Kwantyfikacja nacieku tkanki tłuszczowej mięśni szkieletowych na podstawie decelularyzacji

Interesuje nas wzajemne oddziaływanie między kurczącymi się mięśniami a adipocytami, które tworzą się między włóknami mięśniowymi w urazach i chorobach zwanych międzymięśniową tkanką tłuszczową lub IMAT. Inżynieria genetyczna w komórkach i myszach jest potężnym narzędziem do mechanicznego analizowania przesłuchów mięśni tłuszczowych. Analiza sygnalizacji za pomocą transkryptomiki i proteomiki identyfikuje mediatory, a następnie dostarczanie leków oparte na biomateriale może interweniować w te szlaki.

Jednym z głównych wyzwań jest wyizolowanie i ilościowe określenie adipocytów IMAT. Szczególnie w małych modelach zwierzęcych sygnał IMAT jest wypłukiwany przez analizę całych mięśni, taką jak transkryptomika lub lipidomika. A ilościowe określanie IMAT za pomocą nieinwazyjnego obrazowania cierpi na podobne wymycie, ponieważ większość wokseli zawiera mieszaninę mięśni i IMAT.

Niedawno zastosowaliśmy tę technikę opisaną w tym artykule, aby wykazać, że IMAT bezpośrednio upośledza kurczliwość mięśni. Dzięki precyzyjnym pomiarom osadzania IMAT wykazaliśmy, że nie tylko zastępuje on materiał skurczowy, ale także hamuje skurcz pozostałych mięśni beztłuszczowych. Protokół ten stanowi odpowiedź na wyzwania związane z kwantyfikacją IMAT.

Obecnym standardem pomiaru IMAT u małych zwierząt jest histologia jednowycinkowa, która nie jest kompleksowym lub nieinwazyjnym obrazowaniem, które jest drogie i ma niską rozdzielczość. Uważamy, że ograniczyło to naszą wiedzę na temat przesłuchów mięśniowych IMAT. Technika ta zapewnia kompleksową i niedrogą metodę oceny IMAT poprzez jakościową wizualizację i wieloskalową kwantyfikację.

Mamy nadzieję, że prostota tej techniki zachęci więcej badaczy do pomiaru IMAT i ich modeli zwierzęcych. Ponadto technika ta zapewni badaczom zainteresowanym IMAT bardziej precyzyjne narzędzie do odkrywania bardziej subtelnych relacji między adipocytami IMAT a innymi komórkami. Na początek sprawdź interesujące mięśnie wycięte z ofiarowanej myszy pod kątem braku odłamków kości lub postrzępionych krawędzi i w razie potrzeby odetnij je ostrymi nożyczkami.

Zważ oczyszczone mięśnie za pomocą wagi analitycznej i zapisz ich wagę. Po umieszczeniu mięśnia w co najmniej 0,1 mililitra 1% SDS na miligram wagi, umieść płytkę dołka na kołyszącym się wytrząsarce ustawionej na 50 do 80 herców. Okresowo sprawdzaj wzrokowo roztwór SDS.

Gdy roztwór stanie się mętny, usuń roztwór pipetą bez zasysania mięśni i zastąp go równą objętością świeżego 1% SDS. Gdy roztwór pozostaje klarowny przez 24 godziny, usuń końcowy roztwór SDS z pozbawionych komórek mięśni i zastąp go równą objętością PBS. Sprawdź pozbawione komórek mięśnie pod mikroskopem stereoskopowym i ostrożnie usuń wszelkie włosy lub zanieczyszczenia przyklejone do mięśnia za pomocą kleszczy.

Ostrożnie wyjmij PBS i zastąp go równą objętością 3,7% formaldehydu przed ponownym umieszczeniem płytki w bujanym wytrząsarce na 24 godziny. Przygotuj roztwór ORO, rozpuszczając 0,5 grama proszku ORO w 100 mililitrach izopropanolu w celu wytworzenia roztworu podstawowego. Przygotuj roztwór roboczy dla wszystkich mięśni, łącząc roztwór podstawowy ORO i wodę dejonizowaną w stosunku 60:40.

Przykryj roztwór roboczy na 10 minut, aby cząstki stałe mogły się osadzić. Przefiltruj go przez siatkę o wielkości 40 mikrometrów, a następnie przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,22 mikrometra. Następnie usuń roztwór formaldehydu z pozbawionych komórek mięśni w płytce studzienki i umyj mięśnie trzykrotnie równą objętością PBS.

Następnie zastąp PBS równą objętością 60% roztworu izopropanolu i inkubuj go na kołyszącym się wytrząsarce przez pięć minut. Po zakończeniu zastąp 60% roztwór izopropanolu roztworem roboczym ORO przed 10 minutami inkubacji na wytrząsarce na biegunach. Następnie zastąp roztwór roboczy ORO równą objętością 1% SDS i okresowo sprawdzaj roztwór SDS.

Gdy roztwór stanie się zauważalnie różowy, zastąp roztwór SDS świeżym 1%SDS. Gdy roztwór pozostanie klarowny przez 24 godziny, zastąp 1%SDS PBS. Pod mikroskopem stereoskopowym przy 4-krotnym powiększeniu usuń wszelkie widoczne zanieczyszczenia lub cząstki przyklejone na zewnątrz poplamionego mięśnia.

Jeśli barwienie jest zadowalające, pokazując jaskrawoczerwone kule unoszące się w przezroczystej matrycy, uzyskaj obrazy barwienia za pomocą kamery podłączonej do mikroskopu stereoskopowego. Prawidłowo pozbawione komórek mięśnie były białe i półprzezroczyste. Kiedy pozbawione komórek mięśnie zabarwiono ORO w celu uwidocznienia śródmięśniowej tkanki tłuszczowej lub IMAT, kropelki lipidów IMAT były widoczne w czystych strukturach mięśniowych jako czerwone kule.

Zdrowe mięśnie kończyn tylnych myszy wykazywały niewielki naturalny IMAT, o czym świadczyło niewiele lub brak czerwonego ORO-dodatniego lipidu, w porównaniu z mięśniami kończyn tylnych, którym wstrzyknięto kardiotoksynę lub glicerol. Niepełną decelularyzację stwierdzono natychmiast po początkowym leczeniu SDS lub po wypłukaniu barwienia ORO jako półprzezroczyste jasnoróżowe włókna. Niepełny klirens ORO został zidentyfikowany, po wypłukaniu ORO, jako różowe lub czerwone jednolite tło, a nie wyraźne linie włókien.

Zacznij od przeniesienia zdecelularyzowanych mięśni szkieletowych wybarwionych ORO do 200 mikrolitrów izopropanolu w poszczególnych dołkach 96-dołkowej płytki. Mieszać roztwór, stukając w płytkę i mechanicznie rozgniatać mięsień końcówką pipety pod mikroskopem, aż w pozbawionej komórek zawiesinie mięśniowej nie będzie widać czerwonych kulek. Ponownie wymieszaj zawiesinę komórek w każdym dołku, pipetując w górę iw dół przed przeniesieniem 75 mikrolitrów do dwóch czystych dołków płytki.

Przykryj płytkę i odczytaj absorbancję zduplikowanych studzienek o pojemności 75 mikrolitrów za pomocą spektrofotometru lub czytnika płytek. Aby rozpocząć kwantyfikację barwionych metryk kropelek lipidów IMAT, otwórz stosy konfokalne w ImageJ. Otwórz interfejs użytkownika progu, wybierając Obraz, następnie Dostosuj, a następnie Próg.

W interfejsie użytkownika wybierz Intermodes jako typ progowania i upewnij się, że wybrano opcję Ciemne tło. Następnie kliknij Zastosuj, aby uruchomić algorytm progowy. Uruchom algorytm zlewni, aby oddzielić stykające się kropelki lipidów, wybierając opcję Proces, a następnie Binarny i Zlewnia.

Wybierz opcję Tak w oknie dialogowym, aby przetworzyć wszystkie obrazy w stosie i dodać cienką czarną linię dzielącą większe obszary jednolitej bieli. Aby ustawić maksymalny i minimalny rozmiar cząstek, otwórz oryginalny obraz i obrysuj najmniejszą i największą kroplę lipidu w polu widzenia za pomocą narzędzia Owal. Następnie dodaj te kształty do Menedżera ROI, wpisując T, wybierz Analizuj, a następnie Ustaw miary.

W oknie dialogowym wybierz ustawienia, zaznacz opcję Tylko obszar i kliknij przycisk OK. Następnie wybierz opcję Zmierz w Menedżerze zwrotu z inwestycji. Użyj dwóch miar powierzchni z tego okna Wyniki jako zakresu rozmiarów w polu Analizuj cząstki. Aby zidentyfikować obszar zainteresowania lub ROI za pomocą algorytmu Analizuj cząstki, wybierz pozycję Analizuj, a następnie Analizuj cząstki.

Otworzy się okno dialogowe, w którym można ustawić ustawienia wyboru. Aby wyświetlić pomiary ROI, wybierz opcję Analizuj, a następnie Ustaw pomiary, a następnie wybierz opcję Obszar, Środek ciężkości, Dopasuj elipsę i Położenie stosu. Kliknij OK. Następnie wybierz opcję Zmierz w Menedżerze zwrotu z inwestycji.

Dane w tabeli wyników można wybrać i skopiować do Excela w celu dalszej analizy. W celu szczegółowej oceny wskaźników i rozmieszczenia poszczególnych kropelek lipidów, znakowane fluorescencyjnie kropelki lipidów BODIPY zobrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Progowanie i segmentacja kształtu zapewniły dobre pierwsze przejście do generowania zwrotu z inwestycji dla każdej kropli lipidu.

Jednak do poprawienia błędów potrzebne były ręczne edycje. Głębokie kropelki lipidów, które wydają się przyciemnione na obrazie, można dodać ręcznie za pomocą narzędzia Owal w ImageJ. Grupę kropelek lipidów, błędnie zidentyfikowanych jako pojedynczy ROI, można również skorygować, usuwając i zastępując pierwotny ROI wieloma nowymi ROI.

Tam, gdzie pojedyncza kropla lipidu została zidentyfikowana jako unikalny zwrot z inwestycji w wielu warstwach, zduplikowane zwroty z inwestycji zostały skonsolidowane w jeden zwrot z inwestycji.