Wysokoprzepustowe testy behawioralnego starzenia się i długości życia przy użyciu maszyny Lifespan Machine

W naszym laboratorium badamy fizjologiczne i molekularne uwarunkowania starzenia się i długości życia, i robimy to w sposób ilościowy. W tym celu używamy nicienia C.elegans jako szybko starzejącego się, genetycznie podatnego modelu i używamy go z kombinacją narzędzi, takich jak maszyna do wydłużania życia. Odtwarzalność jest ważną kwestią w badaniach nad starzeniem się.

Aby temu zaradzić, często potrzebna jest duża populacja zwierząt do pomiaru solidnych zmian w długości życia, dlatego proces ten naprawdę korzysta ze zautomatyzowanych protokołów o wysokiej przepustowości. Wiele osób używało maszyny do wydłużania życia do wielu różnych celów i są z tego powodu naprawdę zadowoleni. Jeśli chodzi o nasze własne zastosowania, dwa najważniejsze odkrycia to, po raz pierwszy w 2016 roku, odkrycie skalowania czasowego jako powszechnego wyniku wielu interwencji związanych ze starzeniem się.

Po drugie, w 2022 r. odkryliśmy, że długość zdrowia i długość życia są determinowane przez wyraźne spadki fizyczne. Maszyna do pomiaru żywotności dostosowuje powszechnie stosowane protokoły płytek agarowych do zbierania danych dotyczących przeżycia i starzenia się behawioralnego z dużych populacji nicieni poprzez automatyzację i wysoką częstotliwość akwizycji obrazu. Eliminuje codzienny żmudny proces ręcznych testów przeżycia i gromadzi wcześniej nieosiągalne zestawy danych na temat zachowania nicieni.

Na początek upewnij się, że płytki skanera są gotowe z załadowanymi nicieniami. Ogólnie rzecz biorąc, około 40 zwierząt i 200 mikrolitrów bakteryjnego trawnika na talerz to optymalne warunki do eksperymentu z trawnikiem o żywotności. Rozpocznij konfigurację eksperymentalną, nakładając przeciwmgielny środek do czyszczenia szyb po obu stronach tafli szkła, które będą podtrzymywać płytki skanera.

Następnie nałóż ochronną hydrofobową powłokę szklaną na tę stronę szkła, która będzie stykać się z płytkami skanera. Odczekaj od pięciu do 10 minut i usuń wszelkie pozostałości z tafli szkła. Zastosuj 70% etanol, aby zdezynfekować stronę szkła, która będzie miała kontakt z płytkami skanera.

Pozostaw na jedną do dwóch minut, a następnie usuń etanol szmatką lub ręcznikiem papierowym. Aby załadować płytki na skanery, umieść autoklawowane maty gumowe na obrabianym szkle podtrzymującym płytę. Weź płytki skanera używane do obrazowania z załadowanymi nicieniami i zdejmij pokrywę.

Umieść talerze na gumowych matach skierowanych w stronę szklanej powierzchni. Odłącz wentylatory skanera, aby chronić palce eksperymentatora podczas ładowania płyty. Delikatnie wsuń płytki i podtrzymujące je tafle szkła na powierzchnię skanera.

Ponownie aktywuj wentylatory skanera i upewnij się, że wentylatory przednie i boczne są zasilane. W tym momencie włącz skanery. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy wykonać niezbędne czynności przed akwizycją obrazu, w tym uzyskać podgląd przechwyconego obrazu całej powierzchni skanera.

Korzystając z interfejsu internetowego, znajdź sekcję pobierania obrazów na stronie głównej i skorzystaj z linku o nazwie Urządzenia przechwytujące i serwery obrazów. W otwartym oknie kliknij Wyszukaj nowe urządzenia i upewnij się, że każdy skaner podłączony do serwera pojawia się w polu urządzenia do przechwytywania obrazu. Zaznacz pole wyboru odpowiadające każdemu skanerowi zawierającemu nowo załadowane płyty, a następnie kliknij przycisk Poproś o przechwycenie podglądu.

Następnie w przeglądarce robaka wybierz Plik, Otwórz obraz, a następnie wybierz żądany obraz, aby otworzyć każdy podgląd przechwyconego obrazu. Dla każdego obrazu kliknij, aby wybrać kolumny odpowiadające regionom zawierającym blachy. Po zdefiniowaniu wszystkich obrazów wybierz opcję Image Acquisition (Akwizycja obrazu), Define Scan Areas (Definiuj obszary skanowania), zapisz wybrane obszary skanowania na dysku, a następnie wybierz żądaną lokalizację, aby wyeksportować specyfikacje regionów na dysk.

Zbierz plik zawierający nazwę eksperymentu, fizyczne lokalizacje każdej kolumny na skanerach, całkowity czas trwania eksperymentu i częstotliwość przechwytywania obrazu. Zapisz to jako tekst i plik XML. W przeglądarce robaka kliknij Pobieranie obrazu, Prześlij harmonogram eksperymentu i wybierz wygenerowany plik XML.

Przeglądarka robaka zapyta, czy wyświetlić podsumowanie harmonogramu, czy uruchomić eksperyment. Wygeneruj plik podsumowania. Sprawdź daty zaplanowanych przechwyceń, lokalizację, nazwę i liczbę skanerów w podsumowaniu.

Ponownie załaduj plik XML dla harmonogramu eksperymentu, jak pokazano. Przeglądarka robaka zapyta po raz drugi, czy wyświetlić podsumowanie harmonogramu, czy uruchomić eksperyment. Tym razem wybierz opcję uruchomienia eksperymentu.

Maszyna o żywotności będzie teraz działać autonomicznie, dopóki nie zostaną zakończone końcowe skanowania, określone w harmonogramie eksperymentu. Po zakończeniu eksperymentu i wykonaniu wszystkich etapów pozyskiwania obrazu i opłaty pocztowej ręcznie zweryfikuj automatyczne wyniki za pomocą przeglądarki robaków. W menu przeglądarki robaka kliknij Plik, wybierz Bieżący eksperyment i wybierz żądany eksperyment.

Aby wygenerować scenorys, kliknij pozycję Walidacja, Przeglądaj cały eksperyment, a następnie wybierz opcję Natychmiast po śmierci każdego robaka. Kliknij prawym przyciskiem myszy obraz obiektu, aby wykluczyć obiekty inne niż robaki z serii ujęć. Aby wykluczyć wszystkie obiekty na stronie jednocześnie, przytrzymaj Control i kliknij prawym przyciskiem myszy dowolny obiekt.

Kliknij dwukrotnie prawym przyciskiem myszy, aby ponownie uwzględnić wykluczony obiekt w analizie. Aby zapisać adnotacje wykonane podczas adnotacji scenorysu, kliknij przycisk Zapisz. Kliknij lewym przyciskiem myszy dowolny obiekt serii ujęć, aby otworzyć nowe okno, w którym wyświetlane są szczegółowe informacje o szeregach czasowych dotyczące tego obiektu.

Aby ręcznie dodać adnotacje do czasów śmierci, kliknij lewym przyciskiem myszy na dolnym pasku w punkcie odpowiadającym czasowi śmierci. Użyj spacji i strzałek w prawo lub w lewo na klawiaturze, aby poruszać się po przedziałach czasowych lub kliknij bezpośrednio na pasku w żądanym przedziale czasowym. Ręcznie dodawaj adnotacje do zdarzeń skurczu i rozszerzania, klikając prawym przyciskiem myszy dolny pasek w żądanym przedziale czasowym.

Zobacz krzywe przeżycia po lewej stronie i wykres punktowy porównujący czas zaprzestania energicznego ruchu z czasem śmierci dla każdej osoby po prawej stronie scenorysu. Aby wygenerować czasy śmierci dla eksperymentu w przeglądarce robaka, wybierz Pliki danych, Czasy śmierci, a następnie kliknij Generuj czasy śmierci dla bieżącego eksperymentu. Wpływ ręcznej walidacji danych na krzywe przeżycia przedstawiono tutaj.

Początkowe krzywe przeżycia, utworzone przed adnotacją scenorysu, zostały zniekształcone przez niewłaściwe włączenie obiektów niebędących robakami. Po wykluczeniu obiektów niebędących robakami podczas ręcznej adnotacji scenorysu, wynikowe krzywe przeżycia wyświetlały znacznie lepszą rozdzielczość. Graficzna reprezentacja przedstawia szacowaną średnią pozostałą długość życia na różnych etapach analizy po akwizycji obrazu i jej korelację z długością życia robaków.

Stwierdzono, że ręczne opisywanie czasów śmierci w behawioralnej analizie starzenia się jest szczególnie ważne u dłużej żyjących robaków. W tym przypadku te, które są narażone na najniższe stężenia wołów. Podsumowując, automatyczne szacowanie czasu śmierci przez maszynę do pomiaru długości życia jest wystarczająco dokładne do testów przeżycia.

Podczas gdy behawioralne testy starzenia się mogą skorzystać z ręcznej adnotacji.