Name: Zaprojektowanie i zbudowanie konfigurowalnego, jednoobiektywowego, arkuszowego mikroskopu fluorescencyjnego do wizualizacji sieci cytoszkieletów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj budowę jednoobiektywowego mikroskopu fluorescencyjnego arkuszowego do wizualizacji sieci cytoszkieletów. Ta metoda umożliwia obrazowanie gęstych próbek 3D z minimalnym fotobleachingiem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation (NSF) RUI Award (DMR-2203791) dla J.S. Jesteśmy wdzięczni za wskazówki udzielone przez dr Bin Yanga i dr Manisha Kumara podczas procesu dostosowania. Dziękujemy dr Jenny Ross i K. Alice Lindsay za instrukcje przygotowania silników kinezynowych.

Customizable Fluorescence Microscope to Visualize Cytoskeleton Networks

<ol><li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light-sheet+microscopy+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Optics%22%5BJournal%5D)">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal Optics. 20 (5), 053002(2018).</li>
<li>You, R., McGorty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy+illuminating+soft+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy illuminating soft matter.</a> Frontiers in Physics. 9, 760834(2021).</li>
<li>Fuchs, E., Jaffe, J. S., Long, R. A., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+laser+light+sheet+microscope+for+microbial+oceanography%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Thin laser light sheet microscope for microbial oceanography.</a> Optics Express. 10 (2), 145-154 (2002).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Dunsby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+sectioned+imaging+by+oblique+plane+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Optically sectioned imaging by oblique plane microscopy.</a> Optics Express. 16 (25), 20306-20316 (2008).</li>
<li>Bouchard, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+confocally-aligned+planar+excitation+%28SCAPE%29+microscopy+for+high-speed+volumetric+imaging+of+behaving+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms.</a> Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).</li>
<li>Smith, C. W., Botcherby, E. J., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+oblique-plane+images+in+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Resolution of oblique-plane images in sectioning microscopy.</a> Optics Express. 19 (3), 2662-2669 (2011).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epi-illumination+SPIM+for+volumetric+imaging+with+high+spatial-temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution.</a> Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+multiview+capture+and+fusion+improves+spatial+resolution+in+wide-field+and+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Simultaneous multiview capture and fusion improves spatial resolution in wide-field and light-sheet microscopy.</a> Optica. 3 (8), 897-910 (2016).</li>
<li>Sahasrabudhe, A., Vittal, V., Ghose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peeping+in+on+the+cytoskeleton%3A+Light+microscopy+approaches+to+actin+and+microtubule+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Science%22%5BJournal%5D)">Peeping in on the cytoskeleton: Light microscopy approaches to actin and microtubule organization.</a> Current Science. 105 (11), 1562-1570 (2013).</li>
<li>Kumar, M., Kishore, S., Nasenbeny, J., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+one-+and+two-photon+scanned+oblique+plane+illumination+%28SOPi%29+microscopy+for+rapid+volumetric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Integrated one- and two-photon scanned oblique plane illumination (SOPi) microscopy for rapid volumetric imaging.</a> Optics Express. 26 (10), 13027-13041 (2018).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nature Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li>
<li>Sapoznik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+oblique+plane+microscope+for+large-scale+and+high-resolution+imaging+of+subcellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A versatile oblique plane microscope for large-scale and high-resolution imaging of subcellular dynamics.</a> eLife. 9, e57681(2020).</li>
<li>Bernardello, M., Marsal, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+in+vivo+study+of+microtubule+dynamics+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for the in vivo study of microtubule dynamics in the zebrafish embryo.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6237-6254 (2021).</li>
<li>Shelden, E. A., Colburn, Z. T., Jones, J. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+super+resolution+on+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Focusing super resolution on the cytoskeleton.</a> F1000Res. 5, F1000 Faculty Rev-998 (2016).</li>
<li>Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology-dependent+anomalous+dynamics+of+ring+and+linear+DNA+are+sensitive+to+cytoskeleton+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking.</a> Science Advances. 5 (12), (2019).</li>
<li>Sheung, J. Y., Garamella, J., Kahl, S. K., Lee, B. Y., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor-driven+advection+competes+with+crowding+to+drive+spatiotemporally+heterogeneous+transport+in+cytoskeleton+composites%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Motor-driven advection competes with crowding to drive spatiotemporally heterogeneous transport in cytoskeleton composites.</a> Frontiers in Physics. 10, 1055441(2022).</li>
<li>Zeiss Lightsheet 7. Light-Sheet Multiview Imaging of Living and Cleared Specimens. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html</a> (2023).</li>
<li>Zeiss Lattice Lightsheet 7. Long-Term Volumetric Imaging of Living Cells. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html</a> (2023).</li>
<li>Kumar, M., Kishore, S., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossbill%3A+An+open+access+single+objective+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Crossbill: An open access single objective light-sheet microscopy platform.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+microscopy%3A+A+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Optics+and+Photonics%22%5BJournal%5D)">Light-sheet microscopy: A tutorial.</a> Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).</li>
<li>Pitrone, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSPIM%3A+An+open-access+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">OpenSPIM: An open-access light-sheet microscopy platform.</a> Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).</li>
<li>Sheung Lab, Single Objective Light Sheet Microscope (SOLS) Guide. Sheung Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols">https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols</a> (2023).</li>
<li>Lamb, J. R., Ward, E. N., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+software+package+for+on-the-fly+deskewing+and+live+viewing+of+volumetric+lightsheet+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Open-source software package for on-the-fly deskewing and live viewing of volumetric lightsheet microscopy data.</a> Biomedical Optics Express. 14 (2), 834-845 (2023).</li>
<li>Harvard University. Mitchison Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mitchison.hms.harvard.edu/home">https://mitchison.hms.harvard.edu/home</a> (2023).</li>
<li>Research at Dogic Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://dogiclab.physics.ucsb.edu/research/">http://dogiclab.physics.ucsb.edu/research/</a> (2023).</li>
<li>Watkins, S. C., St. Croix, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+imaging+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Light sheet imaging comes of age.</a> Journal of Cell Biology. 217 (5), 1567-1569 (2018).</li>
<li>Ndlec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+microtubules+and+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of microtubules and motors.</a> Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).</li>
<li>Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+motion+in+hierarchically+assembled+active+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter.</a> Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).</li>
<li>Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensile+to+contractile+transition+in+active+microtubule-actin+composites+generates+layered+asters+with+programmable+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (5), e2115895119(2022).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isomorphic+coalescence+of+aster+cores+formed+in+vitro+from+microtubules+and+kinesin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Isomorphic coalescence of aster cores formed in vitro from microtubules and kinesin motors.</a> Physical Biology. 13 (5), 056002(2016).</li>
<li>Millett-Sikking, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMillett-Sikking%2C+A+%22High+NA+single-objective+lightsheet%22">High NA single-objective lightsheet</a>. , (2019).</li>
<li>Bourgenot, C., Saunter, C. D., Taylor, J. M., Girkin, J. M., Love, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+adaptive+optics+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">3D adaptive optics in a light sheet microscope.</a> Optics Express. 20 (12), 13252-13261 (2012).</li>
<li>Bernardello, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+multimodal+platform+for+classical+and+high+throughput+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Modular multimodal platform for classical and high throughput light sheet microscopy.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1969(2022).</li>
<li>Crombez, S., Leclerc, P., Ray, C., Ducros, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+hyperspectral+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Computational hyperspectral light-sheet microscopy.</a> Optics Express. 30 (4), 4856-4866 (2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia. Wszystkie badania zostały przeprowadzone przy braku powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako konflikt interesów.

Dwa ważne szczegóły dotyczące tego protokołu to całkowity koszt systemu oraz oczekiwany czas budowy i wyrównania. Chociaż dokładny koszt jest zmienny, możemy spokojnie oszacować, że koszt in toto tego SOLS lub podobnego systemu DIY mieściłby się w przedziale 85 000 USD. Zwracamy uwagę, że szacunki te uwzględniają cenę detaliczną wszystkich komponentów, więc ta ogólna cena może zostać znacznie obniżona poprzez pozyskiwanie używanych komponentów. Jeśli chodzi o czas budowy, rozsądne byłoby oczekiwanie, że użytkownik z niewielkim doświadczeniem w optyce zbuduje i wyrówna cały system SOLS w ciągu 1-2 miesięcy, pod warunkiem, że wszystkie komponenty są dostępne i gotowe. Pomimo długości i złożoności protokołu, uważamy, że ilość szczegółów w rękopisie pisemnym, w połączeniu z protokołem wideo, powinna sprawić, że protokół ten będzie prosty i szybki do naśladowania.
W tym protokole istnieją dwa krytyczne kroki. Po pierwsze, umiejscowienie galvo determinuje rozmieszczenie wielu soczewek, ponieważ jest on częścią trzech oddzielnych par soczewek 4f. Bardzo ważne jest, aby galvo było zarówno sprzężone z tylnymi płaszczyznami ogniskowymi O1 i O2, jak i prawidłowo wyśrodkowane, aby zapewnić skanowanie niezmiennicze pod kątem. Po drugie, jakość obrazu jest niezwykle wrażliwa na wyrównanie O2 i O3 względem siebie. W tym przypadku należy zwrócić uwagę, aby upewnić się, że po pierwsze, kąt wyrównania O3 do O2 odpowiada nachyleniu arkusza światła wzbudzenia, zapewniając w ten sposób maksymalnie płaskie oświetlenie w podobnie nachylonym polu widzenia. Po drugie, O3 musi być umieszczony w odpowiedniej odległości osiowej, aby utrzymać płaskie pole widzenia o jak największej powierzchni. Po trzecie, O3 musi być umieszczony w odpowiedniej odległości bocznej od O2, aby zmaksymalizować sygnał przechodzący przez interfejs O2-O3.

Jeśli chodzi o użyteczne pole widzenia, system ten osiągnął płaskie, niezawodne pole ze stałym oświetleniem na obszarze 80 μm x 80 μm. Obszar ten jest mniejszy niż maksymalne pole widzenia zapewniane przez kamerę, więc użyteczne pole widzenia jest oznaczone żółtym polem na rysunku 13. Jeśli chodzi o zdolność rozdzielczą, system ten osiągnął minimalną rozdzielczość 432 nm wzdłuż osi x i 421 nm wzdłuż osi y, która została zmierzona poprzez znalezienie średniej sigma x i y funkcji rozproszenia Gaussa (PSF) w dobrym polu widzenia i pomnożenie przez dwa. Zwracamy uwagę, że ten system nie został zoptymalizowany pod względem całkowitego NA, co oznacza, że jest miejsce na znaczną poprawę, jeśli użytkownicy oczekują wyższej zdolności rozdzielczej niż ta, którą osiągnął ten system. Istnieje wiele kompatybilnych opcji obiektywów dla tego typu konstrukcji SOLS, z których wiele przyczyniłoby się do wyższej rozdzielczości systemu, ale z wadami w postaci wyższego kosztu, mniejszego pola widzenia lub bardziej skomplikowanych technik dopasowywania na interfejsie przekaźnika 8,11,13,20. Oddzielnie, jeśli użytkownicy pragną większego pola widzenia, włączenie drugiego galvo, aby umożliwić skanowanie 2D, osiągnęłoby ten cel, ale wymagałoby dodatkowej optyki i mechaniki sterowania, które zostałyby zintegrowane z projektem32. Więcej szczegółów na temat modyfikacji systemu podaliśmy na naszej stronie internetowej, wraz z linkami do innych pomocnych zasobów dotyczących procesu projektowania23.

Poza ulepszeniem konkretnych komponentów dla tego konkretnego projektu, bardzo możliwe byłoby dodanie innych technik lub modalności mikroskopii o wysokiej rozdzielczości do tej konstrukcji. Jednym z takich ulepszeń byłoby włączenie oświetlenia o wielu długościach fali, co wiązałoby się z ustawieniem dodatkowych laserów wzbudzających do oryginalnej ścieżki wzbudzenia8. Ponadto, ponieważ ten typ konstrukcji SOLS pozostawia próbkę dostępną, dodanie dodatkowych funkcji do mikroskopu, w tym między innymi pęsety optycznej, mikrofluidyki i reometrii, jest stosunkowo proste 2,33.

W porównaniu z niezliczonymi przewodnikami po arkuszach świetlnych, które zostały opublikowane, protokół ten zawiera instrukcje na poziomie zrozumienia, który może uznać za pomocny dla użytkownika bez znaczącego doświadczenia w optyce. Tworząc przyjazną dla użytkownika konstrukcję SOLS z tradycyjnymi możliwościami montażu szkiełek z próbkami dostępnymi dla szerszego grona odbiorców, mamy nadzieję umożliwić jeszcze dalsze rozszerzenie zastosowań badań opartych na SOLS we wszystkich dziedzinach, w których instrument jest lub może być wykorzystywany. Nawet przy szybko rosnącym zastosowaniu instrumentów SOLS w liczbie 2,34,35, uważamy, że wiele korzyści i zastosowań instrumentów typu SOLS nadal pozostaje niezbadanych i wyrażamy podekscytowanie możliwościami tego typu instrumentów w przyszłości.

Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszem światła (LSFM) reprezentuje rodzinę wysokorozdzielczych technik obrazowania fluorescencyjnego, w których światło wzbudzenia jest kształtowane w arkusz1,2, w tym mikroskopię z selektywnym oświetleniem płaszczyzny (SPIM), skanowane wzbudzenie płaskie wyrównane konfokalnie (SCAPE) oraz mikroskopię z płaszczyzną skośną (OPM)3,4,5,6,7. W przeciwieństwie do innych metod mikroskopowych, takich jak epifluorescencja, mikroskopia fluorescencyjna z całkownym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) czy mikroskopia konfokalna, fototoksyczność w LSFM jest minimalna, a próbki mogą być obrazowane w dłuższych odstępach czasu, ponieważ oświetlana jest tylko ta płaszczyzna próbki, która jest w danej chwili obrazowana8,9,10. W związku z tym techniki LSFM są niezwykle użyteczne do obrazowania próbek 3D w wydłużonych okresach czasu, w szczególności nawet tych, które są zbyt grube dla technik mikroskopii konfokalnej. Z tych powodów, od momentu jej pierwotnego opracowania w 2004 roku, LSFM stała się preferowaną techniką obrazowania dla wielu fizjologów, biologów rozwojowych i neurobiologów do wizualizacji całych organizmów, takich jak żywe rybki danio oraz embriony Drosophila3,4,6,11. W ciągu ostatnich dwóch dekad zalety LSFM zostały wykorzystane do wizualizacji struktury i dynamiki w coraz mniejszych skalach, w tym w skali tkankowej11,12, komórkowej i subkomórkowej, zarówno in vivo, jak i in vitro13,14,15,17.
Pomimo doniesień o udanych zastosowaniach w literaturze, wysoki koszt komercyjnych systemów LSFM (~0,25 miliona USD w momencie pisania)18,19 uniemożliwia powszechne stosowanie tej techniki. Aby uczynić konstrukcje typu DIY wykonalną alternatywą dla badaczy, opublikowano wiele przewodników budowy8,13,20,21, w tym projekt open-access OpenSPIM22. Jednak do tej pory badacze z minimalnym doświadczeniem w zakresie optyki mogli korzystać jedynie z wcześniejszych projektów LSFM, które są niekompatybilne z tradycyjnymi próbkami montowanymi na szkiełkach (Ryc. 1A). Niedawne implementacje jednoobiektywowych arkuszy światła (SOLS) wykorzystują jeden obiektyw zarówno do wzbudzenia, jak i detekcji (Ryc. 1C), co pozwala przełamać ograniczenia związane z kompatybilnością5,6,8,13,20. Jednak ceną za wszechstronność konstrukcji SOLS jest znaczny wzrost złożoności budowy ze względu na konieczność zastosowania dwóch dodatkowych obiektywów w celu przekaźnikowania, korygowania kąta nachylenia i ponownego odwzorowania płaszczyzny obiektu na kamerze do obrazowania (Ryc. 1D). Aby ułatwić dostęp do złożonych układów typu SOLS, niniejsza praca przedstawia przewodnik krok po kroku dotyczący projektowania, budowy, procesu wyrównywania oraz użytkowania systemu SOLS kompatybilnego ze szkiełkami, który byłby użyteczny dla badaczy posiadających wiedzę jedynie z podstawowego kursu optyki.
Choć sam protokół jest zwięzły, czytelnicy powinni w trakcie etapów przygotowawczych skorzystać z innych źródeł, aby dowiedzieć się więcej o poszczególnych elementach konstrukcji lub kwestiach sprzętowych. Jeśli jednak czytelnik zamierza postępować zgodnie ze specyfikacjami niniejszego projektu, zrozumienie sposobu wyboru konkretnych komponentów optycznych może nie być konieczne.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig01.jpg" /> 
Rysunek 1: Charakterystyka różnych konfiguracji LSFM. (A) Układ z dwoma ortogonalnymi obiektywami, powszechny we wczesnych konstrukcjach LSFM. W tej konfiguracji do utrzymania próbki używa się rurki kapilarnej lub cylindra żelu, co nie jest kompatybilne z tradycyjnymi technikami montowania na szkiełkach. (B) Schemat konstrukcji light-sheet SOLS przedstawiający następujące elementy: (C) pojedynczy obiektyw służący zarówno do wzbudzenia, jak i zbierania emisji w płaszczyźnie próbki (O1); umożliwia to zamontowanie tradycyjnego szkiełka na górze oraz (D) system obiektywów przekaźnikowych w ścieżce emisji SOLS. O2 zbiera światło emisji i pomniejsza obraz. O3 obrazuje płaszczyznę pod odpowiednim kątem nachylenia na sensor kamery. Skróty: LSFM = light-sheet fluorescence microscopy (mikroskopia fluorescencyjna z płaszczyzną światła); SOLS = single-objective light-sheet (light-sheet z pojedynczym obiektywem); O1-O3 = obiektywy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Soczewka płasko-wklęsła 1" f = -50 mm</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>LC1715-A-ML</td><td>Do lasera do wyrównywania Szacowany koszt: $49.5</td></tr><tr><td>1" Achromatyczny dublet f = 100 mm (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A-ML</td><td>L2, L4 i laser do wyrównywania Szacowany koszt: $ 342.42</td></tr><tr><td>1" Achromatyczny dublet f = 125 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-125-A-ML</td><td>SL2 Szacowany koszt: $114.14</td></tr> 1<tr><td>" Achromatyczny dublet f=150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>L3 Szacowany koszt: $114.14</td></tr> 1<tr><td>" Achromatyczny dublet f=150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>TL2 Szacowany koszt: $114.14</td></tr> 1<tr><td>" Achromatyczny dublet f=45 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-045-A-ML</td><td>L1 Szacowany koszt: $114.14</td></tr><tr><td>1" Achromatyczny dublet f=75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-075-A-ML</td><td>SL1 Szacowany koszt: $114.14</td></tr><tr><td>Soczewka cylindryczna 1" f = 100 mm</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>LJ1567RM CL3 Szacowany koszt: $117.62</td></tr> 1<tr><td>" Soczewka cylindryczna f = 200 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1653RM</td><td>CL2 Szacowany koszt: $111.22</td></tr> 1<tr><td>" Soczewka cylindryczna f = 50 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1695RM</td><td>CL1 Szacowany koszt: $117.62</td></tr><tr><td>1" Zamontowany otworek, 30 &mikro; m Średnica otworka</td><td>Thorlabs</td><td>P30K</td><td>Szacowany koszt: $ 77.08</td></tr><tr><td>1" Srebrne lustro (x3)</td> <td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>M1, M2, jeden do wyrównania Szacowany koszt: $ 168.78</td></tr><tr><td>2-calowe lustro eliptyczne</td><td>Thorlabs</td><td>PFE20-P01</td><td>M3 Szacowany koszt: $179.98</td></tr><tr><td>2-calowy uchwyt na słupki (x11)</td><td>Thorlabs</td><td>PH2</td><td>Do niestandardowego montażu laserowego, koła ND, ekranów bezpieczeństwa Szacowany koszt: $ 98.45</td></tr><tr><td>Słupki 2" (x47)</td><td>Thorlabs</td><td>TR2</td><td>Do niestandardowego montażu laserowego i komponentów optycznych Szacowany koszt: $277.3</td></tr><tr><td>Słupki 3" (x4)&nbsp;</td><td>Szpitale&nbsp;</td><td>TR3</td><td>Do podpór M3 i innych mocowań Szacowany koszt: $24.6</td></tr><tr><td>3-calowy uchwyt na słupki (x4)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>PH3</td><td>Szacowany koszt: 38,48 USD</td></tr><tr><td>Adapter klatki od 30 do 60 mm&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>LCP33</td><td>Do montażu O1 Szacowany koszt: $ 45.42</td></tr><tr><td>Koło filtra klatkowego 30 mm</td><td>Thorlabs</td><td>CFW6</td><td>Do montażu filtrów ND Szacowany koszt: $ 172.36</td></tr><tr><td>Płyta klatki 30 mm (x6)</td><td>Thorlabs</td><td>CP33</td><td>Aby zbudować klatkę wyrównującą i laser do wyrównywania Szacowany koszt: $ 114.54</td></tr><tr><td>30mm Kątowe mocowanie lustra kinematycznego 30 mm (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1</td><td>Do montażu M1 i M2 oraz do wyrównywania lasera Szacowany koszt: 463,95 $</td></tr><tr><td>4-calowy uchwyt na słupek (x30)</td><td>Thorlabs</td><td>PH4</td><td>Szacowany koszt: 320,1 $</td></tr><tr><td>Laser i zasilacz 561 nm&nbsp;</td><td>Opto Engine LLC</td><td>MGL-FN-561-100mW</td><td>Laser wzbudzenia Szacowany koszt: 6000 $</td></tr><tr><td>Płyta klatki 60 mm (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>LCP01</td><td>Do montażu TL1 i M3 mount Szacowany koszt: $ 88.52</td></tr><tr><td>60mm Kątowy uchwyt do lusterka kinematycznego</td><td>Thorlabs</td><td>KCB2</td><td>Aby zamontować M3 Szacowany koszt: $ 187.26</td></tr><tr><td>90&deg; Odwróć górę</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>TRF90</td><td>Do lasera do wyrównywania Szacowany koszt: $ 95.5</td></tr><tr><td>Adapter z zewnętrznymi gwintami C-Mount i wewnętrznymi gwintami SM1</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A9</td><td>Aby podłączyć tubus obiektywu do aparatu Szacowany koszt: $20.96</td></tr><tr><td>Adapter z zewnętrznymi gwintami SM1 i wewnętrznymi gwintami C-Mount</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A10</td><td>Aby podłączyć soczewkę tubusu do mocowania obiektywu Szacowany koszt: $21.82</td></tr><tr><td>Adapter z zewnętrznymi gwintami SM1 i wewnętrznymi gwintami M25 (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A12</td><td>Do montażu O1 i O2 Szacowany koszt: $ 47.06</td></tr><tr><td>Adapter z zewnętrznymi gwintami SM1 i wewnętrznymi gwintami M26</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A27</td><td>Do montażu O3 Szacowany koszt: $22.38</td></tr><tr><td>Dysk wyrównujący</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A7</td><td>Szacowany koszt: 20.45 USD</td></tr><tr><td>Laser wyrównujący</td><td>BISKEE</td><td></td><td>https://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM Szacowany koszt: 16.98 USD</td></tr><tr><td>Autoluorescent Plastic Slide, czerwony&nbsp;</td><td>Chroma</td><td>92001</td><td>Szacowany koszt: 20 USD</td></tr><tr><td>Beam Shutter&nbsp;</td><td>Szpitale&nbsp;</td><td>SM1SH1</td><td>Do blokowania światła laserowego Szacowany koszt: 65.8 USD</td></tr><tr><td>Montaż obrotowy klatki (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1T</td><td>Do montażu CL1-3 Szacowany koszt: 282.15 USD</td></tr><tr><td>Pręty systemu klatkowego 1" (x8)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER1</td><td>Do montażu M3 i O1 Szacowany koszt: 44,8 USD</td></tr><tr><td>Pręty systemu klatkowego 3" (x2)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER3</td><td>Do montażu O3 Szacowany koszt: 14,28 USD</td></tr><tr><td>Pręty systemu klatkowego 4" (x4)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER4</td><td>Do montażu szczeliny Szacowany koszt: $ 30.76</td></tr><tr><td>Pręty systemu klatkowego 8 "(x2)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER8</td><td>Do wyrównania soczewek tubusu Szacowany koszt: 25,3 USD</td></tr><tr><td>Pręty systemu klatkowego 12 "(x8)</td><td>Thorlabs</td><td>ER12</td><td>Do klatki wyrównującej Szacowany koszt: 145,36 USD</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 sCMOS</td><td>Szacowany koszt: ~ $ 14,000</td></tr><tr><td>Widelec zaciskowy (x35)</td><td>Thorlabs</td><td>CF125</td><td>Do mocowania mocowań słupków Szacowany koszt: $ 338.8</td></tr><tr><td>Szkło osłonowe, 22 x 22 mm&nbsp;</td><td>Corning</td><td>2850-22</td><td>Dla próbek preparatów Szacowany koszt: 265 USD</td></tr><tr><td>Dichroic&nbsp;</td><td>AVR</td><td>DI01-R405/488/561/635-25x36</td><td>Aby podzielić ścieżki wycinkowe/emisyjne Szacowany koszt: $ 965</td></tr><tr><td>Etap translacji jaskółczego ogona</td><td>Thorlabs</td><td>DT12</td><td>Aby przetłumaczyć otworek Szacowany koszt: $ 90.55</td></tr><tr><td>Filtr emisyjny</td><td>Thorlabs</td><td>FELHO600</td><td>Szacowany koszt: $ 140.99</td></tr><tr><td>Dysk wyrównujący z matowego szkła (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>DG10-1500-H1</td><td>Do klatki wyrównującej i płaszczyzny pośredniej Szacowany koszt: 75.14 USD</td></tr><tr><td>Generator funkcyjny</td><td>Hewlett-Packard</td><td>HP 33120A 15 MHz</td><td>Do sterowania galvo Szacowany koszt: 900 USD</td></tr><tr><td>Galwanometr - system 1D o dużej średnicy wiązki</td><td>Thorlabs</td><td>GVS011</td><td>Szacowany koszt: 1715.78</td></tr><tr><td>USD Zasilacz galwanometru</td><td>Siglent</td><td>SPD3303C</td><td>Szacowany koszt: 300 USD</td></tr><tr><td>Gelrite</td><td>Research Products International</td><td>G35020-100.0</td><td>Guma Gellan do próbki koralików 3D Szacowany koszt: $ 68.25</td></tr><tr><td>FIJI Software</td><td>Open-source</td><td></td><td>Pobierz z https://imagej.net/software/fiji/downloads Szacowany koszt: bezpłatna</td></tr><tr><td>płyta grzejna / mieszadło</td><td>Corning</td><td>6795-220</td><td>Do przygotowania roztworów próbnych Szacowany koszt: $ 550</td></tr><tr><td>Sterownik silnika szczotkowanego K-Cube</td><td>Thorlabs</td><td>KDC101</td><td>Napędy Z825B Szacowany koszt: $ 757.51</td></tr><tr><td>Montaż kinematyczny</td><td>Thorlabs</td><td>KM100S</td><td>Do montażu dichroic Szacowany koszt: $ 92.01</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Kinesis</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td></td><td>Pobierz z https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285 Szacowany koszt: Bezpłatny</td></tr><tr><td>laserowy bloker światła&nbsp;</td><td>Szpitale&nbsp;</td><td>LB1</td><td>Do odbić filtra ND Szacowany koszt: 57.65</td></tr><tr><td>USD Montaż laserowy</td><td>wykonany</td><td></td> na zamówienie <td>drukowany w 3D Szacowany koszt: Nie dotyczy</td></tr><tr><td>laserowego ekranu bezpieczeństwa (x2)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>TPS4</td><td>Do blokowania rozproszonego światła laserowego Szacowany koszt: 92.02 USD</td></tr><tr><td>Soczewki do skanowania laserowego</td><td>Thorlabs</td><td>TTL200MP</td><td>TL1 Szacowany koszt: 1491 USD</td></tr><tr><td>Mocowanie obiektywu (x10)&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1</td><td>Aby zamontować wszystkie obiektywy i dodatkowe lustro wyrównawcze. Szacowany koszt: 164,7 USD</td></tr><tr><td>Linijka magnetyczna</td><td>Thorlabs</td><td>BHM4</td><td>Aby sprawdzić wyrównanie Szacowany koszt: 52,74 USD</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Micro-Manager&nbsp;</td><td>Open-source</td><td></td><td>Pobierz z https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release Szacowany koszt: Bezpłatne</td></tr><tr><td>szkiełka mikroskopowe</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12550400</td><td>Dla próbek preparatów Szacowany koszt: 123.9 USD</td></tr><tr><td>Stolik mikroskopowy&nbsp;</td><td>ASI</td><td>FTP-2000 z niestandardowymi</td><td>częściami Aby dokładnie przetłumaczyć próbki Szacowany koszt: ~$16,000</td></tr><tr><td>Mini mikser wirowy&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10153-688</td><td>Do przygotowania próbki Szacowany koszt: 152.64 USD</td></tr><tr><td>Siłownik z napędem</td><td>Thorlabs</td><td>Z825B</td><td>Aby dokładnie przetłumaczyć M1 Szacowany koszt: 729,07 USD</td></tr><tr><td>Zamontowana standardowa tęczówka (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>ID20</td><td>Co najmniej 2 do wyrównania Szacowany koszt: 118,02 USD</td></tr><tr><td>Zestaw filtrów ND&nbsp;</td><td>Klatki piersiowe</td><td>NDK01&nbsp;</td><td>Aby zmniejszyć intensywność wzbudzenia Szacowany koszt: $ 726.73</td></tr><tr><td>Obiektyw Lens 1</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Plan Apo 60X/ 1.20 WI</td><td>O1 Szacowany koszt: ~$15,000</td></tr><tr><td>Obiektyw 2</td><td>Nikon</td><td>TU Plan Fluor 100X/0.90&nbsp;</td><td>O2 Szacowany koszt: ~ $ 6,000</td></tr><tr><td>Obiektyw Lens 3</td><td>Mitutoyo</td><td>Plan Apo HR 50X/0.75</td><td>O3 Szacowany koszt: ~ 6,800</td></tr><tr><td>USD OPM Oprogramowanie do deskowania</td><td>Open-source</td><td></td><td>do przetwarzania obrazu. Pobierz z https://github.com/QI2lab/OPM Szacowany koszt: Bezpłatny</td></tr><tr><td>czujnik mocy fotodiody</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>S121C</td><td>Do pomiaru intensywności lasera Szacowany koszt: 379,68 USD</td></tr><tr><td>Dodatnie zniekształcenia siatki Cel</td><td>Thorlabs</td><td>R1L3S3P</td><td>wyrównanie jasnego pola Szacowany koszt: 267.87 USD</td></tr><tr><td>Miernik mocy Konsola cyfrowa</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>PM100D</td><td>Do pomiaru intensywności lasera Szacowany koszt: $1245.48</td></tr><tr><td>Rhodamine 6G</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>J62315.14</td><td>Do próbki szkiełka z powłoką fluorescencyjną Szacowany koszt: $27.7</td></tr><tr><td>Zacisk kątowy do słupków</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>RA90</td><td>Do wspornika M3 i lusterka opuszczanego Szacowany koszt: 32.46 USD</td></tr><tr><td>Płyta klatki z gwintem RMS (x2)&nbsp;</td><td>Szpitale&nbsp;</td><td>CP42</td><td>Do lasera do wyrównywania Szacowany koszt: $ 70.56</td></tr><tr><td>Płyta ścinająca 2.5-5.0 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI050P&nbsp;</td><td>Szacowany koszt: $ 182.85</td></tr><tr><td>Płyta ścinająca 5,0-10,0 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI100P</td><td>Szacowany koszt: $ 201.47</td></tr><tr><td>Płyta ścinana 10.0-25.4 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI254P</td><td>Szacowany koszt: $ 236.42</td></tr><tr><td>Ekran podglądu płyty ścinanej</td><td>Thorlabs</td><td>SIVS</td><td>Szacowany koszt: $ 337.74</td></tr><tr><td>Interferometr ścinający z płytką 1-3 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI035</td><td>Do sprawdzania kolimacji Szacowany koszt: $ 465.85</td></tr><tr><td>Wsuwany kołnierz na słupku (x35)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>R2</td><td>Aby utrzymać wysokość słupka Szacowany koszt: 208.25</td></tr><tr><td>USD Szczelina</td><td>Thorlabs</td><td>VA100</td><td>Szacowany koszt: 294.64 USD</td></tr><tr><td>Szczelinowy tubus obiektywu, 3"</td> <td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1L30C</td><td>Do wyrównywania lasera Szacowany koszt: 77,45 USD</td></tr><tr><td>Lustro kwadratowe, 1 x 1 "</td><td></td><td></td><td>https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hva did=642191768069& hvpos=& hvne tw=g& hvrand=1336734911900437 4691& hvpone=& hvptwo=& hvqmt= & hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint=& hvlocphy=9031212& hvtargid=pla-1 943952718742& gclid=Cj0KCQiA6L yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA Lw_wcB& th = 1 Szacowany koszt: 14.76 USD</td></tr><tr><td>Tubus obiektywu z możliwością układania w stosy 1/2 "(x3)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td><td>Do montażu CL1-3 Szacowany koszt: 40.86 USD</td></tr><tr><td>Tubus obiektywu z możliwością układania w stos 1 "</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L10</td><td>Aby zamontować O3 Szacowany koszt: 15.41 USD</td></tr><tr><td>Tubus obiektywu z możliwością układania w stos 2 "(x2)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L20</td><td>Do ścieżki kamery Szacowany koszt: $35.7</td></tr><tr><td>Adapter podstawy cokołu z ćwiekami (x37)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>BE1</td><td>Aby przymocować mocowania słupków do stołu Szacowany koszt: $ 400.71</td></tr><tr><td>Tłumaczenie mocowania obiektywu (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>LM1XY</td><td>Aby drobno przetłumaczyć otworki, O2 i O3 Szacowany koszt: $ 441</td></tr><tr><td>Etap translacji ze standardowym mikrometrem (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>PT1/M</td><td>TS1-2 Szacowany koszt: $647.54</td></tr><tr><td>Instrukcja podróży Etap tłumaczenia</td><td>Thorlabs</td><td>CT1A</td><td>Mocowanie translacji klatki O3 Szacowany koszt: 497,3 USD</td></tr><tr><td>Obiektyw tubusowy</td><td>Nikon</td><td>MXA20696</td><td>TL3 Szacowany koszt: 359 USD</td></tr><tr>Białe diody<td>LED zamontowane</td><td>&nbsp;</td><td>Źródło światła MNWHL4</td><td>Brightfield Szacowany koszt: 171.28 USD</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>CAŁKOWITY SZACOWANY KOSZT: $ 84,858.98</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Autorzy zauważają, że wiele części zostało zakupionych jako używane. Tutaj staraliśmy się odzwierciedlić cenę detaliczną wszystkich przedmiotów, więc całkowity koszt można znacznie obniżyć, kupując poszczególne używane przedmioty, zwłaszcza te droższe.</td></tr><tr><td>KOMPONENTY</td><td></td><td></td><td></td>OPCJONALNE</tr><tr><td>Grasshopper3 USB3</td><td>FLIR&</td><td>nbsp; GS3-U3-23S6C-C</td><td>Do kontroli diagnostycznych podczas osiowania. Zamiast tego można użyć kamery Acquisiton, ale później wymaga ona ponownego wyrównania. Szacowany koszt: $ 1089</td></tr></tbody></table>

zaprojektowanie i zbudowanie konfigurowalnego, jednoobiektywowego, arkuszowego mikroskopu fluorescencyjnego do wizualizacji sieci cytoszkieletów

Design and Building of a Customizable, Single-Objective, Light-Sheet Fluorescence Microscope for the Visualization of Cytoskeleton Networks

Zrekonstruowane kompozyty cytoszkieletowe okazały się cennym systemem modelowym do badania nierównowagowej miękkiej materii. Wierne uchwycenie dynamiki tych gęstych sieci 3D wymaga optycznego przekroju, który jest często kojarzony z fluorescencyjnymi mikroskopami konfokalnymi. Jednak ostatnie osiągnięcia w mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkuszy świetlnych (LSFM) sprawiły, że jest to opłacalna, a czasami lepsza alternatywa. Aby ułatwić dostęp do LSFM badaczom cytoszkieletów, którzy są mniej zaznajomieni z optyką, przedstawiamy przewodnik krok po kroku dla początkujących, jak zbudować wszechstronny mikroskop fluorescencyjny z arkuszami świetlnymi z gotowych komponentów. Aby umożliwić montaż próbki z tradycyjnymi próbkami szkiełkowymi, LSFM jest zgodny z konstrukcją jednoobiektywowego arkusza świetlnego (SOLS), który wykorzystuje pojedynczy obiektyw zarówno do wzbudzenia, jak i zbierania emisji. Opisujemy funkcję każdego komponentu SOLS na tyle szczegółowo, aby umożliwić czytelnikom modyfikację oprzyrządowania i zaprojektowanie go tak, aby odpowiadało ich konkretnym potrzebom. Na koniec demonstrujemy zastosowanie tego niestandardowego instrumentu SOLS, wizualizując astry w sieciach mikrotubul sterowanych kinezyną.

Wykonaliśmy skany wolumetryczne kulek o średnicy 1 µm zatopionych w gumie gellanowej. Rysunek 14 przedstawia maksymalne projekcje intensywności skorygowanych o skośność skanów wolumetrycznych wzdłuż kierunków x, y i z.
<img alt="Rycina 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig14.jpg" /> 
Rycina 14: Obrazowanie wolumetryczne fluorescencyjnych kulek o rozmiarze 1 µm w gumie gellanowej. Przedstawiono projekcje maksymalnej intensywności skorygowanych wolumetrycznych skanów. Paski skali = 30 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig14large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Wykazaliśmy zastosowanie jednobiektywowego mikroskopu z arkuszem światła do charakterystyki zrekonstruowanych sieci cytoszkieletu poprzez skanowanie wolumetryczne próbek asterów mikrotubularnych. W skrócie, znakowane rhodaminą, stabilizowane taxolem mikrotubule spolimeryzowano z zrekonstruowanych dimerów przy użyciu GTP; następnie, po polimeryzacji, do próbek dodano klastry silników kinesynowych oparte na streptawidynie wraz z ATP, aby uzyskać stężenia końcowe 6 µM mikrotubul, 0,5 µM dimerów kinesyny i 10 mM ATP. Szczegółowe protokoły i instrukcje przygotowania stabilizowanych taxolem mikrotubul oraz klastrów silników kinesynowych można znaleźć na stronach internetowych Mitchson Lab oraz Dogic Lab25,26. Próbki ostrożnie naniesiono pipetą na szkiełka przedmiotowe, uszczelniono i pozostawiono na 8 h przed obrazowaniem, aby aktywność silników ustała, a próbki osiągnęły stabilny stan strukturalny przypominający astery.
W badaniach nad zrekonstytuowanymi systemami cytoszkieletu najczęściej wykorzystuje się mikroskopię konfokalną lub epifluorescencyjną do obrazowania znakowanych filamentów. Jednak obie te techniki mają ograniczone możliwości obrazowania gęstych próbek 3D27. Mimo że w badaniach nad aktywną materią opartą na cytoszkielecie in vitro poczyniono duże postępy poprzez ograniczanie próbek do formy quasi-2D28,29, sieci cytoszkieletu są z natury trójwymiarowe, a wiele obecnych wysiłków koncentruje się na zrozumieniu efektów, które mogą wystąpić wyłącznie w próbkach 3D29,30, co stwarza potrzebę zastosowania wysokorozdzielczego obrazowania 3D.
<img alt="Rycina 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig15.jpg" /> 
Rycina 15: Ułatwienie wizualizacji 3D próbek zrekonstytuowanego cytoszkieletu za pomocą mikroskopii arkusza światła z jednym obiektywem. (A) Obrazy fluorescencyjnych asterów mikrotubul uzyskane za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego Leica DMi8. Obrazy przedstawiają różne płaszczyzny z serii skanów z wzdłuż osi z. Pasek skali = 30 µm. (B) Zdekonwolwowane i skorygowane pod kątem skośności (deskewed) obrazy z jednowolumetrycznego skanu wykonanego na tym samym próbce przy użyciu układu mikroskopii arkusza światła z jednym obiektywem. Pasek skali = 30 µm. Obszar obrazu po korekcie skośności odpowiada tutaj użytecznemu polu widzenia FoV (żółta ramka) przedstawionemu na Rycini 13B. Podczas gdy mikroskop konfokalny doskonale obrazuje pojedyncze płaszczyzny w pobliżu szkiełka nakrywkowe, gęstość fluorescencyjnej próbki powoduje komplikacje podczas obrazowania w wyższych płaszczyznach ze względu na dodatkowy sygnał z obszarów poniżej płaszczyzny obrazowania. Arkusz światła rozwiązuje ten problem, oświetlając jedynie płaszczyznę obrazowania, co pozwala na uzyskanie jednolicie ostrych obrazów w różnych płaszczyznach z. Skróty: SOLS = single-objective light-sheet (arkusz światła z jednym obiektywem); FoV = field of view (pole widzenia). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig15large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Na Rysunku 15 przedstawiamy obrazowanie wolumetryczne zrekonstytuowanej sieci mikrotubul skurczonej w struktury przypominające astery przez klastry motorów kinezynowych. Jak pokazano w poprzednich badaniach28,31, struktury 3D te mają tendencję do zagęszczania się w kierunku centrum, co skutkuje występowaniem jasnych obszarów fluorescencji, które dominują w sygnale. W płaszczyznach obrazowania blisko szkiełka podstawowego (niski poziom z), mikroskopia konfokalna (Rysunek 15A) pozwala rozdzielić pojedyncze filamenty na obrzeżach astera, przy dodatkowym tle w kierunku centrum wynikającym z sygnałów fluorescencji poza ogniskową pochodzących z warstw powyżej. Jednak przesunięcie o kilka mikronów w osi z szybko obniża jakość obrazów, ponieważ w płaszczyźnie obrazowania w sygnale dominują gęste sekcje astera znajdujące się poza ogniskową. Jednopłaszczyznowe oświetlenie arkuszem światła (Rysunek 15B) eliminuje sygnały poza ogniskową z gęstych części astera powyżej i poniżej płaszczyzny obrazowania, co pozwala na uzyskanie porównywalnej jakości obrazu między płaszczyznami. Zdolność arkusza światła do generowania wysokiej jakości, wiarygodnych danych z przeskanowania wolumetrycznego otwiera możliwość wizualizacji i charakteryzacji zjawisk 3D w zrekonstytuowanych systemach cytoszkieletu.

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak zbudować jednoobiektywowy, światło-arkuszowy mikroskop fluorescencyjny i jego zastosowanie do wizualizacji sieci cytoszkieletów.

Zaprojektowanie i zbudowanie konfigurowalnego, jednoobiektywowego, arkuszowego mikroskopu fluorescencyjnego do wizualizacji sieci cytoszkieletów

Reconstituted cytoskeleton composites have emerged as a valuable model system for studying non-equilibrium soft matter. The faithful capture of the ...

Nasze prace mają na celu pogłębienie wiedzy na temat związku między dynamiką pracy trans, strukturą lokalną i właściwościami mechanicznymi w materiałach dalekich od równowagi. Wizualizacja materiałów dalekich od równowagi, takich jak sieci cytoszkieletów, wymaga możliwości obrazowania gęstych trójwymiarowych próbek, z porównywalną jakością obrazu w całej objętości próbki, przy jednoczesnym powodowaniu minimalnych uszkodzeń poprzez wybielanie zdjęć, co jest technicznie trudnym zadaniem, do którego najlepiej nadaje się mikroskopia fluorescencyjna z arkuszami szczelinowymi. Systemy mikroskopów fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi zapewniają doskonałe możliwości przekroju optycznego, co pozwala na obrazowanie tych grubych trójwymiarowych próbek w długich skalach czasowych przy minimalnym wybielaniu zdjęć.W szczególności system jednoobiektywnych arkuszy świetlnych, który zaprezentujemy, jest kompatybilny z tradycyjnymi próbkami montowanymi na suwaku, co czyni go bardzo wszechstronnym narzędziem. Zdecydowana większość prowadnic z pojedynczymi arkuszami świetlnymi obiektywów jest napisana dla użytkowników z dużym doświadczeniem w optyce. Aby ułatwić dostęp do złożonego stylu arkusza świetlnego z pojedynczym obiektywem, ten szczegółowy przewodnik zawiera kroki, które może wykonać użytkownik z głęboką wiedzą na poziomie podstawowym w zakresie optyki.Na początek upewnij się, że układ mikroskopu jest przygotowany na powierzchni stołu optycznego z dokładnie zmierzonymi wszystkimi odległościami. Następnie zamontuj laser wzbudzający na stole. Ustaw dwie przysłony na zamierzoną wysokość lasera i użyj tych przysłon, aby upewnić się, że wiązka jest wypoziomowana i wyśrodkowana.Umieść stolik translacyjny lub stolik TS pod lokalizacją lustra pierwszego lub M1. Użyj pary wirusów ustawionych na dokładną wysokość, aby zdefiniować żądaną ścieżkę wiązki wyjściowej i pokierować rozmieszczeniem i wyrównaniem każdego elementu odblaskowego. Następnie umieść M1 na górze TS. Następnie zamontuj i wyrównaj dichroik nad stołem.Podobnie zamontuj galvo i wyrównaj go z tęczówkami. Po wykonaniu wyrównania ustaw M dwa, a następnie clamp M trzy do stołu. Dostosuj wysokość i położenie, aż belka zostanie z grubsza wyśrodkowana na obu tarczach wyrównujących z matowego szkła.Następnie dodaj podpory do M trzy. Następnie rozpocznij montaż obiektywu na stole. Dostosuj nachylenie i pozycję boczną, aż belka zostanie wyśrodkowana na płytach z matowego szkła powyżej M trzy.Ustaw soczewkę drugą i sprawdź kolimację, używając lustra, aby odbić wiązkę na odległą powierzchnię. Użyj karty indeksowej lub celu, aby prześledzić wiązkę i upewnij się, że belka nie zmienia swojego rozmiaru. Następnie wyreguluj położenie X, Y otworka za pomocą mocowania XY oraz odległość osiową za pomocą stolika jednowymiarowego, aby zmaksymalizować transmisję.Wyreguluj soczewkę cztery osiowo, aby skupić wiązkę wzbudzenia na powierzchni galvo i ułóż soczewkę trzecią na stole, a następnie SL1. Dostosuj odległość osiową SL1, aby utworzyć skolimowany teleskop z soczewką czwartą. Następnie posiadanie TL jeden równolegle do SL1.Dostosuj wysokość pierwszego obiektywu w systemie klatek, aż belka utworzy przewiewny dysk na suficie. A następnie kontynuuj regulację, aż rozmiar dysku zostanie zminimalizowany. Umieść kwadratowe lustro na stoliku próbki pierwszego obiektywu i wyreguluj lustro osiowo, aż rozmiar profilu wiązki zostanie zminimalizowany po dichroiku.Zamontuj laser wyrównujący, wsuwając pręty klatki w puste otwory dwóch płyt klatkowych. Użyj jednego mocowania lusterka kinematycznego i jednego lusterka rozwijanego, aby wyrównać ścieżki belek wyrównujących i wzbudzających. Ustawić kwadratowe lustro osiowo na stoliku próbki pierwszego obiektywu, aby zminimalizować profil wiązki po dichroiku.Włóż SL2 i TL2 do ścieżki emisji w odpowiednich odległościach, wyreguluj pokrętła X, Y w pochyleniu celu drugiego tak, aby czerwona wiązka wyrównująca przechodziła przez tęczówkę i tarczę z matowego szkła. Dostosuj drugi etap translacji, aż wiązka utworzy mały przewiewny krążek na powierzchni, a następnie kontynuuj regulację drugiego etapu translacji, aby zminimalizować rozmiar przewiewnego dysku. Aby zoptymalizować galvo pod kątem skanowania pod kątem pochylenia i wariantów, naciśnij przycisk FSK na generatorze przebiegów, aby wybrać sygnał fali trójkątnej dla galvo i ustawić go na niską częstotliwość, taką jak jeden herc.Obserwuj belkę wyrównującą na tej samej odległej powierzchni lub ścianie. Zamontuj cel trzeci, około czterech do pięciu milimetrów przed celem drugim pod kątem zera stopni i dostosuj wysokość, aby dopasować. Umieść tarczę wyrównującą z matowego szkła we wspólnej płaszczyźnie ogniskowej między SL2 i TL2, mierzoną linijką.Gdy światło emisyjne wypełni tylną aperturę o trzy, zamontuj dysk z matowego szkła w przybliżonym położeniu czujnika aparatu i wyrównaj środek dysku do światła emisyjnego wychodzącego z o trzy. Umieść TL3 za celem trzecim i wyreguluj nachylenie, aby wyrównać wychodzące światło z tarczą z matowego szkła. Umieść kamerę w zmierzonej odległości od soczewki tubusu i ustaw obiektyw trzy osiowo od etapu translacji klatki, aż otwór będzie ostry w aparacie.Ustaw obiektyw trzeci pod kątem 30 stopni od osi optycznej obiektywu drugiego, używając linii na stole jako przewodnika. Ponownie zamontuj dodatni cel testowy siatki na tej samej wysokości osiowej i oświetl siatkę jasnym światłem pola. Przesuń ostrą część pola widzenia w poziomie po ekranie, podczas gdy kwadraty siatki zachowają jednolity rozmiar.Aby wyrównać ukośny arkusz światła, ustaw go cylindrycznie lub CL, tak aby wiązka była skupiona w poziomym profilu arkusza w płaszczyźnie ogniskowej CL3. Włóż i umieść szczelinę w orientacji pionowej w płaszczyźnie ogniskowej między CL3 a obiektywem trzecim. Upewnij się, że na czujniku aparatu arkusz światła o zerowym stopniu jest cienki i pionowy.Korzystając ze zmotoryzowanego sterowania stopniem translacji, przesuń M1 w kierunku cylindrycznych soczewek, aby ustawić kąt arkusza światła. Włóż wstępnie przygotowaną próbkę testową mikrokanalików znakowaną rodaminą na stolik próbki i wyreguluj ją osiowo tak, aby barwnik był oświetlony przez arkusz świetlny na pięciu różnych głębokościach między środkiem pola widzenia a prawą stroną ekranu. Następnie zapisz każdy obraz.Otwórz obrazy w Fidżi. Dla każdego obrazu, za pomocą narzędzia Linia, narysuj poziomą linię od środka pola widzenia do środka arkusza świetlnego. Następnie przejdź do Analizuj, a następnie do Profil wykresu, aby obliczyć kąt arkusza świetlnego powyżej o jeden.Po kalibracji przyrządu zamontuj wstępnie przygotowaną trójwymiarową próbkę koralików i kliknij przycisk FSK na generatorze funkcyjnym, aby ustawić falę trójkątną. Aby znaleźć próbkę, użyj generatora funkcji, aby ustawić parametry, zaczynając od częstotliwości 20 miliherców, 400 miliwoltów od szczytu do amplitudy szczytowej i przesunięcia 0,4. Przewiń w polu Z ręcznie, aż do osiągnięcia płaszczyzny próbkowania, i zoptymalizuj ustawienie Z.W programie micromanager wybierz czas naświetlania i otwórz okno akwizycji wielowymiarowej. Ustaw interwał na 30 i użyj pola liczby, aby wybrać liczbę klatek. Po ustawieniu parametrów nagraj upływ czasu dla jednego pełnego skanowania woluminu.Wolumetryczne skany odtworzonej sieci mikrotubiów wykazały, że trójwymiarowe struktury gęstniały w kierunku centrum, co skutkowało jasnymi obszarami fluorescencji. W płaszczyznach obrazowania w pobliżu szkiełka nakrywkowego, mikroskopia konfokalna rozdzieliła pojedyncze włókna wokół obwodu astoru, z dodatkowym tłem w kierunku środka z powodu nieostrych sygnałów fluorescencyjnych z góry. Jednak przesunięcie o kilka mikronów w Z szybko obniżyło jakość obrazów ze względu na nieostre, gęste sekcje astoru.Podświetlenie arkusza świetlnego w jednej płaszczyźnie wyeliminowało sygnały nieostrości, umożliwiając porównywalną jakość obrazu między płaszczyznami.

design-building-customizable-single-objective-light-sheet

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W wielu sytuacjach biologicznych i klinicznych korzystne jest badanie procesów komórkowych w ich naturalnym mikrośrodowisku. W niniejszym materiale opisujemy montaż i zastosowanie niedrogiego mikroskopu światłowodowego, który umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym w hodowlach komórkowych, badaniach na zwierzętach oraz w badaniach klinicznych z udziałem pacjentów.

Wysokorozdzielcza mikroendoskopia światłowodowa do obrazowania komórkowego in situ

Obrazowanie mikroskopowe żywych komórek śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-actin pozwala na charakterystykę dynamicznych zmian w strukturach cytoszkieletu. W przeciwieństwie do technik wykorzystujących utrwalone preparaty, metoda ta umożliwia szczegółową ocenę zmian czasowych w cytoszkielecie aktynowym w tych samych komórkach przed, w trakcie i po różnych bodźcach fizycznych, farmakologicznych lub zapalnych.

Badanie cytoszkieletu aktynowego w żywych komórkach śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-aktyny

Ten protokół opisuje konfigurację mikroskopu z arkuszem świetlnym i jego implementację do obrazowania in vivo zarodków C. elegans.

Konfiguracja prostego mikroskopu z arkuszami świetlnymi do obrazowania in toto rozwoju C. elegans

Opisano moduł do mikroskopii z oświetleniem jednopłaszczyznowym (SPIM), który można łatwo dostosować do odwróconego mikroskopu szerokokątnego i zoptymalizować pod kątem trójwymiarowych hodowli komórkowych. Próbka znajduje się w prostokątnej kapilarze, a za pomocą układu mikroprzepływowego można w niewielkich ilościach aplikować barwniki fluorescencyjne, środki farmaceutyczne lub leki.

Moduł oświetlenia jednopłaszczyznowego i podejście mikrokapilarne dla mikroskopu szerokokątnego

Przygotowanie funkcjonalizowanych białkiem płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym, określenie ruchliwości białek w ich obrębie i pomiar gęstości białek jest pokazane tutaj. Nakreślono mapę drogową budowy mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia z redukcją szumów, który umożliwia wizualizację pojedynczych dwuwarstwowych fluorochromów o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

Tutaj opisujemy podejście do mikroskopii świetlnej w celu wizualizacji nacieku leukocytów CD45+ w mysim modelu aseptycznego, piorunującego zapalenia mięśnia sercowego, które jest indukowane przez leczenie myszami CD11c.DTR toksyną dyfterytową dotchawiczą.

Ilościowa wizualizacja nacieku leukocytów w mysim modelu piorunującego zapalenia mięśnia sercowego za pomocą mikroskopii świetlnej

Obrazowanie morfogenezy zarodków owadów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opartej na arkuszach świetlnych stało się najnowocześniejszym rozwiązaniem. Protokół ten nakreśla i porównuje trzy techniki montażu odpowiednie dla zarodków Tribolium castaneum, wprowadza dwie nowatorskie, wykonane na zamówienie linie transgeniczne, dobrze nadające się do obrazowania na żywo, omawia podstawowe kontrole jakości i wskazuje obecne ograniczenia eksperymentalne.

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych żywych lub utrwalonych i barwionych zarodków Tribolium castaneum

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji projekcji neuronów ruchowych i arboryzacji aksonów w transgenicznych zarodkach myszy Hb9::GFP. Po barwieniu immunologicznym neuronów ruchowych użyliśmy mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego do obrazowania zarodków do późniejszej analizy ilościowej. Protokół ten ma zastosowanie do innych procesów nawigacji neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym.

Wizualizacja nawigacji aksonów ruchowych i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

To badanie wykorzystuje technikę mikroskopii fluorescencyjnej z dwustronnym oświetleniem (LSFM) w połączeniu z oczyszczaniem optycznym do badania mysiego serca.

Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszem świetlnym do badania mysiego serca

Szczegółowa instrukcja jest opisana, jak zbudować mikroskop HIST (o dużym nachyleniu) i jego zastosowanie do obrazowania pojedynczych molekuł.

Przewodnik po budowie mikroskopu z dużymi nachylonymi płytkami do obrazowania pojedynczych cząsteczek w rozszerzonym polu widzenia

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych jest najcenniejszym narzędziem w biologii rozwoju. Głównym problemem w badaniach porównawczych jest wariancja otoczenia. Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo wielu próbek i dlatego aktywnie rozwiązuje ten problem.

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

Poznaj budowę jednoobiektywowego mikroskopu fluorescencyjnego arkuszowego do wizualizacji sieci cytoszkieletów. Ta metoda umożliwia obrazowanie gęstych próbek 3D z minimalnym fotobleachingiem.

Zaprojektowanie i zbudowanie konfigurowalnego, jednoobiektywowego, arkuszowego mikroskopu fluorescencyjnego do wizualizacji sieci cytoszkieletów (Wideo) | JoVE Journal

Zaprojektowanie i zbudowanie konfigurowalnego, jednoobiektywowego, arkuszowego mikroskopu fluorescencyjnego do wizualizacji sieci cytoszkieletów

Przeglądaj więcej filmów