Zaprojektowanie i zbudowanie konfigurowalnego, jednoobiektywowego, arkuszowego mikroskopu fluorescencyjnego do wizualizacji sieci cytoszkieletów
26 stycznia 2024
Ten protokół opisuje szczegółowo, jak zbudować jednoobiektywowy, światło-arkuszowy mikroskop fluorescencyjny i jego zastosowanie do wizualizacji sieci cytoszkieletów.
Nasze prace mają na celu pogłębienie wiedzy na temat związku między dynamiką pracy trans, strukturą lokalną i właściwościami mechanicznymi w materiałach dalekich od równowagi. Wizualizacja materiałów dalekich od równowagi, takich jak sieci cytoszkieletów, wymaga możliwości obrazowania gęstych trójwymiarowych próbek, z porównywalną jakością obrazu w całej objętości próbki, przy jednoczesnym powodowaniu minimalnych uszkodzeń poprzez wybielanie zdjęć, co jest technicznie trudnym zadaniem, do którego najlepiej nadaje się mikroskopia fluorescencyjna z arkuszami szczelinowymi. Systemy mikroskopów fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi zapewniają doskonałe możliwości przekroju optycznego, co pozwala na obrazowanie tych grubych trójwymiarowych próbek w długich skalach czasowych przy minimalnym wybielaniu zdjęć.
W szczególności system jednoobiektywnych arkuszy świetlnych, który zaprezentujemy, jest kompatybilny z tradycyjnymi próbkami montowanymi na suwaku, co czyni go bardzo wszechstronnym narzędziem. Zdecydowana większość prowadnic z pojedynczymi arkuszami świetlnymi obiektywów jest napisana dla użytkowników z dużym doświadczeniem w optyce. Aby ułatwić dostęp do złożonego stylu arkusza świetlnego z pojedynczym obiektywem, ten szczegółowy przewodnik zawiera kroki, które może wykonać użytkownik z głęboką wiedzą na poziomie podstawowym w zakresie optyki.
Na początek upewnij się, że układ mikroskopu jest przygotowany na powierzchni stołu optycznego z dokładnie zmierzonymi wszystkimi odległościami. Następnie zamontuj laser wzbudzający na stole. Ustaw dwie przysłony na zamierzoną wysokość lasera i użyj tych przysłon, aby upewnić się, że wiązka jest wypoziomowana i wyśrodkowana.
Umieść stolik translacyjny lub stolik TS pod lokalizacją lustra pierwszego lub M1. Użyj pary wirusów ustawionych na dokładną wysokość, aby zdefiniować żądaną ścieżkę wiązki wyjściowej i pokierować rozmieszczeniem i wyrównaniem każdego elementu odblaskowego. Następnie umieść M1 na górze TS. Następnie zamontuj i wyrównaj dichroik nad stołem.
Podobnie zamontuj galvo i wyrównaj go z tęczówkami. Po wykonaniu wyrównania ustaw M dwa, a następnie clamp M trzy do stołu. Dostosuj wysokość i położenie, aż belka zostanie z grubsza wyśrodkowana na obu tarczach wyrównujących z matowego szkła.
Następnie dodaj podpory do M trzy. Następnie rozpocznij montaż obiektywu na stole. Dostosuj nachylenie i pozycję boczną, aż belka zostanie wyśrodkowana na płytach z matowego szkła powyżej M trzy.
Ustaw soczewkę drugą i sprawdź kolimację, używając lustra, aby odbić wiązkę na odległą powierzchnię. Użyj karty indeksowej lub celu, aby prześledzić wiązkę i upewnij się, że belka nie zmienia swojego rozmiaru. Następnie wyreguluj położenie X, Y otworka za pomocą mocowania XY oraz odległość osiową za pomocą stolika jednowymiarowego, aby zmaksymalizować transmisję.
Wyreguluj soczewkę cztery osiowo, aby skupić wiązkę wzbudzenia na powierzchni galvo i ułóż soczewkę trzecią na stole, a następnie SL1. Dostosuj odległość osiową SL1, aby utworzyć skolimowany teleskop z soczewką czwartą. Następnie posiadanie TL jeden równolegle do SL1.
Dostosuj wysokość pierwszego obiektywu w systemie klatek, aż belka utworzy przewiewny dysk na suficie. A następnie kontynuuj regulację, aż rozmiar dysku zostanie zminimalizowany. Umieść kwadratowe lustro na stoliku próbki pierwszego obiektywu i wyreguluj lustro osiowo, aż rozmiar profilu wiązki zostanie zminimalizowany po dichroiku.
Zamontuj laser wyrównujący, wsuwając pręty klatki w puste otwory dwóch płyt klatkowych. Użyj jednego mocowania lusterka kinematycznego i jednego lusterka rozwijanego, aby wyrównać ścieżki belek wyrównujących i wzbudzających. Ustawić kwadratowe lustro osiowo na stoliku próbki pierwszego obiektywu, aby zminimalizować profil wiązki po dichroiku.
Włóż SL2 i TL2 do ścieżki emisji w odpowiednich odległościach, wyreguluj pokrętła X, Y w pochyleniu celu drugiego tak, aby czerwona wiązka wyrównująca przechodziła przez tęczówkę i tarczę z matowego szkła. Dostosuj drugi etap translacji, aż wiązka utworzy mały przewiewny krążek na powierzchni, a następnie kontynuuj regulację drugiego etapu translacji, aby zminimalizować rozmiar przewiewnego dysku. Aby zoptymalizować galvo pod kątem skanowania pod kątem pochylenia i wariantów, naciśnij przycisk FSK na generatorze przebiegów, aby wybrać sygnał fali trójkątnej dla galvo i ustawić go na niską częstotliwość, taką jak jeden herc.
Obserwuj belkę wyrównującą na tej samej odległej powierzchni lub ścianie. Zamontuj cel trzeci, około czterech do pięciu milimetrów przed celem drugim pod kątem zera stopni i dostosuj wysokość, aby dopasować. Umieść tarczę wyrównującą z matowego szkła we wspólnej płaszczyźnie ogniskowej między SL2 i TL2, mierzoną linijką.
Gdy światło emisyjne wypełni tylną aperturę o trzy, zamontuj dysk z matowego szkła w przybliżonym położeniu czujnika aparatu i wyrównaj środek dysku do światła emisyjnego wychodzącego z o trzy. Umieść TL3 za celem trzecim i wyreguluj nachylenie, aby wyrównać wychodzące światło z tarczą z matowego szkła. Umieść kamerę w zmierzonej odległości od soczewki tubusu i ustaw obiektyw trzy osiowo od etapu translacji klatki, aż otwór będzie ostry w aparacie.
Ustaw obiektyw trzeci pod kątem 30 stopni od osi optycznej obiektywu drugiego, używając linii na stole jako przewodnika. Ponownie zamontuj dodatni cel testowy siatki na tej samej wysokości osiowej i oświetl siatkę jasnym światłem pola. Przesuń ostrą część pola widzenia w poziomie po ekranie, podczas gdy kwadraty siatki zachowają jednolity rozmiar.
Aby wyrównać ukośny arkusz światła, ustaw go cylindrycznie lub CL, tak aby wiązka była skupiona w poziomym profilu arkusza w płaszczyźnie ogniskowej CL3. Włóż i umieść szczelinę w orientacji pionowej w płaszczyźnie ogniskowej między CL3 a obiektywem trzecim. Upewnij się, że na czujniku aparatu arkusz światła o zerowym stopniu jest cienki i pionowy.
Korzystając ze zmotoryzowanego sterowania stopniem translacji, przesuń M1 w kierunku cylindrycznych soczewek, aby ustawić kąt arkusza światła. Włóż wstępnie przygotowaną próbkę testową mikrokanalików znakowaną rodaminą na stolik próbki i wyreguluj ją osiowo tak, aby barwnik był oświetlony przez arkusz świetlny na pięciu różnych głębokościach między środkiem pola widzenia a prawą stroną ekranu. Następnie zapisz każdy obraz.
Otwórz obrazy w Fidżi. Dla każdego obrazu, za pomocą narzędzia Linia, narysuj poziomą linię od środka pola widzenia do środka arkusza świetlnego. Następnie przejdź do Analizuj, a następnie do Profil wykresu, aby obliczyć kąt arkusza świetlnego powyżej o jeden.
Po kalibracji przyrządu zamontuj wstępnie przygotowaną trójwymiarową próbkę koralików i kliknij przycisk FSK na generatorze funkcyjnym, aby ustawić falę trójkątną. Aby znaleźć próbkę, użyj generatora funkcji, aby ustawić parametry, zaczynając od częstotliwości 20 miliherców, 400 miliwoltów od szczytu do amplitudy szczytowej i przesunięcia 0,4. Przewiń w polu Z ręcznie, aż do osiągnięcia płaszczyzny próbkowania, i zoptymalizuj ustawienie Z.
W programie micromanager wybierz czas naświetlania i otwórz okno akwizycji wielowymiarowej. Ustaw interwał na 30 i użyj pola liczby, aby wybrać liczbę klatek. Po ustawieniu parametrów nagraj upływ czasu dla jednego pełnego skanowania woluminu.
Wolumetryczne skany odtworzonej sieci mikrotubiów wykazały, że trójwymiarowe struktury gęstniały w kierunku centrum, co skutkowało jasnymi obszarami fluorescencji. W płaszczyznach obrazowania w pobliżu szkiełka nakrywkowego, mikroskopia konfokalna rozdzieliła pojedyncze włókna wokół obwodu astoru, z dodatkowym tłem w kierunku środka z powodu nieostrych sygnałów fluorescencyjnych z góry. Jednak przesunięcie o kilka mikronów w Z szybko obniżyło jakość obrazów ze względu na nieostre, gęste sekcje astoru.
Podświetlenie arkusza świetlnego w jednej płaszczyźnie wyeliminowało sygnały nieostrości, umożliwiając porównywalną jakość obrazu między płaszczyznami.
Przegląd
Celem niniejszego badania jest wzmocnienie zrozumienia dynamiki pracy trans w materiałach daleko od równowagi, ze szczególnym uwzględnieniem sieci cytoszkieletu. Badanie szczegółowo opisuje konstrukcję i zastosowanie mikroskopu fluorescencyjnego z pojedynczym obiektywem do optymalnej wizualizacji tych gęstych trójwymiarowych próbek.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Biologia komórki
- Mikroskopia
- Materiały daleko od równowagi
Tło
- Wyzwania w obrazowaniu gęstych trójwymiarowych biologicznych próbek
- Znaczenie minimalizowania blaknięcia podczas długich sesji obrazowań
- Zalety mikroskopi świetlno-arkuszowej do sekcji optycznej
Stosowane metody
- Konstrukcja mikroskopu fluorescencyjnego z pojedynczym obiektywem
- Wykorzystanie próbek testowych z mikrotubulami oznaczonymi rodaminą
- Procedury wyrównania i kalibracji dla optymalnego obrazu
Główne wyniki
- Skuteczne obrazowanie sieci cytoszkieletu
- Wykazanie minimalnego uszkodzenia próbek podczas obrazu
- Skuteczna wizualizacja na różnych głębokościach w próbce
Wnioski
- Protokół przedstawia wykonalne podejście do obrazowań złożonych struktur biologicznych
- Ta metoda może znacząco pomóc badaczom w badaniu mechanicznie aktywnych materiałów biologicznych
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-resolution visualization of dense, three-dimensional cytoskeleton networks is critical for early discovery and mechanistic de-risking in cell biology-driven drug discovery. The customizable single-objective light-sheet fluorescence microscope (SOLS) enables reproducible, low-photobleaching imaging of complex biological assemblies, supporting predictive confidence in target validation and phenotypic screening. This accessible instrumentation bridges the gap between advanced optical sectioning and practical R&D workflows, enhancing portfolio decision-making at the discovery inflection point.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of cytoskeletal dynamics in reconstituted model systems for hypothesis testing.
- Supports mechanistic de-risking by providing high-fidelity, volumetric imaging of non-equilibrium biological structures.
- Facilitates functional target validation through quantitative, reproducible imaging outputs.
Screening & Assay Development
- Prepares validated 3D biological systems for downstream phenotypic screening workflows.
- Delivers standardized, quantitative optical sectioning data for assay reproducibility.
- Enables reliable evaluation of compound effects on cytoskeletal architecture in dense samples.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant cytoskeletal phenotypes in translational models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling robust, longitudinal imaging studies.
- Reduces risk in advancing candidates by clarifying biological mechanisms in complex systems.
Pipeline & Workflow Integration
The SOLS microscope integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling quantitative imaging of 3D cytoskeleton models, supporting both hypothesis-driven research and scalable assay development.
- Discovery Biology: Provides optical sectioning for hypothesis testing and pathway clarification in dense biological assemblies.
- Screening: Offers reproducible, quantitative imaging outputs suitable for assay standardization and compound screening.
- Analytics: Generates volumetric and time-lapse data for comparative analysis of experimental conditions.
- Translational Research: Connects imaging phenotypes to disease-relevant mechanisms when applied to appropriate models.
- Enterprise Reuse: The modular design supports adaptation across diverse biological systems and research teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cytoskeleton-targeted research.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability in imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, low-artifact data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires foundational optics knowledge and careful alignment of optical components.
- Needs access to standard microscopy instrumentation and analytical software for image processing.
- Demands cross-team standardization for reproducible imaging and data interpretation.
- Adaptable to various model systems with appropriate calibration and sample preparation.
- Practical limitations include alignment complexity and the need for sample compatibility with slide-based mounting.
