Name: In vitro Mapowanie chemiczne struktur DNA G-Quadruplex za pomocą bis-3-chloropiperydyn (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 32 s
Description: Poznaj metodę mapowania chemicznego struktur DNA G-quadruplex za pomocą bis-3-chloropiperydyn. Protokół ten umożliwia identyfikację guanin w G-tetrads z mniejszą liczbą kroków niż tradycyjne metody.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Wydział Nauk Farmaceutycznych i Farmakologicznych Uniwersytetu w Padwie (PRIDJ-BIRD2019).

1. Przygotowanie kwasu nukleinowego i sondy chemicznej
<ol>
	<li>Kwasy nukleinowe 
	UWAGA: Oligonukleotyd o nazwie "TBA" to 15-merowa sekwencja DNA 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3' znakowana na końcu 3' przez fluoroforową 5-karboksyfluoresceinę (FAM), aby umożliwić wizualizację na żelu. Nieznakowany oligonukleotyd "cTBA" jest jego komplementarną sekwencją DNA 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'. TBA i cTBA stosuje się w celu uzyskania trzech różnych struktur, jak pokazano w tabeli 1.
	<ol>
		<li>Końcówki do autoklawu i probówki o pojemności 0,5 ml w celu uzyskania sterylnych materiałów jednorazowego użytku i uniknięcia zanieczyszczenia.</li>
		<li>Przygotować roztwory podstawowe, rozpuszczając każdy oligonukleotyd w wodzie ultraczystej do końcowego stężenia 100 μM. Określić dokładne stężenie oligonukleotydów za pomocą spektrofotometru UV-Vis w ultrafiolecie, stosując współczynnik ekstynkcji przy 260 nm podany przez producenta. 
		UWAGA: Współczynniki ekstynkcji: 164 300 M-1 cm-1 i 138 600 M-1 cm-1 zastosowano odpowiednio dla TBA i cTBA.</li>
		<li>Roztwory podstawowe TBA i cTBA należy przechowywać w temperaturze -20 °C (w tych warunkach przez wiele miesięcy).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Związek B-1 
	UWAGA: Związek B-1 jest syntetyzowany zgodnie z wcześniejszymi raportami6.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy B-1 o stężeniu ~10 mM. Odważyć ~1 mg liofilizowanego związku za pomocą wagi analitycznej umieszczonej w dygestorium i rozpuścić go w 100% dimetylosulfotlenku (DMSO).</li>
		<li>Obliczyć dokładne stężenie związku na podstawie rzeczywistej ilości użytego związku i DMSO (d = 1,1 g/cm3). 
		UWAGA: Z związkiem należy obchodzić się w rękawiczkach przez cały czas (zarówno po liofilizacji, jak i po rozpuszczeniu w DMSO)13,14.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Tabela 1: Struktury oligonukleotydowe użyte w tym protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65373/65373_Table 1 (5).xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
2. Składanie konstruktów kwasów nukleinowych
<ol>
	<li>Przygotowanie
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór buforowy BPE (kwas bifosforanowo-etylenodiaminotetraoctowy [EDTA], 5x: 2 mM NaH2PO4, 6 mM Na2HPO4, 1 mM Na2EDTA, pH 7,4) i roztwór 500 mM KCl w wodzie ultraczystej. Przefiltruj roztwory przez filtry o wielkości porów 0,22 μm. 
		UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, używaj świeżo przygotowanych roztworów. Bufor BPE może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 15 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Składanie próbek G4-TBA, ssTBA i dsTBA metodą ponownego składania na gorąco 
	UWAGA: Kationy potasu są niezbędne do fałdowania struktury G4 (G4-TBA). Nie dodawać kationów potasu do roztworu składającego kontrolnych ssTBA i dsTBA.
	<ol>
		<li>Przygotować 40 μL 4 μM roztworu G4-TBA w 1x BPE i 100 mM KCl. Denaturować roztwór oligonukleotydu G4-TBA poprzez podgrzanie probówki do 95 °C przez 5 minut i powoli schłodzić ją do temperatury pokojowej (RT), aby umożliwić TBA złożenie się w G-kwadrupleksy.</li>
		<li>Przygotować 40 μL 4 μM roztworu ssTBA w 1x BPE. Wykonaj procedurę ponownego składania na gorąco, jak wspomniano w kroku 2.2.1, aby złożyć TBA w postaci jednoniciowej.</li>
		<li>Przygotować 40 μl 4 μM roztworu dsTBA, mieszając równomolowe ilości TBA i cTBA w 1x BPE. Wykonaj procedurę ponownego fałdowania na gorąco, jak wspomniano powyżej (krok 2.2.1), aby TBA wyżarzał się do swojej komplementarnej sekwencji cTBA i tworzył dwuniciową formę TBA. 
		UWAGA: Ostateczna objętość każdego roztworu do składania opiera się na liczbie próbek do reakcji sondowania, biorąc pod uwagę, że na każdą próbkę potrzeba 5 μl roztworu o stężeniu 4 μM. Przygotuj niewielką nadmierną objętość każdego roztworu, aby uniknąć błędów w pipetowaniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Reakcje sondowania
UWAGA: Reakcje sondowania muszą być przeprowadzone natychmiast po procedurze ponownego składania na gorąco.
<ol>
	<li>Gdy roztwory do składania G4-TBA, ssTBA i dsTBA ostygną do RT, należy przeprowadzić wirowanie z krótkim wirowaniem (7 000 × g przez 5-8 s w temperaturze pokojowej) i rozpocząć reakcje sondowania.</li>
	<li>Przygotuj 21 pustych probówek autoklawowanych o pojemności 0,5 ml. Uporządkuj je w trzech zestawach po siedem probówek każdy w stojaku na próbki laboratoryjne, jak podano w tabeli 2. 
	UWAGA: Każdy zestaw kolumn odpowiada trzem różnym warunkom składania TBA: G4-TBA, ssTBA i dsTBA. Każdy rząd odpowiada trzem różnym czasom inkubacji. Każda komórka w kolumnie odpowiada końcowemu stężeniu sondy B-1 (tabela 2). Upewnij się, że rurki są wyraźnie oznaczone.</li>
	<li>Dodaj 3 μl ultraczystej wody do każdej probówki.</li>
	<li>Dodać 5 μl złożonego G4-TBA do każdej probówki z pierwszego zestawu (krok 3.2). Dodać 5 μl złożonego ssTBA do każdej probówki z drugiego zestawu. Dodać 5 μl złożonego dsTBA do każdej probówki z trzeciego zestawu.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy B-1 do 250 μM i 25 μM w wodzie ultraczystej. 
	UWAGA: Rozcieńczenia sondy chemicznej B-1 muszą być świeżo przygotowane i natychmiast poddane reakcji z substratem DNA, aby uniknąć konkurencyjnych reakcji z wodą.</li>
	<li>Dodać do próbek 2 μl odpowiedniego rozcieńczenia B-1 (25 μM i 250 μM). Zastąp związek ultraczystą wodą w trzech próbkach kontrolnych (C) w celu analizy różnie pofałdowanych TBA pod nieobecność związku. Inkubować wszystkie próbki w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 1 godzinach, 4 godzinach i 15 godzinach inkubacji należy przerwać reakcję, umieszczając probówki w temperaturze -20 °C do następnego etapu. 
	UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w tych warunkach przez kilka dni.</li>
	<li>Wysuszyć próbki w wirówce próżniowej. 
	UWAGA: Wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni przed przystąpieniem do analizy PAGE.</li>
</ol>
Tabela 2: Próbki do reakcji sondowania (struktury, stężenia sondy i czas inkubacji). Każdy zestaw kolumn odpowiada trzem różnym warunkom składania TBA (G4-TBA, ssTBA i dsTBA). Każdy rząd odpowiada trzem różnym czasom inkubacji (1, 4, 15 godzin). Każda komórka w kolumnie odpowiada końcowemu stężeniu sondy B-1 (5 lub 50 μM). Kontrola (C) dla każdego zestawu odpowiada próbce różnie pofałdowanych TBA inkubowanych przez dłuższy czas (15 godzin) przy braku związku. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65373/65373_Table 2 (3).xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
4. STRONA w wysokiej rozdzielczości
<ol>
	<li>Przygotowanie denaturującego roztworu poliakrylamidu 
	UWAGA: Przygotuj wcześniej 500 ml 20% denaturującego roztworu żelu poliakrylamidowego. Do każdego eksperymentu zostanie użyte około 80 ml tego roztworu. Użyj butelki ze szkła oranżowego lub przykryj szklaną butelkę folią aluminiową do przechowywania roztworu w RT. 
	UWAGA: Poliakryloamid jest neurotoksyczny. Podczas wszystkich etapów przygotowania i nalewania żelu należy nosić rękawice i fartuch laboratoryjny. Wyrzuć spolimeryzowany akryloamid do odpowiedniego pudełka na zanieczyszczone materiały.
	<ol>
		<li>Odważyć 210 g mocznika w zlewce o pojemności 1 l. Dodać 250 ml 40% roztworu akrylamidu/bisakryloamidu (19/1) i 50 ml 10x TBE (890 mM Tris-HCl, 890 mM boranu, 20 mM EDTA, pH 8).</li>
		<li>Umieścić zlewkę na płytce mieszającej i wymieszać roztwór za pomocą mieszadła. Podczas mieszania przykryj zlewkę folią aluminiową, aby zapobiec rozpryskiwaniu i zanieczyszczeniu.</li>
		<li>Mieszać roztwór, aż mocznik całkowicie się rozpuści, a roztwór będzie klarowny. 
		UWAGA: Ten krok może potrwać wiele godzin. Aby przyspieszyć rozpuszczenie mocznika, dodaj niewielką porcję wody, nie przekraczając pożądanej objętości końcowej.</li>
		<li>Wyjmij pręt mieszający. Wlej roztwór do cylindra i dodaj wodę do dokładnej końcowej objętości 500 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawianie aparatury żelowej
	<ol>
		<li>Oczyść dwie płytki (jedną z karbem i jedną bez karbu) 70% etanolem, pozwól im wyschnąć, a następnie potraktuj płytki roztworem dimetylodichlorosilanu. 
		UWAGA: Silanizację można pominąć, chociaż pomaga ona w uwalnianiu żelu z jednej z płytek po rozebraniu kanapki z żelem. 
		UWAGA: Z roztworem silanizacyjnym należy obchodzić się w rękawiczkach i przeprowadzać obróbkę płytki tym roztworem w dygestorium.</li>
		<li>Umieść przekładki 0,4 mm wzdłuż długich krawędzi dłuższej płyty, umieść krótką płytkę na drugiej i wyrównaj dwie płytki na dole.</li>
		<li>Umieść wiele warstw taśmy papierowej wzdłuż wszystkich krawędzi z wyjątkiem góry.</li>
		<li>Aby uniknąć wycieków podczas odlewania, dodaj dodatkową warstwę taśmy na spód żelu.</li>
		<li>Przypnij boki szklanej kanapki czystymi zaciskami zgodnie z instrukcjami dostawcy (różni dostawcy używają nieco innego urządzenia, zacisków warstwowych i uszczelek).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nalewanie żelu 
	UWAGA: Wlać żel do temperatury RT (25 °C), ponieważ polimeryzacja poliakrylamidu jest wrażliwa na temperaturę.
	<ol>
		<li>Bezpośrednio przed użyciem wlać do zlewki 80 ml wcześniej przygotowanego roztworu poliakryloamidu denaturującego (krok 4.1), 450 μl 10% roztworu nadsiarczanu amonu (APS) o stężeniu 10% m/V oraz 45 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED).</li>
		<li>Wymieszać roztwór i szybko wlać go między szklane płytki za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml. Wprowadź grzebień z żądaną liczbą dołków między szklane płytki, unikając pęcherzyków. W razie potrzeby dodaj roztwór żelu, aby całkowicie wypełnić kanapkę. Umieść cztery zaciski na grzebieniu, aby docisnąć i umożliwić równomierne rozprowadzenie dołków.</li>
		<li>Pozwól żelowi polimeryzować przez co najmniej 45 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchamianie żelu
	<ol>
		<li>Po polimeryzacji usuń wszystkie zaciski i warstwy taśmy papierowej. Powoli wyjmij grzebień i dokładnie spłucz studzienki wodą destylowaną.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami konkretnego dostawcy, aby prawidłowo umieścić kanapkę z żelem w pionowym aparacie do elektroforezy żelowej.</li>
		<li>Przygotować bufor do pracy TBE (1x: 89 mM Tris-HCl, 89 mM boran, 2 mM EDTA, pH 8) w wodzie dejonizowanej i napełnić buforem zarówno górny, jak i dolny zbiornik.</li>
		<li>Rozgrzej płytki, wykonując wstępny przebieg elektroforezy żelowej przez co najmniej 30 minut przy mocy 50 W.</li>
		<li>Przygotować denaturujący bufor ładujący żel (DGLB: 1 M Tris-HCl, 80% formamidu, 50% glicerolu, 0,05% błękitu bromofenolowego) w ultraczystej wodzie. 
		UWAGA: GLB pomaga śledzić przemieszczanie się próbek oligonukleotydów do systemu żelowego i umożliwia załadowanie próbek do studzienek żelu. Obecność środka denaturującego formamidu pozwala na rozdzielenie gatunków DNA w zależności od wielkości, nawet w niedenaturującym PAGE.</li>
		<li>Ponownie zawiesić wysuszone próbki (próbki z etapu 3.8) w 5 μl DGLB.</li>
		<li>Przed załadowaniem próbek należy oczyścić studzienki za pomocą małej strzykawki i buforu TBE w górnej komorze buforowej w celu usunięcia mocznika z dołków. 
		UWAGA: Powtórz ten krok kilka razy, aby dokładnie wyczyścić studzienki, unikając w ten sposób pasm trudnych do interpretacji.</li>
		<li>Załaduj próbki do czystych studzienek i zanotuj kolejność ładowania.</li>
		<li>Uruchom elektroforezę żelu przez 2 godziny przy mocy 50 W lub przynajmniej do momentu, gdy niebieski barwnik bromofenolowy spłynie w 2/3 w dół żelu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie żelu
	<ol>
		<li>Po elektroforezie wyłącz zasilanie, wyjmij szklaną kanapkę i wyczyść szklanki.</li>
		<li>Wykryj fluorescencję prążków oligonukleotydowych znakowanych FAM, skanując za pomocą obrazownika żelowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Identifying G-Quadruplexes in a DNA Template Using Chemical Mapping

<ol><li>Davis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-quartets+40+years+later%3A+from+5%27-GMP+to+molecular+biology+and+supramolecular+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">G-quartets 40 years later: from 5'-GMP to molecular biology and supramolecular chemistry.</a> Angewandte Chemie. 43 (6), 668-698 (2004).</li>
<li>Varshney, D., Spiegel, J., Zyner, K., Tannahill, D., Balasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+and+functions+of+DNA+and+RNA+G-quadruplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The regulation and functions of DNA and RNA G-quadruplexes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (8), 459-474 (2020).</li>
<li>Chambers, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+sequencing+of+DNA+G-quadruplex+structures+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 877-881 (2015).</li>
<li>Zuravka, I., Sosic, A., Gatto, B., Gottlich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+evaluation+of+a+bis-3-chloropiperidine+derivative+incorporating+an+anthraquinone+pharmacophore%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Synthesis and evaluation of a bis-3-chloropiperidine derivative incorporating an anthraquinone pharmacophore.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (20), 4606-4609 (2015).</li>
<li>Zuravka, I., Roesmann, R., Sosic, A., Gottlich, R., Gatto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis-3-chloropiperidines+containing+bridging+lysine+linkers%3A+Influence+of+side+chain+structure+on+DNA+alkylating+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bis-3-chloropiperidines containing bridging lysine linkers: Influence of side chain structure on DNA alkylating activity.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry. 23 (6), 1241-1250 (2015).</li>
<li>Zuravka, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+DNA+cleavage+activity+of+bis-3-chloropiperidines+as+alkylating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and DNA cleavage activity of bis-3-chloropiperidines as alkylating agents.</a> ChemMedChem. 9 (9), 2178-2185 (2014).</li>
<li>Sosic, A., Gottlich, R., Fabris, D., Gatto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-CePs+as+cross-linking+probes+for+the+investigation+of+RNA+higher-order+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">B-CePs as cross-linking probes for the investigation of RNA higher-order structure.</a> Nucleic Acids Research. 49 (12), 6660-6672 (2021).</li>
<li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis-3-chloropiperidines+targeting+TAR+RNA+as+a+novel+strategy+to+impair+the+HIV-1+nucleocapsid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Bis-3-chloropiperidines targeting TAR RNA as a novel strategy to impair the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> Molecules. 26 (7), 1874(2021).</li>
<li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evaluation+of+bis-3-chloropiperidines+as+RNA+modulators+targeting+TAR+and+TAR-protein+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vitro evaluation of bis-3-chloropiperidines as RNA modulators targeting TAR and TAR-protein interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (2), 582(2022).</li>
<li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+topoisomerase+II+mediated+DNA+damage+by+bis-3-chloropiperidines%3A+The+importance+of+being+an+earnest+G%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Direct and topoisomerase II mediated DNA damage by bis-3-chloropiperidines: The importance of being an earnest G.</a> ChemMedChem. 12 (17), 1471-1479 (2017).</li>
<li>Bock, L. C., Griffin, L. C., Latham, J. A., Vermaas, E. H., Toole, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+single-stranded+DNA+molecules+that+bind+and+inhibit+human+thrombin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin.</a> Nature. 355 (6360), 564-566 (1992).</li>
<li>Paborsky, L. R., McCurdy, S. N., Griffin, L. C., Toole, J. J., Leung, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-stranded+DNA+aptamer-binding+site+of+human+thrombin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The single-stranded DNA aptamer-binding site of human thrombin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268 (28), 20808-20811 (1993).</li>
<li>Carraro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behind+the+mirror%3A+chirality+tunes+the+reactivity+and+cytotoxicity+of+chloropiperidines+as+potential+anticancer+agents%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Behind the mirror: chirality tunes the reactivity and cytotoxicity of chloropiperidines as potential anticancer agents.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 10 (4), 552-557 (2019).</li>
<li>Carraro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appended+aromatic+moieties+in+flexible+bis-3-chloropiperidines+confer+tropism+against+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Appended aromatic moieties in flexible bis-3-chloropiperidines confer tropism against pancreatic cancer cells.</a> ChemMedChem. 16 (5), 860-868 (2021).</li>
<li>Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+dichroism+and+conformational+polymorphism+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA.</a> Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).</li>
<li>Onel, B., Wu, G., Sun, D., Lin, C., Yang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+and+dimethyl+sulfate+footprinting+for+characterization+of+G-quadruplexes+and+G-quadruplex-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay and dimethyl sulfate footprinting for characterization of G-quadruplexes and G-quadruplex-protein complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 2035, 201-222 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

G-kwadrupleksy to drugorzędowe struktury kwasów nukleinowych, które zazwyczaj fałdują się w sekwencjach DNA bogatych w guaninę i są ważnymi celami badawczymi ze względu na ich związek z kontrolą genetyczną i chorobami. Mapowanie chemiczne za pomocą B-CePs jest użytecznym protokołem do charakterystyki DNA G4s, który może być wykorzystany do identyfikacji zasad guaninowych zaangażowanych w tworzenie G-tetrad w fizjologicznych warunkach solnych.
Sonda chemiczna użyta w tym protokole to B-1 (<stro...

Oprócz typowej podwójnej helisy Watsona-Cricka, kwasy nukleinowe mogą przybierać różne struktury drugorzędowe, takie jak alternatywna forma kwadrupleksu G (G4), ze względu na ich sekwencje bogate w guaninę. Struktura G4 opiera się na tworzeniu płaskich tetramerów, zwanych tetradami G, w których cztery guaniny oddziałują za pomocą wiązań wodorowych Hoogsteena. Tetrady G są ułożone warstwowo i dodatkowo stabilizowane przez kationy jednowartościowe, które są koordynowane w centrum rdzenia guaniny (Rysunek 1)1.
<img alt="Kwadrupleks guaniny z jonem metalu, schemat cząsteczkowy, stabilizacja struktury DNA, badanie naukowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65373/65373fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczna reprezentacja struktury G-kwadrupleksu. (A) Schematyczna reprezentacja G-tetrady. Układ płaski jest stabilizowany przez pary zasad Hoogsteena oraz centralny kation (M+). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65373/65373fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Sekwencje zawierające cztery lub więcej serii co najmniej dwóch następujących po sobie nukleotydów guaniny są potencjalnymi sekwencjami tworzącymi G-kwadrupleksy (PQSs), które mogą zwijać się w struktury G-kwadrupleksowe. PQSs znajdują się w wielu różnych kontekstach komórkowych, takich jak telomery, promotory genów, rybosomalny DNA oraz miejsca rekombinacji, i biorą udział w regulacji wielu procesów biologicznych2. W związku z tym identyfikacja i eksperymentalna walidacja G4 w ludzkim genomie, przeprowadzana obecnie głównie za pomocą narzędzi obliczeniowych, jest kwestią istotną biologicznie3. Aby wesprzeć przewidywania obliczeniowe lub wykryć nieprzewidziane struktury G4, zaprezentowano tutaj przystępną metodę opartą na mapowaniu chemicznym w celu identyfikacji formowania G4 w matrycy DNA, umożliwiającą precyzyjne określenie guanin tworzących strukturę G-tetradową.
Opisany test mapowania chemicznego wykorzystuje różną reaktywność bis-3-chloropiperydyn (B-CePs) z guaninami po sformowaniu struktur G4. Ze względu na wysoką reaktywność z nukleofilami4,5,6,7,8,9, B-CePs są czynnikami alkilującymi kwasy nukleinowe, które mogą bardzo efektywnie reagować z pozycją N7 nukleotydów guaniny10. Alkilowaniu towarzyszy depurynacja i pękanie nici w konstrukcjach DNA jednoniciowego i dwuniciowego. Z kolei guaniny biorące udział w tworzeniu tetrad G w strukturach G4 są odporne na alkilację przez B-CeP, ponieważ pozycja N7 guanin jest zaangażowana w wiązania wodorowe Hoogsteena. Ta specyficzna reaktywność B-CePs pozwala nie tylko na detekcję struktur G4, ale także na identyfikację guanin tworzących tetradę(y), gdyż można je wywnioskować z ich względnej ochrony przed alkilacją w porównaniu z guaninami w DNA jednoniciowym i dwuniciowym.
W niniejszym dokumencie przedstawiono protokół mapowania chemicznego z wykorzystaniem B-CeP 1 (Rycina 2A) jako sondę do charakteryzacji aptameru wiążącego trombinę (TBA), 15-merowego DNA zdolnego do przyjmowania struktury G4 w obecności kationów potasu11,12Strukturę G4 TBA (G4-TBA) porównano bezpośrednio z dwiema kontrolami: TBA w formie jednoniciowej (ssTBA) oraz TBA przyłączoną do swojej sekwencji komplementarnej w celu utworzenia konstrukcji dwuniciowej (dsTBA) (Tabela 1). Produkty reakcji sondowania rozdziela się za pomocą wysokorozdzielczej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) z rozdzielczością do pojedynczego nukleotydu, lokalizując poszczególne addukty alkilacyjne oraz pęknięcia nici DNA w miejscach alkilowanych guanin. Wizualizacja na żelu jest możliwa dzięki koniugacji oligonukleotydu TBA z fluoroforem na jego końcu 3' (Tabela 1). Niniejszy protokół przedstawia sposób zwijania TBA w jego różnych konformacjach (G4 oraz kontrole), a także sposób przeprowadzania reakcji sondowania z użyciem B-CePs z późniejszą analizą metodą PAGE.

<table><tbody><tr><td>Roztwór akrylamidu/bis-akrylamidu 40%</td> <td>Zastosowanie</td><td>A3658</td><td>R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7460</td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>pbi międzynarodowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy Błękit brylantowy R</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0149</td><td></td></tr><tr><td>wodorofosforan sodu dwunastowodny</td><td>Fluka</td><td>71649</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotydy DNA</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>synteza niestandardowych sekwencji</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Fluka</td><td>40248</td><td>H351-360D-373</td></tr><tr><td>Obrazownik żelowy</td><td>GE Healtcare</td><td>STORM B40</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki 0,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.704</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Aparatura do sekwencjonowania</td><td>Biometra</td><td>Model S2</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór silanizacyjny I</td><td>Fluka</td><td>85126</td><td>H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Carlo Erba</td><td>480086</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator Speedvac</td><td>Thermo Scientific</td><td>Savant DNA 120</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fluka</td><td>87689</td><td>R11-21/22-23-34</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>MERCK</td><td>1.08387.2500</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-Vis</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 1000</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro mapowanie chemiczne struktur dna g-quadruplex za pomocą bis-3-chloropiperydyn

In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) są biologicznie istotnymi, niekanonicznymi strukturami DNA, które odgrywają ważną rolę w ekspresji genów i chorobach, stanowiąc ważne cele terapeutyczne. Potrzebne są dostępne metody do charakterystyki in vitro DNA w obrębie potencjalnych sekwencji tworzących G-kwadrupleks (PQS). B-to klasa środków alkilujących, które okazały się użytecznymi sondami chemicznymi do badania struktury kwasów nukleinowych wyższego rzędu. W artykule opisano nowy test mapowania chemicznego wykorzystujący specyficzną reaktywność B-z N7 guaniny, a następnie bezpośrednie rozszczepienie nici w alkilowanym Gs. 
Mianowicie, aby odróżnić fałdy G4 od rozwiniętych form DNA, używamy B-1 do zbadania aptameru wiążącego trombinę (TBA), 15-merowego DNA zdolnego do przyjęcia układu G4. Reakcja guaniny reagującej na B-z B-1 daje produkty, które można rozwiązać za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym o wysokiej rozdzielczości (PAGE) na poziomie pojedynczego nukleotydu poprzez lokalizację poszczególnych adduktów alkilacyjnych i rozszczepienia nici DNA w alkilowanych guaninach. Mapowanie za pomocą B-CePs jest prostym i potężnym narzędziem do charakteryzowania in vitro sekwencji DNA tworzących G-kwadrupleks, umożliwiając precyzyjną lokalizację guaniny biorących udział w tworzeniu G-tetrad.

Rysunek 2 przedstawia reprezentatywny wynik analizy mapowania chemicznego przeprowadzonej zgodnie z protokołem przy użyciu B-CeP 1 na oligonukleotydzie TBA sfałdowanym w trzech różnych strukturach. Układ G-kwadrupleks TBA (G4-TBA) uzyskano poprzez fałdowanie oligonukleotydu w BPE w obecności kationów K+, natomiast jednoniciową formę tej samej sekwencji TBA (ssTBA) sfałdowano wykluczając obecność potasu. Konstrukt dwuniciowy (dsTBA) przygotowano poprzez hybrydyzację TBA z jego sekw...

Bis-3-chloropiperydyny (B-CePs) są użytecznymi sondami chemicznymi do identyfikacji i charakteryzowania struktur G-kwadrupleksu w matrycach DNA in vitro. Protokół ten szczegółowo opisuje procedurę przeprowadzania reakcji sondowania z B-i rozpuszczania produktów reakcji za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym o wysokiej rozdzielczości.

In vitro Mapowanie chemiczne struktur DNA G-Quadruplex za pomocą bis-3-chloropiperydyn

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing ...

G-kwadrupleksy to drugorzędowe struktury kwasów nukleinowych, które zwykle powstają w sekwencjach DNA bogatych w guaninę. Mapowanie chemiczne G4 za pomocą B-CePs ma na celu scharakteryzowanie G4 in vitro i pozwala na identyfikację specyficznych guanin tworzących G-tetrady. Identyfikacja i eksperymentalna walidacja G4 w potencjalnych sekwencjach tworzących G-kwadrupleks jest biologicznie istotnym zagadnieniem, które jest obecnie rozwiązywane głównie za pomocą narzędzi obliczeniowych.Aby wesprzeć takie przewidywania i wykryć nieprzewidzianego G4, mapowanie chemiczne za pomocą B-CePs stanowi dostępną metodę identyfikacji G4 w sekwencjach DNA. Mapowanie chemiczne za pomocą B-CePs jest wygodną alternatywą dla szeroko stosowanego protokołu śladowania siarczanu dimetylu do charakterystyki G-kwadrupleksów. Kluczową zaletą B-CePs jest to, że zmniejszył liczbę kroków w protokole i zmniejszył początkową ilość substratu DNA.Mapowanie chemiczne za pomocą B-CePs jest opisane tutaj z sekwencją TBA jako dowód słuszności koncepcji. Protokół doprowadzi do nowych eksperymentów mających zastosowanie do każdej innej potencjalnej sekwencji tworzącej G-kwadrupleks, badając zarówno konstrukty DNA, jak i RNA. Zacznij od pipetowania jednoniciowych i dwuniciowych roztworów TBA G4-TBA do trzech różnych probówek do składania.Podgrzewać próbki do temperatury 95 °C przez pięć minut. Pozwól im powoli ostygnąć do temperatury pokojowej. Gdy probówki ostygną do temperatury pokojowej, odwirować probówki.Następnie uporządkuj trzy zestawy po siedem pustych autoklawowanych probówek o pojemności 0,5 ml. Do każdej probówki dodaj 3 l ultraczystej wody. Odpipetować 5 L złożonego kwasu nukleinowego do każdej probówki z zestawu.Następnie dodaj 2 litry 25 lub 250 M B-1, aby uzyskać końcowe stężenie sondy odpowiednio 5 i 50 M. Do trzech probówek kontrolnych dodać ultraczystą wodę zamiast związku i inkubować wszystkie próbki w temperaturze 37 °C. Zatrzymać reakcję, umieszczając probówki w temperaturze 20 °C. Następnie wysuszyć próbki w wirówce próżniowej. Zacznij od przygotowania spolimeryzowanej kanapki z żelem PAGE.Usuń zaciski i warstwy taśmy papierowej i powoli wyjmij grzebień. Dokładnie spłucz studzienki wodą destylowaną. Umieść prawidłowo kanapkę z żelem w pionowym aparacie do elektroforezy.Napełnij górny i dolny zbiornik buforem TBE. Rozgrzej płytki, wykonując wstępny przebieg elektroforezy żelowej przez co najmniej 30 minut przy mocy 50 watów. W międzyczasie ponownie zawiesić wysuszone próbki w 5 litrach denaturującego buforu ładującego żel.Następnie użyj małej strzykawki wypełnionej buforem do KZM, aby wypłukać mocznik z dołków żelu. Teraz załaduj próbki do czystych studzienek, zwracając uwagę na zapach ładowania. Uruchom żel przez dwie godziny z mocą 50 watów lub do momentu, gdy niebieski barwnik bromofenolowy spłynie z dwóch trzecich żelu.Po elektroforezie wyłącz zasilanie, ostrożnie wyjmij szklaną kanapkę i wyczyść szklane płytki. Umieść żel w obrazie żelowym, aby wykryć fluorescencję prążków oligonukleotydowych znakowanych FAM. Po jednej, czterech i 15 godzinach inkubacji 5 lub 50 M B-1 reagowało z 2 M próbkami G4-TBA, jednoniciowymi i dwuniciowymi TBA.Kontrole załadowano dla każdego zestawu próbek. Substrat TBA wykazywał tylko jeden addukt alkilacyjny ze względu na dostępność tylko G8 do alkilowania i późniejszego rozszczepienia nici. W jedno- i dwuniciowych TBA zaobserwowano liczne addukty i pasma produktów rozszczepienia, ponieważ wszystkie guaniny były podatne na reakcję B-.Sondowanie reakcji i Tris Buffer skutkowały nieefektywnym mapowaniem chemicznym ze względu na obecność niepożądanych nukleofilów, co powodowało zmniejszenie reaktywności sondy. Próbki G4-TBA wykazały jedynie tworzenie się adduktów bez rozszczepienia nici. W przypadku jedno- i dwuniciowego TBA tylko 24-godzinna inkubacja doprowadziła do fragmentacji DNA porównywalnej z 15-godzinną fragmentacją bez Tris.

in-vitro-chemical-mapping-g-quadruplex-dna-structures-bis-3

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Prezentujemy montaż i zastosowanie urządzenia w skali molekularnej zasilanego białkiem topoizomerazą. Konstrukcja ta stanowi biomolekularny czujnik, który znakuje dwa główne rodzaje pęknięć DNA w przekrojach tkanek poprzez przyłączenie dwóch różnych fluoroforów do ich końców.

In vitro montaż półsztucznej maszyny molekularnej i jej zastosowanie w detekcji uszkodzeń DNA

Tutaj prezentujemy prostą metodę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji DNA in situ (DNA ISH) w celu wizualizacji powtarzających się sekwencji heterochromatycznych na chromosomach montowanych na szkiełkach. Metoda wymaga minimalnej ilości odczynników i jest uniwersalna w użyciu z krótkimi lub długimi sondami, różnymi tkankami oraz detekcją za pomocą sygnałów fluorescencyjnych lub nieopartych na fluorescencji.

Prosta metoda fluorescencji DNA Hybrydyzacja in situ do zgniecionych chromosomów

Identyfikacja bezpośrednich celów cząsteczek ukierunkowanych na genom pozostaje głównym wyzwaniem. Aby zrozumieć, w jaki sposób cząsteczki wiążące DNA angażują się w genom, opracowaliśmy metodę, która opiera się na sieciowaniu małych cząsteczek w celu wyizolowania chromatyny (COSMIC).

Mapowanie całego genomu interakcji lek-DNA w komórkach za pomocą COSMIC (sieciowanie małych cząsteczek w celu izolacji chromatyny)

Fotostabilne barwniki cyjaninowe są dołączane do oligonukleotydów w celu monitorowania hybrydyzacji poprzez transfer energii.

Synteza sond hybrydyzacyjnych DNA zmieniających długość fali przy użyciu fotostabilnych barwników cyjaninowych

G4 Resolvase1 wiąże się ze strukturami G-quadruplex (G4) o najściślejszym zgłoszonym powinowactwie do białka wiążącego G4 i reprezentuje większość aktywności odwijania G4-DNA w komórkach HeLa. Opisujemy nowatorski protokół, który wykorzystuje powinowactwo i zależną od ATP aktywność odwijania G4-Resolvazy1 do specyficznego oczyszczania katalitycznie aktywnego rekombinowanego G4R1.

Metoda powinowactwa do DNA G-quadruplex do oczyszczania enzymatycznie aktywnej resolwazy G41

Raportujemy protokoły syntezy i oczyszczania oligomerów peptydowych kwasów nukleinowych (PNA) zawierających zmodyfikowane pozostałości. Opisano biochemiczne i biofizyczne metody charakterystyki rozpoznawania dupleksów RNA przez zmodyfikowane PNA.

Specyficzne dla sekwencji i selektywne rozpoznawanie dwuniciowych RNA na jednoniciowych RNA za pomocą chemicznie modyfikowanych peptydowych kwasów nukleinowych

Zgłoszono platformę jednocząsteczkowych pęsety magnetycznej do manipulowania G-quadruplexami, która pozwala na badanie stabilności i regulacji G4 przez różne białka.

Manipulacja pojedynczymi cząsteczkami G-kwadrupleksów za pomocą pęsety magnetycznej

Ten protokół prezentuje technikę mapowania miejsc replikacji w strukturalnie zachowanej chromatynie in situ, która wykorzystuje kombinację wstępnego znakowania EdU-streptawidyny-Nanogold i ChromEMT.

Obrazowanie domen replikacyjnych w ultrastrukturalnie zachowanej chromatynie za pomocą tomografii elektronowej

Interakcja zależnego od ATP czynnika remodelującego chromatynę z ligandem DNA jest opisana za pomocą spektroskopii CD. Indukowane zmiany konformacyjne na promotorze genu analizowane przez wygenerowane piki można wykorzystać do zrozumienia mechanizmu regulacji transkrypcji.

Spektroskopia CD do badania interakcji DNA-białko

Ten protokół szczegółowo opisuje przygotowanie kompleksów nukleosomalnych przy użyciu dwóch metod przygotowania próbek do zamrażania siatek TEM.

Przygotowanie cząstek rdzenia nukleosomów skompleksowanych z czynnikami naprawy DNA do oznaczania strukturalnego w mikroskopii krioelektronowej

Ten protokół opisuje test replikacji pojedynczej cząsteczki DNA oparty na mikroskopii fluorescencyjnej, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym interakcji między polimerazami DNA a przeszkodami, takimi jak struktury G-quadruplex.

Wizualizacja fluorescencji pojedynczej cząsteczki dynamiki polimerazy DNA w G-kwadrupleksach

Poznaj metodę mapowania chemicznego struktur DNA G-quadruplex za pomocą bis-3-chloropiperydyn. Protokół ten umożliwia identyfikację guanin w G-tetrads z mniejszą liczbą kroków niż tradycyjne metody.

In vitro Mapowanie chemiczne struktur DNA G-Quadruplex za pomocą bis-3-chloropiperydyn

Przeglądaj więcej filmów