Utrzymanie i ocena różnych typów tkanek i komórek oka przy użyciu nowatorskiego systemu płynów bez pompy
14 lipca 2023
Analiza żywej tkanki w czasie rzeczywistym dostarcza ważnych danych funkcjonalnych i mechanistycznych. W tym artykule opisano protokoły i zmienne krytyczne w celu zapewnienia dokładnego i powtarzalnego generowania danych przez nowatorski i niewymagający pompowania wielokanałowy system fluidyki, który utrzymuje i ocenia szeroką gamę modeli tkanek i komórek.
Najczęściej spotykane urządzenia służące do pomiaru zużycia tlenu nie obsługują jednoczesnego zbierania frakcji odpływowych. Bardzo ważne jest, aby oznaczyć odpływ w celu skorelowania metabolizmu z funkcją tkanek. Technologie mierzące oba te czynniki mogą lepiej oceniać mechanizmy komórkowe pośredniczące w funkcjonowaniu tkanek i chorobach.
Kluczowym wyzwaniem w pomiarze zużycia tlenu w żywej tkance jest dostarczenie odpowiedniej ilości tlenu w celu utrzymania żywotności i funkcji tkanek. Najlepiej osiągnąć to za pomocą systemów przepływowych. Zastosowanie ciśnienia gazu zamiast standardowych pomp perystaltycznych znacznie upraszcza procedurę, a także eliminuje tworzenie się pęcherzyków.
Użyteczność pomiaru metabolicznego jest tylko tak dobra, jak jego zdolność do ilościowego określania i odtwarzania wyników. Nasz protokół wykorzystuje połączenie precyzyjnie kontrolowanego natężenia przepływu ze stabilnym wykrywaniem tlenu rozpuszczonego w całym okresie eksploatacji zarówno na wlocie, jak i odpływie. Takie podejście może w powtarzalny sposób rozwiązać zmiany w zużyciu tlenu nawet o kilka procent.
Procesy biochemiczne pośredniczące w funkcjonowaniu siatkówki są wynikiem wzajemnego oddziaływania metabolicznego między różnymi tkankami oka. Zdolność naszego systemu przepływu do oceny wielu typów tkanek o różnych geometriach ułatwia badanie unikalnych wewnętrznych właściwości każdego typu komórek i ich skoordynowanych funkcji. Wiele chorób dotykających oko jest spowodowanych upośledzonymi szlakami metabolicznymi i sygnalizacją.
Koncentrujemy się na pomiarze zużycia tlenu i uwalniania metabolicznych produktów ubocznych przez tkanki oka w celu scharakteryzowania, zrozumienia i leczenia rozwoju chorób siatkówki i zwyrodnień. Aby skonfigurować nowatorski, wielokanałowy system hodowli przepływowej bez pompy po zmontowaniu modułu zbiornika pożywki lub MRM, włóż do niego zespoły przewodów i umieść MRM w podgrzewaczu. Po zabezpieczeniu grzałki na miejscu przystąp do wkładania zespołów komory tkankowej lub TCA do modułu komory perfuzyjnej lub PCM Za pomocą narzędzia do wprowadzania TCA włóż każdy z ośmiu TCA pojedynczo do otworów PCM.
Upewnij się, że mocno dociśniesz adapter narzędziem, aż górna część tulei rurki wokół każdej komory dotknie powierzchni, opisując otwory w PCM. Odłóż częściowo zmontowany PCM na bok wraz z klamrą PCM i sześcioma. 30 minut po złożeniu obudowy i po osiągnięciu żądanej temperatury przez MRM, za pomocą pipety o pojemności 50 mililitrów, przenieś wstępnie zrównoważony perfuzat do podgrzanej wkładki MRM, delikatnie rozpraszając ciecz po bokach.
Następnie, aby umieścić PCM na MRM, włóż rurki oporowe TCA wychodzące z dolnej części PCM do wkładek MRM, po cztery z każdej strony rozdzielacza MRM. Ustaw moduł tak, aby komory tkankowe opierały się o detektor tlenu po ustawieniu. Przymocuj PCM do wspornika za pomocą sześciu i śrubokręta elektrycznego.
Następnie zamocuj TCA w żebrach nośnych PCM za pomocą dołączonej elastycznej taśmy, rozciągając ją wokół żeber na poziomie gumowych uszczelek. Umieść detektor tlenu na stojaku detektora, upewniając się, że jego powierzchnia opiera się o żebra PCM. Dopasuj pary fotodetektora LED do barwnika wrażliwego na tlen w komorach tkankowych, poluzowując ustawione z boku uchwytu detektora i w razie potrzeby regulując boczne prowadnice detektora.
Na koniec umieść pokrywę na górze obudowy. Aby załadować tkankę do komór, poczekaj, aż poziom podłoża znajdzie się 0.5 cala od góry. Aby załadować pobraną siatkówkę lub twardówkę naczyniówkową RPE, za pomocą kleszczy precyzyjnych, delikatnie umieść siatkówkę bez składania jej do każdej komory.
W międzyczasie użyj chusteczki higienicznej, aby zapobiec kapaniu płynu z komory tkankowej na czujnik tlenu. Pozwól tkance opaść w kierunku i na FRET. Aby załadować komórki RPE na membrany Transwell, po przepaskowaniu przygotowanych komórek 0,25% trypsyny EDTA, umieść je na filtrach trawionych z politereftalanu etylenu o wielkości porów 0,4 milimetra.
W dniu eksperymentu pokrój błony na trzy paski o równej szerokości i załaduj je do komór tkankowych za pomocą kleszczy. Wskaźnik zużycia tlenu lub OCR siatkówki był stały w czasie wstrzykiwania badanych związków, co wskazuje na stabilny stan i funkcję tkanki oraz potwierdza ważność metody. Zgodnie z danymi uzyskanymi przy użyciu konwencjonalnych metod perfuzji zarówno dla siatkówki, jak i twardówki naczyniówki, OCR zmniejszył się w odpowiedzi na oligomycynę i zwiększył się w odpowiedzi na FCCP.
Zaobserwowane zmiany w szybkości produkcji mleczanu lub LPR były odwrotne do obserwowanych w przypadku OCR. Komórki RPE, które nie były wcześniej analizowane za pomocą systemów przepływowych, zareagowały podobnie do twardówki naczyniówki RPE przy użyciu tej metody.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nowatorski bezpompowy wielokanałowy system mikrofluidyczny do analizy tkanek żywych w czasie rzeczywistym, koncentrujący się na zużyciu tlenu i produktach przemiany materii w tkankach oka. Zastosowana metodologia zapewnia dokładne i powtarzalne generowanie danych, co jest kluczowe dla zrozumienia funkcji tkanek oraz mechanizmów chorobowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Metabolizm
- Okulistyka
Wprowadzenie
- Pomiar zużycia tlenu jest niezbędny do oceny żywotności tkanek.
- Tradycyjne urządzenia często nie pozwalają na jednoczesny pobór frakcji odpływowych.
- Systemy przepływowe usprawniają dostarczanie tlenu do żywych tkanek.
- Zrozumienie szlaków metabolicznych jest kluczowe dla leczenia chorób siatkówki.
Cel badania
- Opracowanie systemu mierzącego zarówno zużycie tlenu, jak i frakcje odpływu.
- Charakterystyka procesów metabolicznych w tkankach oka.
- Poprawa zrozumienia chorób i degeneracji siatkówki.
Zastosowane metody
- Montaż wielokanałowego systemu hodowli przepływowej.
- Wprowadzenie komór tkankowych do analizy w czasie rzeczywistym.
- Wykorzystanie ciśnienia gazu w celu stabilnego dostarczania tlenu.
- Pomiar szybkości zużycia tlenu oraz szybkości produkcji mleczanu.
Główne wyniki
- System skutecznie utrzymywał żywotność tkanki podczas eksperymentów.
- Szybkość zużycia tlenu była stabilna i powtarzalna.
- Reakcje na inhibitory metaboliczne były zgodne z wynikami uzyskanymi metodami tradycyjnymi.
- Komórki RPE wykazały podobne odpowiedzi metaboliczne jak tkanki siatkówki.
Wnioski
- System bezpompowy jest skuteczny w analizie metabolicznej w czasie rzeczywistym.
- Pozwala on na uzyskanie wiedzy na temat oddziaływań metabolicznych w tkankach oka.
- Podejście to może pomóc w zrozumieniu i leczeniu chorób siatkówki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Stabilne utrzymanie i ocena tkanek oka w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem bezpompowego wielokanałowego systemu mikroprzepływowego wypełnia krytyczną lukę w analizach metabolicznych na etapie odkrywania leków. Platforma ta umożliwia powtarzalną kwantyfikację zużycia tlenu oraz produkcji metabolitów, co zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej walidacji celów terapeutycznych i redukcji ryzyka mechanistycznego w procesie poszukiwania leków związanych z zaburzeniami widzenia. Możliwość jednoczesnej analizy wielu tkanek poprawia ciągłość translacyjną oraz proces podejmowania decyzji w ramach portfolio w badaniach i rozwoju (R&D) w dziedzinie okulistyki.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną analizę szlaków metabolicznych w różnych tkankach oka.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez korelację zużycia tlenu z żywotnością tkanki.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki powtarzalnym odczytom metabolicznym.
- Dostarcza danych ilościowych do selekcji wczesnych celów okulistycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane warunki hodowli oparte na przepływie w celu standaryzacji testów.
- Generuje powtarzalne pomiary tlenu i metabolitów, przygotowując układ do badań przesiewowych.
- Wspiera skalowalność dzięki wielokanałowej paralelizacji i możliwości ponownego wykorzystania platformy.
- Umożliwia wiarygodną ocenę wpływu związków na metabolizm tkankowy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uzgadnia wyniki metaboliczne z modelami degeneracji siatkówki istotnymi dla danej choroby.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej dzięki wsparciu dla wielu typów tkanek.
- Dostarcza danych skorygowanych o ryzyko w celu rozwoju kandydatów ukierunkowanych na dysfunkcje metaboliczne oka.
- Zwiększa wartość predykcyjną w opracowywaniu translacyjnych biomarkerów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten bezpompowy system mikroprzepływowy integruje się z continuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając analizę metaboliczną opartą na hipotezach, opracowywanie testów oraz badania translacyjne w modelach okulistycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków metabolicznych poprzez monitorowanie poziomu tlenu i metabolitów w czasie rzeczywistym.
- Screening: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne warunki analizy do oceny związków chemicznych.
- Analityka: Dostarcza ilościowych wyników do porównywania odpowiedzi metabolicznych w różnych tkankach i warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy fazy odkrywcze z przedklinicznymi dzięki wykorzystaniu modeli tkanek istotnych dla danej choroby i analizie uzyskanych wyników.
- Zastosowania w skali przedsiębiorstwa: Oferuje wielokanałową platformę wielokrotnego użytku, którą można dostosować do różnych typów tkanek i potrzeb eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów metabolicznych.
- Wartość operacyjna: Upraszcza przepływy pracy dzięki konstrukcji bezpompowej, standaryzacji i powtarzalności.
- Wartość strategiczna: Ulepsza podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczenie solidnych danych ilościowych na wczesnym etapie procesu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów okulistycznych ukierunkowanych na dysfunkcje metaboliczne.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana jest wiedza w zakresie przygotowania tkanek oraz projektowania testów metabolicznych.
- Konieczne jest zastosowanie aparatury do optycznego pomiaru poziomu tlenu i zbierania frakcji.
- Wymagana jest standaryzacja szybkości przepływu i protokołów ładowania tkanek między zespołami.
- Metoda jest możliwa do adaptacji do różnych geometrii tkanek poprzez optymalizację specyficzną dla danego protokołu.
- Ograniczenia praktyczne obejmują kalibrację szybkości przepływu dla konkretnych tkanek oraz wyrównanie czujników.
