Name: Metody elektroporacji i potwierdzania przemian u Limosilactobacillus reuteri DSM20016 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Poznaj metody elektroporacji i potwierdzania przemian u Limosilactobacillus reuteri DSM20016. Protokoły obejmują hodowlę, transformację plazmidową, PCR kolonii oraz pomiar fluorescencyjnych białek reporterowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bardzo doceniamy cenne rady udzielone przez Prof. J.P. van Pijkeren (University of Wisconsin-Madison), którego wskazówki dotyczące pracy z L. reuteri ATCC PTA 6475 stanowiły podstawę dla opisanych tutaj metod.

1. Przygotowanie L. reuteri DSM20016 elektrokompetentnych komórek
UWAGA: To jest oparte na protokole Berthier et al.17, z prędkościami wirowania podanymi przez Rattanachaikunsopon et al.18.
<ol>
	<li>W probówce wirówkowej o pojemności 50 ml zaszczepić L. reuteri z wywaru glicerolu w 6 ml bulionu deMan Rogosa Sharpe (MRS). Inkubować tlenowo przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze statycznym.</li>
	<li>Następnego ranka zaszczepić 4 ml nocnej kultury w 200 ml bulionu MRS (rozcieńczenie 1:50).</li>
	<li>Pozostawić do wzrostu tlenowego w statycznym inkubatorze o temperaturze 37 °C, aż wartość gęstości optycznej 600 nm (OD600) osiągnie 0,5-0,85; powinno to zająć około 2-3 godzin.</li>
	<li>Gdy tylko zostanie osiągnięta odpowiednia wartość OD600, zdekantuj pożywkę do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i umieść na lodzie, jednocześnie równoważąc probówki.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 5 000 x g w wstępnie schłodzonej wirówce o temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić każdy osad w 50 ml wstępnie schłodzonego (0 °C do 4 °C) ddH2O i ponownie odwirować z tymi samymi ustawieniami, co w poprzednim kroku. Utrzymuj komórki na lodzie tak bardzo, jak to możliwe.</li>
	<li>Powtórz krok 1.6.</li>
	<li>Zawiesić każdą granulkę w 25 ml ddH2O: 0,5 M sacharozy, 10% glicerolu. Wirować przy 5 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min. Odrzucić supernatant i umieścić komórki z powrotem na lodzie.</li>
	<li>Ponownie zawiesić wszystkie granulki w tych samych 2 ml ddH2O: 0,5 M sacharozy, 10% glicerolu.</li>
	<li>Podwielokrotność podzielić na porcje o pojemności od 50 μl do 100 μl we wstępnie schłodzonych probówkach do mikrowirówek; przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.</li>
</ol>
2. Elektroporacja L. reuteri 
UWAGA: Unikaj pipetowania tak bardzo, jak to możliwe, w następujących krokach. Zaleca się włączenie kontrolnej elektroporacji, bez dodatku plazmidu, aby upewnić się, że dobór antybiotyków jest odpowiedni.
<ol>
	<li>Weź całą elektrokompetentną podwielokrotność L. reuteri i rozmroź ją na lodzie.</li>
	<li>Delikatnie wymieszać 5 μl z 10 μl plazmidu (końcowe stężenie plazmidu >6 nM) z rozmrożoną podwielokrotnością, unikając w miarę możliwości pipetowania.</li>
	<li>Przenieść do chłodzonej lodem kuwety elektroporacyjnej o szczelinie 1 mm.</li>
	<li>Elektroporacja przy napięciu 1,25 kV, 400 Ω i 25 μF.</li>
	<li>Dodaj 1 ml bulionu MRS o temperaturze pokojowej (RT) i wymieszaj, odwracając kuwetę raz lub dwa razy.</li>
	<li>Umieścić kuwety w inkubatorze statycznym w temperaturze 37 °C na 2,5-3 godziny, aby umożliwić ich odzyskanie.</li>
	<li>Umieść całą ilość na wielu płytkach agarowych MRS z odpowiednim doborem.</li>
	<li>Umieść płytki w całkowicie hermetycznym pojemniku z małą zapaloną świecą ("tealight") i saszetką wytwarzającą atmosferę beztlenową.</li>
	<li>Rosnąć w temperaturze 37 °C przez 2-3 dni lub do momentu, gdy pojawią się widoczne kolonie.</li>
</ol>
3. Pomiar kwasoodpornego fluorescencyjnego białka reporterowego mCherry2
<ol>
	<li>Wybierz wszystkie kolonie wymagane do pomiaru i zaszczepij w 96-dołkowej mikropłytce do przechowywania z 1,5 ml sterylizowanego filtrem (nieautoklawizowanego) bulionu MRS na studzienkę i odpowiednio dobranym antybiotykiem.</li>
	<li>Inkubować tlenowo przez 24 godziny przez noc w temperaturze 37 °C bez wstrząsania. 
	UWAGA: Tę mikropłytkę do przechowywania należy przechowywać do wykorzystania w sekcji 4 (PCR kolonii).</li>
	<li>L. reuteri wytrąca się z pożywki w fazie stacjonarnej; posiew na noc należy zawiesić za pomocą pipetowania.</li>
	<li>Przenieść 200 μl na płaską, przezroczystą płytkę 96-dołkową, przenieść płytkę do czytnika płytek i zmierzyć OD i fluorescencję mCherry2 (wzbudzenie [Ex]: 589 nm; emisja [Em]: 610 nm) lub innych odpowiednich reporterów.</li>
</ol>
4. Potwierdzenie wychwytu plazmidu za pomocą PCR kolonii
<ol>
	<li>Z 96-dołkowej mikropłytki do przechowywania z sekcji 3 przenieść 5 μl do probówki PCR. 
	UWAGA: Jeśli minęło >5 minut, może być konieczne ponowne zawieszenie L. reuteri po raz drugi.</li>
	<li>W przenośnej mikrowirówce stołowej odwirować w dół, aż będzie widać osad (około 2 minuty przy 2,000 x g), wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 20 μl 20 mM NaOH.</li>
	<li>Gotować w temperaturze 95 °C przez 5 minut, odwirować i powtórzyć gotowanie po raz drugi.</li>
	<li>Natychmiast schłodzić próbki; w kolejnych krokach należy starać się trzymać próbki w jak największym stopniu na lodzie, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo degradacji matrycy i zahamowania PCR.</li>
	<li>Wirować w przenośnej mikrowirówce stołowej o masie 2 000 x g przez 2 minuty, aż resztki komórek zostaną granulowane, następnie pobrać 1 μl supernatantu i rozcieńczyć w 99 μl lodowatego ddH2O wolnego od DNaz i RNaz (100-krotne rozcieńczenie).</li>
	<li>Użyj 100-krotnego rozcieńczenia jako matrycy DNA w standardowej reakcji PCR przy użyciu starterów specyficznych dla plazmidu. Dołączyć kontrolę pozytywną z plazmidem pochodzącym z minipreparatu E. coli.</li>
	<li>Próbki należy umieścić z powrotem na lodzie i dodać odpowiedni barwnik ładujący o stężeniu 1x.</li>
	<li>Uruchomić w 1% żelu agarozowym w buforze TAE (kwas tris-octan-etylenodiaminotetraoctowy [EDTA]) pod napięciem 110 V przez 30 minut. Obraz, jeśli to konieczne.</li>
</ol>
5. Protokół mini-przygotowania dla L. reuteri , a następnie PCR w celu potwierdzenia obecności plazmidu
UWAGA: Protokół przeznaczony do użycia z zestawem mini-przygotowawczym wymienionym w Tabeli Materiałów.
<ol>
	<li>Inokulować L. reuteri w 10 ml bulionu MRS zawierającego odpowiedni antybiotyk i inkubować przez noc w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C w inkubatorze statycznym.</li>
	<li>Wirować przy 5 000 x g przez 10 minut w wstępnie schłodzonej wirówce o temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć osad w 2 ml standardowego buforu P1 (dołączonego do zestawu) w celu zniwelowania kwasowości, która może zakłócać późniejsze etapy, odwirować z tym samym ustawieniem, jak opisano poprzednio, i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 250 μl zmodyfikowanego buforu P1 zawierającego 10 mg/ml lizozymu i 100 U/ml mutanolizyny w celu lizy komórek bakteryjnych. Inkubować przez 1-2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 250 μl buforu P2, wymieszać przez odwrócenie cztery do sześciu razy i inkubować w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 5 minut.</li>
	<li>Dodaj 350 μl buforu N3 (dołączonego do zestawu) i natychmiast delikatnie odwróć cztery do sześciu razy, aby wymieszać.</li>
	<li>Wirować przy 10 000 x g przez 10 min.</li>
	<li>Przenieść jak najwięcej supernatantu do kolumny wirowej i odwirować przy 10 000 x g przez 60 s. Odrzucić przepływ.</li>
	<li>Przemyć kolumnę wirową 500 μl buforu PB (dołączonego do zestawu) i odwirować przy 10 000 x g przez 60 s. Odrzucić przepływ.</li>
	<li>Przemyć kolumnę wirową 750 μl buforu PE (dołączonego do zestawu) i odwirować przy 10 000 x g przez 60 s. Odrzucić przepływ i wirować przez 60 sekund, aby usunąć resztki buforu.</li>
	<li>Umieść kolumnę wirową w probówce do mikrowirówek o pojemności 1.5 ml. Nanieść 20-30 μl ddH2O wolnego od DNA i RNAzy do filtra kolumny wirującej i pozostawić na 1-2 minuty, a następnie odwirować przy 10 000 x g przez 60 s.</li>
	<li>Przeprowadzić standardową reakcję PCR przy użyciu starterów specyficznych dla plazmidu (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA), z eluatem dostarczającym matrycę DNA. Dołączyć kontrolę pozytywną z plazmidem pochodzącym z E. coli mini-prep. 
	UWAGA: Ustawienia PCR używane w tym badaniu to: 98 °C przez 5 minut, (98 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s, 72 °C przez 45 s) 30 cykli, 72 °C przez 2 min, 4 °C trzymanie. Parametry są w dużym stopniu zależne od użytej polimerazy, długości fragmentu i dokładnych starterów używanych przez każdą osobę korzystającą z tego protokołu.</li>
</ol>

Measurement of Reporter Proteins in Limosilactobacillus reuteri DSM20016

<ol><li>Makarova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+the+lactic+acid+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of the lactic acid bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15611-15616 (2006).</li>
<li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+taxonomic+note+on+the+genus+Lactobacillus%3A+Description+of+23+novel+genera%2C+emended+description+of+the+genus+Lactobacillus+beijerinck+1901%2C+and+union+of+Lactobacillaceae+and+Leuconostocaceae%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Systematic+and+Evolutionary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (4), 2782-2858 (2020).</li>
<li>Adams, M. R., Marteau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+safety+of+lactic+acid+bacteria+from+food%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">On the safety of lactic acid bacteria from food.</a> International Journal of Food Microbiology. 27 (2-3), 263-264 (1995).</li>
<li>Urbańska, M., Gieruszczak-Białek, D., Szajewska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review+with+meta-analysis%3A+Lactobacillus+reuteri+DSM+17938+for+diarrhoeal+diseases+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Alimentary+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Systematic review with meta-analysis: Lactobacillus reuteri DSM 17938 for diarrhoeal diseases in children.</a> Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (10), 1025-1034 (2016).</li>
<li>Jansson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+treatment+using+a+mix+of+three+Lactobacillus+strains+for+lumbar+spine+bone+loss+in+postmenopausal+women%3A+a+randomised%2C+double-blind%2C+placebo-controlled%2C+multicentre+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Probiotic treatment using a mix of three Lactobacillus strains for lumbar spine bone loss in postmenopausal women: a randomised, double-blind, placebo-controlled, multicentre trial.</a> The Lancet Rheumatology. 1 (3), e154-e162 (2019).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+non-viable+Lactobacillus+reuteri+combining+with+14-day+standard+triple+therapy+on+Helicobacterpylori+eradication%3A+A+randomized+double-blind+placebo-controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Helicobacter%22%5BJournal%5D)">Effects of non-viable Lactobacillus reuteri combining with 14-day standard triple therapy on Helicobacterpylori eradication: A randomized double-blind placebo-controlled trial.</a> Helicobacter. 26 (6), 12856(2021).</li>
<li>Nikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactobacillus+reuteri+in+bovine+milk+fermented+decreases+the+oral+carriage+of+mutans+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Lactobacillus reuteri in bovine milk fermented decreases the oral carriage of mutans streptococci.</a> International Journal of Food Microbiology. 95 (2), 219-223 (2004).</li>
<li>Reuter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lactobacillus+and+Bifidobacterium+microflora+of+the+human+intestine%3A+Composition+and+succession%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Issues+in+Intestinal+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession.</a> Current Issues in Intestinal Microbiology. 2 (2), 43-53 (2001).</li>
<li>Aukrust, T. W., Brurberg, M. B., Nes, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Lactobacillus+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transformation of Lactobacillus by electroporation.</a> Methods in Molecular Biology. 47, 201-208 (1995).</li>
<li>Lubkowicz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+probiotic+Lactobacillus+reuteri+as+a+biosensor+for+Staphylococcus+aureus+derived+AIP-I+detection%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Reprogramming probiotic Lactobacillus reuteri as a biosensor for Staphylococcus aureus derived AIP-I detection.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1229-1237 (2018).</li>
<li>Walter, J., Britton, R. A., Roos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbial+symbiosis+in+the+vertebrate+gastrointestinal+tract+and+the+Lactobacillus+reuteri+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Host-microbial symbiosis in the vertebrate gastrointestinal tract and the Lactobacillus reuteri paradigm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 4645-4652 (2011).</li>
<li>Ahmad, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+bimodal+molecular+weight+levan+by+a+Lactobacillus+reuteri+isolate+from+fish+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Microbiologica%22%5BJournal%5D)">Production of bimodal molecular weight levan by a Lactobacillus reuteri isolate from fish gut.</a> Folia Microbiologica. 67 (1), 21-31 (2022).</li>
<li>MacKenzie, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+diversity+of+mucus-binding+proteins+in+the+adhesion+and+aggregation+properties+of+Lactobacillus+reuteri%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Strain-specific diversity of mucus-binding proteins in the adhesion and aggregation properties of Lactobacillus reuteri.</a> Microbiology. 156 (11), 3368-3378 (2010).</li>
<li>Oh, J. H., van Pijkeren, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-assisted+recombineering+in+Lactobacillus+reuteri%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-assisted recombineering in Lactobacillus reuteri.</a> Nucleic Acids Research. 42 (17), 131(2014).</li>
<li>Song, X., Huang, H., Xiong, Z., Ai, L., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9D10A+nickase-assisted+genome+editing+in+Lactobacillus+casei%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9D10A nickase-assisted genome editing in Lactobacillus casei.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83 (22), e01259(2017).</li>
<li>Goh, Y. J., Barrangoua, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portable+CRISPR-Cas9N+system+for+flexible+genome+engineering+in+Lactobacillus+acidophilus%2C+Lactobacillus+gasseri%2C+and+Lactobacillus+paracasei%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Portable CRISPR-Cas9N system for flexible genome engineering in Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, and Lactobacillus paracasei.</a> Applied and Environmental Microbiology. 87 (6), e02669(2021).</li>
<li>Berthier, F., Zagorec, M., Champomier-Verg, M., Ehrlich, S. D., Morel-Devillel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transformation+of+Lactobacillus+sake+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Efficient transformation of Lactobacillus sake by electroporation.</a> Microbiology. 142 (5), 1273-1279 (1996).</li>
<li>Rattanachaikunsopon, P., Phumkhachorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glass+bead+transformation+method+for+gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Glass bead transformation method for gram-positive bacteria.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 40 (4), 923(2009).</li>
<li>Pflügl, S., Marx, H., Mattanovich, D., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+Lactobacillus+diolivorans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of Lactobacillus diolivorans.</a> FEMS Microbiology Letters. 344 (2), 152-158 (2013).</li>
<li>Spath, K., Heinl, S., Grabherr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cloning+in+Lactobacillus+plantarum%3A+Electroporation+with+non-methylated+plasmid+DNA+enhances+transformation+efficiency+and+makes+shuttle+vectors+obsolete%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Direct cloning in Lactobacillus plantarum: Electroporation with non-methylated plasmid DNA enhances transformation efficiency and makes shuttle vectors obsolete.</a> Microbial Cell Factories. 11, 141(2012).</li>
<li>Ortiz-Velez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+alterations+associated+with+improved+transformation+efficiency+in+Lactobacillus+reuteri%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Genome alterations associated with improved transformation efficiency in Lactobacillus reuteri.</a> Microbial Cell Factories. 17 (1), 138(2018).</li>
<li>O'Sullivan, D. J., Klaenhammer, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+mini-prep+isolation+of+high-quality+plasmid+DNA+from+Lactococcus+and+Lactobacillus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid mini-prep isolation of high-quality plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp.</a> Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2730-2733 (1993).</li>
<li>Lizier, M., Sarra, P. G., Cauda, R., Lucchini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+expression+vectors+in+Lactobacillus+reuteri+strains%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Comparison of expression vectors in Lactobacillus reuteri strains.</a> FEMS Microbiology Letters. 308 (1), 8-15 (2010).</li>
<li>Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REBASE-a+database+for+DNA+restriction+and+modification%3A+Enzymes%2C+genes+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">REBASE-a database for DNA restriction and modification: Enzymes, genes and genomes.</a> Nucleic Acids Research. 43, Database issue D298-D299 (2015).</li>
<li>Ahrne, S., Molin, G., Axelsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Lactobacillus+reuteri+with+electroporation%3A+Studies+on+the+erythromycin+resistance+plasmid+pLUL631%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transformation of Lactobacillus reuteri with electroporation: Studies on the erythromycin resistance plasmid pLUL631.</a> Current Microbiology. 24, 199-205 (1992).</li>
</ol>

Nie występuje konflikt interesów.

Kluczowym etapem transformacji L. reuteri DSM20016 jest zapewnienie beztlenowych warunków wzrostu po wysianiu transformantów; kolonie uzyskane w warunkach tlenowych pojawiają się bardzo rzadko i zazwyczaj nie rosną po zaszczepieniu do pożywki MRS. W celu zmaksymalizowania prawdopodobieństwa wzrostu kolonii należy wysiać całą objętość roztworu regeneracyjnego. Nawet przy zastosowaniu tych dwóch krytycznych kroków, wydajność transformacji nadal stanowi ograniczenie w eksperymentach, ponieważ liczba oczekiwanych ko...

Rodzaj Lactobacillus był historycznie klasyfikowany jako Gram-dodatnie, pręcikowate, nietworzące przetrwalników, albo fakultatywne beztlenowce, albo mikroaerofile, które rozkładają cukry głównie do produkcji kwasu mlekowego1. Te luźne kryteria doprowadziły do tego, że Lactobacillus jest, fenotypowo i genotypowo, niezwykle zróżnicowanym rodzajem. Ta szeroka kategoryzacja spowodowała przeklasyfikowanie rodzaju, wprowadzając 23 nowe rodzaje w 2020 roku2.
Stary, szerszy rodzaj obejmował główne gatunki komensalne i probiotyczne, ogólnie uważane za bezpieczne (GRAS) do spożycia3. Rodzina Lactobacillaceae utrzymuje publiczne postrzeganie jako "dobre bakterie" ze względu na wiele zgłaszanych korzyści zdrowotnych wynikających z konsumpcji różnych szczepów4,5,6,7. Łatwość, z jaką mogą poruszać się po przewodzie pokarmowym8 i ich publiczna akceptacja sprawiają, że szczepy Lactobacillaceae są silnymi kandydatami jako organizmy chassowe do spożycia, zastosowań leczniczych, terapeutycznych lub diagnostycznych.
Szeroki zakres cech występujących w rodzinie Lactobacillaceae doprowadził do sytuacji, w której de facto nie ma szczepu organizmu modelowego; grupy badawcze miały tendencję do wybierania gatunków o właściwościach najbardziej istotnych dla ich szczególnych celów. (Na przykład, laboratoria fermentacji mlecznej mogą wybrać L. lactis; badania nad fermentacją warzyw mogą wybrać L. plantarum; badania nad probiotykami mogą koncentrować się na L. acidophilus; i tak dalej.)
Ten sam szeroki zakres cech charakterystycznych dla różnych gatunków doprowadził do nagromadzenia protokołów i procedur, które mogą działać dobrze dla jednego podzbioru rodziny Lactobacillaceae, ale wymagają optymalizacji, aby działały efektywnie (a może w ogóle działały) w innych9. Ta potrzeba optymalizacji między członkami rodziny, a nawet w obrębie członków tego samego gatunku, może udaremnić wysiłki niezaznajomionych z nią badaczy. Protokoły publikowane w sekcjach metod artykułów mogą również zawierać własne modyfikacje10, co prowadzi do fragmentarycznych, zdecentralizowanych zbiorów protokołów.
L. reuteri jest uważany za powszechnie występujący komensal kręgowców, spotykany konsekwentnie u ssaków, ptaków11 i ryb12 przewodu pokarmowego (GI). Podszczepy L. reuteri są często genetycznie wyspecjalizowane, poprzez adaptację białka adhezyjnego śluzu, w celu bardziej trwałej kolonizacji określonych rodzimych gospodarzy8,11,13. Przewód pokarmowy Gatunki Limosilactobacillus mogą być izolowane w żywicielach poza ich rodzimym żywicielem, ale mają tendencję bardziej do przejściowej natury8.
Ze względu na specjalizację człowiek-gospodarz, L. reuteri DSM20016 bardzo dobrze pozycjonuje się jako podłoże do zastosowań diagnostycznych lub terapeutycznych w dowolnym momencie ludzkiego przewodu pokarmowego, a szczep DSM20016 może zapewnić długotrwałe okno efektu dla interwencji w porównaniu do bardziej przejściowych szczepów.
W tym artykule przedstawiamy serię protokołów o udowodnionej skuteczności w Limosilactobacillus reuteri (oznaczenie szczepu: F275; inne numery kolekcji: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), wraz ze scentralizowanymi informacjami o szczepie z innych źródeł, aby pomóc w zastosowaniach biologii molekularnej i systemowej. Procedury określone w niniejszym dokumencie powinny umożliwić badaczowi bez wcześniejszego doświadczenia hodowlę L. reuteri, tworzenie elektrokompetentnych stad, selekcję przekształconych kolonii, potwierdzanie transformacji za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy kolonii (PCR) i mierzenie zaprojektowanej odpowiedzi systemu za pomocą fluorescencyjnych białek reporterowych.
Zauważamy, że powiązane protokoły obejmowały rekombinację genomu ssDNA wspomaganą CRISPR-Cas9 u L. reuteri (szczep: ATCC-PTA-6475)14, oraz edycji genomu wspomaganej nickazą CRSIPR-Cas9 w wielu innych niż L. reuteri, Lactobacillaceae family stains15,16; nie dotyczą one jednak szczepu L. reuteri DSM20016, na którym się tutaj skupiamy.

<table><tbody><tr><td>1 kb Plus DNA Ladder</td><td>NEB</td><td>N3200L</td><td></td></tr><tr><td>1mL Kuwety spektrofotometru</td><td>Thomas Scientific</td><td>1145J12</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>AGR001</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-15R (wirówka z chłodzeniem)</td><td>Beckman Allegra&nbsp;</td><td>Nie</td><td>dotyczy już nie dotyczy</td></tr> produkcji <tr><td>Saszetka AnaeroGen 2,5 l Thermo</td><td>Scientific</td><td></td> OXAN0025A <td></td></tr><tr><td>BTX, ECM 399 System elektroporacji</td><td>VWR</td><td>58017-984</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe (50 ml)</td><td>FroggaBio</td><td>TB50-500</td><td></td></tr><tr><td>Żel DNA x6 barwnik ładujący</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta do elektroporacji</td><td>Fisherbrand</td><td>FB101</td><td></td></tr><tr><td>Erytromycyna</td><td>Millipore Sigma</td><td>E5389-5G</td><td></td></tr><tr><td>Żelowa kąpiel elektroporacyjna VWR</td><td></td><td>76314-748</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>GLY001</td><td></td></tr><tr><td>Limosilactobacillus reuteri</td><td>Instytut Leibniza DSMZ</td><td>DSM20016</td><td>Oznaczenie szczepu F275</td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>BioShop</td><td>LYS702.5</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek (1,7 ml)</td><td>FroggaBio</td><td>LMCT1.7B</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do miniprzygotowania (Qiagen)</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>slpGFP zastąpiony konstytutywnym, zoptymalizowanym pod kątem kodonu, reporterem mCherry2 białko&nbsp;</td></tr><tr><td>Bulion MRS (odwodniony)</td><td>Thermo Scientific</td><td>CM0359B</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolysin</td><td>Millipore Sigma</td><td>M9901-5KU</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Pipeta Millipore Sigma</td><td>1064691000</td><td></td></tr><tr><td>P100</td><td>Eppendorf</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>P2.5 Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>P20 Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>probówki PCR</td><td>FroggaBio</td><td>STF-A120S</td><td></td></tr><tr><td>Osobista mikrowirówka</td><td>stołowa Genlantis</td><td>E200100</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>PTC-150 Termocykler</td><td>MJ Research</td><td>Nie dotyczy</td><td>Produkt nie jest już produkowany</td></tr><tr><td>pTRKH3_slpGFP (zmodyfikowany)</td><td>Addgene</td><td>27168</td><td></td></tr><tr><td>SPECTRONIC 200 Spektrofotometr</td><td>Thermo Scientific</td><td>840-281700</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytka do przechowywania</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-225</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>BioShop</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>TAE Bufor 50x</td><td>Thermo Scientific</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td>Nie jest już produkowany</td></tr><tr><td>Inkubator VWR 1500E</td><td></td><td>VWR N/A</td><td>Nie jest już produkowany</td></tr></tbody></table>

metody elektroporacji i potwierdzania przemian u limosilactobacillus reuteri dsm20016

Methods for Electroporation and Transformation Confirmation in Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Lactobacillus były niewiarygodnie dużym, różnorodnym rodzajem bakterii obejmującym 261 gatunków, z których kilka było szczepami komensalnymi z potencjałem do wykorzystania jako podwozie dla syntetycznych przedsięwzięć biologicznych w przewodzie pokarmowym. Duża zmienność fenotypowa i genotypowa zaobserwowana w obrębie rodzaju doprowadziła do niedawnej reklasyfikacji i wprowadzenia 23 nowych rodzajów.
Ze względu na szeroki zakres różnic w obrębie starych rodzajów, protokoły zademonstrowane u jednego członka mogą nie działać tak, jak reklamowano u innych członków. Brak scentralizowanych informacji na temat tego, jak dokładnie manipulować określonymi szczepami, doprowadził do szeregu podejść ad hoc, często zaadaptowanych z innych rodzin bakterii. Może to skomplikować sprawy dla badaczy rozpoczynających pracę w tej dziedzinie, którzy mogą nie wiedzieć, które informacje mają lub nie odnoszą się do wybranego przez nich szczepu.
W tym artykule staramy się scentralizować zestaw protokołów, które okazały się skuteczne, szczególnie w przypadku szczepu Limosilactobacillus reuteri o oznaczeniu F275 (inne numery kolekcji: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), wraz z poradami dotyczącymi rozwiązywania problemów i typowymi problemami, które można napotkać. Protokoły te powinny umożliwić badaczowi z niewielkim lub zerowym doświadczeniem w pracy z L. reuteri DSM20016 transformację plazmidu, potwierdzenie transformacji i pomiar sprzężenia zwrotnego systemu w czytniku płytkowym za pośrednictwem białka reporterowego.

Wydajność transformacji 
L. reuteri nie wymaga zastosowania DCM-/dam- plasmid niezmetylowany, co zaobserwowano w przypadku innych Lactobacillaceae19,20 (patrz Rysunek 1). Elektroporacja L. reuteri DSM20016 z 10 µL plazmidu pTRKH3_mCherry2 o wielkości 8,5 kb (replikacyjna pochodna pAMβ1 theta) powinny wynieść około 80 jednostek tworzących kolonie (CFU)/µg (od pięciu ...

Tutaj prezentujemy protokoły pracy z DSM20016 Limosilactobacillus reuteri, szczegółowo opisując wzrost, transformację plazmidu, PCR kolonii, pomiar fluorescencyjnego białka reporterowego i ograniczone mini-przygotowanie plazmidu, a także typowe problemy i rozwiązywanie problemów. Protokoły te umożliwiają pomiar białek reporterowych w DSM20016 lub potwierdzenie za pomocą PCR kolonii, jeśli nie jest zaangażowany reporter.

Metody elektroporacji i potwierdzania przemian u Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Lactobacillus were an incredibly large, diverse genus of bacteria comprising 261 species, several of which were commensal strains with the potential for ...

L.Reuteri, a w szczególności szczep, DSM20016 jest solidnym, naturalnym komensalem jelitowym człowieka, z wielką nadzieją na dostarczanie terapeutyczne i wykrywanie chorób w całym przewodzie pokarmowym. Prace te pomogą pozycjonować DSM20016 jako podwozie biologii syntetycznej do tego rodzaju zastosowań. Pałeczki kwasu mlekowego nie mają specyficznego organizmu modelowego.Istnieją preferowane gatunki, ale zwykle są one wybierane z uprzedzeniami do określonych celów badawczych. Zmienność w obrębie rodziny bakterii doprowadziła do fragmentarycznych protokołów, z których niektóre z iteracjami modyfikacji sięgają wstecz w publikacjach. Osobom rozpoczynającym naukę bardzo trudno jest dokładnie przefiltrować, co jest, a co nie jest przydatne.Istnieje jedna praca na temat transformacji DSM20016, ale nie jest ona nowoczesna. Istnieją nowoczesne protokoły dla innych członków rodziny Lactobacillales, ale nie są one DSM20016. Tutaj staramy się zapewnić łatwy w użyciu, scentralizowany, zmodernizowany, kompletny zestaw protokołów do DSM20016 elektroporacji.Ten zestaw protokołów oferuje znaczną modernizację w stosunku do poprzedniego protokołu eksploracji DSM20016 i wyjaśnia niektóre wiszące wątki, a także podkreśla części, które wcześniej były mniej jasne. Zestaw protokołów jest również kompletny, a konkretnie dla DSM20016, szczepu, dla którego inne protokoły inne niż DSM20016 nie są w pełni kompatybilne. Jednym z naszych głównych celów jest wykorzystanie mikroorganizmów jako niedrogich czujników i systemów dostarczania.Współpracujemy z ekspertami w dziedzinie chorób jelit, aby wykorzystać DSM20016 do wyczucia warunków w przewodzie pokarmowym i dostarczenia leków zgodnie z wymaganiami.

methods-for-electroporation-transformation-confirmation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Strategie patogenności prątków są wciąż słabo poznane. Powolny tempo wzrostu większości gatunków, nieprzenikniona natura ściany komórkowej oraz zagrożenia związane z pracą z patogenami sprawiają, że prątki są trudne do badania, co w dużej mierze odpowiada za naszą ograniczoną wiedzę na temat tych organizmów. W tym filmie zaprezentujemy technikę elektroporacji, która polega na poddaniu komórek krótkiemu impulsowi o wysokim napięciu elektrycznym w celu umożliwienia wniknięcia DNA. Jest to...

Elektroporacja Mycobacterium

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty protokół tworzenia losowej biblioteki mutantów dla określonej sekwencji docelowej. Pokazujemy, w jaki sposób metoda ta, realizowana in vivo w Escherichia coli, może być łączona z selekcją funkcjonalną w celu wyewoluowania nowych aktywności enzymatycznych.

Protokoły mutagenezy i selekcji funkcjonalnej dla ewolucji sterowanej białek w E. coli

Systematyczne, wielkoskalowe przesiewy syntetycznych interakcji genetycznych (gen-gen lub epistaza) mogą być wykorzystywane do badania redundancji genetycznej i wzajemnych powiązań między szlakami sygnałowymi. W niniejszej pracy opisujemy opracowaną przez nas technologię wysokoprzepustowych ilościowych przesiewów macierzy syntetycznych interakcji genetycznych, nazwaną eSGA, służącą do wyjaśniania relacji epistatycznych i badania sieci interakcji genetycznych w Escherichia coli.

Mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w Escherichia Coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych

Źródło: Stefan, A. i wsp., Wieloaspektowe korzyści z koekspresji białek w Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)Ten film przedstawia procedurę przekształcania Escherichia coli w plazmid przenoszący gen oporności na antybiotyki, w tym przygotowanie komórek, elektroporację, odzyskiwanie i selekcję transformantów.

Przygotowanie i przemiana bakterii za pomocą elektroporacji wysokonapięciowej

Elektroporacja jest powszechnie stosowaną metodą wprowadzania DNA do bakterii w procesie znanym jako transformacja. Tradycyjne protokoły przygotowania ogniw elektrokompetentnych są czasochłonne i pracochłonne. W artykule opisano alternatywną, szybką i wydajną metodę przygotowania ogniw elektrokompetentnych, obecnie stosowaną przez niektóre laboratoria.

Szybki protokół przygotowania elektrokompetentnych Escherichia coli i Vibrio cholerae

Enterobacter sp. YSU rośnie w pożywce z minimalnymi solami glukozy. Auksotrofy są generowane przez przekształcenie go w transposom, który losowo wstawia się do genomu gospodarza. Mutanty są znajdowane przez replikowanie posiewu ze złożonej pożywki do minimalnej pożywki. Przerwane geny są identyfikowane przez ratowanie genów i sekwencjonowanie.

Wytwarzanie auksotrofów Enterobacter sp. YSU z wykorzystaniem mutagenezy transpozonów

Tutaj opisujemy budowę mutantów zerowych Aeromonas w określonych glikozylotransferazach lub regionach zawierających glikozylotransferazy, testy ruchliwości i oczyszczanie wici przeprowadzone w celu ustalenia udziału i funkcji kodowanych przez nie enzymów w biosyntezie glikanu, a także rolę tego glikanu w patogenezie bakterii.

Generowanie mutantów zerowych w celu wyjaśnienia roli glikozylotransferaz bakteryjnych w ruchliwości bakterii

Opisujemy łatwą procedurę jednokopijnego uzupełniania chromosomalnego genu pompy wypływu za pomocą systemu ekspresji opartego na mini-Tn7 do zmodyfikowanego szczepu Acinetobacter baumannii, z niedoborem wypływu. To precyzyjne narzędzie genetyczne pozwala na kontrolowaną ekspresję genów, co ma kluczowe znaczenie dla scharakteryzowania pomp wypływowych w patogenach opornych na wiele leków.

Charakterystyka wielolekowych systemów wypływu u Acinetobacter baumannii przy użyciu szczepu bakteryjnego z niedoborem wypływu i systemu ekspresji genów z pojedynczą kopią

Nanocząsteczki indynawiru, rytonaviru, efawirenzu i atazanawiru zostały wytworzone przy użyciu mokrego mielenia, homogenizacji i sonikacji. Te nanoformulacje, określane wspólnie jako nanoformułowana terapia antyretrowirusowa (nanoART), posłużyły do oceny dostarczania leków za pomocą makrofagów. Określono stopień pobierania, retencji i przedłużonego uwalniania nanoART przez makrofagi pochodzące z monocytów. Te wstępne badania sugerują potencjał nanoART do zastosowań klinicznych.

Opracowanie metod badania transportu nanoformułowanych leków antyretrowirusowych przez makrofagi w krwiobiegu

Samoorganizujące się monowarstwy (SAMs) utworzone z długołańcuchowych alkanotioli na złocie stanowią precyzyjnie zdefiniowane podłoża do tworzenia wzorów białkowych oraz ograniczania przestrzeni wzrostu komórek. Mikro kontaktowy druk heksadekanotiolu przy użyciu stempla z polidimetylosiloksanu (PDMS), a następnie wypełnienie wolnych przestrzeni monomerem alkanotiolu zakończonym grupą glikolową, pozwala na uzyskanie wzoru, w którym białka i komórki adsorbują wyłącznie do obszaru z nadrukowanym...

Tworzenie dwuwymiarowych wzorowanych podłoży do ograniczania przestrzeni białek i komórek

Poznaj metody elektroporacji i potwierdzania przemian u Limosilactobacillus reuteri DSM20016. Protokoły obejmują hodowlę, transformację plazmidową, PCR kolonii oraz pomiar fluorescencyjnych białek reporterowych.

Metody elektroporacji i potwierdzania przemian u Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Przeglądaj więcej filmów