Name: Kwantyfikacja nacieku tkanki tłuszczowej mięśni szkieletowych na podstawie decelularyzacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-09T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Poznaj metodę decelularyzacji do kwantyfikacji tkanki tłuszczowej międzymięśniowej w mięśniach szkieletowych myszy. Technika ta umożliwia precyzyjną wizualizację i pomiar adipocytów IMAT oraz ocenę ich wpływu na kurczliwość mięśni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez R01AR075773 do GAM.

Opieka i ofiarowanie myszy zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym użytkowania i opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi. Wszystkie prace zostały zatwierdzone przez Komitet Badań nad Zwierzętami na Uniwersytecie Waszyngtońskim w St. Louis School of Medicine. Samce myszy C57BL/6J w wieku 2-3 miesięcy (patrz Tabela Materiałów) zostały wykorzystane do wygenerowania przykładowych obrazów zawartych w tym protokole. Wszystkie opisane poniżej czynności wykonywane są w temperaturze pokojowej.
1. Decelularyzacja mięśni
<ol>
	<li>Przygotować 1% w/v dodecylosiarczanu sodu (SDS; patrz Tabela Materiałów) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Mieszaj roztwór, aż do całkowitego wymieszania. 
	UWAGA: 1% SDS można przygotować luzem i przechowywać w temperaturze pokojowej przez 1 miesiąc.</li>
	<li>Przeanalizuj interesujące Cię mięśnie zgodnie z wcześniejszym opisem38,39.
	<ol>
		<li>Odsłoń interesujące Cię mięśnie, zwilżając włosy i skórę 70% roztworem etanolu, następnie wykonując nacięcie przezskórne o długości około 2 cm, a następnie usuwając pokrywającą skórę kleszczami i nożyczkami sprężynowymi. 
		UWAGA: Interesujące tutaj mięśnie obejmują piszczel przedni (TA), prostownik długi palca (EDL) i przeponę. Niektóre mięśnie mogą leżeć głęboko w innych mięśniach, co wymaga rozwarstwienia innych mięśni (np. rozwarstwienie EDL wymaga usunięcia TA).</li>
		<li>Wypreparuj interesujący mięsień (mięśnie) za pomocą ostrych nożyczek lub ostrzy (patrz Tabela materiałów), aby upewnić się, że uzyskano cały zakres mięśnia, a krawędzie są gładkie. 
		UWAGA: Najlepiej zrobić to pod mikroskopem preparacyjnym, aby poprawić wizualizację.</li>
		<li>Sprawdź mięśnie, aby upewnić się, że nie ma odłamków kości ani postrzępionych krawędzi, a następnie w razie potrzeby odetnij je ostrymi nożyczkami.</li>
		<li>Zważ mięsień za pomocą wagi analitycznej i zapisz wagę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść wypreparowany mięsień w co najmniej 0,1 ml 1% SDS na miligram masy; płytki 6-, 12- lub 24-dołkowe działają dobrze odpowiednio na mięśnie przepony, TA i myszy EDL. Typowe objętości to 6 ml, 3 ml i 1,5 ml odpowiednio dla płytek 6-, 12- i 24-dołkowych. 
	UWAGA: Roztwór SDS czasami powoduje deformację mięśni, więc upewnij się, że mięsień jest płaski/rozciągnięty przy początkowym zanurzeniu.</li>
	<li>Umieść płytkę studzienki (lub inne naczynia) na wytrząsarce na biegunach ustawionej na 50-80 Hz.</li>
	<li>Okresowo sprawdzaj wzrokowo roztwór SDS. Gdy roztwór stanie się mętny, usuń roztwór pipetą (uważając, aby nie zassać mięśnia) i zastąp go równą objętością świeżej 1% SDS. Gdy roztwór pozostaje klarowny przez 24 godziny, decelularyzacja jest zakończona. 
	UWAGA: Częstotliwość wymagana do zmiany roztworu różni się w zależności od wielkości mięśni i początkowej objętości roztworu. Większe mięśnie, takie jak TA, potrzebują nowego SDS w ciągu kilku godzin, a mniejsze mięśnie, takie jak EDL, mogą przejść przez noc w oryginalnym roztworze.</li>
	<li>Usunąć końcowy roztwór SDS z mięśni pozbawionych komórek za pomocą pipety (uważając, aby nie zassać mięśnia) i zastąpić go równą objętością PBS.</li>
	<li>Sprawdź wzrokowo pozbawione komórek mięśnie pod mikroskopem preparacyjnym i użyj kleszczy i nożyczek, aby usunąć wszelkie włosy lub zanieczyszczenia, które przykleiły się do mięśnia. 
	UWAGA: Zwróć również uwagę na klarowność zdecelularizowanego mięśnia na tym etapie. Jeśli bezkomórkowy mięsień nie jest w pełni przezroczysty, a roztwór SDS nie zwiększa zmętnienia w ciągu 24 godzin, oznacza to, że decelularyzacja nie była skuteczna. Tworzy to artefakt w ocenach jakościowych i ilościowych, dlatego decelularyzacja powinna być zawsze optymalizowana na próbkach treningowych przed przystąpieniem do eksperymentalnych mięśni.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij PBS, zastąp go równą objętością 3,7% formaldehydu lub 4% roztworu paraformaldehydu i włóż płytkę z powrotem do wytrząsarki na 24 godziny 
	UWAGA: Upewnij się, że roztwór formaldehydu całkowicie pokrywa pozbawiony komórek mięsień, w przeciwnym razie barwienie będzie nierówne.</li>
</ol>
2. Wizualizacja IMAT z czerwonym olejem O
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór ORO.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 0,5 g proszku ORO (patrz tabela materiałów) w 100 ml izopropanolu w celu wytworzenia roztworu podstawowego. 
		UWAGA: Dodaj delikatne ciepło do roztworu, aby całkowicie go rozpuścić. Ten bulion można przechowywać w temperaturze pokojowej przez 1 miesiąc.</li>
		<li>Połączyć roztwór podstawowy ORO i wodę dejonizowaną w stosunku 60:40, aby uzyskać roztwór roboczy potrzebny dla wszystkich mięśni o objętości co najmniej 0,1 ml / mg masy mięśniowej. Typowe objętości to 6 ml, 3 ml i 1,5 ml odpowiednio dla płytek 6-, 12- i 24-dołkowych. 
		UWAGA: Sprawdź roztwór podstawowy przed zmieszaniem. Jeśli roztwór podstawowy zawiera znaczne ilości cząstek stałych, należy przygotować świeży bulion.</li>
		<li>Przykryj roztwór roboczy na 10 minut, aby cząstki stałe mogły się osadzić.</li>
		<li>Przefiltrować roztwór roboczy przez siatkę 40 μm, a następnie przez filtr strzykawkowy 0,22 μm. 
		UWAGA: Filtr strzykawkowy 0,22 μm szybko się zapycha i należy go wymienić, jeśli roztwór roboczy nie przepycha się łatwo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń roztwór formaldehydu lub paraformaldehydu i umyj pozbawione komórek mięśnie trzema podmianami roztworu o równej objętości PBS.</li>
	<li>Zastąp PBS równą objętością 60% roztworu izopropanolu i inkubuj na kołyszącym się wytrząsarce przez 5 minut.</li>
	<li>Zastąp 60% roztwór izopropanolu roztworem roboczym ORO i inkubuj na wytrząsarce bujającej przez 10 min. 
	UWAGA: Upewnij się, że roztwór roboczy ORO całkowicie pokrywa mięsień pozbawiony komórek, w przeciwnym razie barwienie będzie nierówne.</li>
	<li>Zastąp roztwór roboczy ORO równą objętością 1% SDS. Okresowo sprawdzaj wzrokowo roztwór SDS. Gdy roztwór stanie się zauważalnie różowy, usuń roztwór pipetą (uważając, aby nie zassać mięśnia) i zastąp go świeżym 1% SDS.</li>
	<li>Gdy roztwór pozostaje klarowny przez 24 godziny, zastąp 1% SDS PBS i sprawdź zabarwiony mięsień pod mikroskopem preparacyjnym/stereoskopowym przy 4-krotnym powiększeniu. Usuń wszelkie widoczne zanieczyszczenia lub cząstki przyklejone na zewnątrz mięśnia. Jeśli jest to rozległe, pozbawiony komórek mięsień można delikatnie zwinąć na chusteczkę czyszczącą, aby usunąć zanieczyszczenia/cząstki.</li>
	<li>Jeśli barwienie jest zadowalające (jaskrawoczerwone kule unoszące się w przezroczystej matrycy), uzyskaj obrazy barwienia zgodnie z potrzebami za pomocą kamery dołączonej do mikroskopu stereoskopowego (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Jeśli mikroskop sekcyjny nie ma dołączonej kamery, do robienia zdjęć przez okular można użyć aparatu w telefonie.</li>
</ol>
3. Wizualizacja kropelek lipidów IMAT za pomocą BODIPY
UWAGA: Obrazowanie konfokalne jest najbardziej skuteczne w przypadku cienkich mięśni, takich jak EDL lub przepona (~2 mm grubości). Alternatywnie można zastosować paski mięśni o porównywalnej grubości, takie jak TA.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór fluorescencyjny BODIPY 493/503 w stężeniu 1:200 (patrz tabela materiałów) w PBS, aby uzyskać objętość roztworu roboczego co najmniej 0,1 ml/mg masy mięśniowej. Typowe objętości to 6 ml, 3 ml i 1,5 ml odpowiednio dla płytek 6-, 12- i 24-dołkowych.</li>
	<li>Usuń formaldehyd, paraformaldehyd lub 1% SDS i umyj pozbawione komórek mięśnie trzema podmianami roztworu o równej objętości PBS.</li>
	<li>Zastąp PBS roztworem roboczym BODIPY i inkubuj na wytrząsarce na biegunach przez 20 minut.</li>
	<li>Umyj pozbawione komórek mięśnie trzema podmianami roztworu o równej objętości PBS.</li>
	<li>Umieść mięsień w naczyniu o przezroczystym dnie, które jest kompatybilne z dostępnym mikroskopem konfokalnym. Idealnie byłoby, gdyby naczynie miało zagłębione dno, aby umieścić szkiełko nakrywkowe na mięśniu bez jego deformacji (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Uzyskać stosy obrazów za pomocą standardowego mikroskopu konfokalnego (patrz tabela materiałów) przy użyciu lasera 488. Typowe rozmiary stosów dla EDL to 0,5-1 mm przy grubości warstwy 10 μm, co daje 50-100 obrazów na stos. 
	UWAGA: Aby określić ilościowo całkowitą objętość lipidów, całkowitą liczbę kropelek lipidów IMAT i najbliższy sąsiedni wskaźnik grupowania, zobrazuj całą objętość mięśnia, zwracając uwagę na pozostawienie pewnego zachodzenia na siebie w celu rejestracji obrazu. Aby określić ilościowo średnią objętość kropelek lipidów, jeden stos może być wystarczający</li>.
	<li>W razie potrzeby zabarwić mięśnie ORO, zgodnie z sekcją 2, aby uzyskać uzupełniający obraz rozkładu IMAT w całych mięśniach. 
	UWAGA: Ponieważ BODIPY jest fluorescencyjny, nie będzie widoczny pod mikroskopem świetlnym podczas pozyskiwania obrazów OR.</li>
</ol>
4. Oszacowanie całkowitej objętości lipidów przez ekstrakcję lipidów
<ol>
	<li>Po uzyskaniu obrazu przenieś mięśnie do 200 μl izopropanolu w indywidualnych dołkach 96-dołkowej płytki lub dostosuj dołek/objętość, jeśli mięsień jest zbyt duży, aby się zmieścić.</li>
	<li>Mieszać roztwór, stukając w płytkę, pipetując roztwór w górę iw dół i/lub mechanicznie miażdżąc mięsień końcówką pipety, aż pod mikroskopem w mięśniu pozbawionym komórek nie będzie widać czerwonych/fluorescencyjnych kulek. 
	UWAGA: Traktuj wszystkie mięśnie tą samą kombinacją stukania, pipetowania i miażdżenia, aby uzyskać najlepszą niezawodność. Należy również pamiętać o ograniczeniu czasu spędzonego na stukaniu, pipetowaniu i kruszeniu, ponieważ izopropanol szybko odparuje.</li>
	<li>Wymieszać roztwór w każdym dołku, pipetując w górę i w dół, a następnie przenieść 75 μl do dwóch czystych dołków płytki.</li>
	<li>Przykryć płytkę i odczytać absorbancję zduplikowanych studzienek o pojemności 75 μl za pomocą spektrofotometru lub czytnika płytek. Jeśli konstrukt został zabarwiony ORO, odczytać roztwór przy 500 nm; jeśli był zabarwiony BODIPY 493/503, odczytaj tabliczkę pod kątem 493 nm. 
	UWAGA: Jeśli konstrukt został wybarwiony zarówno BODIPY, jak i ORO, zaleca się odczytanie płytki przy 500 nm, ponieważ odczyty 500 nm dają podobne wyniki między konstruktami barwionymi tylko ORO i ORO plus BODIPY.</li>
	<li>W razie potrzeby podzielić odczyt absorbancji przez zarejestrowaną masę mięśnia, aby skorygować różnice w wielkości między próbkami.</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja wskaźników kropelek lipidów IMAT na podstawie obrazów konfokalnych
UWAGA: Ta sekcja wymaga dostępu do ImageJ w wersji 1.47 (zobacz Spis materiałów) lub nowszej oraz podstawowych umiejętności ImageJ40.
<ol>
	<li>Otwieranie stosów konfokalnych w ImageJ. 
	UWAGA: Różne mikroskopy konfokalne mogą zapisywać obrazy konfokalne w różnych formatach. ImageJ może wymagać dodatkowej wtyczki lub wariantu, takiego jak Fiji, aby otworzyć stacks41. Zastosowane algorytmy są częścią pakietu oprogramowania ImageJ.</li>
	<li>Uruchom algorytm progowy w ImageJ, aby zidentyfikować dodatnie piksele BODIPY. Spowoduje to przekonwertowanie bieżącego obrazu na obraz binarny.
	<ol>
		<li>Otwórz interfejs użytkownika progu, wybierając opcję Obraz > Dostosuj > Próg. W interfejsie użytkownika wybierz Intermodes jako typ progowania i upewnij się, że wybrano opcję Ciemne tło. Nie trzeba wybierać żadnych innych opcji. Następnie kliknij Zastosuj.</li>
		<li>Otworzy się okno dialogowe, w którym można przekonwertować stos na binarny. Upewnij się, że wybrano następujące opcje: Metoda: Intermodes; Tło: ciemne. Oblicz próg dla każdego obrazu i czarnego tła (masek binarnych). Spowoduje to wygenerowanie stosu binarnego, gdzie biały oznacza dodatnie piksele BODIPY, a oznacza ujemne piksele BODIPY. 
		UWAGA: Algorytm progowania Intermodes może nie być najlepszym wyborem dla wszystkich użytkowników. Subiektywna kontrola wbudowanych opcji progowania ImageJ pomaga wybrać optymalny algorytm separacji pikseli dodatnich i ujemnych BODIPY.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom algorytm Watershed w ImageJ, aby oddzielić dotykające się kropelki lipidów. Wybierz pozycję Process > binary > Watershed (Zlewnia binarna). Otworzy się okno dialogowe z pytaniem, czy wszystkie obrazy w stosie powinny zostać przetworzone. Wybierz opcję Tak. Spowoduje to dodanie cienkich czarnych linii dzielących większe obszary jednolitej bieli.</li>
	<li>Zidentyfikuj zwrot z inwestycji za pomocą algorytmu analizy cząstek w ImageJ.
	<ol>
		<li>Wybierz opcję Analizuj > Analizuj cząstki. Otworzy się okno dialogowe, w którym można ustawić ustawienia wyboru. 
		UWAGA: Wybór zakresu rozmiarów ma kluczowe znaczenie dla uzyskania najlepszego oszacowania zwrotu z inwestycji w krople lipidów. Dolna granica eliminuje obszary, które są prawdopodobnie zbyt małe, aby mogły być kropelkami lipidów pochodzącymi z IMAT (artefakt tła), a górna granica eliminuje regiony, które są prawdopodobnie zbyt duże, aby być pojedynczymi kropelkami lipidów pochodzącymi z IMAT (dotykającymi kropelek lipidów, które nie zostały oddzielone przez algorytm Watershed).</li>
		<li>Aby ustawić te wartości, otwórz oryginalny obraz i obrysuj najmniejszą i największą kroplę lipidu w polu widzenia za pomocą narzędzia Owal. Następnie dodaj te kształty do menedżera ROI, wpisując "t". Wybierz opcję Analizuj, a następnie Ustaw pomiary. Otworzy się okno dialogowe, w którym można wybrać ustawienia.
		<ol>
			<li>Zaznacz opcję Tylko obszar i kliknij przycisk OK. Następnie wybierz opcję Zmierz w menedżerze zwrotu z inwestycji. Użyj dwóch miar powierzchni z tego okna Wyniki jako zakresu rozmiarów w polu Analizuj cząstki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Upewnij się, że opcja Dodaj do menedżera jest zaznaczona. Nie są potrzebne żadne inne opcje.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nałóż ROI na stos konfokalny, zaznaczając opcję Pokaż wszystko w Menedżerze ROI. Użyj suwaka, aby sprawdzić każdy plasterek stosu z osobna i ręcznie dodać brakujące regiony za pomocą narzędzia Owal (znajdującego się na pasku narzędzi ImageJ).</li>
	<li>Wyprowadzaj pomiary ROI. Wybierz opcję Analizuj > ustaw pomiary, a następnie wybierz opcję Obszar, Środek ciężkości, Dopasuj elipsę i Położenie stosu. Kliknij OK. Następnie wybierz opcję Zmierz w menedżerze zwrotu z inwestycji. Dane w tabeli Wyniki można wybrać i skopiować do Matlaba lub Excela w celu dalszej analizy.</li>
	<li>Doprecyzuj ROI w każdym stosie do pojedynczego ROI za pomocą Refine.m Matlab code37 lub podobnego algorytmu. 
	UWAGA: Ten krok jest wymagany, ponieważ kroki 5.2-5.4 identyfikują tę samą kroplę lipidu w sąsiednich warstwach jako różne ROI. Jednak ROI można alternatywnie zidentyfikować tylko ręcznie, a zduplikowane ROI można wyeliminować ręcznie w ImageJ, aby uniknąć konieczności korzystania z Matlaba.</li>
	<li>Uzyskaj statystyki podsumowujące w ROI za pomocą Matlaba lub Excela.
	<ol>
		<li>Oszacuj całkowitą liczbę kropelek lipidów jako całkowitą liczbę ROI.</li>
		<li>Oszacuj objętość kropelki lipidów jako objętość elipsy dopasowanej do każdego ROI 2D, zakładając, że głębokość kształtu jest średnią z głównych i drugorzędnych osi elipsy.</li>
		<li>Oszacuj całkowitą objętość lipidów, która jest sumą indywidualnych szacowanych objętości kropelek lipidów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration via Decellularization

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W artykule opisano metody jakościowej wizualizacji i ilościowego określania nacieku tłuszczowego mięśni szkieletowych w małych modelach zwierzęcych, które można zastosować do dalszego zrozumienia patogenezy rozwoju i patologicznej ekspansji wewnątrzmięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT). Zastosowanie decelularizacji całych mięśni i barwienia rozpuszczalnego w tłuszczach pozwala na opłacalną, powtarzalną i prostą metodologię kompleksowej oceny obecności IMAT w całych mięśniach. 
Podstawą tego protokołu jest to, że decelularyzacja mięśni za pomocą SDS usuwa składniki komórkowe włókien mięśniowych, w tym małe kropelki lipidów IMCL, ale oszczędza duże kropelki lipidów w adipocytach wewnątrzmięśniowokomórkowych. SDS jest szeroko stosowany42 w inżynierii tkankowej do decelularyzacji matryc. Tkanki takie jak tkanka tłuszczowa i mięśnie szkieletowe zazwyczaj wymagają dodatkowej dysocjacji mechanicznej i/lub ekstrakcji alkoholowej w celu usunięcia resztkowego lipidu adipocytów42,43. Wcześniej wykazaliśmy, że dzieje się tak dlatego, że podczas gdy decelularyzacja za pomocą SDS eliminuje IMCL, oszczędza dużą kroplę lipidu w adipocytach37. Obrazowanie nienaruszonych mięśni przed i po decelularyzacji zabarwionych tetratlenkiem osmu za pomocą μCT potwierdziło, że przestrzenny wzór IMAT nie został zakłócony przez decelularyzację. Co więcej, kwantyfikacja triglicerydów domięśniowych w mięśniu pozbawionym komórek ze znikomym IMAT wynosiła ~ 5% wartości nienaruszonych mięśni, co potwierdza usunięcie IMCL. W związku z tym metodologia ta zachowuje kropelki lipidów IMAT w ich pierwotnym rozmieszczeniu anatomicznym poprzez półprzezroczystą macierz mięśniową.
Właściwa decelularyzacja jest najważniejszym krokiem w tym protokole. Jeśli decelularyzacja jest niekompletna, kropelki lipidów IMAT będą trudne do uwidocznienia, a resztkowy IMCL spowoduje wysokie zabarwienie tła za pomocą ORO lub BODIPY (ryc. 2). Typowe błędy popełniane przez niedoświadczonych użytkowników to niewystarczające pokrycie SDS na mięsień (w każdym dołku), tak że każdy mięsień nie jest całkowicie pokryty roztworem SDS, nieużywanie rockera do mieszania roztworu podczas decelularyzacji oraz niewystarczająco częste zmienianie roztworu. W tym manuskrypcie zaleciliśmy ilość SDS potrzebną na jednostkę masy mięśniowej, ale użytkownik nadal będzie musiał upewnić się, że mięśnie są całkowicie pokryte roztworami, ponieważ każdy mięsień ma unikalną geometrię. Użytkownikom zaleca się również swobodną zmianę roztworów (nawet dwa razy dziennie), aby zapewnić zakończenie decelularyzacji. Dobrej jakości barwienie kropelek lipidowych IMAT udało się osiągnąć już po 4 dniach leczenia SDS. Aby uzyskać wysokiej jakości wyniki barwienia ORO, ważne jest również odpowiednie utrwalenie i przygotowanie roztworu ORO. Podobnie jak w przypadku opisanej powyżej metody leczenia SDS, konieczne jest odpowiednie pokrycie 3,7% roztworem formaldehydu dla każdej próbki mięśni. Jeśli mięsień zostanie usunięty z utrwalacza zbyt wcześnie, kropelki lipidów będą tylko słabo zabarwiać się ORO. W sumie 1-2 godziny powinny wystarczyć, ale zaleca się utrwalenie przez noc, aby utrwalacz wniknął do środka mięśnia i w pełni związał wszystkie kropelki lipidów. Dodatkowym wyzwaniem związanym z barwieniem ORO jest to, że gdy stężenie alkoholu zostanie zmniejszone do 60%, zaczyna tworzyć się cząstka stała. Cząstki te mogą osadzać się na powierzchni i utknąć na granicy mięśni. Najlepszym sposobem, aby tego uniknąć, jest przygotowanie świeżego roztworu roboczego dla każdego barwienia i użycie zarówno filtrów o siatce 40 μm, jak i 0,22 μm. Następnie utrzymywanie mieszania z bujakiem i ograniczenie czasu barwienia do 10 minut pomoże zapobiec osadzaniu się powstających cząstek. Jeśli problem będzie się powtarzał, pomocne może być przygotowanie świeżego roztworu podstawowego ORO. Jeśli jakiś artefakt pozostaje przyklejony do zdecelularnej powierzchni mięśnia, do usunięcia tego artefaktu można użyć mikroskopu stereoskopowego, kleszczy i nożyczek chirurgicznych. Niewyeliminowanie artefaktów wpłynie na jakość obrazu mięśni i przeszacowa zawartość IMAT podczas części ekstrakcji lipidów w ramach przygotowań do odczytu OD. 
Ogólnie rzecz biorąc, technika ta jest prosta i oferuje kilka zalet w porównaniu ze złotymi standardowymi metodami wizualizacji i ilościowego określania nacieku tłuszczu mięśni szkieletowych. Techniki nieinwazyjne, takie jak tomografia komputerowa, rezonans magnetyczny i USG, które są szeroko stosowane u ludzi, a czasem w modelach zwierzęcych, mają ograniczoną rozdzielczość przestrzenną i nie są w stanie odróżnić kropelek lipidów od włókien mięśniowych. Tak więc piksel lub woksel o średniej intensywności sygnału jest przypisywany jako "mięsień" lub "tłuszcz", podczas gdy w rzeczywistości jest to prawdopodobnie mieszanka włókien mięśniowych i adipocytów. Częściej naciek tłuszczowy w mięśniach zwierzęcych ocenia się za pomocą histologii, najczęściej za pomocą ORO w kriosekcjach mięśni. Jednak zwykle wykonuje się to tylko w jednym reprezentatywnym przekroju i jest trudne do ilościowego określenia ze względu na rozproszenie lipidów w przekroju. W przeciwieństwie do tego, barwienie ORO całego mięśnia pozbawionego komórek zapewnia kompleksową ocenę IMAT przy podobnych kosztach i wysiłku, jak nienaruszona morfologia. Ponadto, oprócz poprawy wizualizacji, barwienie ORO decelularyzacji umożliwia ilościowe określenie nacieku tłuszczu przez ekstrakcję lipidów. Aby dokładniej zagłębić się w cechy nacieku tłuszczowego, można zastosować barwnik fluorescencyjny BODIPY w połączeniu z mikroskopią konfokalną. Umożliwia to rekonstrukcję pojedynczych kropelek lipidów IMAT w celu odwzorowania krajobrazu 3D, co nie jest możliwe w przypadku histologii, chyba że odcinki są analizowane na całej długości mięśnia. Chociaż mikroskop konfokalny nie jest standardowym sprzętem laboratoryjnym, jest bardziej prawdopodobne, że będzie dostępny na uniwersytecie lub w przemyśle niż rezonans magnetyczny lub tomografia komputerowa małych zwierząt. Co więcej, wiele z tych procesów można zautomatyzować, co zmniejsza koszt czasu w porównaniu z sekwencyjną histologią. Optymalizacja ustawień w mikroskopie konfokalnym jest dodatkowym czynnikiem branym pod uwagę przy barwieniu BODIPY. Są one unikalne dla każdego mikroskopu. Wartością krytyczną jest intensywność lasera, która musi być wystarczająco wysoka, aby wykryć kropelki lipidów na odległej powierzchni mięśnia, jednocześnie nie nasycając sygnału z kropelek lipidów po bliższej stronie. Z tego powodu sugeruje się, że stosowanie barwienia BODIPY z mikroskopią konfokalną najlepiej sprawdza się w przypadku cieńszych mięśni, w tym EDL lub przepony. 
Kilka ograniczeń tego podejścia wymaga omówienia. Po pierwsze, chociaż przewiduje się, że technika ta ma szerokie zastosowanie poza modelami urazów (kardiotoksyna i glicerol) u prezentowanych tutaj myszy, nowe zastosowania (np. model mdx) mogą wymagać optymalizacji, ponieważ rozmiar i skład mięśnia (np. zwłóknienie) mogą wpływać na decelularyzację, wymagając zwiększonego stężenia SDS lub czasu inkubacji. Inne modele chorobowe ze zmienioną masą mięśniową również wymagałyby analizy zarówno bezwzględnych, jak i znormalizowanych (do masy mięśniowej) wskaźników nacieku tłuszczowego w celu określenia bezwzględnej ilości lipidów lub procentu lipidów w stosunku do objętości mięśni, aby zapewnić bardziej znaczącą miarę wyniku. Co więcej, przewiduje się, że technika ta będzie szeroko stosowana do większych modeli zwierzęcych i biopsji ludzkich, ale może to wymagać optymalizacji dla każdego nowego zastosowania. Po drugie, w tej strategii cały mięsień musi być poświęcony temu testowi i nie może być wykorzystany do oceny innej cechy patologicznej. Badania, które mają na celu ocenę zmian podłużnych w IMAT, są lepiej obsługiwane za pomocą nieinwazyjnych technik obrazowania, a badania, których główny cel wymaga mięśnia do innych celów (histologia, ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy, western blotting) są lepiej obsługiwane przez ocenę histologiczną, ponieważ pozostałą część zamrożonego mięśnia można przypisać do innych testów. Jednak test ten dobrze nadaje się do łączenia z testami in vivo , takimi jak bieganie na bieżni lub testy skurczowe ex vivo , ponieważ pomiary te można wykonać przed decelularyzacją44. Po trzecie, chociaż zastosowanie barwienia BODIPY z mikroskopią konfokalną zapewnia wizualizację i kwantyfikację kropelek lipidów w wysokiej rozdzielczości, nie może jednoznacznie zidentyfikować kropelek lipidów jako pojedynczych adipocytów, ponieważ błona komórkowa jest usuwana, a endogenne białka adipocytów są tracone. Adipocyty wieloplamkowe, reprezentujące niedojrzałe adipocyty lub fenotyp "brązowo-beżowy", można zidentyfikować jako wiele kropelek lipidów. Wreszcie, protokół nie działa dobrze na wcześniej zamrożone mięśnie. Ograniczenia te są prawdopodobnie najgłębsze w przypadku biopsji u ludzi, ponieważ podczas gdy cała biopsja może być pozbawiona komórek, przestrzenny rozkład IMAT w biopsji prawdopodobnie nie będzie bardziej reprezentatywny dla całego mięśnia niż wycinek histologiczny. Ponieważ jednak technika ta jest stosunkowo niewrażliwa na warunki pracy z biopsją niezamrożoną (np. godziny na lodzie w PBS), biopsję można później podzielić na różne testy, w tym część do decelularyzacji, co zapewniłoby lepszą rozdzielczość poszczególnych kropelek lipidów.
Podsumowując, opracowano nowatorską metodę jakościowej i ilościowej analizy naciekania tkanki tłuszczowej mięśni szkieletowych poprzez barwienie i obrazowanie zatrzymanego lipidu konstruktów pozbawionych komórek. Metodologia ta oferuje ulepszenia w stosunku do metod opartych na złotym standardzie, ponieważ umożliwia kompleksowe obrazowanie trójwymiarowej infiltracji tłuszczu w mięśniach oraz szybką, tanią kwantyfikację za pomocą barwienia OR. W celu uzyskania bardziej szczegółowych pomiarów, drugie rozpuszczalne w tłuszczach barwienie BODIPY zapewnia bardziej szczegółową ocenę ilościową liczby kropel lipidów, objętości i wzorca dystrybucji, zgodnie z obrazem za pomocą mikroskopii konfokalnej. Razem te pomiary zapewniają naukowcom sposób na precyzyjny pomiar nacieku tłuszczu mięśni szkieletowych na poziomie poszczególnych kropelek lipidów bez pobierania próbek lub kosztownego nieinwazyjnego obrazowania.

Nagromadzenie adipocytów między włóknami mięśniowymi w mięśniach szkieletowych jest charakterystyczną cechą różnych schorzeń, od cukrzycy typu 2 przez sarkopenię po urazy mięśniowo-szkieletowe1,2,3,4,5,6,7. Kompleksowa ocena tej domięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT) ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia patogenezy tych schorzeń, ponieważ odkładanie się IMAT jest silnie skorelowane z insulinoopornością3,8,9,10 i słaba funkcja mięśni szkieletowych11,12,13,14,15. Chociaż powiązania te są obserwowane od dziesięcioleci, mechanizmy związane z IMAT i jego pochodzenie nadal pozostają obszarem intensywnych badań. Dzieje się tak częściowo dlatego, że większość badań oceniających naciek tłuszczowy mięśni szkieletowych przeprowadzono na ludziach, gdzie badania mechanistyczne są ograniczone16,17. Jednak ostatnio małe modele zwierzęce, w tym myszy, zostały wykorzystane do określenia komórkowej regulacji rozwoju i sygnalizacji IMAT18,19,20. Prace te mają na celu dostarczenie nowego narzędzia do wykorzystania z małymi modelami zwierzęcymi do jakościowej wizualizacji i ilościowego określania nacieku tłuszczu mięśni szkieletowych.
Klinicznie w populacjach ludzkich, naciek tłuszczowy jest oceniany za pomocą metod nieinwazyjnych, w tym tomografii komputerowej (CT)6,21, rezonans magnetyczny (MRI)16,17,22,23 i ultrasonografia (US)17,24. Te techniki obrazowania zazwyczaj identyfikują zdefiniowany obszar zainteresowania (ROI) w mięśniu i uzyskują wycinki obrazu w tym regionie, chociaż zastosowano również kompleksowe podejścia25,26,27. Te wycinki obrazu są poddawane gradacji jakościowej6 i określane ilościowo za pomocą progowania pikseli28. Podobne podejścia stosowano wcześniej u zwierząt29,30; Są one jednak kosztowne i wymagają dostępu do systemów obrazowania małych zwierząt. Rozdzielczość przestrzenna za pomocą tomografii komputerowej i rezonansu magnetycznego również stanowi poważny problem, ponieważ nie są one w stanie oddzielić adipocytów IMAT od włókien mięśni szkieletowych w wokselu, a zamiast tego polegają na subiektywnym oddzieleniu głównie regionów mięśniowych i głównie regionów IMAT31,32. W związku z tym niemożność dokładnej identyfikacji tkanki tłuszczowej lub mięśniowej powoduje również niedokładne określenie ilościowe reprezentatywnych ilości tych tkanek.
Ze względu na te ograniczenia, obecne techniki oceny naciekania tłuszczu mięśni szkieletowych w małych modelach zwierzęcych najczęściej polegają na histologii jako taniej i dostępnej alternatywie33,34. Standardowe procedury barwienia, w tym hematoksylina i eozyna (H&E), czerwień olejowa O (ORO) oraz barwienie immunologiczne markerów adipocytów, takich jak perylipida, pozwalają na proste wykrycie i wizualizację adipocytów zawierających naciek tłuszczowy w mięśniach. Jednak podejścia histologiczne rzadko są kompleksowe i zazwyczaj ocena jakościowa lub ilościowa IMAT jest ograniczona do jednej sekcji34. Ekstrakcja lipidów została również wykorzystana do ilościowego określenia całkowitej ilości lipidów mięśniowych35; jednak ta technika nie rozróżnia między wewnątrzmięśniowokomórkowymi magazynami lipidów (IMCL) i śródmięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT)36. Podsumowując, obecne metodologie wizualizacji i ilościowego oznaczania tkanki tłuszczowej w mięśniach pozostają ograniczone albo przez koszty finansowe, albo specyficzne wykrywanie IMAT.
Tutaj opisujemy szczegółową metodę oceny nacieku tłuszczowego mięśni szkieletowych, zarówno poprzez jakościową wizualizację, jak i wieloskalową kwantyfikację. Metodologia ta wykorzystuje prostą technikę decelularyzacji, która usuwa struktury mięśniowokomórkowe, w tym IMCL, ale utrzymuje nienaruszone większe kropelki lipidów pochodzące z adipocytów IMAT. Opublikowano walidację specyficzności tej techniki37, w tym za pomocą ekstrakcji lipidów w celu wykazania zubożenia IMCL z decelularyzacją, μCT w celu pokazania zachowania wzorca IMAT z decelularyzacją oraz histologii w celu pokazania podobnego rozkładu wielkości kropelek lipidów IMAT w porównaniu z tymi zidentyfikowanymi za pomocą decelularyzacji. Po decelularizacji mięśnie można zabarwić barwnikami rozpuszczalnymi w tłuszczach w celu jakościowej wizualizacji wzoru i zakresu nacieku tłuszczowego i/lub obrazowania ilościowego poszczególnych kropelek lipidów IMAT. Barwniki można następnie ekstrahować izopropanolem, a gęstość optyczną (OD) otrzymanego roztworu można wykorzystać do oszacowania objętości lipidów IMAT. Rygorystyczna walidacja tej techniki została opublikowana w innym miejscu37. Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół stosowania tej metodologii z mięśniami myszy i zawiera wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów, które wspierają przyjęcie tej metody w innych zastosowaniach, takich jak mięśnie innych gatunków lub inne tkanki.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; m Filtr strzykawkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>1 ml LuerLock</td><td></td> Szkiełka nakrywkowe <td>Fisher Scientific</td> 14823434 <td></td></tr><tr><td>12 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545F</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 12-dołkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1H</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (Isopropanol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516</td><td>0,5 mg/ml roztwór podstawowy można przechowywać w temperaturze pokojowej przez 1 miesiąc. Roztwór roboczy musi być świeży.</td></tr><tr><td>37% roztwór formaldehydu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8187081000</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m Filtr siatkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>87711</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-2C</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Fisher Scientific</td><td>D-3922</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Myszy</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Czasza do obrazowania konfokalnego</td><td>VWR</td><td>734-2905</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>TCS SPEII</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny/stereoskopowy</td><td>Zeiss</td><td>4107009123001000</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do preparacji</td><td>Narzędzia do nauki</td> precyzyjnej <td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>Narzędzia do nauki o naukach</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>033361.K2</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O Powder</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>Bio-tek</td><td>Synergy II&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rocker/Shaker</td><td>Niezawodny naukowy</td><td>55D</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>1% roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej przez 1 miesiąc</td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>137119D</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja nacieku tkanki tłuszczowej mięśni szkieletowych na podstawie decelularyzacji

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Naciek tłuszczowy to nagromadzenie adipocytów między włóknami mięśniowymi w mięśniach szkieletowych i jest charakterystyczną cechą wielu miopatii, zaburzeń metabolicznych i dystrofii. Klinicznie w populacjach ludzkich naciek tłuszczowy ocenia się za pomocą metod nieinwazyjnych, w tym tomografii komputerowej (CT), rezonansu magnetycznego (MRI) i ultrasonografii (USG). Chociaż w niektórych badaniach wykorzystano tomografię komputerową lub rezonans magnetyczny do ilościowego określenia nacieku tłuszczu w mięśniach myszy, koszty i niewystarczająca rozdzielczość przestrzenna pozostają wyzwaniem. Inne metody na małych zwierzętach wykorzystują histologię do wizualizacji poszczególnych adipocytów; Jednak metodologia ta cierpi z powodu błędu systematycznego w patologii heterogenicznej. Protokół ten opisuje metodologię jakościowego oglądania i ilościowego pomiaru nacieku tłuszczowego kompleksowo w nienaruszonych mięśniach myszy i na poziomie poszczególnych adipocytów za pomocą decelularyzacji. Protokół nie jest ograniczony do konkretnych mięśni lub określonych gatunków i może być rozszerzony na biopsję człowieka. Ponadto oceny jakościowe i ilościowe brutto można przeprowadzać za pomocą standardowego sprzętu laboratoryjnego przy niewielkich kosztach, dzięki czemu procedura ta jest bardziej dostępna we wszystkich laboratoriach badawczych.

Jakościowa wizualizacja naciekania tłuszczowego mięśni szkieletowych 
Prawidłowo zdecelularyzowane mięśnie są białe i półprzezroczyste (sekcja 1; Rysunek 1). Po zabarwieniu zdecelularyzowanych mięśni barwnikiem ORO w celu wizualizacji IMAT (sekcja 2), krople lipidów IMAT są widoczne w przejrzystych strukturach mięśniowych jako czerwone sfery (Rysunek 1). Zdrowe mięśnie kończyn dolnych myszy wykazują niewielką ilość naturalnego IMAT, co przejawia się brakiem lub niewielką ilością czerwonych lipidów pozytywnych w badaniu ORO (Rysunek 1A). W porównaniu z nimi, mięśnie kończyn dolnych, w które wstrzyknięto kardiotoksynę (CTX; Rysunek 1B) lub glicerol (GLY; Rysunek 1C) 14 dni przed decelularyzacją, wykazują zwiększoną akumulację IMAT, przy czym wyższe stężenie IMAT występuje po podaniu CTX w porównaniu z GLY, co odnotowano wcześniej37.
Niepełną decelularyzację można zidentyfikować bezpośrednio po wstępnej obróbce SDS lub po wypłukaniu barwnika ORO jako półprzezroczyste, jasnoróżowe włókna (Rycina 2B w porównaniu z Ryciną 2A). Niepełne usunięcie ORO można rozpoznać po wypłukaniu barwnika jako różowe lub czerwone jednorodne tło, a nie wyraźne linie włókien (Rycina 2C). Rycina 2A,B zawiera również tkankę tłuszczową epimuscularną (gwiazdki), czyli skupisko kropli lipidowych poza decelularyzowanym mięśniem. Rycina 2C pokazuje ponadto fałdowanie mięśnia, które może wystąpić, jeśli mięśnie nie zostaną rozłożone podczas procesu decelularyzacji. Niepełna decelularyzacja, niepełne usunięcie ORO oraz pozostałości tkanki tłuszczowej epimuscularnej sztucznie zwiększają gęstość optyczną (OD) ekstrahowanego lipidu, ale niekoniecznie utrudniają jakościową ocenę nacieku tłuszczowego, o ile zostaną one rozpoznane jako artefakty.
Ilościowe obrazowanie infiltracji tłuszczowej mięśni szkieletowych 
Kropelki lipidów znakowane fluorescencyjnie BODIPY można obrazować za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu bardziej szczegółowej oceny parametrów i rozkładu poszczególnych kropelek lipidów (Rysunek 3). Proces ten jest półautomatyczny, zgodnie z wcześniejszym opisem, obejmującym kod Matlab37. Prawidłowe barwienie BODIPY daje jasne kształty eliptyczne, odróżnialne od kształtów sąsiednich podczas obrazowania w płaszczyźnie (Rysunek 3A). Progowanie i segmentacja kształtów stanowią dobrą wstępną metodę generowania ROI dla każdej kropelki lipidów (Rysunek 3B), jednak wymagane są ręczne korekty w celu usunięcia błędów. Najczęstszym błędem są kropelki lipidów znajdujące się głęboko w tkance, które nie są jasne na żadnym z przekrojów (Rysunek 3B; różowe podwójne strzałki). Można to naprawić, dodając ROI ręcznie za pomocą narzędzia Oval w programie ImageJ (Rysunek 3C). Drugim błędem jest identyfikacja grupy kropelek lipidów jako pojedynczego ROI (Rysunek 3B; czerwona gwiazdka). Można to skorygować poprzez usunięcie pierwotnego ROI i zastąpienie go wieloma nowymi ROI (Rysunek 3D). Wreszcie, pojedyncza kropelka lipidów zostaje zidentyfikowana jako osobne ROI na wielu przekrojach, zatem zdublowane ROI muszą zostać połączone w jedno ROI (Rysunek 3E; niebieska strzałka). Najłatwiej jest to zrobić za pomocą narzędzia do przetwarzania danych, takiego jak Matlab, ale można to również wykonać ręcznie, identyfikując największe ROI i usuwając pozostałe. Średnie wartości dla każdego parametru u myszy C57BL6/J oraz 129Sv można znaleźć w pracy Biltz et al.37.
<img alt="Analiza histologiczna, tkanki mięśniowe, grupy leczone, obrazy mikroskopowe, porównanie barwienia na czerwono." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65461/65461fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przykład barwienia Oil Red O (ORO) zdecelularyzowanych mięśni. Mięśnie barwione ORO 14 dni po wstrzyknięciu soli fizjologicznej (SAL), kardiotoksyny (CTX) lub gliceryny (GLY). Mysie mięśnie prostownika długiego palców (EDL) oraz mięsień piszczelowy przedni (TA) wykazują niewielką ilość IMAT (czerwone sfery) przy leczeniu SAL (A), lecz akumulują IMAT w odpowiedzi na leczenie CTX (B) i GLY (C). Widoczna jest całkowita decelularyzacja i wypłukanie ORO, co potwierdzają wyraźne krople lipidów dodatnie pod względem ORO na przezroczystym, białym tle mięśnia. Paski skali = 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65461/65461fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza histologiczna decelularyzacji tkanki i usuwania ORO, porównanie obrazów mikroskopowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65461/65461fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przykłady słabych wyników barwienia ORO. Niepełna decelularyzacja lub niepełne usunięcie ORO prowadzi do powstania półprzezroczystego różowego/czerwonego tła. W porównaniu do przezroczystego białego tła całkowicie decelularyzowanego mięśnia przepony myszy (A), niepełna decelularyzacja charakteryzuje się jasnoróżowymi/czerwonymi śladami włókien (B), a niepełne usunięcie ORO charakteryzuje się rozproszonym różowym/czerwonym tłem (C). Paski skali: panele górne = 1 mm; panele dolne = 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65461/65461fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat mikroskopii fluorescencyjnej pokazujący przekroje komórkowe, skala 100μm, do analizy strukturalnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65461/65461fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Przykłady identyfikacji pojedynczych kropel lipidowych z wykorzystaniem barwienia fluorescencyjnego BODIPY i mikroskopii konfokalnej Pojedyncze krople lipidowe zabarwione BODIPY mogą zostać zidentyfikowane i ilościowo określone w odkomórkowionych mięśniach przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Pojedyncze przekroje z serii obrazów konfokalnych pokazują krople lipidowe znajdujące się w płaszczyźnie jako jasne zielone elipsy, a krople lipidowe poza płaszczyzną jako słabiej widoczne kształty (A; niebieskie strzałki). Progowanie w połączeniu z segmentacją obiektów metodą watershed i identyfikacją ROI pozwala na mapowanie obszarów zainteresowania (ROI) zabarwionych BODIPY (B). Progowanie może pominąć niektóre słabiej widoczne krople lipidowe (B; różowa podwójna strzałka), co wymaga ich ręcznej identyfikacji (C). Segmentacja watershed może grupować kilka kropel lipidowych razem (B; czerwona gwiazdka), co wymaga usunięcia ROI i ponownej ręcznej estymacji (D). Ta sama kropla lipidowa jest identyfikowana na wielu przekrojach, co wymaga rejestracji obrazów (E) w celu usunięcia zduplikowanych ROI. Paski skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65461/65461fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Niniejsze badanie opisuje oparte na decelularyzacji metodologie wizualizacji i ilościowego określania wewnątrzmięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT) poprzez nienaruszoną objętość mięśni, a także ilościowe określanie metryk poszczególnych adipocytów składających się na IMAT.

Kwantyfikacja nacieku tkanki tłuszczowej mięśni szkieletowych na podstawie decelularyzacji

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic ...

Interesuje nas wzajemne oddziaływanie między kurczącymi się mięśniami a adipocytami, które tworzą się między włóknami mięśniowymi w urazach i chorobach zwanych międzymięśniową tkanką tłuszczową lub IMAT. Inżynieria genetyczna w komórkach i myszach jest potężnym narzędziem do mechanicznego analizowania przesłuchów mięśni tłuszczowych. Analiza sygnalizacji za pomocą transkryptomiki i proteomiki identyfikuje mediatory, a następnie dostarczanie leków oparte na biomateriale może interweniować w te szlaki.Jednym z głównych wyzwań jest wyizolowanie i ilościowe określenie adipocytów IMAT. Szczególnie w małych modelach zwierzęcych sygnał IMAT jest wypłukiwany przez analizę całych mięśni, taką jak transkryptomika lub lipidomika. A ilościowe określanie IMAT za pomocą nieinwazyjnego obrazowania cierpi na podobne wymycie, ponieważ większość wokseli zawiera mieszaninę mięśni i IMAT.Niedawno zastosowaliśmy tę technikę opisaną w tym artykule, aby wykazać, że IMAT bezpośrednio upośledza kurczliwość mięśni. Dzięki precyzyjnym pomiarom osadzania IMAT wykazaliśmy, że nie tylko zastępuje on materiał skurczowy, ale także hamuje skurcz pozostałych mięśni beztłuszczowych. Protokół ten stanowi odpowiedź na wyzwania związane z kwantyfikacją IMAT.Obecnym standardem pomiaru IMAT u małych zwierząt jest histologia jednowycinkowa, która nie jest kompleksowym lub nieinwazyjnym obrazowaniem, które jest drogie i ma niską rozdzielczość. Uważamy, że ograniczyło to naszą wiedzę na temat przesłuchów mięśniowych IMAT. Technika ta zapewnia kompleksową i niedrogą metodę oceny IMAT poprzez jakościową wizualizację i wieloskalową kwantyfikację.Mamy nadzieję, że prostota tej techniki zachęci więcej badaczy do pomiaru IMAT i ich modeli zwierzęcych. Ponadto technika ta zapewni badaczom zainteresowanym IMAT bardziej precyzyjne narzędzie do odkrywania bardziej subtelnych relacji między adipocytami IMAT a innymi komórkami. Na początek sprawdź interesujące mięśnie wycięte z ofiarowanej myszy pod kątem braku odłamków kości lub postrzępionych krawędzi i w razie potrzeby odetnij je ostrymi nożyczkami.Zważ oczyszczone mięśnie za pomocą wagi analitycznej i zapisz ich wagę. Po umieszczeniu mięśnia w co najmniej 0,1 mililitra 1% SDS na miligram wagi, umieść płytkę dołka na kołyszącym się wytrząsarce ustawionej na 50 do 80 herców. Okresowo sprawdzaj wzrokowo roztwór SDS.Gdy roztwór stanie się mętny, usuń roztwór pipetą bez zasysania mięśni i zastąp go równą objętością świeżego 1% SDS. Gdy roztwór pozostaje klarowny przez 24 godziny, usuń końcowy roztwór SDS z pozbawionych komórek mięśni i zastąp go równą objętością PBS. Sprawdź pozbawione komórek mięśnie pod mikroskopem stereoskopowym i ostrożnie usuń wszelkie włosy lub zanieczyszczenia przyklejone do mięśnia za pomocą kleszczy.Ostrożnie wyjmij PBS i zastąp go równą objętością 3,7% formaldehydu przed ponownym umieszczeniem płytki w bujanym wytrząsarce na 24 godziny. Przygotuj roztwór ORO, rozpuszczając 0,5 grama proszku ORO w 100 mililitrach izopropanolu w celu wytworzenia roztworu podstawowego. Przygotuj roztwór roboczy dla wszystkich mięśni, łącząc roztwór podstawowy ORO i wodę dejonizowaną w stosunku 60:40.Przykryj roztwór roboczy na 10 minut, aby cząstki stałe mogły się osadzić. Przefiltruj go przez siatkę o wielkości 40 mikrometrów, a następnie przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,22 mikrometra. Następnie usuń roztwór formaldehydu z pozbawionych komórek mięśni w płytce studzienki i umyj mięśnie trzykrotnie równą objętością PBS.Następnie zastąp PBS równą objętością 60% roztworu izopropanolu i inkubuj go na kołyszącym się wytrząsarce przez pięć minut. Po zakończeniu zastąp 60% roztwór izopropanolu roztworem roboczym ORO przed 10 minutami inkubacji na wytrząsarce na biegunach. Następnie zastąp roztwór roboczy ORO równą objętością 1% SDS i okresowo sprawdzaj roztwór SDS.Gdy roztwór stanie się zauważalnie różowy, zastąp roztwór SDS świeżym 1%SDS. Gdy roztwór pozostanie klarowny przez 24 godziny, zastąp 1%SDS PBS. Pod mikroskopem stereoskopowym przy 4-krotnym powiększeniu usuń wszelkie widoczne zanieczyszczenia lub cząstki przyklejone na zewnątrz poplamionego mięśnia.Jeśli barwienie jest zadowalające, pokazując jaskrawoczerwone kule unoszące się w przezroczystej matrycy, uzyskaj obrazy barwienia za pomocą kamery podłączonej do mikroskopu stereoskopowego. Prawidłowo pozbawione komórek mięśnie były białe i półprzezroczyste. Kiedy pozbawione komórek mięśnie zabarwiono ORO w celu uwidocznienia śródmięśniowej tkanki tłuszczowej lub IMAT, kropelki lipidów IMAT były widoczne w czystych strukturach mięśniowych jako czerwone kule.Zdrowe mięśnie kończyn tylnych myszy wykazywały niewielki naturalny IMAT, o czym świadczyło niewiele lub brak czerwonego ORO-dodatniego lipidu, w porównaniu z mięśniami kończyn tylnych, którym wstrzyknięto kardiotoksynę lub glicerol. Niepełną decelularyzację stwierdzono natychmiast po początkowym leczeniu SDS lub po wypłukaniu barwienia ORO jako półprzezroczyste jasnoróżowe włókna. Niepełny klirens ORO został zidentyfikowany, po wypłukaniu ORO, jako różowe lub czerwone jednolite tło, a nie wyraźne linie włókien.Zacznij od przeniesienia zdecelularyzowanych mięśni szkieletowych wybarwionych ORO do 200 mikrolitrów izopropanolu w poszczególnych dołkach 96-dołkowej płytki. Mieszać roztwór, stukając w płytkę i mechanicznie rozgniatać mięsień końcówką pipety pod mikroskopem, aż w pozbawionej komórek zawiesinie mięśniowej nie będzie widać czerwonych kulek. Ponownie wymieszaj zawiesinę komórek w każdym dołku, pipetując w górę iw dół przed przeniesieniem 75 mikrolitrów do dwóch czystych dołków płytki.Przykryj płytkę i odczytaj absorbancję zduplikowanych studzienek o pojemności 75 mikrolitrów za pomocą spektrofotometru lub czytnika płytek. Aby rozpocząć kwantyfikację barwionych metryk kropelek lipidów IMAT, otwórz stosy konfokalne w ImageJ. Otwórz interfejs użytkownika progu, wybierając Obraz, następnie Dostosuj, a następnie Próg.W interfejsie użytkownika wybierz Intermodes jako typ progowania i upewnij się, że wybrano opcję Ciemne tło. Następnie kliknij Zastosuj, aby uruchomić algorytm progowy. Uruchom algorytm zlewni, aby oddzielić stykające się kropelki lipidów, wybierając opcję Proces, a następnie Binarny i Zlewnia.Wybierz opcję Tak w oknie dialogowym, aby przetworzyć wszystkie obrazy w stosie i dodać cienką czarną linię dzielącą większe obszary jednolitej bieli. Aby ustawić maksymalny i minimalny rozmiar cząstek, otwórz oryginalny obraz i obrysuj najmniejszą i największą kroplę lipidu w polu widzenia za pomocą narzędzia Owal. Następnie dodaj te kształty do Menedżera ROI, wpisując T, wybierz Analizuj, a następnie Ustaw miary.W oknie dialogowym wybierz ustawienia, zaznacz opcję Tylko obszar i kliknij przycisk OK. Następnie wybierz opcję Zmierz w Menedżerze zwrotu z inwestycji. Użyj dwóch miar powierzchni z tego okna Wyniki jako zakresu rozmiarów w polu Analizuj cząstki. Aby zidentyfikować obszar zainteresowania lub ROI za pomocą algorytmu Analizuj cząstki, wybierz pozycję Analizuj, a następnie Analizuj cząstki.Otworzy się okno dialogowe, w którym można ustawić ustawienia wyboru. Aby wyświetlić pomiary ROI, wybierz opcję Analizuj, a następnie Ustaw pomiary, a następnie wybierz opcję Obszar, Środek ciężkości, Dopasuj elipsę i Położenie stosu. Kliknij OK. Następnie wybierz opcję Zmierz w Menedżerze zwrotu z inwestycji.Dane w tabeli wyników można wybrać i skopiować do Excela w celu dalszej analizy. W celu szczegółowej oceny wskaźników i rozmieszczenia poszczególnych kropelek lipidów, znakowane fluorescencyjnie kropelki lipidów BODIPY zobrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Progowanie i segmentacja kształtu zapewniły dobre pierwsze przejście do generowania zwrotu z inwestycji dla każdej kropli lipidu.Jednak do poprawienia błędów potrzebne były ręczne edycje. Głębokie kropelki lipidów, które wydają się przyciemnione na obrazie, można dodać ręcznie za pomocą narzędzia Owal w ImageJ. Grupę kropelek lipidów, błędnie zidentyfikowanych jako pojedynczy ROI, można również skorygować, usuwając i zastępując pierwotny ROI wieloma nowymi ROI.Tam, gdzie pojedyncza kropla lipidu została zidentyfikowana jako unikalny zwrot z inwestycji w wielu warstwach, zduplikowane zwroty z inwestycji zostały skonsolidowane w jeden zwrot z inwestycji.

decellularization-based-quantification-skeletal-muscle-fatty

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Choroby nerwowo-mięśniowe często wykazują zróżnicowaną czasowo, przestrzennie niejednorodną i wieloaspektową patologię. Celem tego protokołu jest scharakteryzowanie tej patologii za pomocą nieinwazyjnych metod obrazowania metodą rezonansu magnetycznego.

Ilościowy rezonans magnetyczny w chorobach mięśni szkieletowych

Tutaj prezentujemy protokół do szybkich analiz włókien mięśniowych, który pozwala na poprawę jakości barwienia, a tym samym na automatyczne pozyskiwanie i kwantyfikację populacji włókien za pomocą swobodnie dostępnego oprogramowania ImageJ.

Szybki zautomatyzowany protokół analizy populacji włókien mięśniowych w przekrojach poprzecznych mięśni szczurów przy użyciu immunohistochemii łańcuchów ciężkich miozyny

Opisany tutaj jest protokół bezpośredniego znakowania immunologicznego martwiczych włókien mięśniowych w kriosekcjach mięśni. Komórki martwicze są przepuszczalne dla białek surowicy, w tym immunoglobuliny G (IgG). Ujawnienie wychwytu IgG przez włókna mięśniowe umożliwia identyfikację i ilościowe określenie włókien mięśniowych, które ulegają martwicy niezależnie od stanu mięśni.

Znakowanie immunologiczne zwyrodnienia włókien mięśniowych w biopsjach mięśni

Zmodyfikowana procedura po utrwaleniu zwiększa kontrast cząsteczek glikogenu w tkance. W tym artykule przedstawiono protokół krok po kroku opisujący, jak obchodzić się z tkanką, przeprowadzać obrazowanie i stosować metody stereologiczne w celu uzyskania bezstronnych i ilościowych danych na temat specyficznej dla typu włókien subkomórkowej dystrybucji glikogenu w mięśniach szkieletowych.

Kwantyfikacja subkomórkowego rozkładu glikogenu we włóknach mięśni szkieletowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Coraz więcej dowodów wskazuje, że nadmierna infiltracja lipidów wewnątrz mięśni szkieletowych prowadzi do lipotoksyczności i cukrzycy. Tutaj przedstawiamy kompletny protokół, w tym przetwarzanie tkanek, barwienie za pomocą Bodipy, akwizycję obrazu i analizę, w celu ilościowego określenia wielkości, gęstości i subkomórkowego rozkładu kropelek lipidów w sposób specyficzny dla rodzaju włókna.

Analiza zawartości kropelek lipidów w mięśniach szkieletowych pod kątem rodzaju włókien i subkomórek

Zastąpienie zdrowej tkanki mięśniowej tłuszczem śródmięśniowym jest charakterystyczną cechą ludzkich chorób i schorzeń. Protokół ten określa, jak wizualizować, obrazować i określać ilościowo śródmięśniową tkankę tłuszczową, umożliwiając rygorystyczne badanie mechanizmów leżących u podstaw tworzenia się śródmięśniowej tkanki tłuszczowej.

Przewodnik po badaniu śródmięśniowego tworzenia się tłuszczu i jego komórkowego pochodzenia w mięśniach szkieletowych

Ten protokół wykorzystuje mikrotomografię komputerową, aby umożliwić ekonomiczną kwantyfikację beztłuszczowej masy, w tym mięśni szkieletowych i tkanki trzewnej, tkanki tłuszczowej i tkanki szkieletowej u małych zwierząt. Rozróżnia tkankę beztłuszczową i tłuszczową, co daje znaczące korzyści w badaniach biomedycznych, szczególnie w badaniach translacyjnych na małych zwierzętach.

Nieinwazyjna kwantyfikacja mięśni szkieletowych u małych zwierząt za pomocą mikrotomografii komputerowej

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Niniejszy protokół opisuje procedurę badania oddychania mitochondriów izolowanych z mięśni szkieletowych. Metoda ta została opracowana na podstawie pracy Scorrano et al. (2007). Procedura izolacji mitochondriów zajmuje około 2 godzin. Pomiar oddychania mitochondriów może zostać ukończony w ciągu około 1 godziny.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych

Poznaj metodę decelularyzacji do kwantyfikacji tkanki tłuszczowej międzymięśniowej w mięśniach szkieletowych myszy. Technika ta umożliwia precyzyjną wizualizację i pomiar adipocytów IMAT oraz ocenę ich wpływu na kurczliwość mięśni.

Kwantyfikacja nacieku tkanki tłuszczowej mięśni szkieletowych na podstawie decelularyzacji

Przeglądaj więcej filmów