Name: Niefrakcjonowana masowa hodowla mięśni szkieletowych myszy w celu podsumowania spoczynku niszy i komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Poznaj niefrakcjonowaną hodowlę mięśni szkieletowych myszy do badania komórek satelitarnych i ich niszy spoczynkowej. Ta metoda umożliwia analizę populacji komórkowych in vitro z zachowaniem naturalnych interakcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dla rysunku 2 użyto szablonów z Servier Medical Art (https://smart.servier.com/). Laboratorium FR jest wspierane przez Association Française contre les Myopathies - AFM za pośrednictwem TRANSLAMUSCLE (granty 19507 i 22946), Fondation pour la Recherche Médicale - FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), Agence Nationale pour la Recherche - ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73) oraz La Ligue Contre le Cancer (IP/SC-17130). Wyżej wymienieni fundatorzy nie odegrali żadnej roli w projektowaniu, gromadzeniu, analizie, interpretacji lub raportowaniu tego badania lub pisaniu tego manuskryptu.

Wszystkie eksperymenty były zgodne z francuskimi i unijnymi przepisami dotyczącymi zwierząt w Institut Mondor de Recherche Biomédicale (INSERM U955), w szczególności z dyrektywą 2010/63/UE. Zwierzęta były utrzymywane w kontrolowanym i wzbogaconym środowisku w zwierzętnikach z numerami certyfikatów A94 028 379 oraz D94-028-028; były one obsługiwane wyłącznie przez uprawnionych badaczy i opiekunów zwierząt, a personel odpowiedzialny za zakwaterowanie zwierząt przeprowadzał regularne inspekcje wzrokowe pod kątem oznak dyskomfortu w trakcie ich życia. Eutanazję przeprowadzono poprzez zwichnięcie karku przed sekcją. W trakcie życia zwierząt nie wykonywano żadnych procedur interwencyjnych, w związku z czym uzyskanie zgody na procedurę od Komitetu Etyki oraz francuskiego Ministerstwa Szkolnictwa Wyższego, Badań i Innowacji nie było konieczne. Rzeczywiście, zgodnie z dyrektywą 2010/63/UE, eutanazja i sekcja pośmiertna nie wymagają zgody komisji etycznej. Wyniki przedstawione w niniejszym manuskrypcie pochodzą z linii typu dzikiego C57BL/6NRj (patrz Tabela materiałów) oraz linii transgenicznej Tg:Pax7-nGFP12 (hodowanej przez nasz zespół). Protokół zastosowano u myszy samców i samic w wieku od 8 do 12 tygodni.
1. Przygotowanie odczynników i sprzętu przed trawieniem
<ol>
	<li>Spryskaj narzędzia do sekcji (nożyczki proste i zakrzywione, pęsety, patrz Tabela materiałów) 70% etanolem i osusz je papierem. Okładkę korkową pokryj folią aluminiową i przygotuj w pobliżu szalki Petriego o średnicy 10 cm (jedna na zwierzę). Przygotuj papier oraz 70% etanol w zasięgu ręki. 
	UWAGA: Po zakończeniu sekcji opłucz narzędzia wodą, następnie spryskaj je 70% etanolem i osusz papierem.</li>
	<li>Ustaw rotacyjną łaźnię wodną na 37 °C i przygotuj mieszaninę do trawienia (20 mL/zwierzę), łącząc DMEM z 1% penicyliną-streptomycyną, 0,5 U/mL kolagenazą, 3 U/mL dispazą (patrz Tabela materiałów) oraz 0,2% BSA w probówce(ach) o pojemności 50 mL.</li>
	<li>Przefiltruj mieszaninę do trawienia przez filtr 0,22 µm w komorze do hodowli komórek. 
	UWAGA: Zaleca się każdorazowe przygotowywanie świeżej mieszaniny do trawienia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie odczynników i sprzętu po trawieniu
<ol>
	<li>Po trawieniu mieszaninę można zamrozić lub poddać hodowli. Do zamrażania należy przygotować roztwór 10% DMSO i 90% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz zestaw krioprotek (1 mL zawiesiny komórkowej na każdą krioprotubkę o pojemności 2 mL). Do hodowli należy przygotować pożywkę hodowlaną (DMEM uzupełniony o 1% pencylyny-streptomycyny, 4 ng/mL bFGF oraz 20% FBS) oraz zestaw płytek 8-dołkowych. Płytki muszą zostać pokryte odpowiednią warstwą przed wysianiem komórek (szczegóły znajdują się w kroku 7.1).</li>
	<li>Do barwienia należy przygotować 4% paraformaldehyd (PFA) w buforze fosforanowym (PBS) (0,15 mL/dołek płytki 8-dołkowej) oraz roztwór blokujący (5% albuminy surowicy bydlęcej [BSA] bez IgG w PBS; 0,15 mL/dołek płytki 8-dołkowej). 
	OSTROŻNIE: Nie wdychać proszku PFA; należy go przygotowywać i obchodzić się z nim pod wyciągiem chemicznym.</li>
</ol>
3. Disekcja
<ol>
	<li>Spryskaj uśpione zwierzę 70% etanolu. Wykonaj dużymi nożyczkami poziome nacięcie (od lewej do prawej strony ciała) na wysokości brzucha, a następnie przetnij skórę wokół talii. Odsuń skórę z kończyn tylnych, aby odsłonić mięśnie (Rysunek 1A).</li>
	<li>Umieść zwierzę na korkowej płytce pokrytej folią aluminiową i przypnij przeciwległą kończynę przednią oraz tylną. Szybko usuń wszystkie mięśnie kończyny tylnej (przednie i tylne) do 10 cm płytki Petriego umieszczonej na lodzie (Rysunek 1B,C). Zachowaj szczególną ostrożność podczas usuwania tkanki tłuszczowej z obszarów wokół mięśnia czworogłowego i mięśni tylnych. Na tym etapie można również usunąć powięź, nerwy i ścięgna, o ile nie wydłuży to całkowitego czasu sekcji. 
	UWAGA: Optymalny czas sekcji obu kończyn tylnych powinien wynosić około 15-20 min. Zaleca się, aby czas sekcji nie przekroczył 30 min.</li>
	<li>Od czasu do czasu dodawaj krople DMEM do mięśni, aby utrzymać ich wilgotność, ale nie w nadmiarze, ponieważ utrudni to rozdrabnianie. Powtórz czynność dla drugiej kończyny tylnej. Gdy wszystkie mięśnie jednego zwierzęcia znajdą się w płytce Petriego (Rysunek 1D), siekaj je drobno nożyczkami przez 7-10 min, aż do uzyskania gładkiego homogenatu (Rysunek 1E). 
	UWAGA: W niniejszym protokole zastosowano DMEM uzupełniony o L-glutaminę, pirowinian oraz 4,5 g/L D-glukozy.</li>
</ol>
<img alt="Zdjęcia z sekcji przedstawiające ekstrakcję i przetwarzanie tkanek do analizy biologicznej; obejmuje próbki na lodzie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65433/65433fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przygotowanie mięśni przed hodowlą. (A) Usunięcie skóry w celu odsłonięcia mięśni kończyny tylnej, zgodnie z opisem w kroku 3.1. (B,C) Pobranie wszystkich mięśni kończyny tylnej (B) wokół oraz (C) pomiędzy kości, zgodnie z opisem w kroku 3.2. (D) Pobrane mięśnie umieszczono w szalce Petriego o średnicy 10 cm na lodzie z kroplami DMEM w celu utrzymania ich wilgotności, zgodnie z opisem w kroku 3.3. (E) Mięśnie są drobno siekane nożyczkami aż do uzyskania gładkiej papki o konsystencji przedstawionej na zdjęciu. (F) Obraz osadu po końcowym wirowaniu; niebieska strzałka wskazuje osad znajdujący się przy ściance probówki, pod przerywaną niebieską linią. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65433/65433fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
4. Trawienie
UWAGA: Pod koniec procesu trawienia do sekcji 5 będą potrzebne: wirówka ustawiona na 4 °C, wiadro z lodem, trzy sitka do komórek (100 um, 70 um, 40 um) oraz trzy probówki 50 mL (na zwierzę).
<ol>
	<li>Przygotować i przefiltrować mieszaninę trawienną zgodnie z opisem w kroku 1.2. Mieszaninę przechowywać w lodzie.</li>
	<li>Po posiekaniu wszystkich mięśni, umieścić homogenat w probówce o pojemności 50 mL z 20 mL mieszaniny trawiennej. Brzegi zakrętki owinąć folią elastyczną, aby zapobiec wyciekom, a następnie umieścić probówkę w wytrząsanej kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przy niskiej lub średniej prędkości (50 rpm).</li>
	<li>Po 1 h w temperaturze 37 °C otworzyć zakrętkę i wymieszać zawartość, delikatnie pipetując siedem razy w górę i w dół za pomocą pipety 10 mL, aby uzyskać jednorodną mieszaninę. Ponownie owinąć zakrętkę folią i umieścić probówkę z powrotem w wytrząsanej kąpieli wodnej. Po kolejnej 1 h wyjąć probówkę i wyłączyć kąpiel wodną. 
	UWAGA: W przypadku hodowli wykorzystać ten czas inkubacji na pokrycie płytek zgodnie z opisem w kroku 7.1 przed przejściem do sekcji 5.</li>
</ol>
5. Filtracja
<ol>
	<li>Napełnić probówkę do trawienia zimnym DMEM (uzupełnionym o 1% penicyliny-streptomycyny) do poziomu 50 mL. Wymieszać, odwracając probówkę trzy razy. Przechowywać DMEM w wiadrze z lodem do kolejnych etapów.</li>
	<li>Umieścić sitko komórkowe 100 µm na nowej probówce 50 mL. Przesiać trawioną mieszaninę przez sitko do nowej probówki. Odwirować przy 600 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Odlać nadsącz do pojemnika na odpady płynne.</li>
	<li>Resuspendować osad w 1 mL zimnego DMEM (uzupełnionego o 1% penicyliny-streptomycyny). Dopełnić probówkę do 50 mL tym samym DMEM. UWAGA: Jeśli pominiemy wirowanie, kolejny osad będzie trudniejszy do zidentyfikowania i utrzymania.</li>
	<li>Umieścić sitko komórkowe 70 µm na nowej probówce 50 mL. Przesiać odwirowaną/resuspendowaną mieszaninę przez sitko do nowej probówki. Odwirować przy 80 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Ten krok nie jest obowiązkowy, ale jest zalecany w celu usunięcia szczątków komórkowych.</li>
	<li>Umieścić sitko komórkowe 40 µm na nowej probówce 50 mL. Przesiać nadsącz przez sitko do nowej probówki. Odwirować przy 600 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C, odlać nadsącz do pojemnika na odpady płynne i resuspendować osad w FBS pod dygestorium. Na tym etapie osad jest bardzo mały (Rycina 1F). 
	UWAGA: Filtrowanie przez sitko 40 µm usuwa zanieczyszczenia, które mogłyby generować nieswoisty sygnał podczas późniejszego barwienia kultur.</li>
</ol>
6. (Opcjonalnie) Mrożenie
UWAGA: Sekcja 6 jest opcjonalna. Protokół można przerwać po filtracji, jednak może to zmniejszyć przeżywalność komórek i sukces hodowli.
<ol>
	<li>Dodać DMSO, aby uzyskać stosunek 10% DMSO:90% FBS, a następnie przenieść do kryoprobówek (1 mL resuspenderowanego osadu na każdą probówkę o pojemności 2 mL).</li>
	<li>Umieścić kryoprobówkę w temperaturze −80 °C w pudełku polistyrenowym na noc. Następnego dnia przenieść do temperatury −150 °C w celu długoterminowego przechowywania. 
	UWAGA: Możliwe jest również krótkoterminowe przechowywanie w temperaturze −80 °C.</li>
	<li>Przy rozpoczynaniu hodowli szybko rozmrozić kryoprobówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż zawiesina komórkowa zostanie całkowicie rozmrożona. W dygestorium wymieszać z 4 mL DMEM. Wirować przy 600 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Odpipetować supernatant i kontynuować zgodnie z opisem w kroku 7.2.</li>
</ol>
7. Hodowla
UWAGA: Można oczekiwać, że zamrożone lub świeże zawiesiny komórkowe wypełnią 24–32 studzienki w trzech lub czterech płytkach 8-dołkowych.
<ol>
	<li>Pokryj płytki 8-dołkowe roztworem do powlekania, który należy rozmrozić w temperaturze 4 °C lub na lodzie (roztwór zapasowy do powlekania jest zazwyczaj przechowywany w temperaturze −20 °C). Dodaj 0,4 mL roztworu do jednego dołka, a następnie przenoś go pipetą z dołka do dołka. Po przeniesieniu roztworu do wszystkich dołków można go zebrać i ponownie zamrozić do przyszłych hodowli. Inkubuj powlekane płytki w temperaturze 37 °C przez 30 min przed wysianiem komórek.</li>
	<li>Dodaj DMEM (uzupełniony o 1% penicyliny-streptomycyny) z dodatkiem 4 ng/mL bFGF (patrz Tabela materiałów) do zawiesiny komórek w FBS, aby uzyskać stosunek 20% FBS:80% DMEM. 
	UWAGA: Chociaż dodatek bFGF może być korzystny w pierwotnych hodowlach mioblastów i przy produkcji komórek podobnych do satelitarnych w hodowlach masowych, jego dodatek jest opcjonalny, ponieważ pominięcie go w hodowlach masowych trwających ok. 7 dni nie wpływa znacząco na wydajność komórkową.</li>
	<li>Wysiej 0,4 mL zawiesiny (z kroku 7.2) na dołek w powlekanych płytkach 8-dołkowych. 
	UWAGA: Oblicz 30 cm2 hodowli na jedno zwierzę dla preparatów mrożonych i świeżych.</li>
	<li>Inkubuj hodowle w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez maksymalnie 10 dni, wymieniając medium codziennie, gdy hodowla zacznie zmieniać kolor na żółtawy (zazwyczaj po 5-7 dniach). 
	UWAGA: Aby zmierzyć ilość komórek w fazie S cyklu komórkowego13, dodaj 10 µM EdU na 2 h przed utrwaleniem. Aby uchwycić pierwszą fazę S, dodaj 10 µM EdU podczas wysiewania i utrwal po 40 h hodowli.</li>
</ol>
8. Fixacja
UWAGA: Etapy 8-10 należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
<ol>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną i utrwalić komórki za pomocą 4% PFA (0,15 mL/studzienkę). 
	OSTRZEŻENIE: PFA należy dodawać pod wyciągiem chemicznym. 
	UWAGA: Jeśli wszystkie studzienki są utrwalane w tym samym czasie, inkubować z PFA w temperaturze pokojowej przez 10 min. Jeśli studzienki są utrwalane w różnych punktach czasowych, dodać PFA do studzienek przeznaczonych do utrwalenia i przechowywać płytkę w inkubatorze w 37 °C przez 5 min.</li>
	<li>Odessać PFA i dodać PBS na 10 s (0,15 mL/studzienkę). Odessać PBS i dodać świeży PBS na 5 min (0,15 mL/studzienkę). 
	UWAGA: Jeśli wszystkie studzienki są utrwalane w tym samym czasie, inkubować z PBS w temperaturze pokojowej. Jeśli studzienki są utrwalane w różnych punktach czasowych, dodać PBS do utrwalonych studzienek i przechowywać płytkę w inkubatorze w 37 °C przez 5 min. Następnie dodać 0,4 mL PBS i przechowywać płytkę w inkubatorze do 1 tygodnia.</li>
</ol>
9. Permeabilizacja i blokowanie
<ol>
	<li>Przed przystąpieniem do barwienia odessać PBS i przeprowadzić permeabilizację przy użyciu 0,5% TritonX 100 w PBS (0,15 mL/dołek) przez 8 min. Odessać TritonX 100, wypłukać PBS przez 10 s (0,15 mL/dołek), odessać PBS i przemyć PBS przez 5 min (0,15 mL/dołek).</li>
	<li>Zablokować próbki, stosując 5% BSA bez IgG w PBS przez 30-60 min (0,15 mL/dołek).</li>
</ol>
10. Barwienie
<ol>
	<li>Odssać BSA i dodać mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w PBS (0,15 mL/dołek) (patrz Tabela materiałów; rozcieńczenia: anti-CD31 1:100, anti-FOSB 1:200, anti-GFP 1:1,000, anti-KI67 1:1,000, anti-MyHC 1:400, anti-MYOD 1:200, anti-MYOG 1:150, anti-PAX7 1:100, anti-PDGFRa 1:50) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Po inkubacji z przeciwciałami zebrać mieszaninę przeciwciał, dodać azydek sodu i przechowywać w temperaturze 4 °C lub −20 °C (zgodnie z instrukcjami producenta przeciwciał) do ponownego użycia.</li>
	<li>Odssać mieszaninę przeciwciał, wypłukać PBS przez 10 s (0,15 mL/dołek), odessać PBS i przemyć PBS przez 5 min (0,15 mL/dołek).</li>
	<li>Odssać PBS użyty do mycia, dodać mieszaninę przeciwciał wtórnych (kozie anty-mysie Alexa Fluor 488, kozie anty-królicze Alexa Fluor 555, kozie anty-szczurze Alexa Fluor 647, kozie anty-mysie Alexa Fluor 555, kozie anty-kurze Alexa Fluor 488, wszystkie stosowane w rozcieńczeniach od 1:500 do 1,000) oraz marker jąder komórkowych (np. DAPI) rozcieńczone w PBS (0,15 mL/dołek) (patrz Tabela materiałów) i inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Odssać mieszaninę przeciwciał wtórnych, wypłukać PBS przez 10 s (0,15 mL/dołek), odessać PBS, przemyć PBS przez 5 min (0,15 mL/dołek), odessać PBS i zamontować preparat. 
	UWAGA: W przypadku użycia płytek 8-dołkowych z wyjmowanymi separatorami, należy usunąć separatory przed montowaniem.</li>
</ol>

Harvesting Mouse Skeletal Muscle to Culture Stem Cells and Their Niche

<ol><li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle%3A+A+brief+review+of+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle: A brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li>
<li>Forcina, L., Cosentino, M., Musarò, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+regulating+muscle+regeneration%3A+Insights+into+the+interrelated+and+time-dependent+phases+of+tissue+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mechanisms regulating muscle regeneration: Insights into the interrelated and time-dependent phases of tissue healing.</a> Cells. 9 (5), 1297(2020).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).</li>
<li>Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+absolute+requirement+for+Pax7-positive+satellite+cells+in+acute+injury-induced+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).</li>
<li>McCarthy, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+fiber+hypertrophy+in+satellite+cell-depleted+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Effective fiber hypertrophy in satellite cell-depleted skeletal muscle.</a> Development. 138 (17), 3657-3666 (2011).</li>
<li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).</li>
<li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7-expressing+satellite+cells+are+indispensable+for+adult+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).</li>
<li>Hicks, M. R., Pyle, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The emergence of the stem cell niche.</a> Trends in Cell Biology. 33 (22), 112-123 (2022).</li>
<li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692(2021).</li>
<li>Gama, J. F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+regulatory+T+cells+in+skeletal+muscle+regeneration%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Role of regulatory T cells in skeletal muscle regeneration: A systematic review.</a> Biomolecules. 12 (6), 817(2022).</li>
<li>Loreti, M., Sacco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+jam+session+between+muscle+stem+cells+and+the+extracellular+matrix+in+the+tissue+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">The jam session between muscle stem cells and the extracellular matrix in the tissue microenvironment.</a> NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 16(2022).</li>
<li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+regulatory+cascades+govern+extraocular+and+pharyngeal+arch+muscle+progenitor+cell+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct regulatory cascades govern extraocular and pharyngeal arch muscle progenitor cell fates.</a> Developmental Cell. 16 (6), 810-821 (2009).</li>
<li>Pereira, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cell+cycle+kinetics+by+EdU+%285-ethynyl-2%27-deoxyuridine%29-coupled-fluorescence-intensity+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis.</a> Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).</li>
<li>Bismuth, K., Relaix, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+skeletal+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of skeletal muscle development.</a> Experimental Cell Research. 316 (18), 3081-3086 (2010).</li>
<li>Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+and+the+muscle+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Satellite cells and the muscle stem cell niche.</a> Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).</li>
<li>Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+functions+of+platelet%2Fendothelial+cell+adhesion+molecule-1+%28CD31%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31).</a> Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).</li>
<li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ki-67+protein%3A+From+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Ki-67 protein: From the known and the unknown.</a> Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).</li>
<li>Abou-Khalil, R., Le Grand, F., Chazaud, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+murine+skeletal+muscle+reserve+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Niche%22%5BJournal%5D)">Human and murine skeletal muscle reserve cells.</a> Stem Cell Niche. 1035, 165-177 (2013).</li>
<li>Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+muscle+stem+cells+by+fluorescence+activated+cell+sorting+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2011).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Montarras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).</li>
<li>Qu, Y., Edwards, K., Barrow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+use+of+primary+murine+myoblasts+in+small-molecule+screens%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and use of primary murine myoblasts in small-molecule screens.</a> STAR Protocols. 4 (2), 102149(2023).</li>
<li>Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+satellite+cells%3A+Background+and+methods+for+isolation+and+analysis+in+a+primary+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle satellite cells: Background and methods for isolation and analysis in a primary culture system.</a> Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2011).</li>
<li>Saclier, M., Theret, M., Mounier, R., Chazaud, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+macrophage+conditioned-medium+on+murine+and+human+muscle+cells%3A+analysis+of+proliferation%2C+differentiation%2C+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of macrophage conditioned-medium on murine and human muscle cells: analysis of proliferation, differentiation, and fusion.</a> Methods in Molecular Biology. 1556, 317-327 (2017).</li>
<li>Giordani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+single-cell+cartography+reveals+novel+skeletal+muscle-resident+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations.</a> Molecular Cell. 74 (3), 609-621 (2019).</li>
<li>Tabula Muris Consortium et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li>
<li>Brunetti, J., Koenig, S., Monnier, A., Frieden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopattern+surface+improves+cultured+human+myotube+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Nanopattern surface improves cultured human myotube maturation.</a> Skeletal Muscle. 11 (1), 12(2021).</li>
<li>Denes, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+C2C12+myotubes+on+micromolded+gelatin+hydrogels+accelerates+myotube+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation.</a> Skeletal Muscle. 9 (1), 17(2019).</li>
<li>LaFramboise, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+muscle+origin+and+phenotype+on+satellite+cell+muscle-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Effect of muscle origin and phenotype on satellite cell muscle-specific gene expression.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (10), 1307-1318 (2003).</li>
<li>Azhar, M., Wardhani, B. W. K., Renesteen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regenerative+potential+of+Pax3%2FPax7+on+skeletal+muscle+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Generic+Engineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The regenerative potential of Pax3/Pax7 on skeletal muscle injury.</a> Journal of Generic Engineering and Biotechnology. 20 (1), 143(2022).</li>
<li>Hardy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+injury+models+for+studying+muscle+regeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative study of injury models for studying muscle regeneration in mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0147198(2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Funkcjonowanie mięśni szkieletowych u dorosłych osób opiera się na precyzyjnie zaaranżowanym zestawie interakcji komórkowych i sygnałów molekularnych. W tym miejscu przedstawiono metodę, która pozwala na badanie tych parametrów w warunkach ex vivo , które bardzo przypominają fizjologiczne mikrośrodowisko.
Kilka grup opisało metody in vitro do hodowli komórek miogennych. Metody te miały na celu wyizolowanie komórek satelitarnych w celu zbadania ich miogennych właściwości proge...

Ruch, oddychanie, metabolizm, postawa ciała i utrzymanie temperatury ciała zależą od mięśni szkieletowych, a nieprawidłowe działanie mięśni szkieletowych może powodować wyniszczające patologie (np. miopacie, dystrofie mięśniowe, itp.)1. Ze względu na swoje podstawowe funkcje i obfitość, mięśnie szkieletowe przyciągnęły uwagę laboratoriów badawczych na całym świecie, które starają się zrozumieć kluczowe aspekty, które wspierają prawidłowe funkcjonowanie mięśni i mogą służyć jako cele terapeutyczne. Ponadto mięśnie szkieletowe są szeroko stosowanym modelem do badania regeneracji i funkcji komórek macierzystych, ponieważ zdrowe mięśnie mogą w pełni samonaprawiać się po całkowitym urazie i zwyrodnieniu, głównie dzięki rezydującym komórkom macierzystym2; Są one również nazywane komórkami satelitarnymi i są zlokalizowane pod blaszką podstawną na obrzeżach włókien mięśniowych3.
Podstawowymi komórkami dorosłego mięśnia szkieletowego są włókna mięśniowe (długie syncytialne komórki wielojądrzaste) i komórki satelitarne (komórki macierzyste o potencjale miogennym, które pozostają w stanie spoczynku, dopóki uraz ich nie aktywuje). Te ostatnie komórki są centralnymi komórkami regeneracji mięśni, a proces ten nie może zachodzić pod ich nieobecność4,5,6,7. W ich bezpośrednim mikrośrodowisku istnieje wiele typów komórek i czynników molekularnych, które wysyłają im sygnały. Ta nisza jest stopniowo ustanawiana przez cały okres rozwoju i aż do dorosłości8. Dorosły mięsień zawiera wiele typów komórek (komórki śródbłonka, perycyty, makrofagi, fibro-adipogenne komórki progenitorowe-FAP, regulatorowe limfocyty T itp.)9,10 i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej (lamininy, kolageny, fibronektyna, fibryliny, periostyna itp.)11, które oddziałują ze sobą i z komórkami satelitarnymi w kontekście zdrowia, choroby i regeneracji.
Zachowanie tej skomplikowanej niszy w warunkach eksperymentalnych jest fundamentalne, ale trudne. Równie trudne jest utrzymanie lub powrót do stanu spoczynku, stanu komórki, który jest krytyczny dla komórek satelitarnych9. Aby częściowo poradzić sobie z tymi wyzwaniami, wprowadzono kilka metod, z których każda ma swoje zalety i wady (szczegółowo opisane w części poświęconej dyskusji). W tym miejscu przedstawiono metodę, która może częściowo pokonać te dwie bariery. Mięśnie są początkowo zbierane, a następnie rozkładane mechanicznie i enzymatycznie, zanim heterogeniczna mieszanina komórek zostanie wprowadzona do hodowli. W trakcie hodowli wykrywa się wiele typów komórek niszy i obserwuje się komórki satelitarne, które powróciły do stanu spoczynku. Jako ostatni etap protokołu przedstawiono etapy immunofluorescencji, które pozwalają na wykrycie każdego typu komórek za pomocą powszechnie akceptowanych markerów.

<table><tbody><tr><td>anty-CD31</td><td>BD</td><td>550274</td><td>rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>anty-FOSB</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7203</td><td>rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>anty-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>anty-Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td>rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>anty-MyHC</td><td>DSHB</td><td>MF20-c</td><td>rozcieńczenie 1:400</td></tr><tr><td>anty-MYOD</td><td>Aktywny motyw</td><td>39991</td><td>rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>anty-MYOG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-576</td><td>rozcieńczenie 1:150</td></tr><tr><td>anty-Pax7</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-81648</td><td>rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>anty-PDGFR&alfa;</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-16571</td><td>rozcieńczenie 1:50</td></tr><tr><td>b-FGF</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td>stężenie 4 ng/ml</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA) &ndash; stosowana do trawienia&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906-1006</td><td>stężenie 0,2%</td></tr> <tr><td>BSA Bez IgG, bez proteaz &ndash; używany do barwienia</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td>stężenie 5%</td></tr><tr><td>Sitko do komórek 40 um</td><td>Dominique Dutscher</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek 70 um</td><td>Dominique Dutscher</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek 100 um</td><td>Dominique Dutscher</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td>stężenie 0,5 U/ml</td></tr><tr><td>Płytka hodowlana</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.802</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Euromedex</td><td>UD8050-05-A</td><td></td></tr><tr><td>Stężenie 4942078001 Dyspazy</td><td>Roche</td><td></td><td>3 U/ml</td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne rozmiar 5</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne rozmiar 55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do preparowania (duże, proste)</td><td>Fine Science Tools</td><td>9146-11</td><td>idealne do siekania</td></tr><tr><td>Nożyczki do rozwarstwiania (małe, zakrzywione)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15017-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do preparowania (małe, proste)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Dulbecco Eagle's Medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw EdU Click-iT</td><td>ThermoFisher</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca dla płodu &ndash; opcja 1</td><td>Eurobio</td><td>CVF00-01</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca dla płodu &ndash; opcja 2</td><td>Gibco</td><td>10270-106&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning Life Sciences</td><td>354234</td><td>roztwór do powlekania</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Dominique Dutscher</td><td>090261</td><td>elastyczna folia</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd &ndash; opcja 1</td><td>PanReac AppliChem ITW Odczynniki</td><td>211511.1209</td><td>stężenie 4%</td></tr><tr><td>Paraformaldeyde &ndash; opcja 2</td><td>ThermoFisher</td><td>28908</td><td>stężenie 4%</td></tr><tr><td>Penicylina streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna z wytrząsaniem</td><td>ThermoFisher</td><td>TSSWB27</td><td></td></tr><tr><td>TritonX100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8532-500 ML</td><td>stężenie 0,5%</td></tr> <tr><td>Myszy typu dzikiego</td><td>Janvier</td><td>C57BL/6NRj</td><td></td></tr></tbody></table>

niefrakcjonowana masowa hodowla mięśni szkieletowych myszy w celu podsumowania spoczynku niszy i komórek macierzystych

Unfractionated Bulk Culture of Mouse Skeletal Muscle to Recapitulate Niche and Stem Cell Quiescence

Mięśnie szkieletowe to największa tkanka ciała i spełnia wiele funkcji, od lokomocji po kontrolę temperatury ciała. Jego funkcjonalność i rekonwalescencja po urazach zależą od wielu typów komórek oraz od sygnałów molekularnych między rdzennymi komórkami mięśniowymi (włóknami mięśniowymi, komórkami macierzystymi mięśni) a ich niszą. Większość warunków eksperymentalnych nie zachowuje tego złożonego fizjologicznego mikrośrodowiska, ani też nie pozwala na badanie ex vivo komórek macierzystych mięśni w stanie spoczynku, który jest dla nich kluczowy. W tym miejscu przedstawiono protokół hodowli ex vivo komórek macierzystych mięśni ze składnikami komórkowymi ich niszy. Poprzez mechaniczny i enzymatyczny rozkład mięśni uzyskuje się mieszaninę typów komórek, którą umieszcza się w hodowli 2D. Barwienie immunologiczne pokazuje, że w ciągu 1 tygodnia w hodowli pojawia się wiele komórek niszowych wraz z włóknami mięśniowymi i, co ważne, komórkami Pax7-dodatnimi, które wykazują cechy komórek macierzystych mięśni w stanie spoczynku. Te unikalne właściwości sprawiają, że protokół ten jest potężnym narzędziem do amplifikacji komórek i generowania komórek macierzystych przypominających stan spoczynku, które można wykorzystać do rozwiązywania podstawowych i translacyjnych pytań.

Niniejszy protokół umożliwia hodowlę komórek mięśniowych przy jednoczesnym zachowaniu komórek satelitarnych i większości komórek w ich endogennej niszy. Rysunek 2 przedstawia podsumowanie głównych etapów protokołu, natomiast kluczowe części sekcji i trawienia zaprezentowano na Rysunku 1. Zaleca się sekcję mięśni kończyny tylnej (Rysunek 1A-C), ponieważ grupa ta jest dobrze przebadana i wykazuje wspó...

Mięśnie szkieletowe składają się z wielu typów komórek, w tym rezydentnych komórek macierzystych, z których każda ma szczególny wkład w homeostazę i regenerację mięśni. W tym miejscu opisano hodowlę 2D komórek macierzystych mięśni i niszy komórek mięśniowych w warunkach ex vivo, które zachowują wiele cech fizjologicznych, in vivo i środowiskowych.

Niefrakcjonowana masowa hodowla mięśni szkieletowych myszy w celu podsumowania spoczynku niszy i komórek macierzystych

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and ...

Nasze badania polegają na badaniu zdrowych i chorych mięśni szkieletowych ze szczególnym uwzględnieniem komórek satelitarnych. Jednym z podstawowych aspektów, które badamy, jest identyfikacja wzmacniaczy transkrypcji, które koordynują ekspresję genów specyficznych dla komórki. Protokół ten pozwala nam na przeprowadzanie szybkich testów w celu określenia swoistości.W dziedzinie badań nad mięśniami szkieletowymi podejścia sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki i pojedynczego jądra są często stosowane do badania różnych populacji komórek w homeostazie, regeneracji i chorobie. Ponadto komórki satelitarne można izolować za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją lub FACS i hodować w celu testowania hipotez i walidacji wyników sekwencjonowania. Badanie komórek satelitarnych in vitro stanowi poważne wyzwanie.Ostatnie badania podkreśliły rolę komórek satelitarnych w niszy w jego fizjologii. Chociaż hodowla izolowanych komórek satelitarnych FACS jest powszechna, replikacja komórek satelitarnych w niszy in vitro nie została jeszcze osiągnięta. Nasz protokół zapewnia skuteczny i praktyczny sposób hodowli całej tkanki mięśniowej, w tym komórek niemiogennych, takich jak komórki śródbłonka i włókniste edoprogenetyczne komórki progenitorowe.Wykazaliśmy, że komórki przypominające stan spoczynku pojawiają się w ciągu tygodnia hodowli. Protokół ten może być również wykorzystany do zbadania wpływu, jaki inne komórki mają na przywrócenie tej spokojnej puli.

unfractionated-bulk-culture-mouse-skeletal-muscle-to-recapitulate

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Izolacja i hodowla włókien mięśniowych to złoty standard systemu in vitro do badania przejścia komórek satelitarnych przez spoczynek, aktywację i różnicowanie.  Co ważne, system hodowli pojedynczych włókien mięśniowych zachowuje asocjację miofiber/komórki macierzyste, która jest niezbędnym składnikiem niszy komórek macierzystych mięśni.

Izolacja i hodowla poszczególnych włókien mięśniowych i ich komórek satelitarnych z dorosłych mięśni szkieletowych

Izolacja i hodowla czystej populacji spokojnych komórek satelitarnych, populacji komórek macierzystych mięśni, jest niezbędna do zrozumienia biologii i regeneracji komórek macierzystych mięśni, a także przeszczepu komórek macierzystych do terapii dystrofii mięśniowej i innych chorób zwyrodnieniowych.

Izolacja, hodowla i przeszczep satelitarnych komórek mięśniowych

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Mioblasty to proliferujące komórki prekursorowe, które różnicują się, tworząc wielojądrowe miotuby, a w końcu mięśnie szkieletowe mięśni szkieletowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół skutecznej izolacji i hodowli pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych młodych dorosłych myszy. Metoda umożliwia badania molekularne, genetyczne i metaboliczne komórek mięśniowych w hodowli.

Izolacja i różnicowanie pierwotnych mioblastów z eksplantatów mięśni szkieletowych myszy

Tutaj proponujemy metodę efektywnego pozyskiwania pojedynczych włókien mięśniowych we wczesnych stadiach rozwoju pourodzeniowego z homozygotycznego zmutowanego modelu myszy Lamin Δ8-11, bardzo ciężkiego modelu dystrofii mięśniowej Emery'ego-Dreifussa (EDMD).

Izolacja i hodowla pojedynczych włókien mięśniowych z mysiego modelu dystrofii mięśniowej Embergla-Dreifussa we wczesnym rozwoju poporodowym

W tym protokole opisana jest metoda hodowli in vitro i analizy funkcjonalnej komórek macierzystych mięśni, która zachowuje większość ich interakcji z ich endogenną niszą.

Test pojedynczej hodowli włókien mięśniowych do oceny funkcjonalności dorosłych komórek macierzystych mięśni ex vivo

Precyzyjna identyfikacja fibro-adipogennych komórek progenitorowych (FAP) i komórek macierzystych mięśni (MuSCs) jest kluczowa dla badania ich funkcji biologicznej w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Protokół ten zawiera wytyczne dotyczące izolacji, oczyszczania i hodowli FAP i MuSC z mięśni dorosłych myszy.

FACS-Izolacja i hodowla włóknisto-adipogennych progenitorów i mięśniowych komórek macierzystych z niezakłóconych i uszkodzonych mięśni szkieletowych myszy

Ten protokół opisuje izolację komórek macierzystych mięśni i fibro-adipogennych komórek progenitorowych z indywidualnych mięśni szkieletowych u myszy. Protokół obejmuje rozwarstwienie pojedynczego mięśnia, izolację komórek macierzystych przez sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją, ocenę czystości za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego oraz ilościowy pomiar wejścia w fazę S za pomocą testu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny.

Izolacja spoczynkowych populacji komórek macierzystych od poszczególnych mięśni szkieletowych

Niniejszy protokół opisuje opłacalną metodę oczyszczania, namnażania i charakteryzowania wysoce jednorodnych mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego (BMSC) od myszy. Takie podejście ułatwia pozyskiwanie dużych ilości BMSC o wysokim potencjale proliferacji i różnicowania, wspierając modele mysie i posuwając naprzód badania przedkliniczne.

Oczyszczanie, ekspansja i fenotypowanie oparte na cytometrii przepływowej mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego pochodzenia mysiego

Protokół ten zapewnia ustandaryzowaną metodę izolowania i wzbogacania pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i noworodków myszy poprzez dysocjację tkanek, filtrację sekwencyjną, wstępne nakładanie oraz określone warunki hodowlane, umożliwiając tworzenie i utrzymanie hodowli mioblastów pochodzących z komórek satelitarnych do dalszych zastosowań eksperymentalnych.

Izolacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych do badań in vitro miogenezy

Poznaj niefrakcjonowaną hodowlę mięśni szkieletowych myszy do badania komórek satelitarnych i ich niszy spoczynkowej. Ta metoda umożliwia analizę populacji komórkowych in vitro z zachowaniem naturalnych interakcji.

Niefrakcjonowana masowa hodowla mięśni szkieletowych myszy w celu podsumowania spoczynku niszy i komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów