Name: Regeneracja łusek danio pręgowanego w kulturze łusek toto i ex vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 49 s
Description: Odkryj metodę hodowli łusek danio pręgowanego ex vivo do 7 dni. Technika umożliwia badanie interakcji osteoblastów i osteoklastów w regeneracji kości, oferując unikalny model poznawania procesów starzenia i rytmu dobowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Mathew Greenowi z Jednostki Opieki nad Zwierzętami za hodowlę ryb i Katy Jepson z Centrum Bioobrazowania Wolfson. CLH, DB i QT były finansowane przez Versus Arthritis (CLH Senior Fellowship 21937, DB and QT Intermediate Fellowship 22044), RR było finansowane przez (NHMRC APP1158758). Prace te były również wspierane przez grant BBSRC (BB/T001984/1).

Uniwersytecka Jednostka Naukowa ds. Zwierząt (ASU) jest odpowiedzialna za opiekę nad danio pręgowanym zgodnie z wytycznymi dotyczącymi hodowli danio pręgowanego. Wszystkie procedury, w tym pobieranie wagi, barwienie żywych kości i obrazowanie na żywo, zostały zatwierdzone i wykonane na podstawie brytyjskiej licencji Home Office Project License (PP4700996). W tym manuskrypcie wykorzystano młode dorosłe transgeniczne danio pręgowane z linii sp7:mCherry [Tg(osterix:mCherry-NTR)pd46]17. Wśród ryb były zarówno samce, jak i samice w wieku 4 miesięcy.
1. Regeneracja skali in vivo
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem eksperymentu z regeneracją łuski, przenieś danio pręgowanego z ich głównych zbiorników do indywidualnych zbiorników (patrz Tabela Materiałów) i wróć do tych indywidualnych zbiorników po obrazowaniu przez cały eksperyment, jak pokazano na Rysunek 2. Ma to na celu zapewnienie, że wszystkie regenerujące się łuski są tymi, które zostały zebrane na potrzeby eksperymentu; Trzymanie grupowe może prowadzić do sporadycznej utraty łusek z powodu urazów spowodowanych przez inne ryby. 
	UWAGA: Ryby są umieszczane indywidualnie, aby uniknąć walki i późniejszej utraty łusek między rybami.</li>
	<li>Zapisz informacje dla każdej ryby doświadczalnej (tj. genotyp, wiek i płeć) zgodnie z projektem eksperymentu. Użyj aparatu (aparaty w smartfonach działają dobrze), aby zrobić zdjęcie każdej ryby obok linijki, aby zarejestrować rozmiar/długość ryby i stan zdrowia.</li>
	<li>W dniu eksperymentu znieczulić danio pręgowanego za pomocą 0,05% (v/v) sulfonianu metanu trikainy (MS222, patrz tabela materiałów) przez zanurzenie, a następnie umieścić go na szalce Petriego z wilgotną tkanką, aby uniknąć ruchu ryby podczas obrazowania lub odłowu.</li>
	<li>Ułóż rybę na boku (zazwyczaj używa się tutaj lewej flanki dla konsystencji). Wykonaj obrazowanie boczne za pomocą mikroskopu stereoskopowego o odpowiednim powiększeniu (zazwyczaj w niniejszym badaniu używano 2x, 4x i/lub 6,3x i 8x, aby uchwycić zarówno ogólny obszar regeneracji, jak i obszar powiększony w celu szczegółowej obserwacji). 
	UWAGA: Punkty czasowe obrazowania bocznego zależą od celu eksperymentalnego i wyboru reporterów transgenicznych. Na przykład, aby śledzić osteoblasty podczas regeneracji łusek, sugerowane punkty czasowe to Dzień 0 (ontogenetyczny), 2 dni po zbiorach (dph), 4 dph, 7 dph, 10 dph, 14 dph, 21 dph. Aby zmniejszyć efekty wielokrotnego znieczulenia, utrzymuj punkty czasowe obrazowania na jak najmniejszej liczbie wymaganej w eksperymencie.</li>
	<li>Zbierz łuski za pomocą cienkiej pęsety i kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym. Zebrane łuski przenieść do probówek zbiorczych w celu późniejszego barwienia kamienia. 
	UWAGA: Maksymalna liczba łusek, które można zebrać, będzie zależeć od lokalnych zatwierdzeń etycznych, które obowiązują. Zazwyczaj zbieramy około 20 do 30 łusek i zbieramy je do indywidualnych probówek do późniejszego barwienia łusek, takich jak ALP, von Kossa14.</li>
	<li>Zbierz wagę do probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml lub 2 ml. Zależy to od zastosowanej techniki barwienia.
	<ol>
		<li>Zarówno w przypadku barwienia ALP, jak i von Kossa należy przenieść łuski do probówek zbiorczych zawierających wodę dejonizowaną, natomiast w przypadku barwienia TRAP lub immunohistochemii należy przenieść łuski do probówek zbiorczych zawierających 4% PFA (roztwór utrwalający).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opcjonalnie: Przed przeniesieniem wagi do probówek, w razie potrzeby zrób zdjęcia poszczególnych zebranych łusek. 
	UWAGA: Sugerowane punkty czasowe zbioru wagi to dzień 0 (ontogenetyczny), dzień 10 i dzień 21 (zregenerowane łuski).</li>
</ol>
2. Barwienie żywych kości
UWAGA: Barwienie żywego szkieletu może być wykonywane zarówno wtedy, gdy eksperymentalne ryby nie są transgeniczne dla fluorescencyjnych reporterów, albo gdy noszą jednokolorowe reportery transgeniczne. Barwienie na żywo może być stosowane jako uzupełnienie transgeników; na przykład można użyć reportera osteoblastów, takiego jak sp7 / osx w jednym kolorze (np. GFP), a następnie zabarwić kość na czerwono czerwienią alizaryny (AR). AR i calcein green mogą być używane razem do tych samych ryb; w tym scenariuszu AR służy do oznaczania pierwotnej lub ontogenetycznej kości poprzez wiązanie się ze zmineralizowaną macierzą starzejącej się kości, a kalceina wiąże się z jonami wapnia, które są obfite w nowo powstałą kość. Na przykład podczas barwienia skali ontogenetycznej można uwidocznić AR, ale zieleń kalceinowa może być nieobecna lub minimalna, ponieważ skale ontogenetyczne mają niski poziom tworzenia nowych kości.
<ol>
	<li>Wykonaj barwienie na żywo czerwienią alizaryny (AR).
	<ol>
		<li>Przygotuj butelkę z 2x roztworem barwiącym AR, mieszając 0,5% (w/v) podstawowego roztworu alizaryny (10 ml) z 10 ml 1 M podstawowego roztworu HEPES (stężenie końcowe, 10 mM) (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Uzupełnić do 1 l 1x roztworem Danieau (patrz tabela materiałów). Roztwór należy przechowywać w ciemności lub owinąć folią.</li>
		<li>W dniu eksperymentu przynieś 500 ml roztworu 2x AR do obiektu danio pręgowanego i dodaj 500 ml wody systemowej (z akwarium), aby uzyskać 1x działający roztwór AR.</li>
		<li>Przenieś ryby z ich zbiorników do 1x działającego roztworu barwiącego AR i pozostaw na 15-20 minut. Zmyj nadmiar plamy na rybach przez 15 minut "mycia" w wodzie systemowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj barwienie Calcein Green na żywo.
	<ol>
		<li>Przygotuj butelkę 2x roztwór barwiący Calcein Green, dodając 45 mg proszku Calcein do 900 ml 1x roztworu Danieau (patrz Tabela Materiałów). Użyj mieszadła magnetycznego, aby proszek całkowicie się rozpuścił.</li>
		<li>Dostosuj pH do 8. To jest 2x roztwór Calcein Green. Roztwór można przechowywać w ciemności/owinąć folią do 1 miesiąca.</li>
		<li>W dniu eksperymentu przynieś 500 ml 2x roztworu Calcein Green do zakładu danio pręgowanego i dodaj 500 ml wody systemowej, aby uzyskać 1x działający roztwór Calcein Green. Zaleca się stosowanie świeżo przygotowanego roztworu barwiącego Calcein.</li>
		<li>Przenieś ryby z ich zbiorników do 1x roboczego roztworu barwiącego Calcein Green i pozostaw na 1-2 godziny. W zależności od wielkości ryby może być wymagany dłuższy czas barwienia.</li>
		<li>Nadmiar plamy na rybie zmyć przez 15 minut "mycia" w wodzie systemowej. 
		UWAGA: Wyobraź sobie rybę poplamioną Calcein Green tak szybko, jak to możliwe, ponieważ ta plama zniknie w ciągu kilku godzin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Barwienie fosfatazy alkalicznej (ALP) na łuskach po zbiorach
<ol>
	<li>Przygotować roztwór barwiący ALP, mieszając 100 mM Tris (pH 9,5 z HCl) ze 100 mM NaCl i 50 mM MgCl2.</li>
	<li>Stosować dostępny na rynku roztwór podstawowy NBT/BCIP (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przenieś łuski do probówek zawierających wodę dejonizowaną.</li>
	<li>Płucz łuski w roztworze barwiącym ALP przez 5 minut.</li>
	<li>W międzyczasie przygotuj działający roztwór barwiący, dodając 200 μl roztworu NBT/BCIP do 10 ml buforu barwiącego ALP. Musi być świeżo przygotowany w momencie barwienia.</li>
	<li>Łuski należy barwić roboczym roztworem barwiącym ALP przez 15 minut.</li>
	<li>Przerwij reakcję, spłukując łuski wodą dejonizowaną.</li>
</ol>
4. Von KOSSA barwienie na łuskach po zbiorach
<ol>
	<li>Przygotować 5% (w/v) roztwór azotanu srebra.</li>
	<li>Przygotować 5% (w/v) roztwór tiosiarczanu sodu.</li>
	<li>Zebrane łuski przenieść do probówek zawierających wodę dejonizowaną.</li>
	<li>Inkubować łuski w roztworze azotanu srebra przez 40 minut w silnym świetle. 
	UWAGA: Nosić PPE (środki ochrony osobistej), ponieważ azotan srebra pozostawia plamę, którą trudno usunąć.</li>
	<li>Umyj wagę dwukrotnie przez 5 minut wodą dejonizowaną. 
	UWAGA: Odpady azotanu srebra należy zbierać i utylizować zgodnie z lokalnymi wytycznymi.</li>
	<li>Inkubować łuski w tiosiarczanie sodu przez 5 minut.</li>
	<li>Umyj wagę dwukrotnie przez 5 minut wodą dejonizowaną.</li>
</ol>
5. Barwienie kolorymetryczne TRAP
UWAGA: Aby zapoznać się ze szczegółową procedurą, zapoznaj się z poprzednio opublikowanymi work18.
<ol>
	<li>Przygotuj roztwory barwiące.
	<ol>
		<li>Przygotować 10 mg/ml roztworu fosforanu naftolu AS-MX.
		<ol>
			<li>Odważyć 5 mg fosforanu naftolu AS-MX (patrz tabela materiałów).</li>
			<li>W dygestorii przygotować probówkę z 0,5 ml N,N'-dimetyloformamidu i rozpuścić 5 mg fosforanu Naftol AS-MX w 0,5 ml N,N'-dimetyloformamidu, aby uzyskać roztwór podstawowy 10 mg/ml fosforanu Naftolu AS-MX (delikatnie wstrząsnąć).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować 1,6 mM roztworu podstawowego Fast Red Violet LB w 50 mM winianu sodu.
		<ol>
			<li>Przygotuj 50 ml 0,1 M octanu sodu o pH 5 (dodać 0,41015 g octanu sodu do 50 ml wody dejonizowanej i dostosować pH do 5 za pomocą 100% kwasu octowego).</li>
			<li>Rozpuścić 0,575 g dwuwodnego dwuwodnego L-winianu sodu (patrz tabela materiałów) w 50 ml 0,1 M buforu octanu sodu (pH = 5).</li>
			<li>Dodaj 30 mg szybkiej soli LB z czerwonego fioletu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować PBS-0,1Tx (rozpuścić 500 μL Triton-X w 500 ml PBS).
		<ol>
			<li>Przygotuj PBS-0,1 Tw (rozpuść 500 μl Tween-20 w 500 ml PBS).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj działające rozwiązanie TRAP.
	<ol>
		<li>Wymieszać oba roztwory podstawowe w dygestorii (0,5 ml roztworu fosforanu 10 mg/ml Naphthol AS-MX i 50 ml 1,6 mM roztworu podstawowego Fast Red Violet LB w 50 mM winianu sodu). 
		UWAGA: Roztwór roboczy może być teraz używany na zewnątrz dygestorium. Można go przechowywać w lodówce (zawinięty w folię) do miesiąca. Przechowywać w oddzielnych pojemnikach z przeciwciałami lub innymi odczynnikami wrażliwymi na utrwalacze. Trzymaj się z dala od światła tak bardzo, jak to możliwe.</li>
		<li>Opcjonalnie: przygotować roztwór wybielający (na próbkach po utrwaleniu, które zostały wybarwione metodą TRAP) w PBS i 0,1% Tween-20 (PBS-0,1%Tw).</li>
		<li>Przygotować końcową mieszaninę o stężeniu 0,5% wodorotlenku potasu (KOH) (z 10% roztworu podstawowego (w/v)) i 3% nadtlenku wodoru (H2O2) (33% roztwór podstawowy, przechowywany w lodówce).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj utrwalanie próbki.
	<ol>
		<li>Napraw łuski w 4% PFA w 1x PBS, kołysząc lub obracając przez 40 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Usuń 4% PFA i umyj PBS-0.1Tx co najmniej 3 razy przez 5 minut każde pranie.</li>
		<li>Bezpośrednio przejdź do barwienia TRAP (najlepsze podejście) lub przechowuj w PBS-0.1 Tx przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj barwienie łusek metodą TRAP.
	<ol>
		<li>Usunąć roztwór PBS-0,1 Tx i dodać kolorymetryczny roztwór roboczy TRAP (krok 5.2.1), aby całkowicie pokryć próbki (tj. 1 ml w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml).</li>
		<li>Inkubować przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej, kołysząc się w ciemności.</li>
		<li>Usuń roztwór barwiący i umyj co najmniej 3 razy PBS-0,1 Tw przez 5 minut przy każdym praniu.</li>
		<li>Po utrwaleniu próbek w 4% PFA przez 30 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie kołysząc w ciemności.</li>
		<li>Usunąć roztwór PFA, przemłukując 3 razy PBS-0,1 Tw przez 5 minut każdy krok. 
		UWAGA: Próbki mogą być przechowywane (w roztworach do przechowywania/zamontowane na szkiełkach mikroskopowych) w temperaturze 4 °C w ciemności przez czas nieokreślony.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Montaż poplamionych łusek
<ol>
	<li>Przygotować podłoże montażowe, dodając 2,4 g kryształów Mowiol 4-88 do 6 g glicerolu (patrz Tabela Materiałów). Można użyć dowolnych preferowanych nośników montażowych.</li>
	<li>Dodaj 6 ml wody dejonizowanej i pozostaw na mieszadle magnetycznym na godzinę.</li>
	<li>Dodać 12 ml 0,2 M Tris (pH 8,5) i inkubować w temperaturze około 53 ° C, aż kryształy Mowiolu całkowicie się rozpuszczą.</li>
	<li>Klarować roztwór, odwirowując przy 2000 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieś roztwór do pojemnika do przechowywania. Podłoże montażowe można przechowywać w zamrażarce przez około 12 miesięcy. Rozmrożony roztwór Mowiol jest stabilny do 1 miesiąca.</li>
	<li>Zamontuj łuski na szkiełku mikroskopowym w montażu podłoża, przykryj je szkiełkiem nakrywkowym i obejrzyj pod mikroskopem.</li>
</ol>
7. Hodowla łusek ex vivo
UWAGA: Ten krok jest zaadaptowany z de Vrieze et al.12.
<ol>
	<li>Przed zbiorem łusek w sterylnym środowisku przygotuj pożywkę osteogenną i płytkę hodowlaną.
	<ol>
		<li>Pożywka do hodowli osteogennej (OCM): W sterylnej probówce wirówkowej przygotować 15 ml OCM w standardowej pożywce do hodowli komórkowych (wysoka glukoza, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowej) przy końcowych stężeniach 1% surowicy cielęcej bydła, 1% (200 mM dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy w 0,85% NaCl), 1% roztworu antybiotyku/antybiotyku (100x), 4 mM CaCl2, 10 mM β-glicerofosforanu, 1 nM pirogronian sodu i 1 % amfoterycyna B (opcjonalnie) (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Wlej OCM do sterylnego zbiornika na odczynnik i za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 100 μl do każdego dołka 96-dołkowej płytki.</li>
		<li>Zamknij 96-dołkową płytkę i przechowuj ją. OCM można przechowywać w lodówce przez krótki okres (od nocy do 1 tygodnia) i przechowywać w temperaturze 28 °C przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj zbieranie wagi i mycie PBS.
	<ol>
		<li>Zbierz łuski za pomocą sterylnej pęsety/kleszczy i umieść je na szalce Petriego zawierającej sterylny roztwór PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj ustawianie płyty.
	<ol>
		<li>Przenieść każdą łuskę z płytki Petriego do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce za pomocą 100 μl OCM (ogrzanego do 28 °C) za pomocą sterylnych kleszczyków.</li>
		<li>Gdy wszystkie łuski zostaną przeniesione na płytkę, umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą cienkiej, sterylnej końcówki pipety delikatnie przesuń każdą łuskę na dno studzienki i trzymaj je z dala od boku studzienek, aby uniknąć odbicia światła podczas akwizycji obrazu. 
		UWAGA: Ten krok jest wymagany tylko w przypadku wykonywania obrazowania na żywo.</li>
		<li>Ostrożnie przenieść płytkę do inkubatora lub systemu obrazowania na żywo (LIS, patrz tabela materiałów) (ustawionego w temperaturze 28 °C, 5% CO2 ), gdzie łuski mogą być hodowane przez okres do 7 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odśwież OCM (opcjonalnie).
	<ol>
		<li>Podgrzej OCM, który był przechowywany w lodówce, do 28 °C.</li>
		<li>Ostrożnie przenieść 96-dołkową płytkę do sterylnego środowiska. Za pomocą pipety wielokanałowej odessać 50 μl z każdej studzienki. W tym celu dociśnij końcówki do ścian i nie zanurzaj ich aż do dna, aby uniknąć zasysania/przesuwania/wyjmowania łusek. Korzystaj z nowych wskazówek dla różnych warunków.</li>
		<li>Wlej OCM do sterylnego zbiornika na odczynnik i za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 60 μl OCM do każdego dołka.</li>
		<li>Umieść płytkę pod mikroskopem stereoskopowym i sprawdź, czy nie ma źle umieszczonych łusek (zbyt blisko ścianek, unoszących się lub w pozycji pionowej w pożywce). W razie potrzeby zmień ich położenie za pomocą cienkiej, sterylnej końcówki pipety.</li>
		<li>Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze/LIS. 
		UWAGA: Nie odświeżaj pożywki, jeśli eksperyment dotyczy rytmu okołodobowego (CR), ponieważ wstrząs surowicy może wpływać na zegar biologiczny. Zauważ, że podczas studiowania CR zauważysz, że warunki oświetleniowe również resetują zegar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj barwienie i obrazowanie w skali postkulturowej (opcjonalnie).
	<ol>
		<li>Po 6 dniach hodowli utrwal je i skieruj do odpowiedniego barwienia, takiego jak von Kossa i ALP wspomniane powyżej.</li>
		<li>Alternatywnie, jeśli ryby doświadczalne mają znacznik fluorescencyjny, umieść płytkę w systemie obrazowania na żywo. 
		UWAGA: Jeśli korzystasz z systemu obrazowania na żywo, upewnij się, że jest on ustawiony na temperaturę i poziom CO2 odpowiedni dla eksperymentu. Zazwyczaj w tym badaniu stosowano 28 °C i 5% CO2 . Dobierz odpowiednie filtry i punkty czasowe obrazowania (tutaj zastosowano interwał 2 lub 4 h, który jest wystarczający do śledzenia migracji osteoblastów) oraz obiektywy o małym powiększeniu (tj. 4x), aby zapewnić równomierne obrazowanie całych studzienek. Dzieje się tak, ponieważ łuski mają tendencję do przemieszczania się wewnątrz studzienek, szczególnie podczas wymiany pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Harvesting and Visualization of Elasmoid Scales of Zebrafish During In Vivo Regeneration

<ol><li>Tobias, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+in+functional+genomics+research+in+osteoporosis%3A+report+from+a+workshop+held+by+the+causes+working+group+of+the+osteoporosis+and+bone+research+academy+of+the+Royal+Osteoporosis+Society+on+October+5th+2020%2C%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges in functional genomics research in osteoporosis: report from a workshop held by the causes working group of the osteoporosis and bone research academy of the Royal Osteoporosis Society on October 5th 2020,&#34;.</a> Frontiers in Endocrinology. 11, (2021).</li>
<li>Busse, B., Galloway, J. L., Gray, R. S., Harris, M. P., Kwon, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+An+emerging+model+for+orthopedic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: An emerging model for orthopedic research.</a> Journal of Orthopaedic Research. 38 (5), 925-936 (2020).</li>
<li>Dietrich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+biology+and+disease+modeling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Skeletal biology and disease modeling in zebrafish.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 36 (3), 436-458 (2021).</li>
<li>McGowan, L. M., Kague, E., Vorster, A., Newham, E., Cross, S., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt16+elicits+a+protective+effect+against+fractures+and+supports+bone+repair+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22JBMR+Plus%22%5BJournal%5D)">Wnt16 elicits a protective effect against fractures and supports bone repair in zebrafish.</a> JBMR Plus. 5 (3), 10461(2021).</li>
<li>Sehring, I., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+fin%3A+Complex+molecular+interactions+and+cellular+mechanisms+guiding+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish fin: Complex molecular interactions and cellular mechanisms guiding regeneration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 14 (7), 040758(2022).</li>
<li>Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+emerging+model+for+osteoporosis%3A+a+primary+testing+platform+for+screening+new+osteo-active+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds.</a> Frontiers in Endocrinology. 10 (6), (2019).</li>
<li>Aman, A. J., Fulbright, A. N., Parichy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2F%CE%B2-catenin+regulates+an+ancient+signaling+network+during+zebrafish+scale+development%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Wnt/β-catenin regulates an ancient signaling network during zebrafish scale development.</a> Elife. 7, 37001(2018).</li>
<li>Iwasaki, M., Kuroda, J., Kawakami, K., Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+regulation+of+bone+morphogenesis+through+the+development+and+regeneration+of+osteoblasts+in+the+zebrafish+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epidermal regulation of bone morphogenesis through the development and regeneration of osteoblasts in the zebrafish scale.</a> Developmental Biology. 437 (2), 105-119 (2018).</li>
<li>Metz, J. R., de Vrieze, E., Lock, E. J., Schulten, I. E., Flik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elasmoid+scales+of+fishes+as+model+in+biomedical+bone+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Ichthyology%22%5BJournal%5D)">Elasmoid scales of fishes as model in biomedical bone research.</a> Journal of Applied Ichthyology. 28 (3), 382-387 (2012).</li>
<li>Cox, B. D., De Simone, A., Tornini, V. A., Singh, S. P., Di Talia, S., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+toto+imaging+of+dynamic+osteoblast+behaviors+in+regenerating+skeletal+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">In toto imaging of dynamic osteoblast behaviors in regenerating skeletal bone.</a> Current Biology. 28 (24), 3937-3947 (2018).</li>
<li>Tonelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+A+resourceful+vertebrate+model+to+investigate+skeletal+disorders%2C%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: A resourceful vertebrate model to investigate skeletal disorders,&#34;.</a> Frontiers in Endocrinology. 11, (2020).</li>
<li>de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+osteogenic+compounds+by+an+ex-vivo+sp7%3A+Luciferase+zebrafish+scale+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Identification of novel osteogenic compounds by an ex-vivo sp7: Luciferase zebrafish scale assay.</a> Bone. 74, 106-113 (2015).</li>
<li>De Vrieze, E., Moren, M., Metz, J. R., Flik, G., Lie, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arachidonic+acid+enhances+turnover+of+the+dermal+skeleton%3A+Studies+on+zebrafish+scales%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Arachidonic acid enhances turnover of the dermal skeleton: Studies on zebrafish scales.</a> PLoS One. 9 (2), 89347(2014).</li>
<li>Bergen, D. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+zebrafish+scales+express+a+subset+of+evolutionary+conserved+genes+involved+in+human+skeletal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Regenerating zebrafish scales express a subset of evolutionary conserved genes involved in human skeletal disease.</a> BMC Biology. 20 (1), 21(2022).</li>
<li>Bergen, D. J. M., et al. High bone mass disorders: New insights from connecting the clinic and the bench. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergen%2C+DJM+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22">Journal of Bone and Mineral Research</a>. , John Wiley and Sons Inc. (2022).</li>
<li>Pasqualetti, S., Banfi, G., Mariotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblast+and+osteoclast+behavior+in+zebrafish+cultured+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Osteoblast and osteoclast behavior in zebrafish cultured scales.</a> Cell and Tissue Research. 350 (1), 69-75 (2012).</li>
<li>Singh, S. P., Holdway, J. E., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+amputated+zebrafish+fin+rays+from+de+novo+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of amputated zebrafish fin rays from de novo osteoblasts.</a> Developmental Cell. 22 (4), 879-886 (2012).</li>
<li>Ethiraj, L. P., Fong, E. L. S., Liu, R., Chan, M., Winkler, C., Carney, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+and+fluorescent+TRAP+assays+for+visualising+and+quantifying+fish+osteoclast+activity%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Colorimetric and fluorescent TRAP assays for visualising and quantifying fish osteoclast activity.</a> European Journal of Histochemistry. 66 (2), 3369(2022).</li>
<li>DeLaurier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+sp7%3AEGFP%3A+a+transgenic+for+studying+otic+vesicle+formation%2C+skeletogenesis%2C+and+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration.</a> Genesis. 48 (8), 505(2010).</li>
<li>Carnovali, M., Banfi, G., Mariotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+modulation+of+bone+metabolism+in+zebrafish+scales+as+new+model+of+male+osteoporosis+in+lower+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Geroscience%22%5BJournal%5D)">Age-dependent modulation of bone metabolism in zebrafish scales as new model of male osteoporosis in lower vertebrates.</a> Geroscience. 43 (2), 927-940 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Elasmoidalne łuski danio pręgowanego, jako nowy model do badań szkieletowych, mają ogromny potencjał, aby pomóc nam zrozumieć konserwację, regenerację i naprawę kości. Obfitość łusek na rybach pozwala na średnio- i wysokoprzepustowe badania przesiewowe związków przy jednoczesnym zmniejszeniu liczby wykorzystywanych zwierząt i ograniczeniu zmienności wewnątrzosobniczej. W tym miejscu przedstawiono protokoły regeneracji kamienia i hodowli w skali ex vivo w celu zbadania regeneracji i naprawy.
Podczas korzystania z tego protokołu należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych kroków. Ostrożne usunięcie łusek jest niezbędne, zwłaszcza w przypadku stosowania transgenicznej linii reporterowej w celu ograniczenia zakłóceń w populacji komórek spowodowanych zbiorem. Jeśli mają być dokonywane porównania ze skalami ontogenetycznymi, należy upewnić się, że region nie zawiera spontanicznie regenerujących się łusek (które mogą naturalnie występować przez całe życie ryby). Upewnij się, że środowisko i sprzęt są sterylne do hodowli ex vivo , aby osiągnąć optymalną przeżywalność komórek i minimalną infekcję w hodowli.
W zależności od konkretnego pytania badawczego, można dokonać adaptacji do protokołu, takich jak łączenie różnych transgenicznych linii reporterowych w celu wizualizacji innych typów komórek profili ekspresji genów podczas regeneracji i naprawy11,14.
Szeroki zakres barwień, jakie można wykonać na wadze, sprawia, że dla każdego badanego związku lub schorzenia można przyjrzeć się jego wpływowi na kość pod różnymi kątami; podczas gdy reporterzy sp7 / osx mogą pokazywać liczbę osteoblastów, barwienie ALP może wizualizować aktywność osteoblastów, barwienie TRAP może wizualizować aktywność osteoklastów, barwienie na żywo Calcein green może oznaczać nowo tworzącą się kość, a barwienie czerwienią Alizarin lub von Kossa może wykazywać mineralizację skali. Można również wykorzystać aktywność lucyferazy do ilościowego określenia osteoblastów12. W połączeniu z tymi technikami barwienia można poznać względny udział osteoblastów i osteoklastów w danym efekcie kostnym. Łuski nie mają osteocytów, które są powszechne w kościach ssaków i są głównymi czynnikami napędzającymi odpowiedź mechanosensoryczną kości; Naprawa i regeneracja łusek w tym modelu są napędzane przede wszystkim przez osteoblasty, a następnie przebudowane przez osteoklasty 8,9. Należy zauważyć, że różnice występują między osobami i grupami wiekowymi20. Aby to zminimalizować, obszar odłowu łusek musi być stały, ponieważ różne lokalizacje mogą powodować różne morfologie łusek, a ryby z tych samych grup rodzeństwa są wykorzystywane, aby wiek i wielkość były spójne. Ponieważ jednak można zebrać wiele łusek na rybę, można przeprowadzić więcej eksperymentów przy użyciu mniejszej liczby ryb, zmniejszając zmienność wewnątrzosobniczą.
Podsumowując, protokoły te pokazują techniki eksperymentalne, które można zastosować do skal ontogenetycznych i regeneracyjnych. Podsumowując, skale elasmoidalne wykazują ogromny potencjał jako model szkieletowy, który pomaga w zrozumieniu procesu powstawania i naprawy kości; i przyczyni się do ograniczenia wykorzystywania zwierząt do wysokoprzepustowych badań przesiewowych związków osteoanabolicznych.

Kość to twarda tkanka łączna, która stanowi główną część szkieletu, umożliwiając poruszanie się i działając jako rezerwa mineralna w ciele. Aby utrzymać zdrową kość, niezbędna jest znakomita równowaga między tworzeniem a degradacją kości dzięki sprzężonej aktywności osteoblastów (które są anaboliczne) i osteoklastów (które resorbują kość). Równowaga ta jest zaburzona przez starzenie się lub brak równowagi hormonalnej, co często prowadzi do chorób związanych z łamliwością kości, takich jak osteoporoza1. Chociaż istniejące leki zostały zatwierdzone do leczenia chorób związanych z łamliwością kości, wiele z nich ma skutki uboczne; W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na nowe metody terapeutyczne<klasa SUP="xref">1. W związku z tym nadal istnieje zapotrzebowanie na liczne źródła biologicznie istotnej tkanki kostnej, które można wykorzystać do testowania potencjalnych związków terapeutycznych.
Tradycyjnie, modele gryzoni i systemy hodowli komórkowych były wykorzystywane do badania biologii kości. Jednak danio pręgowany coraz częściej staje się kolejnym modelem z wyboru. Chociaż nie jest to system ssaków, danio pręgowany oferuje pewne korzyści w badaniach kości w porównaniu z gryzoniami; Należą do nich ich płodność i przezroczystość larw; Nawet w wieku dorosłym niektóre tkanki szkieletowe, w tym łuski i płetwy, pozostają przezroczyste, co umożliwia obrazowanie in vivo w wysokiej rozdzielczości i zwiększoną dostępność mutantów szkieletowych2,3. Zarówno płetwy, jak i łuski danio pręgowanego są zdolne do całkowitej regeneracji po usunięciu. Regeneracja szkieletu i naprawa urazów płetw zebry pręgowanego były szeroko badane4,5, podczas gdy łuski danio pręgowanego są nowszym modelem kości w terenie, ale oferują korzyści dla hodowli ex vivo6.
Łuski są bardzo obfite, z co najmniej 300 łuskami na każdej rybie, które służą jako osłona ochronna dla ryb. Każda łuska jest małą zmineralizowaną płytką składającą się z osteoblastów tworzących kości i osteoklastów resorbujących kości bogatej w kolagen macierzy szkieletowej bogatej w kolagen7. Proces kostnienia zarówno łusek danio pręgowanego, jak i kości ludzkich wymaga różnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych w osteoblasty w celu utworzenia zmineralizowanej macierzy. Łuski danio pręgowanego stanowią ogromną zaletę w badaniach szkieletowych dzięki ich silnym zdolnościom regeneracyjnym, które można wykorzystać do badania regeneracji i naprawy kości. Jednak pomimo obecności zarówno osteoblastów, jak i osteoklastów, łuski danio pręgowanego nie mają osteocytów, które są ważne dla przebudowy kości człowieka i mechanosensacji; Powierzchowne położenie łusek oznacza, że można je łatwo usunąć za pomocą kleszczy. Po usunięciu skali następuje kaskada zdarzeń i rozpoczyna się regeneracja skali8,9. Dostępne są różne opcje barwienia i obrazowania w celu wizualizacji aktywności osteoblastów i osteoklastów oraz mineralizacji łusek, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1. Dodatkowo, dostępność wielu istotnych fluorescencyjnych transgenicznych linii reporterowych danio pręgowanego oznacza, że można wizualizować dynamikę komórek podczas regeneracji7,10,11. Proces ten pozwala lepiej zrozumieć tworzenie się kości de novo poprzez obserwację wczesnych wzorców regeneracji łusek na boku ryby w celu zbadania morfologii, aktywności komórkowej i profili genetycznych tych zregenerowanych łusek. Biologia powstawania i regeneracji kamienia została dobrze scharakteryzowana. Co ważne, skale mogą wykazywać dobrą zdolność predykcyjną dla związków istotnych terapeutycznie12, a leczenie ryb glikokortykosteroidami prowadzi do skali, która regeneruje się, aby pokazać fenotypy osteoporotyczne13. Transkryptom skal regeneracyjnych pokazuje, że geny aktywowane w procesie regeneracji skali są wzbogacone o geny związane z chorobami układu kostnego u ludzi, co dodatkowo dowodzi ich znaczenia jako systemu modelowego6,14.
Na koniec, te łuski mogą być hodowane ex vivo przez okres do 7 dni. W porównaniu z hodowlami linii komórkowych, które zwykle składają się z jednego typu komórek, hodowla w skali ex vivo zapewnia możliwości badania kości in vitro w naturalnym środowisku zawierającym zarówno osteoblasty, jak i osteoklasty z naturalną macierzą zewnątrzkomórkową 8,12,15,16.
Skala kulturowa pozwala nam również na przeprowadzanie badań przesiewowych leków pod kątem nowych celów osteoanabolicznych. Obfitość łusek na rybach oznacza, że można wypełnić co najmniej dwie płytki 96-dołkowej płytki z tylko jednej ryby, co pozwala na badanie przesiewowe złożone w formacie wielodołkowym, w którym każda studzienka zawiera jedną łuskę wraz z naturalną niszą komórek. Dodatkowo, ponieważ łuski są cienkie, wchłanianie leku jest przewidywalne12. Podsumowując, elasmoidalne łuski danio pręgowanego mają ogromny potencjał w badaniach szkieletowych i mogą pomóc nam uzyskać lepszy wgląd w zdarzenia komórkowe podczas tworzenia i naprawy kości. W tym miejscu opisujemy protokoły pobierania wag w celu przeprowadzenia regeneracji in vivo i hodowli łusek ex vivo.

<table><tbody><tr><td>10x Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco</td><td>70013-016</td><td>PBS</td></tr><tr><td>12-Multichanel Pipeta</td><td>Sartorius</td><td>728230</td><td>Multichanel, Pipeta mechaniczna Proline Plus, 12-kanałowa, , 10-100 &mikro;L.&nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml Probówki wirówkowe</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>Probówka wirówkowa, nasadka CentriStar, polipropylen, bez RNAz/DNA, niepirogenny</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Alizaryn czerwony</td><td>Sigma</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15290026</tr><tr><td>Bemis Parafilm M Laboratoryjna folia do owijania</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>11772644</td><td>Folia uszczelniająca</td></tr><tr><td>Kalceina w proszku</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Thermo Scientific</td><td>L13191.30</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>96-dołkowa, przezroczysta, z płaskim dnem Polistyren Mikropłytki poddane działaniu TC, pakowane pojedynczo, z pokrywką, sterylne</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Cytiva&nbsp; HyClone Wzbogacona żelazem surowica dla cieląt</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SH30072.03</td><td></td></tr><tr><td>Danieau</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31053</td><td></td></tr><tr><td>Rurki Falcon</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Fast Red Violet LB roztwór podstawowy</td><td>Sigma</td><td>F3381</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplement</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>X</td><td></td><td>Inkubator, Zestaw do 28 & stopni; C i 5% CO2</td></tr><tr><td>IncuCyte Zoom</td> System obrazowania na żywo <td>Sartorious</td><td>X</td><td>, ustawienie do 28 stopni C i 5% CO2</td></tr><tr><td>Leica stereomikroskop</td><td>X</td><td></td><td>Sterioskop</td></tr><tr><td>L-winian dwuzasadowy dwuwodny</td><td>Sigma</td><td>228729</td><td></td></tr><tr><td>Mgcl2</td><td>BDH Laboratory Sup.&nbsp;</td><td>261237T</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Epredia</td><td>J2800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>9002-89-5</td><td></td></tr><tr><td>MQ woda</td><td>X</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N, N'-dimetyloformamid (Merck: D4451)</td><td>Merck</td><td>D4451</td><td></td></tr><tr><td>NaCL</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/3120/53</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol AS-MX fosforan</td><td>Merck</td><td>N4875</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór NBT/BCIP</td><td>Sigma</td><td>#000000011681451001</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Corning</td><td>430589</td><td>35 mm sterylna szalka Petriego, niepoddana obróbce, niepirogenna, polistyren.</td></tr><tr><td>Zbiornik odczynnika</td><td>Startub</td><td>E2310-1025</td><td>25mL Zbiornik odczynnika</td></tr><tr><td>Azotan srebra</td><td>Sigma</td><td>209139</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma</td><td>52889</td><td></td></tr><tr><td>Beta-glicerofosforan sodu pentahydrat</td><td>Thermo Scientific</td><td>L03425.14</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór pirogronianu sodu</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Winian sodu</td><td>Sigma</td><td>S4797</td><td></td></tr><tr><td>Tiokulfat sodu</td><td>Sigma</td><td>563188</td><td></td></tr><tr><td>Trikaina sulfonian metanu (MS222)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma 252859</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td>Pęseta <td>do CHE3852</td><td></td> <td>SLS</td></tr><tr><td>Numer 5</td><td>Dumont</td><td>500341</td><td>Pęseta, INOX, klasa biologiczna</td></tr><tr><td>Zbiorniki na rybę pręgowany&nbsp;</td><td>Tecniplast</td><td>&nbsp; ZB30BCP</td><td>3,5 L - 28 cm x 11 cm x 17 cm Zbiorniki</td></tr><tr><td>na danio pręgowane&nbsp;</td><td>Tecniplast</td><td>&nbsp; ZB30BCP</td><td>1 L - 28 cm x 7 cm x 11 cm</td></tr></tbody></table>

regeneracja łusek danio pręgowanego w kulturze łusek toto i ex vivo

Zebrafish Scale Regeneration In Toto and Ex Vivo Culture of Scales

Choroby układu kostnego są często skomplikowane w swojej etiologii i dotykają miliony ludzi na całym świecie. Ze względu na starzenie się społeczeństwa istnieje zapotrzebowanie na nowe terapie, które mogłyby zmniejszyć obciążenie systemów opieki zdrowotnej. Ponieważ choroby te są złożone, dokładne modelowanie patofizjologii kości w warunkach laboratoryjnych jest trudne i kosztowne. Wyzwaniem dla tej dziedziny jest stworzenie opłacalnej, biologicznie istotnej platformy do modelowania chorób kości, którą można wykorzystać do testowania potencjalnych związków terapeutycznych. Taka platforma powinna w idealnym przypadku umożliwiać dynamiczną wizualizację zachowań komórek osteoblastów budujących kości i osteoklastów rozkładających kości działających w swoim zmineralizowanym środowisku macierzy. Danio pręgowany jest coraz częściej wykorzystywany jako modele ze względu na dostępność narzędzi genetycznych, w tym transgenicznych linii reporterowych, oraz fakt, że niektóre tkanki szkieletowe (w tym łuski) pozostają przezroczyste do wieku dorosłego, co umożliwia dynamiczne opcje obrazowania. Ponieważ łuski danio pręgowanego mają zarówno osteoblasty, jak i osteoklasty i są bardzo liczne, stanowią łatwo dostępny i obfity zasób niezależnych jednostek kostnych. Co więcej, po usunięciu dorosłe łuski danio pręgowanego w pełni się regenerują, oferując w ten sposób sposób możliwość badania czasoprzestrzennego wzrostu zmineralizowanej tkanki in vivo. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokoły zbioru i śledzenia regeneracji łusek. Na koniec przedstawiono również protokół stabilnej hodowli łusek ex vivo przez tydzień i po reakcji gojenia po kontrolowanym uszkodzeniu zmineralizowanej matrycy łuski w czasie.

Regeneracja łusek 
Regenerację łusek można śledzić za pomocą standardowego stereomikroskopu fluorescencyjnego, obrazując bok ciała danio-ostrobramka. Rycina 3A przedstawia zmiany w ekspresji sp7/osx w łuskach podczas ich regeneracji u 4-miesięcznego danio-ostrobramka. Punkty czasowe obrazowania boku ciała pokazane na Rycynie 3A to etap ontogenetyczny (pierwotne łuski przed usunięciem), 2. dzień, 4. dzień i 10. dzień po usunięciu. Zazwyczaj stosujemy linie transgeniczne osx (znane również jako osterix lub sp7) (zarówno GFP (Tg(Ola.sp7:NLS-eGFP)19, jak i mCherry Tg(osterix:mCherry-NTR)pd46)17), aby śledzić zmiany w układzie kostnym, ponieważ marker ten znakuje osteoblasty tworzące kość. Wczesne wzorowanie nowo tworzonych łusek jest widoczne w 2. dniu regeneracji. Ten wczesny wzorzec regeneracji łusek jest w niektórych przypadkach zaburzony, zwłaszcza u mutantów szkieletowych. Śledząc postępy regeneracji, można przeanalizować jej wydajność i tempo. W dniu usuwania łusek, po obrazowaniu boku ciała, można przeprowadzić obrazowanie poszczególnych usuniętych łusek przy użyciu tego samego stereomikroskopu, jak pokazano na Rycynie 3B. Zregenerowane łuski wykazują znacznie wyższą ekspresję osx w porównaniu do łusek ontogenetycznych z dnia 0, ponieważ osteoblasty są niezbędne do tworzenia nowej tkanki kostnej.
Ex vivo skalowanie hodowli 
Choć proces tworzenia kości de novo można badać, śledząc proces regeneracji na boku ciała ryby, model ten można również wykorzystać do badania naprawy i gojenia urazów szkieletowych z ex vivo hodowlę łusek, wykonując nacięcie na łuskach za pomocą skalpela. Przy użyciu systemu obrazowania żywych komórek proces naprawy można śledzić w czasie rzeczywistym. Rycina 4 przedstawia reprezentatywny wynik odpowiedzi gojenia urazu w skali ontogenetycznej po 3 dniach w kulturze, w której osteoblasty zostały znakowane za pomocą osxmCherry. Miejsce urazu przedstawione na wstawkach na początku hodowli wykazuje wyraźną przerwę między osteoblastami a okręgami wzrostu łuski (Rycina 4A). Migrację osteoblastów w stronę miejsca urazu można monitorować za pomocą obrazowania poklatkowego (time-lapse). Po 3 dniach hodowli szerokość przerwy ulega zmniejszeniu, a ekspresjaosx można dostrzec pomiędzy przerwą a nowo powstałymi kręgami łuski (Rysunek 4B). Ponadto morfologia pod kątem kształtu osteoblastów jest bardziej okrągła na początku hodowli, a po 3 dniach staje się bardziej wydłużona. Zmiana wyglądu osteoblastów wynika prawdopodobnie z przebywania w hodowli, a nie w naturalnym środowisku (przylegając do ryby).
<img alt="Analiza tkanki kostnej z użyciem osx: mCherry, AR, kalceiny, ALP, TRAP, metody Von Kossa; schemat mikroskopowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65396/65396fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przykłady opcji obrazowania łusek. Osteoblasty można zwizualizować za pomocą transgenicznych linii reporterowych osx/sp7 (z użyciem GFP lub mCherry). Barwienie ALP może służyć do wykazania aktywności osteoblastów. Barwienie TRAP pozwala na wykazanie aktywności osteoklastów. Czerwień alizarynowa (AR) i zielona kalceina to barwniki, które można stosować u żywych ryb; AR znakuje mineralizację, a kalceina znakuje nowo powstałą kość. Stopień mineralizacji można również wykazać za pomocą barwienia metodą von Kossa. Paski skali: 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65396/65396fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat obrazowania in vivo danio pręgowanego; układ eksperymentalny dla zbierania danych w określonych punktach czasowych i pobierania łusek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65396/65396fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schematyczny rysunek eksperymentu regeneracji łusek. Ogólny schemat eksperymentu regeneracji łusek pokazujący, że ryby są rozdzielane do oddzielnych zbiorników przed rozpoczęciem badania. Odnotowano długość, płeć i stan zdrowia. Schemat przedstawia również sugerowany obszar na boku ryby do pobrania łusek oraz sugerowane punkty czasowe obrazowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65396/65396fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rozwój ontogenetyczny i osteoblastyczny, obrazy mikroskopowe wykazujące fluorescencję w 2, 4, 10 dph, marker osx." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65396/65396fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy ekspresji osterix (w celu wizualizacji osteoblastów) podczas regeneracji łusek pobranych od 4-miesięcznej danio-pręgowanej. (A) Obrazy boku ciała wykonane w dniu 0 (przed usunięciem, łuski ontogenetyczne), 2 dph (dni po usunięciu), 4 dph oraz 10 dph w celu śledzenia zmian w ekspresji osx. Paski skali: 1 mm. (B) Reprezentatywne obrazy łuski ontogenetycznej oraz łuski w 10 dph pobranych od tej samej ryby co na panelu (A). Zwróć uwagę na zwiększone poziomy ekspresji osx, zaznaczone kolorem magenta w centrum regenerujących się łusek. Paski skali: 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65396/65396fig03large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Porównanie regeneracji uszkodzonej tkanki w ciągu trzech dni, analiza obrazów mikroskopowych wykazująca regenerację." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65396/65396fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki odpowiedzi naprawczej po urazie szkieletowym w skali ontogenetycznej, zarejestrowane u 4-miesięcznego danio przebrzuchym przy użyciu systemu obrazowania na żywo. (A) Łuski ontogenetyczne z urazem wykonanym skalpelem w tym samym dniu, w którym pobrano hodowlę (punkt czasowy 0/dzień 0). (B) Ta sama łuska pokazana 3 dni po urazie. Wstawka przedstawia obszar urazu. Paski skali: 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65396/65396fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół opisuje zbieranie i wizualizację elasmoidalnych łusek danio pręgowanego podczas regeneracji in vivo. Ponadto przedstawiono hodowlę ex vivo tych łusek do 7 dni po zbiorach.

Regeneracja łusek danio pręgowanego w kulturze łusek toto i ex vivo

Skeletal diseases are often complex in their etiology and affect millions of people worldwide. Due to the aging population, there is a need for new ...

Jedną z zalet używania rybich łusek do badań jest to, że zawierają one zarówno osteoblast, jak i osteoklast, które są niezbędne do przebudowy kości. Kiedy łuski są hodowane ex vivo, możemy badać interakcje tych dwóch populacji komórek wraz z macierzą szkieletową, w przeciwieństwie do tradycyjnej hodowli komórkowej, w której zwykle występuje tylko jeden typ komórek. Zaletą stosowania rybich łusek do badań jest to, że są one obfite w rybach, łatwo je zbierać i są półprzezroczyste, co pozwala na lepsze obrazowanie ex vivo.Ponieważ łuski mogą się całkowicie zregenerować, pozwalają nam badać regenerację kości, która rzadko występuje w modelach ssaków. Protokoły, które tutaj prezentujemy, pozwalają nam lepiej analizować interakcje komórkowe. Pozwoli nam to przetestować, jak różne typy komórek reagują na starzenie się i zmiany w rytmie okołodobowym.

zebrafish-scale-regeneration-in-toto-and-ex-vivo-culture-of-scales

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ponieważ wiele modeli chorób neurologicznych i nieneurologicznych u danio pręgowanego jest badanych na dorosłych rybach, a nie na zarodkach/larwach, opracowaliśmy ilościowy test regeneracyjny linii bocznej, który może być zastosowany do modeli chorób u dorosłych ryb danio pręgowanego. Test polegał na rozdzielczości na poziomie 1) neuromastu i 2) poszczególnych komórek rzęsatych.

Test do regeneracji linii bocznej u dorosłych danio pręgowanych

Keratocyty danio pręgowanego migrują w arkuszach komórkowych z eksplantatów i dostarczają modelu in vitro do badania mechanizmów zbiorowej migracji komórek w kontekście gojenia się ran nabłonkowych. Protokoły te szczegółowo opisują skuteczny sposób ustanawiania pierwotnych kultur eksplantatów do wykorzystania w zbiorczych testach migracji komórek.

Eksplantaty keratocytów danio pręgowanego w celu zbadania zbiorowej migracji komórek i reepitelializacji w gojeniu się ran skórnych

Regeneracja mięśni szkieletowych jest napędzana przez komórki macierzyste mięśni rezydujące w tkankach, które są upośledzone w wielu chorobach mięśni, takich jak dystrofia mięśniowa, co skutkuje niezdolnością mięśni do regeneracji. W tym miejscu opisujemy protokół, który pozwala na badanie regeneracji mięśni w modelach choroby mięśni danio pręgowanego.

Badanie regeneracji mięśni w modelach chorób mięśni danio pręgowanego

Ten protokół oferuje metodę badania dynamiki komórkowej za pomocą prostej techniki hodowli in vitro. Jest to okazja dla badaczy i edukatorów danio pręgowanego do badania procesów komórkowych, takich jak te związane z homeostazą kości i podstawową biologią komórki, poprzez wizualizację jąder fluorescencyjnych i komórek apoptotycznych w łuskach.

Technika hodowli in vitro do badania dynamiki komórkowej w łuskach danio pręgowanego

Organotypowe hodowle skrawków embrionalnego mózgu gryzoni są szeroko stosowane w badaniach nad rozwojem mózgu. Choć systemy in vivo często oferują pewne korzyści, ...

Organotypowa hodowla plastrów mózgu szczura w 18. dniu embrionalnym (E18)

W tym filmie zaprezentowano New culture – metodę, dzięki której zarodki kurcząt są hodowane poza jajem przez maksymalnie 24 hr. Metoda ta umożliwia badanie wczesnego rozwoju (od pręgi pierwotnej do 14 som.), co odpowiada okresowi E7-9 u myszy. Zastosowania tej techniki obejmują elektroporację, hybrydyzację in situ oraz immunohistochemię.

Metoda hodowli wczesnych zarodków kurczaka ex vivo (nowa hodowla)

Danio pręgowany stał się potężną platformą in vivo do przesiewowych badań leków opartych na fenotypie oraz analiz genetyki chemicznej. W niniejszej pracy prezentujemy prostą i praktyczną metodę wielkoskalowego przesiewu małych cząsteczek z wykorzystaniem embrionów danio pręgowanego.

Wielkoskalowe badania z wykorzystaniem rybek zebrafish In vivo Przesiewanie małych cząsteczek

Jajowód (FT) wyłania się jako alternatywne miejsce pochodzenia surowiczego raka jajnika (SOC). Niniejszy protokół opisuje nową metodę izolacji i hodowli ex vivo komórek nabłonkowych jajowodu. System ten odwzorowuje nabłonek in vivo i umożliwia badanie patogenezy SOC.

Kultura ex vivo pierwotnych ludzkich komórek nabłonkowych jajowodu

Opisano metodę warunkowego wyciszania ekspresji białka docelowego w siatkówce dorosłego danio-zebry, która polega na dokonywaniu iniekcji domięśniowych morfolino antysensownych oraz ich elektroporacji do siatkówki. W wyniku tego procesu ekspresja białka jest wyciszona przez kilka dni, co umożliwia zbadanie roli tego białka w regenerującej się lub nienaruszonej siatkówce.

In vivo elektroporacja morfolin do siatkówki dorosłego danio pręgowanego

Opisujemy metodę warunkowego wyciszania ekspresji białka docelowego podczas regeneracji płetwy u dorosłych ryb zebrafish. Technika ta polega na mikroiniekcji i elektroporacji antysensownych oligonukleotydów morpholino do tkanki płetwy, co pozwala na badanie roli białka w różnych etapach regeneracji płetwy, w tym podczas gojenia rany, tworzenia blastemy oraz regeneracyjnego wzrostu.

In vivo elektroporacja morfolin do regenerującej płetwy ogonowej dorosłego zebrafisha

Odkryj metodę hodowli łusek danio pręgowanego ex vivo do 7 dni. Technika umożliwia badanie interakcji osteoblastów i osteoklastów w regeneracji kości, oferując unikalny model poznawania procesów starzenia i rytmu dobowego.

Regeneracja łusek danio pręgowanego w kulturze łusek toto i ex vivo

Przeglądaj więcej filmów