskać końcowe stężenie sondy odpowiednio 5 i 50 M. Do trzech probówek kontrolnych dodać ultraczystą wodę zamiast związku i inkubować wszystkie próbki w temperaturze 37 °C. Zatrzymać reakcję, umieszczając probówki w temperaturze 20 °C. Następnie wysuszyć próbki w wirówce próżniowej. Zacznij od przygotowania spolimeryzowanej kanapki z żelem PAGE.
Usuń zaciski i warstwy taśmy papierowej i powoli wyjmij grzebień. Dokładnie spłucz studzienki wodą destylowaną. Umieść prawidłowo kanapkę z żelem w pionowym aparacie do elektroforezy.
Napełnij górny i dolny zbiornik buforem TBE. Rozgrzej płytki, wykonując wstępny przebieg elektroforezy żelowej przez co najmniej 30 minut przy mocy 50 watów. W międzyczasie ponownie zawiesić wysuszone próbki w 5 litrach denaturującego buforu ładującego żel
.Następnie użyj małej strzykawki wypełnionej buforem do KZM, aby wypłukać mocznik z dołków żelu. Teraz załaduj próbki do czystych studzienek, zwracając uwagę na zapach ładowania. Uruchom żel przez dwie godziny z mocą 50 watów lub do momentu, gdy niebieski barwnik bromofenolowy spłynie z dwóch trzecich żelu.
Po elektroforezie wyłącz zasilanie, ostrożnie wyjmij szklaną kanapkę i wyczyść szklane płytki. Umieść żel w obrazie żelowym, aby wykryć fluorescencję prążków oligonukleotydowych znakowanych FAM. Po jednej, czterech i 15 godzinach inkubacji 5 lub 50 M B-1 reagowało z 2 M próbkami G4-TBA, jednoniciowymi i dwuniciowymi TBA.
Kontrole załadowano dla każdego zestawu próbek. Substrat TBA wykazywał tylko jeden addukt alkilacyjny ze względu na dostępność tylko G8 do alkilowania i późniejszego rozszczepienia nici. W jedno- i dwuniciowych TBA zaobserwowano liczne addukty i pasma produktów rozszczepienia, ponieważ wszystkie guaniny były podatne na reakcję B-.
Sondowanie reakcji i Tris Buffer skutkowały nieefektywnym mapowaniem chemicznym ze względu na obecność niepożądanych nukleofilów, co powodowało zmniejszenie reaktywności sondy. Próbki G4-TBA wykazały jedynie tworzenie się adduktów bez rozszczepienia nici. W przypadku jedno- i dwuniciowego TBA tylko 24-godzinna inkubacja doprowadziła do fragmentacji DNA porównywalnej z 15-godzinną fragmentacją bez Tris.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł omawia zastosowanie bis-3-chloropiperydyn (B-CePs) jako sond chemicznych służących do identyfikacji i charakterystyki struktur G-kwadrupleksów w DNA. Przedstawiony protokół opisuje metodę przeprowadzania reakcji sondowania oraz rozdzielania produktów za pomocą wysokorozdzielczej elektroforezy w żelu poliakryloamidowym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Biologia molekularna
- Genetyka
Wprowadzenie
- G-kwadrupleksy to struktury drugorzędowe tworzone w sekwencjach DNA bogatych w guaninę.
- B-CePs umożliwiają charakterystykę G-kwadrupleksów in vitro.
- Identyfikacja G-kwadrupleksów jest kluczowa dla zrozumienia ich znaczenia biologicznego.
- Mapowanie chemiczne za pomocą B-CePs stanowi alternatywę dla tradycyjnych metod, takich jak footprinting z użyciem dimetylosiarczanu.
Cel badania
- Dostarczenie protokołu wykorzystania B-CePs do badania struktur G-kwadrupleksów.
- Ułatwienie identyfikacji konkretnych guanin w tetradach G.
- Usprawnienie procesu charakteryzacji G-kwadrupleksów.
Zastosowane metody
- Reakcje sondowania z wykorzystaniem bis-3-chloropiperydyn (B-CePs).
- Wysokorozdzielcza elektroforeza w żelu poliakryloamidowym w celu rozdzielenia produktów.
- Techniki mapowania chemicznego do identyfikacji G-kwadrupleksów.
- Porównanie z protokołami footprintingu z użyciem dimetylosiarczanu.
Główne wyniki
- B-CePs skutecznie identyfikują struktury G-kwadrupleksów w DNA.
- Metoda ta zmniejsza liczbę etapów oraz ilość wymaganego substratu DNA.
- Walidacja eksperymentalna potwierdza przewidywania obliczeniowe dotyczące G-kwadrupleksów.
- Protokół zwiększa dostępność dla badaczy zajmujących się G-kwadrupleksami.
Wnioski
- B-CePs są cennym narzędziem w badaniach nad G-kwadrupleksami.
- Protokół ten upraszcza identyfikację i charakterystykę G-kwadrupleksów.
- Metoda ta może dostarczyć nowych informacji na temat biologicznych ról G-kwadrupleksów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Precyzyjne mapowanie struktur G-kwadrupleksów (G4) DNA ma kluczowe znaczenie dla walidacji celów w regulacji genów oraz szlakach związanych z chorobami. Test mapowania chemicznego B-CeP umożliwia bezpośrednią identyfikację guanin tworzących G-tetrady in vitro, co wspiera usuwanie ryzyk mechanistycznych i zwiększa pewność predykcyjną we wczesnej fazie odkrywania leków. Możliwość ta usprawnia ocenę potencjalnych celów terapeutycznych w bogatych w guaninę regionach genomowych, usprawniając selekcję i priorytetyzację portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią walidację eksperymentalną struktur G4 w obrębie potencjalnych sekwencji docelowych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez odróżnienie sfałdowanych G4 od niefałdowanych lub alternatywnych form DNA.
- Zwiększa pewność predykcyjną w odniesieniu do zidentyfikowanych obliczeniowo PQS poprzez dostarczenie ortogonalnych dowodów chemicznych.
- Zmniejsza niejednoznaczność w wyborze celów dla strategii regulacji genów i modyfikacji przebiegu chorób.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane substraty DNA zawierające G4 do dalszych procesów przesiewowych.
- Zapewnia mapowanie z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu, co wspiera standaryzację i powtarzalność testów.
- Umożliwia ilościową ocenę reaktywności sond oraz wzorców cięcia DNA w celu opracowania wiarygodnych testów.
- Upraszcza wymagania dotyczące próbek i etapy protokołu w porównaniu z tradycyjnymi metodami footprintingu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia zgodność z systemami istotnymi dla przebiegu chorób poprzez mapowanie struktur G4 zaangażowanych w ekspresję genów oraz stabilność genomową.
- Zapewnia ciągłość procesu od mapowania na etapie odkrywania do walidacji związków ukierunkowanych na G4 w modelach przedklinicznych.
- Wspiera optymalizację ryzyka podczas rozwoju projektu poprzez wyjaśnienie strukturalnych podstaw wiązania z celem.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Niniejszy test mapowania chemicznego integruje etap wczesnego odkrywania z identyfikacją związków wiodących, stanowiąc pomost pomiędzy przewidywaniami obliczeniowymi a eksperymentalną walidacją celów G4.
- Biologia odkrywcza: Potwierdza tworzenie się G4 i udział guaniny, wspierając weryfikację hipotez oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych danych mapowania w celu przygotowania testów i oceny związków.
- Analityka: Zapewnia wysokorozdzielcze wyniki PAGE do analizy porównawczej zwiniętych i niezwiniętych form DNA.
- Badania translacyjne: Umożliwiają mapowanie G4 w sekwencjach istotnych dla chorób, wspierając dopasowanie biomarkerów, jeśli jest to właściwe.
- Zastosowania przemysłowe: Oferuje szeroko stosowalny, skalowalny protokół mapowania dla różnorodnych konstruktów zawierających PQS.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów G4.
- Wartość operacyjna: upraszcza przepływy pracy, zmniejsza wymagania dotyczące ilości wejściowej DNA i zwiększa powtarzalność.
- Wartość strategiczna: usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez wyjaśnienie zależności między strukturą a funkcją celu.
- Wpływ na portfolio: wspiera priorytetyzację programów celujących w G4 w całym potoku odkrywania leków, z uwzględnieniem dostosowania do ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu chemii kwasów nukleinowych oraz analizy PAGE o wysokiej rozdzielczości.
- Wymagany jest dostęp do sond chemicznych (B-CePs) oraz aparatury do obrazowania żeli.
- Niezbędna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalnego mapowania i interpretacji danych.
- Metoda jest możliwa do zastosowania zarówno w konstruktach DNA, jak i RNA z sekwencjami bogatymi w guaninę.
- Reaktywność sond może być wpływana przez skład buforu oraz obecność nukleofili, co wymaga optymalizacji protokołu.
