Name: Utrzymanie i ocena różnych typów tkanek i komórek oka przy użyciu nowatorskiego systemu płynów bez pompy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-14T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Poznaj nowatorski system płynów bez pompy do analizy tkanki oka w czasie rzeczywistym. Ta metoda umożliwia pomiar zużycia tlenu i produktów metabolicznych siatkówki oraz nabłonka barwnikowego, wspierając badania nad chorobami siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane z grantów National Institutes of Health (R01 GM148741 I.R.S.), U01 EY034591, R01 EY034364, BrightFocus Foundation, Research to Prevent Blindness (J.R.C.) i R01 EY006641, R01 EY017863 i R21 EY032597 (J.B.H.).

Pumpless Multi-Channel Flow Culture to Maintain and Assess Tissues and Cells

<ol><li>Lacy, P. E., Walker, M. M., Fink, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perifusion+of+isolated+rat+islets+in+vitro%3A+Participation+of+the+microtubular+system+in+the+biphasic+release+of+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Perifusion of isolated rat islets in vitro: Participation of the microtubular system in the biphasic release of insulin.</a> Diabetes. 21 (10), 987-998 (1972).</li>
<li>Doliba, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+and+ionic+coupling+factors+in+amino+acid-stimulated+insulin+release+in+pancreatic+beta-HC9+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Metabolic and ionic coupling factors in amino acid-stimulated insulin release in pancreatic beta-HC9 cells.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (6), E1507-E1519 (2007).</li>
<li>Sweet, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ATP%2FADP+in+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Regulation of ATP/ADP in pancreatic islets.</a> Diabetes. 53 (2), 401-409 (2004).</li>
<li>Chertov, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+glucose+in+photoreceptor+survival%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Roles of glucose in photoreceptor survival.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34700-34711 (2011).</li>
<li>Kooragayala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Oxygen+Consumption+in+Retina+Ex+Vivo+Demonstrates+Limited+Reserve+Capacity+of+Photoreceptor+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li>
<li>Bisbach, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Succinate+Can+Shuttle+Reducing+Power+from+the+Hypoxic+Retina+to+the+O2-Rich+Pigment+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Succinate Can Shuttle Reducing Power from the Hypoxic Retina to the O2-Rich Pigment Epithelium.</a> Cell Reports. 31 (5), 107606(2020).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mitochondrial+pyruvate+transport+by+zaprinast+causes+massive+accumulation+of+aspartate+at+the+expense+of+glutamate+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mitochondrial pyruvate transport by zaprinast causes massive accumulation of aspartate at the expense of glutamate in the retina.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (50), 36129-36140 (2013).</li>
<li>Hass, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Succinate+metabolism+in+the+retinal+pigment+epithelium+uncouples+respiration+from+ATP+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Succinate metabolism in the retinal pigment epithelium uncouples respiration from ATP synthesis.</a> Cell Reports. 39 (10), 110917(2022).</li>
<li>Kamat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluidics+system+for+resolving+concentration-dependent+effects+of+dissolved+gases+on+tissue+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Fluidics system for resolving concentration-dependent effects of dissolved gases on tissue metabolism.</a> Elife. 10, e66716(2021).</li>
<li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStryer%2C+L+%22Biochemistry%22">Biochemistry</a>. , 4th edn, Freeman and Company, New York. (1995).</li>
<li>Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+respiration+in+adherent+cells+by+Seahorse+XF96+Cell+Mito+Stress+Test%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100245(2021).</li>
<li>Engel, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+dysfunction+in+Sorsby+patient-derived+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix dysfunction in Sorsby patient-derived retinal pigment epithelium.</a> Experimental Eye Research. 215, 108899(2022).</li>
<li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Mitochondrial+Respiration+Impairs+Nutrient+Consumption+and+Metabolite+Transport+in+Human+Retinal+Pigment+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Mitochondrial Respiration Impairs Nutrient Consumption and Metabolite Transport in Human Retinal Pigment Epithelium.</a> Journal of Proteome Research. 20 (1), 909-922 (2021).</li>
<li>Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retina+Metabolism+and+Metabolism+in+the+Pigmented+Epithelium%3A+A+Busy+Intersection%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">Retina Metabolism and Metabolism in the Pigmented Epithelium: A Busy Intersection.</a> Annual Review of Vision Science. 7, 665-692 (2021).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+activation+and+photoreceptor+survival+in+retinal+detachment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Autophagy activation and photoreceptor survival in retinal detachment.</a> Experimental Eye Research. 205, 108492(2021).</li>
<li>Okawa, H., Sampath, A. P., Laughlin, S. B., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+consumption+by+mammalian+rod+photoreceptors+in+darkness+and+in+light%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ATP consumption by mammalian rod photoreceptors in darkness and in light.</a> Current Biology. 18 (24), 1917-1921 (2008).</li>
<li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. , 100846(2020).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+strategies+of+engineering+retinal+organoids+and+organoid-on-a-chip+in+modeling+intraocular+drug+delivery%3A+Current+progress+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Emerging strategies of engineering retinal organoids and organoid-on-a-chip in modeling intraocular drug delivery: Current progress and future perspectives.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 197, 114842(2023).</li>
<li>Arjamaa, O., Nikinmaa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-dependent+diseases+in+the+retina%3A+role+of+hypoxia-inducible+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Oxygen-dependent diseases in the retina: role of hypoxia-inducible factors.</a> Experimental Eye Research. 83 (3), 473-483 (2006).</li>
<li>Kamat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Versatile+Multi-Channel+Fluidics+System+for+the+Maintenance+and+Real-Time+Metabolic+and+Functional+Assessment+of+Tissue+or+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports+Methods.+In+Press%22%5BJournal%5D)">A Versatile Multi-Channel Fluidics System for the Maintenance and Real-Time Metabolic and Functional Assessment of Tissue or Cells.</a> Cell Reports Methods. In Press. , (2023).</li>
<li>Neal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Low-Level+Drug+Effects+Using+Real-Time%2C+in+vitro+Measurement+of+Oxygen+Consumption+Rate%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Quantification of Low-Level Drug Effects Using Real-Time, in vitro Measurement of Oxygen Consumption Rate.</a> Toxicological Sciences. 148 (2), 594-602 (2015).</li>
<li>Jung, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+cytochrome+C+is+an+essential+regulator+of+sustained+insulin+secretion+by+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reduced cytochrome C is an essential regulator of sustained insulin secretion by pancreatic islets.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (20), 17422-17434 (2011).</li>
<li>Rountree, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+insulin+secretion+by+cytochrome+C+and+calcium+signaling+in+islets+with+impaired+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Control of insulin secretion by cytochrome C and calcium signaling in islets with impaired metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (27), 19110-19119 (2014).</li>
<li>Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+measuring+extracellular+flux+from+intact+polarized+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers.</a> Molecular Vision. 24, 425-433 (2018).</li>
<li>Jarrett, S. G., Rohrer, B., Perron, N. R., Beeson, C., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+mitochondrial+damage+in+retinal+cells+and+tissues+using+quantitative+polymerase+chain+reaction+for+mitochondrial+DNA+damage+and+extracellular+flux+assay+for+mitochondrial+respiration+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessment of mitochondrial damage in retinal cells and tissues using quantitative polymerase chain reaction for mitochondrial DNA damage and extracellular flux assay for mitochondrial respiration activity.</a> Methods in Molecular Biology. 935, 227-243 (2013).</li>
<li>Perron, N. R., Beeson, C., Rohrer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+alterations+in+mitochondrial+reserve+capacity%3B+a+means+to+predict+subsequent+photoreceptor+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioenergetics+and+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Early alterations in mitochondrial reserve capacity; a means to predict subsequent photoreceptor cell death.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 45 (1-2), 101-109 (2013).</li>
<li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-throughput+assays+for+evaluation+of+human+pancreatic+islet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function.</a> Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2008).</li>
<li>Doliba, N. M., Qin, W., Vinogradov, S. A., Wilson, D. F., Matschinsky, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid+acutely+inhibits+acetylcholine-+but+not+GLP-1-stimulated+insulin+secretion+in+mouse+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid acutely inhibits acetylcholine- but not GLP-1-stimulated insulin secretion in mouse pancreatic islets.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 299 (3), E475-E485 (2010).</li>
</ol>

I.R.S., M.G. i K.B. mają powiązania finansowe z EnTox Sciences, Inc. (Mercer Island, WA), producentem/dystrybutorem systemu peryfuzji BaroFuse opisanego w tym badaniu. Wszyscy pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Ze względu na znaczenie bioenergetyki we wszystkich aspektach funkcjonowania komórek i utrzymania różnych elementów oka, istnieje pilna potrzeba opracowania metod badania jej regulacji. W szczególności siatkówka nerwowa i RPE zależą od metabolizmu zarówno w zakresie wytwarzania energii, jak i sygnalizacji wewnątrz- i międzykomórkowej 14,15,16,17. Ze względu na ich wysoką zdolność oksydacyjną, izolowane tkanki oka nie są dobrze utrzymane w warunkach statycznych18,19 i dlatego badanie izolowanych elementów oka wymaga systemów przepływu, które mogą zarówno utrzymywać, jak i oceniać procesy metaboliczne. System fluidics został opracowany do generowania danych OCR i LPR z szerokiego zakresu typów tkanek, a w tym artykule przedstawiliśmy szczegółowe protokoły, które okazały się dające optymalne wyniki.
Głównym czynnikiem decydującym o generowaniu wiarygodnych danych przy użyciu systemu przepływu jest wstępna równowaga pożywki/bufora na bazie CO2 w temperaturze 39 °C (w celu zapewnienia, że peryfuzat nie jest przesycony rozpuszczonym gazem, który uległby odgazowaniu podczas eksperymentu). W szczególności pożywka lub bufor KRB przechowywane w temperaturze 4 °C będą przesycone w stosunku do 37 °C i zostaną odgazowane podczas eksperymentu, jeżeli czasy równowagi wstępnej są niewystarczające. Ponadto tkanki załadowane do komór tkankowych nie mogą być uszkodzone przez niewłaściwą izolację tkanki z powodu rozerwania lub niepełnego oddzielenia tkanki lub przez zbyt długie wystawienie tkanki w małej ilości buforu na bazie wodorowęglanów na działanie powietrza atmosferycznego. Kontrola temperatury, stabilność przepływu i niezawodność detekcjiO2 mają niewielką zmienność, a czynniki te nie przyczyniają się znacząco do awaryjności.
Przyrząd posiada osiem kanałów przepływowych/komór tkankowych, które działają jednocześnie, które są zasilane peryfuzatem z dwóch zbiorników, po cztery komory tkankowe dla każdego zbiornika. Aby uzyskać najdokładniejsze przebiegi czasowe OCR, krzywe kinetyczne są korygowane według linii bazowej przez komory, które nie są obciążone tkanką. Tak więc typowy protokół eksperymentalny obejmowałby dwie grupy po trzy komory tkankowe. Ogólnie rzecz biorąc, protokoły dzielą się na dwie kategorie: jedna to różne protokoły dotyczące związków testowych po każdej stronie (na przykład lek/nośnik po jednej stronie MRM, a po drugiej tylko nośnik); drugi to ten sam protokół wstrzykiwania badanego związku po obu stronach MRM, ale inna tkanka lub model tkanki po każdej stronie MRM. W tym artykule wpływ oligomycyny i FCCP na siatkówkę porównano z OCR przez tkanki, które nie były narażone na żadne badane związki, a dwie tkanki oceniano jednocześnie w tym samym protokole i warunkach w celu zidentyfikowania zachowania specyficznego dla tkanki. To ostatnie zostało zilustrowane w tym badaniu, pokazując zwiększony zakres dynamiczny tempa przemiany materii przez twardówkę naczyniówkową RPE w stosunku do siatkówki równolegle w tym samym eksperymencie. Inne raporty opisywały szerszy zakres projektów badań, w tym pomiar wpływu różnych poziomówO2 na OCR i LPR oraz zależności od stężeń paliw, leków i toksyn20,21. Ponadto, chociaż ograniczyliśmy analizę frakcji odpływowych do pomiaru mleczanu i obliczenia LPR, zawartość informacji w eksperymencie znacznie wzrasta, jeśli testuje się wiele związków i klas związków we frakcjach odpływowych, takich jak hormony, neuroprzekaźniki, sygnały komórkowe i metabolity, które mogą opuścić komórki20,22, Lokal mieszkalny 23.
Obciążenie izolowanej siatkówki lub twardówki naczyniówkowej jest proste, a po wyizolowaniu tkanki te są po prostu umieszczane w górnej części komór tkankowych za pomocą kleszczy i pozostawiane do opadnięcia na frytę. Komórki RPE hodowane na wkładach filtracyjnych rozwijają odpowiednią polaryzację i markery dojrzałości RPE po 4-8 tygodniach w hodowli. Nie jest możliwe usunięcie RPE do analizy żywych komórek po podłączeniu do membrany transwell, jeśli ma być zachowana dojrzałość i polaryzacja RPE24. W komorze peryfuzyjnej mogą znajdować się paski membrany transwell, które są cięte skalpelem, gdy są zanurzone w buforze i szybko wprowadzane do komór tkankowych. Chociaż wycinanie pasków filtracyjnych zostało umieszczone w systemie statycznym24, żadna inna metoda fluidyczna do oceny tych ważnych typów komórek nie jest dostępna. Odpowiedzi komórek RPE były szybkie i bardziej dynamiczne niż siatkówki lub twardówki naczyniówki-twardówki, prawdopodobnie częściowo ze względu na natychmiastowy dostęp zarówno wierzchołkowych, jak i podstawowych aspektów komórek RPE skonfigurowanych jako monowarstwa na wkładce błonowej.
Innym czynnikiem zapewniającym, że dane mają najwyższy stosunek sygnału do szumu, jest wybór optymalnego stosunku tkanki załadowanej do komór peryfuzyjnych w stosunku do natężenia przepływu. Zbyt mała ilość tkanki w stosunku do natężenia przepływu powoduje, że różnica stężenia rozpuszczonegoO2 między dopływem a odpływem jest bardzo mała i trudna do wiarygodnego zmierzenia. W przeciwieństwie do tego, jeśli przepływ jest zbyt wolny, stężenie O2 staje się tak niskie, że tkanka jest dotknięta niedotlenieniem. Niemniej jednak przepływ cieczy sterowany ciśnieniem gazu może być utrzymywany przy natężeniu przepływu do 5 ml / min, co wymaga tylko niewielkiej ilości tkanki do dokładnych pomiarów OCR i LPR. W pokazanych tutaj eksperymentach użyto około 20 ml / min / kanał, co było odpowiednie dla jednej siatkówki, dwóch twardówek naczyniówkowych RPE lub 360 000 komórek RPE. Aby zminimalizować efekty systemowe, które opóźniają i rozpraszają narażenie tkanki na wstrzyknięty badany związek, dostarczane są komory tkankowe o różnych rozmiarach, tak aby ilość tkanki (i szybkość przepływu) była dopasowana do odpowiedniej wielkości komory.
Dane z analiz przedstawionych w tym artykule zostały przedstawione na dwa sposoby: wielkość bezwzględna w odniesieniu do szybkości lub zmiany ułamkowe w stosunku do stanu ustalonego lub linii bazowej. Skoncentrowano się na zilustrowaniu pomiaru odpowiedzi na badane związki. Jednak system fluidics jest dobrze przystosowany do oceny i porównywania efektów leczenia tkanek przed analizą peryfuzyjną, takich jak modyfikacje genetyczne. Badanie, czy leczenie różni się od grupy kontrolnej, jest najbardziej wiarygodne, jeśli analizowany jest wpływ leczenia na znormalizowane odpowiedzi badanych związków. Jeśli analiza wymaga wielkości bezwzględnych, moc statystyczna analiz próbek, które są poddawane wstępnej obróbce, jest maksymalizowana, jeśli ich ocena i kontrole są przeprowadzane w tym samym eksperymencie.
Z wyjątkiem mieszadła, wszystkie części, które mają kontakt z cieczą, są dostarczane przez producenta jako materiały eksploatacyjne i zostały wysterylizowane. Części te nie powinny być ponownie używane, ponieważ eksperymenty mogą czasami zostać utracone z powodu niepełnego czyszczenia i zanieczyszczonych powierzchni. System na początku konfiguracji jest sterylny. Jednak pożywka jest dodawana do MRM, a tkanka jest ładowana do komór w warunkach niesterylnych. Zmierzyliśmy OCR w systemie, który jest zmontowany z części, które są sterylne, ale sam eksperyment jest przeprowadzany w warunkach niesterylnych. Potrzeba około 14 godzin, aby bakterie zgromadziły się do punktu, w którym można uzyskać mierzalny OCR (niepublikowane wyniki). Jeśli stosowane są protokoły krótsze niż 10 godzin, nagromadzenie bakterii i wszelkie skutki z tego powodu będą znikome.
Wielu badaczy używa przyrządów przeznaczonych do pomiaru OCR w statycznej inkubacji monowarstwy komórek o stosunkowo wysokiej przepustowości25,26. W przeciwieństwie do tego, przyrząd do fluidyki, który przetestowaliśmy i opisaliśmy w tym artykule, utrzymuje tkankę, zapewniając odpowiednie dostarczanieO2, co ma kluczowe znaczenie dla większych odległości dyfuzji, które są obecne w próbkach tkanek. Ponadto jest w stanie zbierać frakcje, co pozwala na ocenę wielu parametrów równolegle z OCR, co znacznie zwiększa możliwość badania relacji między nimi. Wreszcie, stężenia rozpuszczonych gazów (takich jakO2 i CO2 ) mogą być kontrolowane, co wydłuża czas trwania eksperymentów z pożywkami i buforem na bazie wodorowęglanów, umożliwiając użytkownikowi badanie skutkówO2. Należy podkreślić, że ograniczeniem dla obu metodologii jest brak możliwości badania wymywania badanych związków, co są funkcjonalnością, którą mają inne systemy peryfuzyjne 4,27,28. Innym czynnikiem branym pod uwagę przy określaniu optymalnej metody analizy jest fakt, że systemy fluidyczne zużywają więcej mediów i związków testowych niż systemy statyczne. Dodatkowe koszty są zminimalizowane w przypadku obecnych systemów płynów, jednak ze względu na niskie natężenia przepływu, z których można korzystać.
Ogólnie rzecz biorąc, opisano szczegółowy opis protokołów przeprowadzania eksperymentów z nowym instrumentem do przepływu/oceny. Dane wygenerowane za pomocą siatkówki i twardówki naczyniówkowej RPE podsumowały poprzednie wyniki uzyskane za pomocą systemów, które są znacznie trudniejsze w użyciu (i nie są łatwo dostępne). Wykazano również, że system może utrzymywać i oceniać komórki RPE przyczepione do membran transwell, co jest bardzo ważnym modelem komórkowym, który nie był wcześniej analizowany za pomocą systemów przepływowych ze względu na kruchość komórek. Główne części protokołu składają się z 75-minutowego czasu konfiguracji, po którym następuje 90-minutowy okres równoważenia i protokół eksperymentalny, dzięki czemu nadaje się do rutynowego użytku przez laboratoria, które nie specjalizują się w obsłudze systemów fluidycznych. Chociaż skupiliśmy się na pomiarze ostrej odpowiedzi tkanki na badane związki, system jest bardzo odpowiedni do porównywania tkanek z różnych źródeł, takich jak modele zwierzęce lub modele komórek, które zostały genetycznie zmienione lub przeszły testowe zabiegi/warunki. Ponadto zakres testów, które można przeprowadzić na frakcjach odpływowych, jest szeroki i obejmuje metabolity, cząsteczki sygnalizacji komórkowej oraz wydzielane hormony/neuroprzekaźniki, a także analizę wieloskładnikową generowaną przez spektrometrię mas na frakcjach, a także na tkance.

Systemy peryfuzji mają długą historię w naukach przyrodniczych. W szczególności, do badania funkcji wydzielniczych przez wyspy trzustkowe, zostały one wykorzystane do scharakteryzowania kinetyki wydzielania insuliny w odpowiedzi na secretagogues1. Oprócz zbierania frakcji odpływowych do późniejszego oznaczania hormonów i metabolitów, zastosowano czujniki czasu rzeczywistego, głównie do wykrywania zużycia tlenu2,3,4. Szeroko zakrojone wysiłki mające na celu lepsze zrozumienie mechanizmów pośredniczących w chorobach oczu były ograniczone przez brak fizjologicznie istotnych metod oceny regulacji metabolicznej i rozregulowania różnych izolowanych elementów oka, w tym siatkówki, nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), twardówki naczyniówki, twardówki i hodowanych komórek RPE. Systemy statyczne zaprojektowane dla hodowanych komórek zostały przystosowane do tissue5, ale tkanka wymaga przepływu dla odpowiedniego natlenienia. Systemy przepływu z powodzeniem mierzą w czasie rzeczywistym reakcje na wskaźnik zużycia tlenu (OCR) przez siatkówkę i twardówkę naczyniówkową RPE, a tkanki pozostają stabilne metabolicznie przez ponad 8 godzin, co pozwala na wysoce informacyjne protokoły obejmujące wiele związków testowych4,6,7,8,9. Niemniej jednak działanie systemów fluidycznych historycznie wymagało aparatury wykonanej na zamówienie i przeszkolonego personelu technicznego w zakresie niestandardowych metodologii. Takie systemy nie zostały przyjęte jako standardowa metodologia w większości laboratoriów. BaroFuse to nowo opracowany system fluidyczny, który nie opiera się na pompach, ale raczej na ciśnieniu gazu, aby napędzać przepływ przez wiele kanałów i komór tkankowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Każdy kanał jest stale monitorowany pod kątem OCR, a odpływ jest zbierany za pomocą płytkowego kolektora frakcji w celu późniejszego oznaczenia zawartości. Co ważne, komory peryfuzyjne tkanek w instrumencie są zaprojektowane tak, aby pomieścić tkanki o różnych geometriach i rozmiarach.
Sercem instrumentu jest system fluidics, w którym przepływ jest kierowany z zamkniętego, ciśnieniowego zbiornika przez rurkę o małej średnicy wewnętrznej (ID) (co przyczynia się do największego oporu przepływu w obiegu płynu) do szklanych komór na tkanki, które przechowują tkankę. Ciśnienie do modułu zbiornika mediów (MRM) jest dostarczane przez reduktory niskiego i wysokiego ciśnienia podłączone do butli gazowej zawierającej mieszaninę gazów (zwykle 21%O2, 5% CO2, bilans N2), a zbiornik jest uszczelniony od góry przez moduł komory peryfuzyjnej (PCM), w którym znajdują się zespoły komory tkankowej (TCA). Natężenie przepływu jest kontrolowane przez długość i ID rurek oporowych oraz ustawienie ciśnienia regulatora niskiego ciśnienia. Rurki odpływowe połączone z górną częścią komór na chusteczki dostarczają płyn do pojemnika na odpady (który jest stale ważony w celu automatycznego określenia natężenia przepływu) lub do studzienek z 96-dołkową płytką kontrolowaną przez kolektor frakcji. System detekcjiO2 mierzy żywotność barwnika wrażliwego naO2 namalowanego po wewnętrznej stronie każdej ze szklanych komór na chusteczki za tkanką. Informacje te są następnie wykorzystywane do ciągłego obliczania OCR. Cały układ fluidyczny znajduje się w obudowie o kontrolowanej temperaturze, a zbiornik gazu, kolektor frakcji i komputer są głównymi elementami przyrządu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Wreszcie, oprogramowanie, które uruchamia przyrząd, służy do kontrolowania jego działania (w tym przygotowania i czasu wstrzykiwania związków testowych, systemu pomiaru przepływu i czasu kolektora frakcji), a także przetwarzania i tworzenia wykresów danych OCR i innych pomiarów dodatkowych.
W tym artykule opisujemy protokoły korzystania z systemu fluidics do peryfuzji i oceny OCR oraz szybkości produkcji mleczanu (LPR) dla różnych izolowanych elementów oka. LPR to parametr odzwierciedlający szybkość glikolityczną, który jest wysoce komplementarny do OCR, gdzie para odpowiada za dwie główne gałęzie wytwarzania energii z węglowodanów w komórce10. Ponieważ przygotowania tkanki i ładowania jej do komór tkankowych najlepiej nauczyć się, oglądając procedurę, film pomoże zilustrować kilka krytycznych kroków, które są wykonywane podczas konfiguracji i operacji, a które nie są łatwe do przekazania za pomocą samego tekstu.
Opis protokołu podzielony jest na 8 sekcji, które odpowiadają różnym fazom eksperymentu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B): 1. przygotowanie przedeksperymentalne; 2. przygotowanie/równoważenie peryfuzatu; 3. Ustawienie instrumentu; 4. równowaga tkankowa; 5. Protokół eksperymentalny; 6. awaria instrumentu; 7. Przetwarzanie danych; oraz 8. oznaczanie frakcji odpływowych.

<table><tbody><tr><td>BIOLOGICAL SAMPLES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J myszy</td><td>Envigo Harlan (Indianapolis, IN)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ODCZYNNIKI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920L9795</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270G</td><td></td></tr><tr><td>KCN</td><td>Mleczan Sigma-Aldrich</td><td>60178</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>L6661</td><td></td></tr><tr><td>Oliigomycyna A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351L9795</td><td></td></tr><tr><td> HODOWLA KOMÓRKOWA I ZBIÓR TKANEK</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beuthanasia-D</td><td>Schering-Plough Animal Health Corp., Unia, NJ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol, 390 mg/ml sodu pentobarbital</td><td>Virbac</td><td>RXEUTHASOL</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>12303C</td><td></td></tr><tr><td>Motek' s Buforowany roztwór soli</td><td>GIBCO</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>Krebs Ringer Wodorowęglan (KRB)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J67795L9795</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>#CB-40230</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>ROCKi&nbsp;</td><td>Selleck Chemicals</td><td>Y-27632</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>#25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>SUPPLIES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gas Butle: 21% O2/5% CO2/balance N2</td><td>Praxair Distribution, Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Filtry Transwell&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>3470</td><td></td></tr><tr><td>TESTY KOMERCYJNE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplex Zestaw do oznaczania czerwonej glukozy/oksydazy glukozowej</td><td>ThermoFisher</td><td>A22189</td><td></td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa z Aerococcus viridans</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>A22189L9795</td><td></td></tr><tr><td>Oksydaza mleczanowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9795</td><td></td></tr><tr><td><mocny>SPRZĘT</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BaroFuse&nbsp; Wielokanałowy system peryfuzji</td><td>EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA</td><td>Model 001-08</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 4 Fluorometer</td><td>BioTek (Winooski, VT)</td><td>S4MLFPTA</td><td></td></tr></tbody></table>

utrzymanie i ocena różnych typów tkanek i komórek oka przy użyciu nowatorskiego systemu płynów bez pompy

Maintaining and Assessing Various Tissue and Cell Types of the Eye Using a Novel Pumpless Fluidics System

Wiele modeli in vitro używanych do badania funkcji tkanek i biologii komórki wymaga przepływu pożywki, aby zapewnić odpowiednie natlenienie i optymalne warunki dla komórek niezbędne do utrzymania funkcji i żywotności. W tym celu opracowaliśmy wielokanałowy system hodowli przepływowej, który utrzymuje tkanki i komórki w hodowli oraz stale ocenia funkcję i żywotność za pomocą czujników in-line i/lub zbierania frakcji odpływowych. System łączy w sobie 8-kanałowy, ciągły optyczny czujnik zużycia tlenu z wbudowanym kolektorem frakcji w celu jednoczesnego pomiaru tempa produkcji metabolitów i wydzielania hormonów. Chociaż jest w stanie utrzymać i ocenić szeroki zakres modeli tkanek i komórek, w tym wysp trzustkowych, mięśni i podwzgórza, tutaj opisujemy jego zasady działania i eksperymentalne preparaty/protokoły, które zastosowaliśmy do zbadania bioenergetycznej regulacji izolowanej siatkówki myszy, nabłonka barwnikowego siatkówki myszy (RPE)-naczyniówki-twardówki oraz hodowanych ludzkich komórek RPE. Innowacje w konstrukcji systemu, takie jak bezpompowy przepływ płynu, znacznie uprościły obsługę wielokanałowego systemu przepływowego. Pokazane są filmy i obrazy, które ilustrują, jak złożyć, przygotować instrument do eksperymentu i załadować różne modele tkanek/komórek do komór perfuzyjnych. Ponadto nakreślono i omówiono wytyczne dotyczące wyboru warunków do eksperymentów specyficznych dla protokołu i tkanki, w tym ustawienie prawidłowego stosunku przepływu do tkanki w celu uzyskania spójnych i stabilnych warunków hodowli oraz dokładne określenie wskaźników zużycia i produkcji. Połączenie optymalnego utrzymania tkanek i oceny wielu parametrów w czasie rzeczywistym daje wysoce pouczające zestawy danych, które będą miały wielką użyteczność w badaniach nad fizjologią oka i odkrywaniu leków do leczenia zaburzeń widzenia.

Aby zilustrować rozdzielczość danych generowanych z izolowanych komponentów oka, zmierzono OCR i LPR w trzech typach tkanek (siatkówce, kompleksie nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE)-naczyniówki-twardówki oraz komórkach RPE), stosując powszechnie używany protokół (test stresu mitochondrialnego10; Rycina 10, Rycina 11 i Rycina 12). Ilość wykorzystanej tkanki dla każdego rodzaju tkanki przedstawiono w Tabeli 1. Dane zostały przetworzone i przedstawione na wykresach przy użyciu pakietu oprogramowania opracowanego dla systemu mikroprzepływowego. Przygotowanie siatkówki oraz kompleksu RPE-naczyniówki-twardówki jest stosunkowo proste i zajmuje mniej niż 20 min dla każdego typu tkanki. OCR pozostawał stały w czasie wstrzykiwania badanych związków, co wskazuje na stabilny stan zdrowia i funkcję tkanki oraz potwierdza poprawność metody (Rycina 10). Po walidacji dla każdego typu tkanki nie uznano za konieczne przeprowadzania kontroli bez wstrzykiwania badanych związków dla każdego eksperymentu. Zgodnie z danymi uzyskanymi przy użyciu bardziej konwencjonalnych metod perifuzji6,8,13, odnotowano spadek OCR w odpowiedzi na oligomycynę oraz wzrost OCR w odpowiedzi na FCCP. Zmiany LPR przebiegały w kierunku przeciwnym do obserwowanych dla OCR: oligomycyna zwiększyła LPR, który następnie spadł (choć tylko nieznacznie) w odpowiedzi na FCCP (Rycina 11). Aby porównać istotność statystyczną efektu każdego kolejnego badanego związku, przeprowadzono testy t (obliczane automatycznie przez oprogramowanie dołączone do urządzenia). Ponieważ celem publikacji był opis sposobu wykonania metody, liczba przeprowadzonych powtórzeń nie zawsze była wystarczająco wysoka, aby uzyskać istotność statystyczną. Ogólnie jednak, przy liczbie powtórzeń równej 3 lub więcej, efekty działania FCCP i oligomycyny na OCR oraz LPR były istotne.
Komórki RPE nie były wcześniej analizowane za pomocą systemów przepływowych, jednak reagowały w sposób podobny do kompleksu RPE-naczyniówka-twardówka (co jest zgodne z przekonaniem, że duża część OCR wynika z aktywności komórek RPE; Rysunek 11). Te ilustracyjne przykłady podkreślają zdolność systemu do utrzymania żywotności tkanki, co odzwierciedla stabilność OCR w kanałach kontrolnych, oraz wysoki stosunek sygnału do szumu dla zmian w OCR o wielkości indukowanej przez oligomycynę i FCCP, który wynosił ponad 100:1. Dodatkowo, analizy frakcji wypływowych mogą być wykorzystane do korelacji szybkości poboru lub produkcji szerokiego spektrum związków wymienianych z płynem pozakomórkowym, co stanowi uzupełnienie dla OCR (w tym przypadku LPR). Cechy instrumentu pozwoliły na dokładną kwantyfikację charakterystycznych różnic w odpowiedziach pomiędzy typami tkanek badanych równolegle. OCR w kompleksie RPE-naczyniówka-twardówka oraz w komórkach RPE jest konsekwentnie bardziej wrażliwy na oligomycynę niż w siatkówce (Rysunek 11 i Rysunek 12), choć w przypadku kompleksu RPE-naczyniówka-twardówka czas ekspozycji na FCCP nie był wystarczająco długi, aby osiągnąć stan stacjonarny. Kwestią wymagającą rozważenia było zastosowanie DMSO jako rozpuszczalnika. Przy wyższych stężeniach (0,2%) DMSO wywołało przejściowy efekt na OCR siatkówki (prawdopodobnie odzwierciedlający wpływ zmiany ciśnienia osmotycznego spowodowanej działaniem DMSO na przepuszczalność błon).
Przy założeniu, że KCN całkowicie hamuje oddychanie poprzez bezpośrednie działanie na oksydazę cytochromu c, wartość OCR na koniec ekspozycji na KCN przyjmuje się jako 0, a wszystkie wartości OCR są obliczane na podstawie zmiany względem wartości KCN. OCR może zachodzić niezależnie od łańcucha oddechowego i oksydazy cytochromu c. Jednakże wielkość tego wkładu w całkowity OCR zazwyczaj nie przekracza kilku procent (dane nie zostały przedstawione), a wydłużony czas ekspozycji tkanki na KCN zapewnia wyczerpanie substratów oksydaz, które nie są częścią łańcucha transportu elektronów.
Analiza statystyczna 
Pojedyncze eksperymenty przedstawiono zgodnie z oznaczeniami na rysunkach, jednak z uśrednieniem z wielu kanałów. Dane przedstawiono następnie na wykresach jako średnią ± błąd standardowy (SE; obliczony jako SD/√n).
<img alt="Schemat komory perfuzyjnej z czujnikami tlenu; kontrola przepływu dla analiz tkanek; temperatura ustawiona na 37°C." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat systemu mikroprzepływowego/ocennego. Główne komponenty obejmują obudowę, elementy kontroli temperatury, systemy mikroprzepływowe i komory tkankowe, regulację ciśnienia gazu w przestrzeni nad perfuzatem, kolektor frakcji/monitor przepływu oraz detektory O2. Skróty: MRM = Media Reservoir Module, PCM = Perifusion Chamber Module, TCA = Tissue Chamber Assemblies. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat systemu płynowego z detekcją tlenu, zbieraczem frakcji; etapy eksperymentu do analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figura 2"> 
Figura 2. (A) Zdjęcie głównych komponentów urządzenia. Główne komponenty obejmują butlę z gazem (regulatory ciśnienia), obudowę, zbieracz frakcji oraz komputer. (B) Schemat blokowy eksperymentu przedstawiający główne kategorie etapów oraz czas potrzebny na ich realizację. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Schemat konfiguracji komory do elektroforezy żelowej do rozdziału i analizy DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Widok MRM. MRM pokazano z wkładką MRM (po lewej) i magnesami do mieszania (po prawej) umieszczonymi na dnie wkładki MRM (umieszczonej po każdej stronie przegrody MRM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat obudowy BaroFuse; konfiguracja przepływu gazu i wstrzykiwania związku; aparatura spektroskopowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Zespół przewodów oraz zespół przewodów płuczących w MRM. (A) Zespół przewodów do wstrzykiwania związku testowego oraz zespół przewodów płuczących przyłączone do portów w MRM. (B-C) Zespół do wstrzykiwania związku testowego oraz zespół przewodów płuczących (B) umieszczone w rowku z przodu obudowy (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ kontroli temperatury; wyświetlacz cyfrowy pokazujący PV 32.2°C, SV 35.0°C; sprzęt laboratoryjny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Uruchamianie kontrolera temperatury MRM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ elektroforezy z komorą żelową i elektrodami; używany do separacji DNA i analizy wyników." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Komory tkankowe i zbiornik z gazem.Ustawienie detektora O2 na statywie detektora (który podtrzymuje również MRM i PCM) oraz rozmieszczenie opaski wokół żeberek PCM, które pomagają unieruchomić komory tkankowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig06large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Ustawienie regulatora gazu do kontroli ciśnienia; na schemacie eksperymentu laboratoryjnego pokazano konfiguracje dwuzaworowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7. (A) Regulatory wysokiego i niskiego ciśnienia na zbiorniku z gazem. (B-C) Rurka do płukania. Rurka do płukania umożliwia usunięcie powietrza z przestrzeni nad cieczą w MRM i wypełnienie jej gazem ze zbiornika zasilającego. Zdjęcia przedstawiają otwartą rurkę do płukania (B) oraz zamkniętą rurkę do płukania (C). Zespół do wstrzykiwania związku testowego pozostaje zamknięty podczas procesu płukania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat równowagi statycznej; konfiguracja systemu chromatograficznego z rurkami; wykres rozkładu powierzchni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig08v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8. Komora tkankowa i konfiguracja odpływu. (A) Wymiary membrany Transwell po przecięciu jej na trzy paski o tej samej szerokości. (B) Wieloprzewodowy uchwyt odpływowy. (C) Wieloprzewodowy uchwyt odpływowy umieszczony na krawędzi obudowy z adapterami rurek znajdującymi się w pobliżu komór tkankowych. (D) Zdjęcie zestawów rurek odpływowych przyłączonych do komór tkankowych. (E) Widok z góry na obudowę bez pokrywy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig08largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procesu filtrowania strzykawką; konfiguracja laboratorium oczyszczania białek; zastosowanie kolumny chromatograficznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig09.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9. Wstrzykiwanie związku w MRM. Wstrzykiwanie związku testowego przez port wtryskowy do MRM za pomocą strzykawki 5 mL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig09large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Zmiany LPR i OCR w czasie; analiza strumienia metabolicznego; wykres liniowy; traktowanie KRB, FCCP, KCN." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig10.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 10"> 
Rysunek 10. Krzywe OCR i LPR w odpowiedzi na związki testowe. OCR i LPR w siatkówkach wyizolowanych od myszy (1 siatkówka/kanał) w odpowiedzi na obecność lub brak (kontrola) wskazanych związków testowych. Każda krzywa stanowi średnią z 6 powtórzeń z jednego eksperymentu (słupki błędu to SE; wartości p obliczono za pomocą parzystych testów t, porównując wartości stanu stacjonarnego dla każdego czynnika testowego z wartością poprzedniego czynnika testowego). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig10large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Zmiana OCR w czasie; wykres testu metabolicznego; stężenia: KRB, Oligo, FCCP, KCN." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig11.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 11"> 
Rysunek 11. Krzywe OCR. OCR mierzony równolegle w odpowiedzi na wskazane związki testowe w kompleksie RPE-naczyniówka-twardówka oraz siatkówce wyizolowanych od myszy (1 siatkówka lub 2 kompleksy RPE-naczyniówka-twardówka/kanał). Dane stanowią średnią z powtórzeń z jednego eksperymentu (n = 2 dla RPE-naczyniówka-twardówki i 4 dla siatkówki; wartości p obliczono za pomocą sparowanych testów t, porównując wartości stanu stacjonarnego dla każdego związku testowego z wartością dla poprzedniego związku). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig11large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres oddychania mitochondrialnego; LPR, OCR w funkcji czasu; efekt FCCP i KCN; wykres liniowy, dane eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig12.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 12"> 
Rysunek 12. Krzywe OCR i LPR z komórek RPE. OCR i LPR z komórek RPE przytwierdzonych do membran transwell, które zostały pocięte na paski i umieszczone w komorach perifuzyjnych. Dane stanowią średnią z powtórzeń z jednego eksperymentu (n = 3, przy 1,5 membrany/kanał (360 000 komórek/kanał); wartości p obliczono, wykonując sparowane testy t w celu porównania wartości stanu stacjonarnego dla każdego czynnika testowego z wartością dla poprzedniego czynnika testowego). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig12large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>TKANKA/KOMÓRKA</td>
			<td>Ilość/Kanał</td>
			<td>PRZEPŁYW: ml/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siatkówka (mysz)</td>
			<td>1</td>
			<td>0.025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nabłonek pigmentowy siatkówki-naczyniówka-twardówka (mysz)</td>
			<td>2</td>
			<td>0.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Komórki RPE na membranach Transwell</td>
			<td>360 000 komórek (4 x paski filtrujące 1/3)</td>
			<td>0.016</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Zalecane specyfikacje operacyjne dla różnych tkanek.
Rycina uzupełniająca 1. Graficzne przedstawienie projektu doświadczalnego. Harmonogram i skład ekspozycji na związki testowe oraz czas pobierania frakcji. Przyrost stężenia (Conc Inc) to zmiana stężenia, którą należy wprowadzić. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig1.zip" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 2. Interfejs użytkownika podczas uruchamiania. Interfejs użytkownika okna startowego oprogramowania do detekcji O2, które monitoruje poziom O2 w komorach tkankowych włożonych do PCM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig2.zip" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 3. Interfejs użytkownika ustawień eksperymentu. Interfejs do wprowadzania informacji o eksperymencie (po lewej) i wyboru czasów zbierania frakcji odpływu (po prawej). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig3.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 4. Interfejs użytkownika strony wtryskiwania. Strona wtryskiwania, która oblicza objętości wtrysku na podstawie pożądanych stężeń związku testowego oraz objętości pozostałej w MRM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig4.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 1: Metody przygotowania próbek tkankowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/supplementary%20file%201_RE.docx" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Analiza żywej tkanki w czasie rzeczywistym dostarcza ważnych danych funkcjonalnych i mechanistycznych. W tym artykule opisano protokoły i zmienne krytyczne w celu zapewnienia dokładnego i powtarzalnego generowania danych przez nowatorski i niewymagający pompowania wielokanałowy system fluidyki, który utrzymuje i ocenia szeroką gamę modeli tkanek i komórek.

Utrzymanie i ocena różnych typów tkanek i komórek oka przy użyciu nowatorskiego systemu płynów bez pompy

Many in vitro models used to investigate tissue function and cell biology require a flow of media to provide adequate oxygenation and optimal cell ...

Najczęściej spotykane urządzenia służące do pomiaru zużycia tlenu nie obsługują jednoczesnego zbierania frakcji odpływowych. Bardzo ważne jest, aby oznaczyć odpływ w celu skorelowania metabolizmu z funkcją tkanek. Technologie mierzące oba te czynniki mogą lepiej oceniać mechanizmy komórkowe pośredniczące w funkcjonowaniu tkanek i chorobach.Kluczowym wyzwaniem w pomiarze zużycia tlenu w żywej tkance jest dostarczenie odpowiedniej ilości tlenu w celu utrzymania żywotności i funkcji tkanek. Najlepiej osiągnąć to za pomocą systemów przepływowych. Zastosowanie ciśnienia gazu zamiast standardowych pomp perystaltycznych znacznie upraszcza procedurę, a także eliminuje tworzenie się pęcherzyków.Użyteczność pomiaru metabolicznego jest tylko tak dobra, jak jego zdolność do ilościowego określania i odtwarzania wyników. Nasz protokół wykorzystuje połączenie precyzyjnie kontrolowanego natężenia przepływu ze stabilnym wykrywaniem tlenu rozpuszczonego w całym okresie eksploatacji zarówno na wlocie, jak i odpływie. Takie podejście może w powtarzalny sposób rozwiązać zmiany w zużyciu tlenu nawet o kilka procent.Procesy biochemiczne pośredniczące w funkcjonowaniu siatkówki są wynikiem wzajemnego oddziaływania metabolicznego między różnymi tkankami oka. Zdolność naszego systemu przepływu do oceny wielu typów tkanek o różnych geometriach ułatwia badanie unikalnych wewnętrznych właściwości każdego typu komórek i ich skoordynowanych funkcji. Wiele chorób dotykających oko jest spowodowanych upośledzonymi szlakami metabolicznymi i sygnalizacją.Koncentrujemy się na pomiarze zużycia tlenu i uwalniania metabolicznych produktów ubocznych przez tkanki oka w celu scharakteryzowania, zrozumienia i leczenia rozwoju chorób siatkówki i zwyrodnień. Aby skonfigurować nowatorski, wielokanałowy system hodowli przepływowej bez pompy po zmontowaniu modułu zbiornika pożywki lub MRM, włóż do niego zespoły przewodów i umieść MRM w podgrzewaczu. Po zabezpieczeniu grzałki na miejscu przystąp do wkładania zespołów komory tkankowej lub TCA do modułu komory perfuzyjnej lub PCM Za pomocą narzędzia do wprowadzania TCA włóż każdy z ośmiu TCA pojedynczo do otworów PCM.Upewnij się, że mocno dociśniesz adapter narzędziem, aż górna część tulei rurki wokół każdej komory dotknie powierzchni, opisując otwory w PCM. Odłóż częściowo zmontowany PCM na bok wraz z klamrą PCM i sześcioma. 30 minut po złożeniu obudowy i po osiągnięciu żądanej temperatury przez MRM, za pomocą pipety o pojemności 50 mililitrów, przenieś wstępnie zrównoważony perfuzat do podgrzanej wkładki MRM, delikatnie rozpraszając ciecz po bokach.Następnie, aby umieścić PCM na MRM, włóż rurki oporowe TCA wychodzące z dolnej części PCM do wkładek MRM, po cztery z każdej strony rozdzielacza MRM. Ustaw moduł tak, aby komory tkankowe opierały się o detektor tlenu po ustawieniu. Przymocuj PCM do wspornika za pomocą sześciu i śrubokręta elektrycznego.Następnie zamocuj TCA w żebrach nośnych PCM za pomocą dołączonej elastycznej taśmy, rozciągając ją wokół żeber na poziomie gumowych uszczelek. Umieść detektor tlenu na stojaku detektora, upewniając się, że jego powierzchnia opiera się o żebra PCM. Dopasuj pary fotodetektora LED do barwnika wrażliwego na tlen w komorach tkankowych, poluzowując ustawione z boku uchwytu detektora i w razie potrzeby regulując boczne prowadnice detektora.Na koniec umieść pokrywę na górze obudowy. Aby załadować tkankę do komór, poczekaj, aż poziom podłoża znajdzie się 0.5 cala od góry. Aby załadować pobraną siatkówkę lub twardówkę naczyniówkową RPE, za pomocą kleszczy precyzyjnych, delikatnie umieść siatkówkę bez składania jej do każdej komory.W międzyczasie użyj chusteczki higienicznej, aby zapobiec kapaniu płynu z komory tkankowej na czujnik tlenu. Pozwól tkance opaść w kierunku i na FRET. Aby załadować komórki RPE na membrany Transwell, po przepaskowaniu przygotowanych komórek 0,25% trypsyny EDTA, umieść je na filtrach trawionych z politereftalanu etylenu o wielkości porów 0,4 milimetra.W dniu eksperymentu pokrój błony na trzy paski o równej szerokości i załaduj je do komór tkankowych za pomocą kleszczy. Wskaźnik zużycia tlenu lub OCR siatkówki był stały w czasie wstrzykiwania badanych związków, co wskazuje na stabilny stan i funkcję tkanki oraz potwierdza ważność metody. Zgodnie z danymi uzyskanymi przy użyciu konwencjonalnych metod perfuzji zarówno dla siatkówki, jak i twardówki naczyniówki, OCR zmniejszył się w odpowiedzi na oligomycynę i zwiększył się w odpowiedzi na FCCP.Zaobserwowane zmiany w szybkości produkcji mleczanu lub LPR były odwrotne do obserwowanych w przypadku OCR. Komórki RPE, które nie były wcześniej analizowane za pomocą systemów przepływowych, zareagowały podobnie do twardówki naczyniówki RPE przy użyciu tej metody.

maintaining-assessing-various-tissue-cell-types-eye-using-novel

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opracowano mikrofluidyczne urządzenie do perifuzji wysepek trzustkowych w celu oceny dynamicznego wydzielania insuliny przez wiele wysepek oraz jednoczesnego obrazowania fluorescencyjnego napływu jonów wapnia i zmian potencjału mitochondrialnego.

Wieloparametryczny system perfuzji wysepek w mikroprzepływowym urządzeniu perfuzyjnym

Ten protokół replikuje fizjologiczny lub patologiczny przepływ krwi in vitro, aby pomóc w określeniu odpowiedzi komórek w patologiach chorobowych. Wprowadzając komorę tłumiącą ciśnienie za pompą krwi, przepływ krwi przez naczynia krwionośne może zostać ponownie podsumowany i nałożony na monowarstwę śródbłonka naczyniowego lub kokulturę mimetyczną.

In vitro Model fizjologicznego i patologicznego przepływu krwi z zastosowaniem do badań przebudowy komórek naczyniowych

Obecne modele in vitro do oceny soczewek kontaktowych (CL) i innych zastosowań związanych z oczami są poważnie ograniczone. Prezentowana platforma okularowa symuluje fizjologiczny przepływ łez, objętość łez, ekspozycję na powietrze oraz zużycie mechaniczne. System ten jest bardzo wszechstronny i może być stosowany do różnych analiz in vitro z CL.

Opracowanie platformy ocznej in vitro do badania soczewek kontaktowych

Opisano tutaj krok po kroku protokół do nieniszczącego i długoterminowego monitorowania procesu przebudowy naczyń krwionośnych i degradacji rusztowań w czasie rzeczywistym biodegradowalnych naczyń krwionośnych opartych na polimerowych rusztowaniach z pulsacyjną stymulacją za pomocą optycznej koherentnej tomografii.

Nieniszczące monitorowanie rozwoju naczyń krwionośnych opartych na degradowalnych rusztowaniach za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Opisujemy i szczegółowo opisujemy zastosowanie translaminarnego systemu autonomicznego. System ten wykorzystuje ludzki tylny odcinek do niezależnej regulacji ciśnienia wewnątrz segmentu (wewnątrzgałkowego) i otaczającego nerw wzrokowy (wewnątrzczaszkowego) w celu wytworzenia translaminarnego gradientu ciśnienia, który naśladuje cechy jaskrowej neuropatii nerwu wzrokowego.

Translaminarny model autonomicznego systemu do modulacji ciśnienia wewnątrzgałkowego i śródczaszkowego w tylnych segmentach dawcy człowieka

Celem tego protokołu jest wyjaśnienie i zademonstrowanie rozwoju trójwymiarowego (3D) modelu mikroprzepływowego wysoce wyrównanej tkanki serca ludzkiego, składającej się z kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych hodowanych wspólnie z fibroblastami serca (CF) w biomimetycznym hydrożelu na bazie kolagenu, do zastosowań w inżynierii tkankowej serca, badaniach przesiewowych leków i modelowaniu chorób.

Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

Urazy oczu na otwartej kuli mogą pozostać nieleczone przez wiele dni w scenariuszach związanych z obszarami wiejskimi lub wojskowymi, powodując ślepotę. Potrzebne są środki terapeutyczne, aby zminimalizować utratę wzroku. W tym miejscu szczegółowo opisujemy model uszkodzenia w kształcie otwartej kuli narządowej. Dzięki temu modelowi można właściwie ocenić potencjalne terapie stabilizujące te urazy.

Platforma hodowli narządów w przednim segmencie do śledzenia urazów na otwartej kuli i wyników terapeutycznych

Przedstawiamy protokół użycia światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii (CLM) do nieinwazyjnego badania czasoprzestrzennego rozkładu liposomów w oku po wstrzyknięciu podspojówkowym.

Przestrzenno-czasowe obrazowanie in vivo ocznych systemów dostarczania leków za pomocą światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii

Przedstawiamy tutaj protokół do wytworzenia i obsługi układu mikrofluidalnego, który naraża komórki śródbłonka na zsynchronizowany oscylatorny hiperglikemię i pulsujące naprężenia ścinające. Takie podejście zapewnia fizjologicznie istotny in vitro model do badania cukrzycowej dysfunkcji śródbłonka. Ten protokół umożliwia ilościowe pomiary stresu oksydacyjnego i reakcji komórek śródbłonka.

System mikrofluidyczny do modelowania dysfunkcji endotelialnych w warunkach połączonego fizjologicznego pulsującego stresu ścinającego i oscylacyjnej hiperglikemii

Spektroskopia Ramana jest odpowiednią techniką do bezkontaktowej, bezetykietowej analizy żywych komórek, konstruktów inżynierii tkankowej oraz tkanek natywnych. Specyficzne dla źródła sygnatury spektralne mogą być generowane i analizowane przy użyciu analizy wielowariancyjnej.

Bezkontaktowy i bezetykietowy monitoring komórek oraz macierzy pozakomórkowej z wykorzystaniem spektroskopii Ramanowskiej

Poznaj nowatorski system płynów bez pompy do analizy tkanki oka w czasie rzeczywistym. Ta metoda umożliwia pomiar zużycia tlenu i produktów metabolicznych siatkówki oraz nabłonka barwnikowego, wspierając badania nad chorobami siatkówki.

Utrzymanie i ocena różnych typów tkanek i komórek oka przy użyciu nowatorskiego systemu płynów bez pompy

Przeglądaj więcej filmów