Name: Ulepszona metoda izolowania mitochondrialnych miejsc kontaktowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Poznaj ulepszoną metodę izolacji mitochondrialnych miejsc kontaktowych w drożdżach. Technika ta pozwala badać rolę kompleksu MICOS i białka CQD1 w architekturze błon mitochondrialnych oraz biogenezie mitochondriów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.E.H. dziękuje Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), projekt numer 413985647, za wsparcie finansowe. Autorzy dziękują dr. Michaelowi Kieblerowi z Uniwersytetu Ludwika i Maksymiliana w Monachium za hojne i szerokie wsparcie. Jesteśmy wdzięczni Walterowi Neupertowi za jego wkład naukowy, pomocne dyskusje i nieustającą inspirację. J.F. dziękuje Graduate School Life Science Munich (LSM) za wsparcie.

1. Bufory i roztwory zapasowe
<ol>
	<li>Przygotować 1 M roztwór kwasu 3-morfolinopropano-1-sulfonowego (MOPS) w wodzie dejonizowanej, pH 7,4. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 500 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) w wodzie dejonizowanej, pH 8,0. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 2,4 M roztwór sorbitolu w wodzie dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze pokojowej po autoklawowaniu.</li>
	<li>Przygotować 2,5 M roztwór sacharozy w wodzie dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze pokojowej po autoklawowaniu.</li>
	<li>Przygotować 200 mM fluorek fenylometylosulfonylowy (PMSF) w izopropanolu. Przechowywać w temperaturze −20 °C. 
	OSTRZEŻENIE: PMSF jest toksyczny w przypadku połknięcia oraz powoduje ciężkie oparzenia skóry i uszkodzenia oczu. Nie wdychać pyłu, używać rękawic ochronnych i okularów ochronnych.</li>
	<li>Przygotować 72% kwas trójchlorooctowy (TCA) w wodzie dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze 4 °C. 
	OSTRZEŻENIE: TCA może powodować podrażnienie dróg oddechowych, ciężkie oparzenia skóry i uszkodzenia oczu. Nie wdychać pyłu, używać rękawic ochronnych i okularów ochronnych.</li>
	<li>Przygotować bufor SM: 20 mM MOPS i 0,6 M sorbitol, pH 7,4.</li>
	<li>Przygotować bufor do pęcznienia (swelling buffer): 20 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF oraz koktajl inhibitorów proteaz, pH 7,4.</li>
	<li>Przygotować bufory do gradientu sacharozy: 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M oraz 1,3 M sacharozy w 20 mM MOPS i 0,5 mM EDTA, pH 7,4. 
	UWAGA: Wszystkie bufory można przechowywać w temperaturze 4 °C; zaleca się jednak przechowywanie buforów zawierających sacharozę w temperaturze −20 °C, aby uniknąć wzrostu grzybów. Inhibitory proteaz należy dodawać bezpośrednio przed użyciem.</li>
</ol>
2. Generowanie pęcherzyków submitochondrialnych
<ol>
	<li>Wyizoluj świeże, surowe mitochondria drożdżowe zgodnie z uznanymi protokołami34,35. 
	UWAGA: W tym eksperymencie mitochondria wyizolowano z Saccharomyces cerevisiae. Generowanie czystych gradientowo mitochondriów pozbawionych innych organelli nie jest konieczne.</li>
	<li>Resuspenderuj 10 mg świeżo wyizolowanych mitochondriów w 1,6 mL buforu SM (4 °C) poprzez pipetowanie (Rycina 2, krok 1).</li>
	<li>Przenieś zawiesinę mitochondrialną do schłodzonej wcześniej kolby Erlenmeyera o pojemności 100 mL.</li>
	<li>Powoli dodaj 16 mL buforu pęczniącego, używając szklanej pipety 20 mL. Podczas dodawania stosuj stałe, łagodne mieszanie w kąpieli lodowej. Ta obróbka osmotyczna prowadzi do poboru wody do przestrzeni macierzy. Pęcznienie wewnętrznej błony mitochondrialnej spowoduje przerwanie błony zewnętrznej. Jednak obie błony pozostaną w kontakcie w miejscach kontaktu9(Rycina 2, krok 2).</li>
	<li>Inkubuj próbki przez 30 min w kąpieli lodowej przy stałym, łagodnym mieszaniu.</li>
	<li>Powoli dodaj 5 mL 2,5 M roztworu sacharozy, używając szklanej pipety 5 mL, aby zwiększyć stężenie sacharozy w próbkach do około 0,55 M. Ta obróbka osmotyczna powoduje odpływ wody z macierzy36. Kurczenie się błony wewnętrznej ma na celu maksymalizację jej odległości od pozostałych fragmentów błony zewnętrznej. Zmniejsza to prawdopodobieństwo powstania sztucznych pęcherzyków hybrydowych z błon wewnętrznej i zewnętrznej podczas sonikacji (Rycina 2, krok 3).</li>
	<li>Inkubuj próbki przez 15 min w kąpieli lodowej przy łagodnym mieszaniu.</li>
	<li>Poddaj mitochondria sonikacji w celu wygenerowania pęcherzyków błony submitochondrialnej (Rycina 2, krok 4).
	<ol>
		<li>Przenieś zawiesinę mitochondrialną do schłodzonej wcześniej komórki typu rosette.</li>
		<li>Sonikuj zawiesinę mitochondrialną przy amplitudzie 10% przez 30 s, chłodząc komórkę rosette w kąpieli lodowej.</li>
		<li>Pozostaw zawiesinę na 30 s w kąpieli lodowej.</li>
		<li>Powtórz krok 2.8.2 i krok 2.8.3 jeszcze trzy razy. 
		UWAGA: Warunki sonikacji będą się różnić w zależności od użytego sonikatora. Konieczna będzie optymalizacja dla poszczególnych urządzeń. Zbyt intensywna sonikacja doprowadzi do sztucznego tworzenia pęcherzyków składających się z wewnętrznej i zewnętrznej błony mitochondrialnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Separacja pęcherzyków submitochondrialnych
<ol>
	<li>Oddziel wygenerowane pęcherzyki od pozostałych nienaruszonych mitochondriów poprzez wirowanie przy 20 000 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C. Nienaruszone mitochondria utworzą osad, natomiast pęcherzyki pozostaną w nadłożu.</li>
	<li>Skoncentruj mieszaninę pęcherzyków.
	<ol>
		<li>Przenieś nadŁoże do świeżych probówek do ultrawirowania.</li>
		<li>Na dno probówki nanieś poduszkę z 0,3 mL 2,5 M roztworu sacharozy, używając strzykawki 1 mL wyposażonej w kaniulę 0,8 mm x 120 mm.</li>
		<li>Wiruj przy 118 000 x g przez 100 min w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: W tym przypadku zastosowano rotor z koszyczkami o maksymalnym promieniu 153,1 mm. Warunki wirowania są silnie zależne od rotora i muszą zostać dostosowane w przypadku użycia innego rotora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wirowaniu pęcherzyki pojawią się w postaci dysku na górze poduszki sacharozowej. Odrzuć około 90% nadłożu. Następnie zbierz skoncentrowane pęcherzyki, resuspendując je w pozostałym buforze zawierającym 2,5 M sacharozę poprzez pipetowanie w górę i w dół. Przenieś zawiesinę do schłodzonego do temperatury lodu homogenizatora Dounce'a.</li>
	<li>Zhomogenizuj zawiesinę, wykonując co najmniej 10 pociągnięć za pomocą tłoka z politetrafluoroetylenu.</li>
	<li>Przygotuj gradient sacharozowy.
	<ol>
		<li>W przypadku 11 mL gradientu skokowego z pięcioma stopniami (1,3 M, 1,13 M, 1,02 M, 0,96 M i 0,8 M sacharozy w 20 mM MOPS i 0,5 mM EDTA, pH 7,4), każda warstwa zawiera 2,2 mL roztworu sacharozy. 
		UWAGA: Do pomiaru i dostosowania stężeń sacharozy zaleca się użycie refraktometru, choć nie jest on niezbędny. Nanieś 10 µL buforu na refraktometr i odczytaj odpowiednie współczynniki załamania światła. Obliczenie stężenia sacharozy przebiega następująco: 
		<img alt="Równanie współczynnika załamania światła dla analizy stężenia sacharozy w eksperymentach optycznych." src="/files/ftp_upload/65444/65444eq01v2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> 
		Wartość 1,3333 reprezentuje współczynnik załamania światła wody. Wartość 0,048403 jest specyficznym dla sacharozy wskaźnikiem konwersji otrzymanym z liniowego skalowania refrakcyjności molowej do stężenia sacharozy w roztworach wodnych 37.</li>
		<li>Dodaj najwyższe stężenie sacharozy do probówki do wirowania i umieść probówkę w temperaturze −20 °C. Odczekaj do całkowitego zamrożenia warstwy przed naniesieniem kolejnej. Postępuj w ten sposób, aż do dodania ostatniej warstwy, a następnie przechowuj gradienty w temperaturze −20 °C. 
		UWAGA: Pamiętaj o przeniesieniu zamrożonych gradientów do temperatury 4 °C przed rozpoczęciem eksperymentu, aby umożliwić ich rozmrożenie. Zajmie to około 3 h. Do wirowania w tej procedurze użyto rotora z koszyczkami o pojemności 13,2 mL. W przypadku użycia innego rotora objętość stopni gradientu musi zostać odpowiednio dostosowana.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz stężenie sacharozy w próbkach za pomocą refraktometru. W przypadku braku dostępu do refraktometru można alternatywnie przyjąć, że stężenie sacharozy wynosi 2 M. To założone stężenie sacharozy będzie podstawą do następnego kroku.</li>
	<li>Dostosuj stężenie sacharozy do 0,6 M poprzez dodanie odpowiedniej ilości 20 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF i koktajlu inhibitorów proteaz, pH 7,4. Jeśli stężenie sacharozy zostało oszacowane na 2 M zamiast zmierzone, zaleca się sprawdzenie, czy po dostosowaniu stężenie jest wystarczająco niskie. Nanieś niewielką alikwot próbki (ok. 50 µL) na 200 µL 0,8 M sacharozy w probówce. Próbka musi pozostać nad warstwą 0,8 M sacharozy.</li>
	<li>Nanieś próbki (około 1 mL) na górę gradientu sacharozowego (zachowaj 10% do późniejszej referencji). Ważne jest ostrożne pipetowanie, aby uniknąć zaburzenia gradientu (Rysunek 2, krok 5).</li>
	<li>Rozdziel pęcherzyki poprzez wirowanie przy 200 000 x g w temperaturze 4 °C przez 12 h. Jeśli to możliwe, ustaw wirówkę na wolne przyspieszanie i zwalnianie, aby uniknąć zaburzenia gradientu (Rysunek 2, krok 6). 
		UWAGA: W tym przypadku zastosowano rotor z koszyczkami o maksymalnym promieniu 153,1 mm. Warunki wirowania są silnie zależne od rotora i muszą zostać dostosowane w przypadku użycia innego rotora.</li>
	<li>Zbierz gradient od góry do dołu w frakcjach po 700 µL, używając pipety 1 mL. Pozwoli to na uzyskanie 17 frakcji, co zapewnia wystarczającą rozdzielczość.</li>
</ol>
4. Analiza pęcherzyków submitochondrialnych
<ol>
	<li>Skoncentruj białka, poddając każdą frakcję dwóm sekwencyjnie wykonanym precypitacjom TCA38 w celu przygotowania próbek do SDS-PAGE.
	<ol>
		<li>Do poszczególnych frakcji dodaj 200 µL 72% TCA i mieszaj do uzyskania homogennego roztworu. Inkubuj frakcje przez 30 min na lodzie, a następnie odwiruj wytrącone białka w wirowce przy 20,000 x g i 4 °C przez 20 min. Odlej nadsącz, dodaj 500 µL 28% roztworu TCA, dokładnie wymieszaj i powtórz etap wirowania.</li>
		<li>Przemyj osady 1 mL acetonu (−20°C) i wiruj przez 10 min przy 20,000 x g i 4 °C. Odlej nadsącz i pozostaw osady do wyschnięcia na powietrzu. Resuspenduj osady w 60 µL buforu do próbek SDS i inkubuj próbki przez 5 min w temperaturze 95 °C. 
		UWAGA: Po pierwszej precypitacji TCA pozostanie duża ilość sacharozy, szczególnie w frakcjach o wysokiej gęstości. Zostanie ona usunięta podczas dodatkowej precypitacji TCA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizuj 20 µL każdej frakcji za pomocą SDS-PAGE39 oraz immunoblottingu40,41,42,43.</li>
</ol>

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.

Subfrakcjonowanie mitochondriów to skomplikowany eksperyment składający się z kilku bardzo złożonych etapów. W związku z tym naszym celem było dalsze ulepszanie i do pewnego stopnia uproszczenie naszej ustalonej metody32. Tutaj wyzwaniem było zapotrzebowanie na skomplikowane i wysoce specjalistyczne urządzenia, które często są indywidualnymi konstrukcjami oraz ogromne zużycie czasu i energii. W tym celu staraliśmy się usunąć pompy i poszczególne konstrukcje używane do odlewania i zbierania gradien...

Mitochondria pełnią u eukariontów wiele różnych funkcji, z których najbardziej znaną jest produkcja ATP poprzez fosforylację oksydacyjną. Inne funkcje obejmują wytwarzanie klastrów żelazowo-siarkowych, syntezę lipidów, a u wyższych eukariontów sygnalizację Ca2+ oraz indukcję apoptozy1,2,3,4. Funkcje te są nierozerwalnie związane z ich złożoną ultrastrukturą.
Ultrastruktura mitochondriów została po raz pierwszy opisana za pomocą mikroskopii elektronowej5. Wykazano, że mitochondria są dość złożonymi organellami składającymi się z dwóch błon: zewnętrznej błony mitochondrialnej i mitochondrialnej błony wewnętrznej. W ten sposób błony te tworzą dwa przedziały wodne: przestrzeń międzybłonową i matrycę. Wewnętrzną błonę mitochondrialną można jeszcze bardziej podzielić na różne sekcje. Wewnętrzna błona graniczna pozostaje w bliskiej odległości od błony zewnętrznej, a grzebienie tworzą wgłębienia. Tak zwane połączenia crista łączą wewnętrzną błonę graniczną i cristae (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). Co więcej, mikrofotografie elektronowe osmotycznie skurczonych mitochondriów ujawniają, że istnieją miejsca, w których błony mitochondrialne są ściśle połączone6,7. Te tak zwane miejsca kontaktu są tworzone przez kompleksy białkowe obejmujące dwie błony (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Uważa się, że te miejsca interakcji są niezbędne dla żywotności komórek ze względu na ich znaczenie dla regulacji dynamiki mitochondriów i dziedziczenia, a także transferu metabolitów i sygnałów między cytozolem a matrix8.
Kompleks MICOS w wewnętrznej błonie mitochondrialnej jest prawdopodobnie najlepiej scharakteryzowanym i najbardziej wszechstronnym kompleksem tworzącym miejsca kontaktu. MICOS został opisany w drożdżach w 2011 roku i składa się z sześciu podjednostek9,10,11: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 i Mic10. Tworzą one kompleks około 1,5 MDa, który lokalizuje się w crista junctions9,10,11. Usunięcie którejkolwiek z podjednostek rdzeniowych, Mic10 lub Mic60, prowadzi do braku tego kompleksu9,11, co oznacza, że te dwie podjednostki są niezbędne dla stabilności MICOS. Co ciekawe, MICOS tworzy nie tylko jedno, ale wiele miejsc kontaktu z różnymi mitochondrialnymi białkami i kompleksami błony zewnętrznej: TOM complex11,12, kompleks TOB/SAM9,12,13,14,15,16, kompleks Fzo1-Ugo19, Por110, OM4510 oraz Miro17. Wskazuje to wyraźnie, że kompleks MICOS bierze udział w różnych procesach mitochondrialnych, takich jak import białek, metabolizm fosfolipidów i wytwarzanie ultrastruktury mitochondriów18. Ta ostatnia funkcja jest prawdopodobnie główną funkcją MICOS, ponieważ brak kompleksu MICOS indukowany przez delecję MIC10 lub MIC60 prowadzi do nieprawidłowej ultrastruktury mitochondrialnej, która praktycznie całkowicie pozbawiona jest regularnych grzebienia. Zamiast tego gromadzą się pęcherzyki błony wewnętrznej bez połączenia z wewnętrzną błoną graniczną19, 20. Co ważne, MICOS jest zachowany pod względem formy i funkcji, od drożdży do human21. Związek mutacji w podjednostkach MICOS z ciężkimi chorobami człowieka również podkreśla jego znaczenie dla wyższych eukariontów22,23. Chociaż MICOS jest bardzo wszechstronny, muszą istnieć dodatkowe strony kontaktowe (na podstawie naszych niepublikowanych obserwacji). Rzeczywiście, zidentyfikowano kilka innych miejsc kontaktowych, na przykład maszynerie fuzji mitochondrialnej Mgm1-Ugo1/Fzo124,25,26 lub Mdm31-Por1, który bierze udział w biosyntezie specyficznej dla mitochondriów fosfolipidowej kardiolipiny27. Niedawno udoskonaliliśmy metodę, która doprowadziła nas do identyfikacji MICOS, aby zidentyfikować Cqd1 jako część nowego miejsca kontaktu utworzonego z kompleksu błony zewnętrznej Por1-Om1428. Co ciekawe, to miejsce kontaktowe wydaje się być również zaangażowane w wiele procesów, takich jak homeostaza błony mitochondrialnej, metabolizm fosfolipidów i dystrybucja koenzymu Q28,29.
Tutaj użyliśmy wariantu wcześniej opisanej frakcjonacji mitochondriów9,30,31,32,33. Osmotyczne traktowanie mitochondriów prowadzi do przerwania zewnętrznej błony mitochondrialnej i skurczenia się przestrzeni macierzy, pozostawiając obie błony tylko w bliskiej odległości w miejscach kontaktu. Pozwala to na wytwarzanie pęcherzyków, które składają się wyłącznie z zewnętrznej błony mitochondrialnej lub wewnętrznej błony mitochondrialnej lub w miejscach kontaktu obu błon poprzez łagodną sonikację. Ze względu na to, że wewnętrzna błona mitochondriów ma znacznie wyższy stosunek białka do lipidów, pęcherzyki mitochondrialnej błony wewnętrznej wykazują większą gęstość w porównaniu z pęcherzykami mitochondrialnej błony zewnętrznej. Różnica w gęstości może być wykorzystana do oddzielenia pęcherzyków błonowych poprzez wirowanie w gradiencie gęstości wyporu sacharozy. W ten sposób pęcherzyki mitochondrialnej błony zewnętrznej gromadzą się przy niskich stężeniach sacharozy, podczas gdy pęcherzyki błony wewnętrznej mitochondriów są wzbogacane przy wysokich stężeniach sacharozy. Pęcherzyki zawierające miejsca kontaktu koncentrują się w średnich stężeniach sacharozy (<silna klasa="xfig">Ryc. 2). Poniższy protokół szczegółowo opisuje tę ulepszoną metodę, która wymaga mniej specjalistycznego sprzętu, czasu i energii w porównaniu z naszą poprzednio ustaloną klasą one32 i stanowi użyteczne narzędzie do identyfikacji możliwych białek w miejscu kontaktu.

<table><tbody><tr><td>13,2 mL, Otwarta cienkościenna ultraprzezroczysta tuba, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Instruments, Niemcy</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>50 mL, Otwarta grubościenna rurka z poliwęglanu Open-Top, 29 x 104 mm</td><td>Beckman Instruments, Niemcy</td><td>363647</td><td></td></tr><tr><td>A-25.50 Wirnik stałokątowy - aluminium, 8 x 50 mL, 25 000 obr./min, 75 600 x g</td><td>Beckman Instruments, Niemcy</td><td>363055</td><td></td></tr><tr><td>Refraktometr Abbego</td><td>Zeiss, Niemcy</td><td></td><td>wycofane, można używać dowolnego refraktometru Abbego</td></tr><tr><td>accu-jet pro Kontroler pipet</td><td>Brandtech, USA</td><td>BR26320</td><td>wycofany, wystarczy dowolny kontroler pipet</td></tr><tr><td>Zlewka 1000 ml</td><td>DWK Life Science, Niemcy</td><td>C118.1</td><td></td></tr><tr><td>Branson&nbsp; Cyfrowy sonifier W-250 D</td><td>Branson Ultrasonics, Stany Zjednoczone</td><td>FIS15-338-125</td><td></td></tr><tr><td>Branson Ultradźwiękowy 3mm STOŻKOWA MIKROKOŃCÓWKA</td><td>Branson Ultrasonics, USA</td><td>101-148-062</td><td></td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics Sonizery 200- i 400-watowe: Rozetowa komórka chłodząca</td><td>Branson Ultrasonics, USA</td><td>15-338-70</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Avanti JXN-26</td><td>Beckman Instruments, Niemcy</td><td>B37912</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Optima XPN-100 ultra</td><td>Beckman Instruments, Niemcy</td><td>8043-30-0031</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail</td><td>Roche, Szwajcaria</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbit</td><td>Roth, Niemcy</td><td>6213</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (dwuwodian soli disodowej kwasu etyleno-tetraoctowego)</td><td>Roth, Niemcy</td><td>8043</td><td></td></tr><tr><td>Kolba Erlenmeyera, 100 ml</td><td>Roth, Niemcy</td><td>Pipeta miarowa X747.1</td><td></td></tr><tr><td>, Kl. B, 25:0, 0,1</td><td>Hirschmann, Niemcy</td><td>Pipeta</td> miarowa 1180170<td></td></tr><tr><td>, Kl. B, 5:0, 0,05</td><td>Hirschmann, Niemcy</td><td>1180153</td><td></td></tr><tr><td>kąpieli lodowej</td><td>neoLab, Niemcy</td><td>&nbsp; S12651</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne RCT basic</td><td>IKA-Werke GmbH, Niemcy</td><td>Z645060GB-1EA</td><td></td></tr><tr><td>MOPS (kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy)Gerbu</td><td>, Niemcy</td><td>1081</td><td></td></tr><tr><td>MyPipetman Select P1000</td><td>Gilson, Stany Zjednoczone</td><td>FP10006S</td><td></td></tr><tr><td>MyPipetman Select P20</td><td>Gilson, Stany Zjednoczone</td><td>FP10003S</td><td></td></tr><tr><td>MyPipetman Select P200</td><td>Gilson, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td>FP10005S</tr><tr><td>Omnifix 1 ml</td><td>Braun, Niemcy</td><td>4022495251879</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)</td><td>Serva, Niemcy</td><td>32395.03</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula STERICAN 21 Gx4 4/5 0,8x120 mm</td><td>Braun, Niemcy</td><td>4022495052414</td><td></td></tr><tr><td>mieszadło, 15 mm</td><td>VWR, USA</td><td>442-0366</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Merck, Niemcy</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Rotor z łyżką wahadłową</td><td>Beckman Instruments, Niemcy</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Probówki</td><td>Eppendorf, Niemcy</td><td>3810X</td><td></td></tr><tr><td>Młynki do tkanek, typ Potter-Elvehjem, szklane naczynie 2 ml</td><td>VWR, USA</td><td>432-0200</td><td></td></tr><tr><td>Młynki do tkanek typu Potter-Elvehjem, tłok 2 ml z ząbkowaną końcówką</td><td>VWR, USA</td><td>432-0212</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trichlorooctowy ( TCA)</td><td>Sigma Aldrich, Niemcy</td><td>33731</td><td>wycofane, każdy TCA wystarczy (CAS: 73-03-9)</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Roth, Niemcy</td><td>4855</td><td></td></tr></tbody></table>

ulepszona metoda izolowania mitochondrialnych miejsc kontaktowych

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Mitochondria są obecne praktycznie we wszystkich komórkach eukariotycznych i pełnią podstawowe funkcje, które wykraczają daleko poza produkcję energii, na przykład syntezę klastrów żelazowo-siarkowych, lipidów lub białek, buforowanie Ca2+ i indukcję apoptozy. Podobnie dysfunkcja mitochondriów prowadzi do poważnych chorób ludzkich, takich jak rak, cukrzyca i neurodegeneracja. Aby pełnić te funkcje, mitochondria muszą komunikować się z resztą komórki przez swoją otoczkę, która składa się z dwóch błon. Dlatego te dwie membrany muszą stale ze sobą współdziałać. Białka mają w tym względzie zasadnicze znaczenie dla miejsc kontaktu między błoną wewnętrzną i zewnętrzną mitochondriów. Do tej pory zidentyfikowano kilka miejsc kontaktowych. W opisanej tutaj metodzie mitochondria Saccharomyces cerevisiae są wykorzystywane do izolowania miejsc kontaktu, a tym samym do identyfikacji kandydatów, którzy kwalifikują się do białek w miejscu kontaktu. Użyliśmy tej metody do identyfikacji mitochondrialnego miejsca kontaktu i kompleksu systemu organizowania cristae (MICOS), jednego z głównych kompleksów tworzących miejsca kontaktu w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, która jest konserwowana od drożdży do ludzi. Ostatnio jeszcze bardziej udoskonaliliśmy tę metodę, aby zidentyfikować nowe miejsce kontaktu składające się z Cqd1 i kompleksu Por1-Om14.

Rozdzielenie wewnętrznej i zewnętrznej błony mitochondrialnej jest stosunkowo łatwe. Jednakże generowanie i oddzielanie pęcherzyków zawierających miejsca kontaktu jest znacznie trudniejsze. Naszym zdaniem kluczowe i niezbędne są dwa etapy: warunki sonikacji oraz zastosowany gradient.
Zazwyczaj uważa się, że gradienty liniowe mają lepszą rozdzielczość w porównaniu z gradientami schodkowymi. Jednak ich powtarzalne wytwarzanie jest żmudne i wymaga specjalistycznego sprzętu. W związku z tym opraco...

Mitochondrialne miejsca kontaktu to kompleksy białkowe, które oddziałują z wewnętrznymi i zewnętrznymi białkami błony mitochondrialnej. Miejsca te są niezbędne do komunikacji między błonami mitochondrialnymi, a tym samym między cytozolem a macierzą mitochondrialną. W tym miejscu opisujemy metodę identyfikacji kandydatów kwalifikujących się do tej konkretnej klasy białek.

Ulepszona metoda izolowania mitochondrialnych miejsc kontaktowych

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Naszym celem jest zrozumienie funkcji molekularnej mitochondrialnych miejsc kontaktu, umożliwiających komunikację między dwiema błonami mitochondrialnymi. W rzeczywistości jest to warunek wstępny do zrozumienia funkcji biogenezy mitochondriów, a tym samym żywotności komórek. Odkryliśmy nowe miejsce kontaktu między wewnętrzną i zewnętrzną błoną mitochondrialną utworzone przez CQD1, a co ważniejsze, porowe.Nasze dane sugerują, że to miejsce może pomóc w imporcie lipidów, takich jak kwas fosfatydowy. Opierając się na identyfikacji kompleksu MICOS, przyczyniliśmy się do głębszego zrozumienia, w jaki sposób generowana jest architektura błon mitochondrialnych. Pozwoliło nam to opracować model roboczy, który wyjaśnia, w jaki sposób powstają dwie formy grzebień mitochondrialnych, blaszkowate i rurkowate.W przeszłości nasze badania były prowadzone na drożdżach. Jesteśmy jednak przekonani, że tworzenie prawidłowej architektury mitochondrialnej jest również ważne dla wysokich eukariontów. Kolejnym krokiem w naszych badaniach jest analiza roli elementów architektury mitochondrialnej w bardziej złożonych modelach, takich jak neurony pierwotne.Na początek weź 10 miligramów świeżo wyizolowanych mitochondriów drożdży i ponownie zawieś je w 1,6 mililitra buforu SM w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pipetowanie. Następnie przenieść zawiesinę mitochondrialną do wstępnie schłodzonej 100-mililitrowej kolby Erlenmeyera. Powoli dodawać 16 mililitrów buforu pęczniejącego za pomocą szklanej pipety o pojemności 20 mililitrów, stosując stałe, łagodne mieszanie z lodem.Próbki inkubować pod stałym, łagodnym mieszaniem przez 30 minut na lodzie. Następnie powoli dodaj pięć mililitrów 2,5-molowego roztworu sacharozy za pomocą pięciomililitrowej szklanej pipety, pozwalając wewnętrznej membranie się skurczyć. Inkubować próbki pod łagodnym mieszaniem przez 15 minut na lodzie.Aby wytworzyć pęcherzyki błony submitochondrialnej, przenieś zawiesinę mitochondrialną do wstępnie schłodzonej komórki rozety i sonikuj zawiesinę przy amplitudzie 10% przez 30 sekund, schładzając komórkę rozety w łaźni lodowej. Zawiesinę należy pozostawić na 30 sekund w łaźni lodowej. Na początek weź przygotowane pęcherzyki submitochondrialne drożdży i odwiruj wytworzone pęcherzyki i pozostałe nienaruszone mitochondria w temperaturze 20 000 G przez 20 minut w czterech stopniach Celsjusza.Nienaruszone mitochondria tworzą osad, podczas gdy pęcherzyki pozostają w supernatancie. Następnie przenieść supernatant do świeżych probówek do ultrawirówki. Załadować poduszkę 0,3 mililitra 2,5 molowego roztworu sacharozy na dno probówki za pomocą jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w kaniulę i odwirować przy 118 000 G przez 100 minut w czterech stopniach Celsjusza.Po odwirowaniu pęcherzyki pojawią się jako krążek na wierzchu poduszki sacharozy. Usunąć około 90% sklarowanego osadu. Aby zebrać zagęszczone pęcherzyki, należy je ponownie zawiesić w pozostałym buforze, w tym 2,5-molowej sacharozy, przez pipetowanie.Przenieść zawiesinę do lodowatego homogenizatora Dounce i homogenizować zawiesinę za pomocą garnka z politetrafluoroetylenu z co najmniej 10 pociągnięciami. Następnie przygotuj 11-mililitrowy gradient krokowy, przy czym każda warstwa zawiera 2,2 mililitra roztworu sacharozy. Oblicz stężenie sacharozy za pomocą tego wzoru.Dodaj najwyższe stężenie sacharozy do probówki wirówkowej i umieść ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż warstwa całkowicie zamarznie. Zmierzyć stężenie sacharozy w próbkach za pomocą refraktometru. Jeśli refraktometr jest niedostępny, należy założyć, że stężenie sacharozy wynosi dwa zęby molowe.Aby dostosować stężenie sacharozy do 0,6 mola, dodaj odpowiedni koktajl MOPS, EDTA, PMSF i inhibitorów proteazy o pH 7,4. Ostrożnie załadować próbki na gradient sacharozy, aby uniknąć zakłócenia gradientu. Odwirować pęcherzyki w temperaturze 200 000 G i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 12 godzin.Jeśli to możliwe, ustaw powolne przyspieszanie i zwalnianie, aby uniknąć zakłócenia nachylenia. Następnie zbierz gradient od góry do dołu we frakcjach o wielkości 700 mikrolitrów, używając pipety o pojemności jednego mililitra, co daje 17 frakcji, co zapewnia wystarczającą rozdzielczość. Następnie należy wykonać dwa kolejno wykonane wytrącanie kwasu trichlorooctowego, dodając 200 mikrolitrów 72% kwasu trichlorooctowego do poszczególnych frakcji i mieszając, aż roztwór będzie jednorodny.Inkubować frakcje przez 30 minut na lodzie i granulować wytrącone białka, odwirowując w temperaturze 20 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut. Odrzucić supernatant. Dodaj 500 mikrolitrów 28% roztworu kwasu trichlorooctowego, dobrze wymieszaj i powtórz etap wirowania.Na koniec przeanalizuj frakcje za pomocą strony SDS i immuno blot. Znaczenie łagodnej sonikacji jest przedstawione tutaj. Mitochondrialny marker błony zewnętrznej Tom40 był wzbogacony we wczesnych frakcjach o niskiej gęstości i był praktycznie nieobecny we późniejszych.Mitochondrialny marker błony wewnętrznej Tim17 był skoncentrowany we frakcjach o dużej gęstości. W przeciwieństwie do tego, białko Mic60 w miejscu kontaktu gromadziło się we frakcjach o pośrednim stężeniu sacharozy, co wskazuje na pomyślne wygenerowanie, a następnie oddzielenie różnych pęcherzyków błonowych. W przeciwieństwie do tego, w trudniejszych warunkach sonikacji, mitochondrialny marker błony zewnętrznej Tom40 można było wykryć w niższych frakcjach gradientu.Dodatkowo stwierdzono znaczną ilość Tim17 we frakcjach o pośredniej gęstości.

an-improved-method-to-isolate-mitochondrial-contact-sites

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano metodę szybkiej izolacji mitochondriów z biopsji tkanek ssaków. Preparaty wątroby szczura lub mięśni szkieletowych homogenizowano za pomocą komercyjnego dysocjatora tkanek, a mitochondria izolowano przez filtrację różnicową przez filtry z siatki nylonowej. Czas izolacji mitochondriów wynosi &lt;30 min w porównaniu do 60 - 100 min przy użyciu metod alternatywnych.

Szybka izolacja i oczyszczanie mitochondriów do przeszczepu przez dysocjację tkanek i filtrację różnicową

Opisana tutaj jest metoda wykrywania i ilościowego oznaczania białek zewnętrznej błony mitochondrialnej poprzez immunoznakowanie mitochondriów wyizolowanych z tkanek gryzoni i analizę za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta może być rozszerzona o ocenę funkcjonalnych aspektów subpopulacji mitochondrialnych.

Immunodetekcja białek błony zewnętrznej za pomocą cytometrii przepływowej izolowanych mitochondriów

Porównanie potencjału błony mitochondrialnej między próbkami dostarcza cennych informacji o stanie komórek. Opisano szczegółowe etapy izolacji mitochondriów i oceny odpowiedzi na inhibitory i rozprzęgacze za pomocą fluorescencji. Metoda i użyteczność tego protokołu są zilustrowane przez zastosowanie hodowli komórkowej i zwierzęcego modelu stresu komórkowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy

Opisano metody biopsji mięśnia obszernego bocznego, przygotowania oczyszczonych mitochondriów i profilowania respirometrycznego. Wykorzystanie małej objętości mięśniowej sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań w badaniach klinicznych.

Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej

Tutaj prezentujemy modyfikację wcześniej opisanej metody, która pozwala na izolację wysokiej jakości i oczyszczonych mitochondriów z mniejszych ilości mięśni szkieletowych myszy. Procedura ta powoduje powstanie wysoce sprzężonych mitochondriów, które oddychają z wysoką funkcją podczas testów respirometycznych opartych na mikropłytkach.

Izolacja mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy w celu wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Ponieważ mitochondria stanowią tylko niewielki procent komórki roślinnej, muszą zostać oczyszczone do szeregu badań. Mitochondria można wyizolować z różnych organów roślinnych poprzez homogenizację, a następnie wirowanie w gradiacji różnicowej i gęstości w celu uzyskania wysoce oczyszczonej frakcji mitochondrialnej.

Izolacja i pomiary oddechowe mitochondriów Arabidopsis thaliana

Tutaj prezentujemy protokół ekstrakcji, dystrybucji i identyfikacji superkompleksów mitochondrialnych, który minimalizuje narażenie na detergenty i Coomassie Blue. Protokół ten zapewnia optymalną równowagę między rozdzielczością a zachowaniem aktywności enzymów, jednocześnie minimalizując ryzyko utraty labilnych interakcji białko-białko.

Hybrydowa elektroforeza przezroczysta/niebieska natywna do separacji i analizy superkompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych

Prezentujemy dwuetapowy protokół wysokiej jakości izolacji mitochondriów, który jest zgodny z odkrywaniem białek i kwantyfikacją w skali proteomu. Nasz protokół nie wymaga inżynierii genetycznej, a zatem nadaje się do badania mitochondriów z dowolnych pierwotnych komórek i tkanek.

Dwuetapowa izolacja mitochondriów bez znaczników w celu lepszego odkrywania białek i kwantyfikacji

Ten protokół opisuje technikę analizy superkompleksów oddechowych, gdy dostępne są tylko małe ilości próbek.

Izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych

Badania bioenergetyczne i metabolomiczne mitochondriów ujawniły ich wieloaspektową rolę w wielu chorobach, ale metody izolacji tych organelli są różne. Opisana tutaj metoda jest w stanie oczyścić wysokiej jakości mitochondria z wielu źródeł tkankowych. Jakość określa się na podstawie współczynników kontroli oddechu i innych wskaźników ocenianych za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Solidna izolacja mitochondriów z tkanki serca gryzoni

Poznaj ulepszoną metodę izolacji mitochondrialnych miejsc kontaktowych w drożdżach. Technika ta pozwala badać rolę kompleksu MICOS i białka CQD1 w architekturze błon mitochondrialnych oraz biogenezie mitochondriów.

Ulepszona metoda izolowania mitochondrialnych miejsc kontaktowych

Przeglądaj więcej filmów