Name: Produkcja ogniw na dużą skalę w oparciu o rozpuszczalne porowate mikronośniki klasy GMP (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Poznaj metodę produkcji ogniw na dużą skalę przy użyciu rozpuszczalnych mikronośników klasy GMP w zamkniętym systemie bioreaktorowym. Protokół umożliwia wydajną hodowlę komórek mezenchymalnych, HEK293T i Vero z zachowaniem standardów terapii komórkowej i genowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana finansowo przez National Science Foundation for Distinguished Young Scholars (82125018).

Closed System Production of Adherent Cells Based on Dissolvable Microcarriers

<ol><li>Golchin, A., Farahany, T. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+products%3A+Cellular+therapy+and+FDA+approved+products%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Biological products: Cellular therapy and FDA approved products.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 15 (2), 166-175 (2019).</li>
<li>Young, C. M., Quinn, C., Trusheim, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+cell+and+gene+therapy+potential+patient+and+financial+impact%3A+US+projections+of+product+approvals%2C+patients+treated%2C+and+product+revenues%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Durable cell and gene therapy potential patient and financial impact: US projections of product approvals, patients treated, and product revenues.</a> Drug Discovery Today. 27 (1), 17-30 (2022).</li>
<li>Elverum, K., Whitman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivering+cellular+and+gene+therapies+to+patients%3A+solutions+for+realizing+the+potential+of+the+next+generation+of+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Delivering cellular and gene therapies to patients: solutions for realizing the potential of the next generation of medicine.</a> Gene Therapy. 27 (12), 537-544 (2020).</li>
<li>Blache, U., Popp, G., Dünkel, A., Koehl, U., Fricke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+solutions+for+manufacture+of+CAR+T+cells+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Potential solutions for manufacture of CAR T cells in cancer immunotherapy.</a> Nature Communications. 13 (1), 5225(2022).</li>
<li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+process+scale-up+challenges+for+commercial-scale+manufacturing+of+allogeneic+pluripotent+stem+cell+products%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Cell culture process scale-up challenges for commercial-scale manufacturing of allogeneic pluripotent stem cell products.</a> Bioengineering. 9 (3), 92(2022).</li>
<li>Emerson, J., Glassey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprocess+monitoring+and+control%3A+Challenges+in+cell+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Bioprocess monitoring and control: Challenges in cell and gene therapy.</a> Current Opinion in Chemical Engineering. 34, 100722(2021).</li>
<li>Robb, K. P., Fitzgerald, J. C., Barry, F., Viswanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cell+therapy%3A+progress+in+manufacturing+and+assessments+of+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cell therapy: progress in manufacturing and assessments of potency.</a> Cytotherapy. 21 (3), 289-306 (2019).</li>
<li>Olsen, T. R., Ng, K. S., Lock, L. T., Ahsan, T., Rowley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+MSC-Are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Peak MSC-Are we there yet.</a> Frontiers in Medicine. 5, 178(2018).</li>
<li>Roots Analysis. Stem Cell Therapy Contract Manufacturing (CMO) Market, 2019 - 2030. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.rootsanalysis.com/reports/view_document/stem-cell-therapy-contract-manufacturing-market-2019-2030/271.html">https://www.rootsanalysis.com/reports/view_document/stem-cell-therapy-contract-manufacturing-market-2019-2030/271.html</a> (2019).</li>
<li>Elseberg, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcarrier-based+expansion+process+for+hMSCs+with+high+vitality+and+undifferentiated+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics.</a> The International Journal of Artificial Organs. 35 (2), 93-107 (2012).</li>
<li>de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Silva, da, L, C., Cabral, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+microcarrier-based+manufacturing+of+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells.</a> Journal of Biotechnology. 236, 88-109 (2016).</li>
<li>Rafiq, Q. A., Coopman, K., Nienow, A. W., Hewitt, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+microcarrier+screening+and+agitated+culture+conditions+improves+human+mesenchymal+stem+cell+yield+in+bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Systematic microcarrier screening and agitated culture conditions improves human mesenchymal stem cell yield in bioreactors.</a> Biotechnology Journal. 11 (4), 473-486 (2016).</li>
<li>Tavassoli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+production+of+stem+cells+utilizing+microcarriers%3A+A+biomaterials+engineering+perspective+from+academic+research+to+commercialized+products%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Large-scale production of stem cells utilizing microcarriers: A biomaterials engineering perspective from academic research to commercialized products.</a> Biomaterials. 181, 333-346 (2018).</li>
<li>Mizukami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+for+large-scale+umbilical+cord-derived+MSC+expansion%3A+Experimental+performance+and+cost+of+goods+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Technologies for large-scale umbilical cord-derived MSC expansion: Experimental performance and cost of goods analysis.</a> Biochemical Engineering Journal. 135, 36-48 (2018).</li>
<li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersible+and+dissolvable+porous+microcarrier+tablets+enable+efficient+large-scale+human+mesenchymal+stem+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Dispersible and dissolvable porous microcarrier tablets enable efficient large-scale human mesenchymal stem cell expansion.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (5), 263-275 (2020).</li>
<li>Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarletti%2C+E+%223D+Cell+Culture%3A+Methods+and+Protocols%22">3D Cell Culture: Methods and Protocols</a>. Haycock, J. W. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-39 (2011).</li>
<li>Loh, Q. L., Choong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+scaffolds+for+tissue+engineering+applications%3A+Role+of+porosity+and+pore+size%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+B+Reviews%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional scaffolds for tissue engineering applications: Role of porosity and pore size.</a> Tissue Engineering. Part B Reviews. 19 (6), 485-502 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMP-grade+microcarrier+and+automated+closed+industrial+scale+cell+production+platform+for+culture+of+MSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">GMP-grade microcarrier and automated closed industrial scale cell production platform for culture of MSCs.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 16 (10), 934-944 (2022).</li>
<li>NMPA. Pharmaceutical Excipient Registration Database: Microcarrier tablets for cells. Center for Drug Evaluation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cde.org.cn/main/xxgk/listpage/ba7aed094c29ae314670a3563a716e">https://www.cde.org.cn/main/xxgk/listpage/ba7aed094c29ae314670a3563a716e</a> (2023).</li>
<li>List of Drug Master Files (DMFs). US Food and Drug Administration. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/drug-mater-files-dmfs/list-drug-master-files-dmfs">https://www.fda.gov/drug-mater-files-dmfs/list-drug-master-files-dmfs</a> (2023).</li>
<li>Beeravolu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+umbilical+cord+and+fetal+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55224(2017).</li>
<li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quality+evaluation+system+establishment+of+mesenchymal+stromal+cells+for+cell-based+therapy+products%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">The quality evaluation system establishment of mesenchymal stromal cells for cell-based therapy products.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 176(2020).</li>
<li>Maillot, C., Sion, C., De Isla, N., Toye, D., Olmos, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+by+design+to+define+critical+process+parameters+for+mesenchymal+stem+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Quality by design to define critical process parameters for mesenchymal stem cell expansion.</a> Biotechnology Advances. 50, 107765(2021).</li>
<li>Silva Couto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+human+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+%28hMSCs%29+in+bioreactors+using+microcarriers%3A+Lessons+learnt+and+what+the+future+holds%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Expansion of human mesenchymal stem/stromal cells (hMSCs) in bioreactors using microcarriers: Lessons learnt and what the future holds.</a> Biotechnology Advances. 45, 107636(2020).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+bead-to-bead+cell-transfer+method+for+serial+subculture+and+large-scale+expansion+of+human+mesenchymal+stem+cells+in+bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Facile bead-to-bead cell-transfer method for serial subculture and large-scale expansion of human mesenchymal stem cells in bioreactors.</a> Stem Cells Translational Medicine. 10 (9), 1329-1342 (2021).</li>
<li>Tsai, A. C., Pacak, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprocessing+of+human+mesenchymal+stem+cells%3A+From+planar+culture+to+microcarrier-based+bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors.</a> Bioengineering. 8 (7), 96(2021).</li>
<li>Hewitt, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+human+mesenchymal+stem+cells+on+microcarriers%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Expansion of human mesenchymal stem cells on microcarriers.</a> Biotechnology Letters. 33 (11), 2325-2335 (2011).</li>
<li>Mawji, I., Roberts, E. L., Dang, T., Abraham, B., Kallos, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+in+downstream+separation+processes+for+mesenchymal+stromal+cells+cultured+in+microcarrier-based+stirred+suspension+bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities in downstream separation processes for mesenchymal stromal cells cultured in microcarrier-based stirred suspension bioreactors.</a> Biotechnology and Bioengineering. 119 (11), 3062-3078 (2022).</li>
<li>Schirmaier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale-up+of+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cell+production+in+stirred+single-use+bioreactors+under+low-serum+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Engineering+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Scale-up of adipose tissue-derived mesenchymal stem cell production in stirred single-use bioreactors under low-serum conditions.</a> Engineering in Life Sciences. 14 (3), 292-303 (2014).</li>
<li>Lawson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+development+for+expansion+of+human+mesenchymal+stromal+cells+in+a+50L+single-use+stirred+tank+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Process development for expansion of human mesenchymal stromal cells in a 50L single-use stirred tank bioreactor.</a> Biochemical Engineering Journal. 120, 49-62 (2017).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+microcarrier+culture+of+HEK293T+cells+and+Vero+cells+in+single-use+bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">Large-scale microcarrier culture of HEK293T cells and Vero cells in single-use bioreactors.</a> AMB Express. 9 (1), 70(2019).</li>
<li>Fang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+scalable+vaccinia+virus-based+vector+production+process+using+dissolvable+porous+microcarriers%5BTitle%5D)+AND+%2225th+Annual+Meeting+of+the+American+Society+of+Gene+%26+Cell+Therapy.+Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Development of scalable vaccinia virus-based vector production process using dissolvable porous microcarriers.</a> 25th Annual Meeting of the American Society of Gene & Cell Therapy. Molecular Therapy. 30, 195-196 (2022).</li>
</ol>

Y.D. jest doradcą naukowym, a H.X., Y.Z., L.G., M.L., Y.Y., W.L. i X.Y. są pracownikami Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd. Pozostali autorzy nie mają żadnego komercyjnego, zastrzeżonego ani finansowego interesu w produktach lub firmach opisanych w tym artykule. Wszyscy pozostali autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów.

Zarówno immunoterapia, jak i terapia komórkami macierzystymi wykorzystują żywe komórki jako leki; Jednak ich produkty końcowe nie powinny być oczyszczane ani sterylizowane w taki sam sposób, jak małe cząsteczki lub wirusy. W związku z tym należy zawsze pamiętać o zasadzie jakości w fazie projektowania (QbD) i praktycznie stosować ją w procesie produkcji i kontroli chemikaliów (CMC) podczas produkcji ogniw23. W celu spełnienia wymagań preferencyjnie uważa się, że w pełni zamknięty system hodowli ko...

Branża CGT doświadczyła wykładniczego rozwoju w ciągu ostatnich dwóch dekad. Przewiduje się, że ewolucja leków nowej generacji pozwoli leczyć i leczyć wiele chorób opornych na leczenie1. Od czasu pierwszego zatwierdzenia przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) produktu CGT, Kymriah, w 2017 r., badania i rozwój związany z CGT na świecie nadal rozwijają się w szybkim tempie, a FDA odnotowała wzrost liczby aktywnych wniosków o nowe leki eksperymentalne dla CGT do 500 w 2018 r. 2. Przewidywano, że do 2030 r. liczba zatwierdzeń produktów CGT w Stanach Zjednoczonych wyniesie prawdopodobnie 54-74 2.
Chociaż szybki wzrost badań i innowacji CGT jest ekscytujący, nadal istnieje duża luka technologiczna między badaniami laboratoryjnymi a produkcją na skalę przemysłową, która mogłaby dostarczyć te obiecujące leki, aby dotrzeć do tylu pacjentów, ilu potrzeba, po przystępnych kosztach. Obecne procesy przyjęte w tych badaniach klinicznych zostały ustanowione w laboratoriach do eksperymentów na małą skalę i potrzebne są znaczne wysiłki w celu ulepszenia i wprowadzenia innowacji w CGT manufacturing3. Istnieje wiele rodzajów produktów CGT, z których większość opiera się na żywych komórkach, które mogą być allogeniczne, autologiczne, inżynieryjne lub naturalne. Te żywe leki są znacznie bardziej złożone niż małe jednostki molekularne lub biologiczne, co sprawia, że produkcja na dużą skalę jest poważnym wyzwaniem4,5,6. W tej pracy demonstrujemy protokół produkcji komórek na dużą skalę dla trzech komórek zależnych od zakotwiczenia, które są szeroko stosowane w CGT. Należą do nich ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste/zrębowe (hMSC), które są wykorzystywane w terapii komórkowej, oraz komórki HEK293T i komórki Vero, które są wykorzystywane do produkcji wirusów do inżynierii genetycznej końcowego produktu komórkowego terapeutycznego. Komórki zależne od zakotwiczenia są zwykle hodowane w systemach płaskich, które wymagają ręcznego przetwarzania. Jednak ręczne metody hodowli wymagają znacznego nakładu pracy i są podatne na zanieczyszczenia, co może zagrozić jakości produktu końcowego. Ponadto nie ma kontroli procesu na linii produkcyjnej, co prowadzi do znacznych różnic w jakości między partiami7. Biorąc za przykład terapię komórkami macierzystymi, z obiecującą linią ponad 200 kandydatów na terapię komórkami macierzystymi, szacuje się, że potrzeba 300 bilionów hMSC rocznie, aby sprostać wymaganiom zastosowań klinicznych8. W związku z tym produkcja komórek terapeutycznych na dużą skalę stała się warunkiem wstępnym do przeprowadzenia tych interwencji terapeutycznych przy tak dużym zapotrzebowaniu na komórki9.
Aby zapobiec niepowodzeniom systemów planarnych, podjęto wysiłki w rozwijaniu procesów produkcyjnych na dużą skalę w bioreaktorach z mieszadłem z konwencjonalnymi nierozpuszczalnymi mikronośnikami10,11,12,13, ale cierpią one z powodu skomplikowanych procedur przygotowawczych i niskiej wydajności pozyskiwania komórek14. Niedawno opracowaliśmy innowacyjny mikronośnik rozpuszczalny do ekspansji komórek macierzystych, mając na celu obejście wyzwań związanych z pozyskiwaniem komórek z konwencjonalnych, nierozpuszczalnych komercyjnych mikronośników15. Ten nowatorski, dostępny na rynku rozpuszczalny porowaty mikronośnik 3D klasy GMP, 3D TableTrix, wykazał ogromny potencjał w produkcji komórek na dużą skalę. Rzeczywiście, hodowla 3D oparta na tych porowatych mikronośnikach może potencjalnie odtworzyć korzystne mikrośrodowiska biomimetyczne, aby promować adhezję, proliferację, migrację i aktywację komórek16. Porowate struktury i połączone ze sobą sieci porów mikronośników mogą tworzyć większy obszar adhezji komórek i promować wymianę tlenu, składników odżywczych i metabolitów, tworząc w ten sposób optymalny substrat do ekspansji komórek in vitro17. Wysoka porowatość tych rozpuszczalnych porowatych mikronośników 3D klasy GMP umożliwia ekspansję hMSC na dużą skalę, a zdolność do całkowitego rozpuszczenia komórek pozwala na efektywne zbieranie tych rozszerzonych komórek18. Jest to również produkt klasy GMP i został zarejestrowany jako farmaceutyczna substancja pomocnicza w Chińskim Centrum Oceny Leków (numery zgłoszeń: F20210000003 i F20200000496)19 oraz FDA Stanów Zjednoczonych (FDA, USA; Numer głównego pliku leku: 35481)20.
Tutaj ilustrujemy zautomatyzowany system produkcji komórek na skalę przemysłową (ACISCP)18 używając tych dyspergowalnych i rozpuszczalnych porowatych mikronośników do hMSC, HEK293T komórek i ekspansji komórek Vero. Udało nam się przeprowadzić dwupoziomową ekspansję hMSC (128 skumulowanych krotnych rozszerzeń w ciągu 9 dni) z bioreaktora o pojemności 5 litrów do bioreaktora o pojemności 15 litrów i ostatecznie uzyskaliśmy do 1,1 x 1010 hMSCs z jednej partii produkcji. Komórki zebrano poprzez całkowite rozpuszczenie mikronośników, zagęszczono, przemyto i sformowano za pomocą systemu przetwarzania komórek opartego na wirówce z ciągłym przepływem, a następnie podano za pomocą systemu napełniania komórek. Ponadto oceniliśmy jakość produktów hMSC, aby potwierdzić zgodność. Wykazaliśmy również zastosowanie tych rozpuszczalnych mikronośników do zwiększenia skali produkcji dwóch innych typów komórek kotwiczących, komórek HEK293T i komórek Vero, które są szeroko stosowane w przemyśle CGT. Szczytowa gęstość komórek HEK293T komórek osiągnęła 1,68 x 107 komórek/ml, podczas gdy gęstość szczytowa komórek Vero osiągnęła 1,08 x 107 komórek/ml. System ACISCP może zostać przystosowany do hodowli różnych przylegających komórek i potencjalnie może stać się potężną platformą przyczyniającą się do przyspieszenia uprzemysłowienia CGT.

<table><tbody><tr><td>0,25% trypsyna EDTA</td><td>BasalMedia</td><td>S310JV</td><td>Służy do zbierania komórek 2D.</td></tr><tr><td>3D FloTrix Digest</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>R001-500</td><td>Jest to odczynnik, który specyficznie rozpuszcza mikronośniki 3D TableTrix.</td></tr><tr><td>3D FloTrix MSC Serum Free Medium</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>RMZ112</td><td>Jest to bezsurowicowy, wolne od zwierząt podłoże do ekspansji i utrzymania mezenchymalnych komórek macierzystych w hodowli planarnej 2D, a także hodowli 3D na mikronośnikach 3D TableTrix.</td></tr><tr><td>Jednorazowy moduł filtracji 3D FloTrix</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>R020-00-10</td><td>Ten moduł zawiera 0,22 &mu; m Filtry kapsułkowe stosowane do filtracji pożywki hodowlanej i roztworu trawiącego.</td></tr><tr><td>Jednorazowa torba do przechowywania 3D FloTrix (10 l)</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>R020-00-03</td><td>Używana jako torba na paszę do bioreaktora 5 l.</td></tr><tr><td>Jednorazowa torba do przechowywania 3D FloTrix (3 L)</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>R020-00-01</td><td>Używana jako worki do wysiewu komórek lub przenoszenia.</td></tr><tr><td>Jednorazowa torba do przechowywania 3D FloTrix (50 L)</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>R020-00-04</td><td>Używana jako torba na paszę do bioreaktora 15 L.</td></tr><tr><td>3D FloTrix vivaPACK Jednorazowe wypełnienie i Zestaw materiałów eksploatacyjnych do wykończenia</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>PACK-01-01</td><td>Jest to standardowy zestaw przystosowany do systemu napełniania i wykańczania 3D vivaPACK.</td></tr><tr><td>System napełniania i wykańczania 3D FloTrix vivaPACK do komórek</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>vivaPACK</td><td>Ten system jest zamkniętym urządzeniem do obsługi cieczy, z automatycznymi funkcjami mieszania i odprowadzania gazu. Komórki zawieszone w buforze do kriokonserwacji można szybko i równomiernie podzielić na 20 worków na partię.</td></tr><tr><td>System przetwarzania komórek 3D FloTrix vivaPREP PLUS</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>vivaPREP PLUS</td><td>Ten system jest urządzeniem opartym na wirówce przepływowej. Komórki mogą być zagęszczane, myte i ponownie zawieszane w całkowicie zamkniętych procedurach.</td></tr><tr><td>3D FloTrix vivaPREP PLUS Jednorazowy zestaw do przetwarzania komórek</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>PREP-PLUS-00</td><td>Jest to standardowy zestaw przystosowany do przetwarzania komórek 3D vivaPREP PLUS.</td></tr><tr><td>Bioreaktor 3D FloTrix vivaSPIN&nbsp; 15 L</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>FTVS15</td><td>Ten produkt bioreaktora wykorzystuje kontroler, szklany zbiornik z mieszadłem o pojemności 15 litrów i analizatory. Dostępna jest specjalna rurka perfuzyjna.</td></tr><tr><td>Bioreaktor 3D FloTrix vivaSPIN&nbsp; 5 L</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>FTVS05</td><td>Ten produkt bioreaktora wykorzystuje kontroler, szklany zbiornik z mieszadłem o pojemności 5 litrów i analizatory. Dostępna jest specjalna rurka perfuzyjna.</td></tr><tr><td>Zestaw materiałów eksploatacyjnych 3D FloTrix vivaSPIN do systemu zamkniętego (10/15 L)</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>R020-10-10</td><td>Jest to standardowy zestaw przewodów dostosowany do bioreaktora 3D vivaSPIN 15 L, zawierający worki do pobierania próbek.</td></tr><tr><td>Zestaw materiałów eksploatacyjnych 3D FloTrix vivaSPIN do systemu zamkniętego (2/5 L)</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>R020-05-10</td><td>Jest to standardowy zestaw przewodów dostosowany do bioreaktora 3D vivaSPIN 5 L, zawierający worki do pobierania próbek.</td></tr><tr><td>3D TableTrix mikronośniki G02</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>G02-10-10g</td><td>Te porowate i degradowalne mikronośniki nadają się do hodowli komórek HEK293T. Są one wstępnie wysterylizowane w 10 g / butelkę z rurkami C-Flex do spawania z rurami w bioreaktorach.</td></tr><tr><td>Mikronośniki 3D TableTrix V01</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>V01-100-10g</td><td>Te porowate i degradowalne mikronośniki nadają się do przylegających hodowli komórkowych, występują w postaci niesterylizowanych mikronośników, które przed użyciem należy autoklawować w PBS. Nadają się one szczególnie do produkcji szczepionek.</td></tr><tr><td>Mikronośniki 3D TableTrix W01</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>W01-10-10g (opakowanie jednorazowe); W01-200 (tabletki)</td><td>Te porowate i degradowalne mikronośniki nadają się do przylegających hodowli komórkowych, szczególnie do komórek, które muszą być zbierane jako produkty końcowe. Są one wstępnie wysterylizowane w 10 g / butelkę z rurkami C-Flex do spawania z rurami w bioreaktorach. Produkt uzyskał 2 kwalifikacje dla farmaceutycznych substancji pomocniczych od CDE, o numerach rejestracyjnych [F20200000496; F20210000003]. Otrzymał również kwalifikację DMF dla farmaceutycznych substancji pomocniczych od FDA, z numerem rejestracyjnym [DMF:35481]</td></tr><tr><td>APC anty-ludzkie przeciwciało CD45</td><td>BioLegend</td><td>368512</td><td>Stosowany w cytometrii przepływowej do oceny tożsamości MSC</td></tr><tr><td>Zestaw do podwójnego barwienia Calcein-AM/PI</td><td>Dojindo</td><td>C542</td><td>Calcein-AM/PI Double Staining Kit służy do jednoczesnego barwienia fluorescencyjnego żywych i martwych komórek. Ten zestaw zawiera roztwory Calcein-AM i jodku propidyny (PI), które barwią odpowiednio żywe i martwe komórki.</td></tr><tr><td>Zakrętka do EZ Top Container Zamknięcia do pojemników NALGENE (500mL)</td><td>Saint-Gobain</td><td>CAP-38</td><td>Marki i numery katalogowe to tylko na przykład, podobne produkty są dostępne u różnych dostawców i o ile mają taką samą funkcjonalność, przedmioty można zastąpić innymi markami.</td></tr><tr><td>Rurka C-Flex, Formulacja 374 (0,25 cala x 0,44 cala)</td><td>Saint-Gobain</td><td>374-250-3</td><td>Służy do spawania i rozłączania rur.</td></tr><tr><td>Worek do zamrażania CryoMACS 50</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>200-074-400</td><td>Służy do rozbudowy jednorazowego wypełniacza 3D FloTrix vivaPACK& Wykończ zestaw materiałów eksploatacyjnych.</td></tr><tr><td>Siarczan dimetylu (DMSO)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D2650-100mL</td><td>Służy do przygotowania roztworu do krioprezerwacji.</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM)</td><td>BasalMedia</td><td>L120KJ</td><td>Służy do hodowli komórek HEK293T i Vero.</td></tr><tr><td>DURAN Original GL 45 Butelka laboratoryjna (2 L)</td><td>DWK nauki przyrodnicze</td><td>218016357</td><td>Służy do zbierania odpadów z bioreaktora o pojemności 5 l.</td></tr><tr><td>DURAN Original GL 45 Butelka laboratoryjna (5 L)</td><td>DWK nauki przyrodnicze</td><td>218017353</td><td>Służy do zbierania odpadów z bioreaktora o pojemności 15 l.</td></tr><tr><td>DURAN Original GL 45 Butelka laboratoryjna (500 mL)</td><td>DWK nauki przyrodnicze</td><td>218014459</td><td>Służy do dodatkowej butelki 0,1 M NaOH.</td></tr><tr><td>EZ Górne zamknięcia pojemników do pojemników NALGENE (500 ml)</td><td>Saint-Gobain</td><td>EZ500 ML-38-2</td><td>Marki i numery katalogowe to tylko na przykład, podobne produkty są dostępne u różnych dostawców i o ile mają taką samą funkcjonalność, przedmioty można zastąpić innymi markami.</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS) najwyższej jakości</td><td>Żubr</td><td>086-150</td><td>Stosowany do hodowli komórek HEK293T.</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD14 FITC</td><td>BioLegend</td><td>301804</td><td>Stosowany w cytometrii przepływowej do oceny tożsamości MSC.</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD34 FITC</td><td>BioLegend</td><td>343504</td><td>Stosowany w cytometrii przepływowej do oceny tożsamości MSC.</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie FITC CD90 (Thy1)</td><td>BioLegend</td><td>328108</td><td>Stosowane w cytometrii przepływowej do oceny tożsamości MSC.</td></tr><tr><td>Cytometria przepływowa</td><td>Beckman Coulter</td><td>CytoFLEX</td><td>Służy do oceny tożsamości komórki.</td></tr><tr><td>Fluorescencyjny analizator komórek</td><td>Alit life science</td><td>Countstar Rigel S2</td><td>Służy do zliczania komórek. Żywotność komórek można obliczyć, barwiąc barwnikami AO/PI.</td></tr><tr><td>Złącze wieloportowe GL 45 z 2 portami&nbsp;</td><td>DWK nauki przyrodnicze</td><td>292632806</td><td>Marki i numery katalogowe to tylko przykład, podobne produkty są dostępne u różnych dostawców i tak długo, jak mają tę samą funkcjonalność, artykuły mogą być zastępowane innymi markami.</td></tr><tr><td>Glukometr</td><td>Sinocare</td><td>6243578</td><td>Służy do wykrywania stężenia glukozy w pożywce do hodowli komórkowych i supernatancie.</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS), z wapniem i magnezem</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td>Służy do przygotowania roztworu trawiącego.</td></tr><tr><td>Albumina ludzka 20% Behring (HSA)</td><td>CSL Behring</td><td>N/A</td><td>Służy do przygotowania buforu do płukania.</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td><td>OLYMBUS</td><td>CKX53SF</td><td>Służy do obserwacji i obrazowania w polu brifgt oraz fluorescencji.</td></tr><tr><td>Cylinder miarowy Nalgene (500 mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>3662-0500PK</td><td>Służy do kalibracji prędkości objętościowej przepływu cieczy pomp perystaltycznych.</td></tr><tr><td>Surowica dla noworodków cielęcych (NBS) bardzo drobna</td><td>MINHAI BIO</td><td>SC101.02</td><td>Służy do hodowli komórek Vero.</td></tr><tr><td>Zestaw do różnicowania i charakterystyki adipogennej ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych OriCell</td><td>Cyagen</td><td>HUXUC-90031</td><td>Służy do trójliniowego różnicowania hUCMSC.</td></tr><tr><td>Zestaw do różnicowania i charakterystyki chondrogennej ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych OriCell</td><td>Cyagen</td><td>HUXUC-90041</td><td>Służy do trójliniowego różnicowania hUCMSC.</td></tr><tr><td>Zestaw do różnicowania i charakterystyki osteogennej ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych OriCell</td><td>Cyagen</td><td>HUXUC-90021</td><td>Służy do trójliniowego różnicowania hUCMSC.</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD105 BioLegend</td><td></td><td>800504</td><td>Stosowane w cytometrii przepływowej do oceny tożsamości MSC.</td></tr><tr><td>PE anty-ludzkie przeciwciało CD19</td><td>BioLegend</td><td>302208</td><td>Stosowany w cytometrii przepływowej do oceny tożsamości MSC.</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie przeciwko ludzkiej CD73 (ekto-5'-nukleotydazie) BioLegend</td><td></td><td>344004</td><td>Stosowany w cytometrii przepływowej do oceny tożsamości MSC.</td></tr><tr><td>Przeciwciało PE anty-ludzkie HLA-DR</td><td>BioLegend</td><td>307605</td><td>Stosowany w cytometrii przepływowej do oceny tożsamości MSC.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Żubr</td><td>311-010-CL</td><td>Stosowany w autoklawowaniu naczyń szklanych i mikronośników V01 oraz wymianie pożywki hodowlanej.</td></tr><tr><td>Sani-Tech Platinum Utwardzane silikonowe rurki sanitarne (0,13 cala x 0,25 cala)</td><td>Saint-Gobain</td><td>ULTRA-C-125-2F</td><td>Służy do przenoszenia roztworu napędzanego pompami perystaltycznymi.</td></tr><tr><td>Sterylna sól fizjologiczna</td><td>Hopebiol</td><td>HBPP008-500</td><td>Służy do przygotowania buforu do mycia.</td></tr><tr><td>Trypzyme Rekombinowana trypsyna</td><td>BasalMedia</td><td>S342JV</td><td>Ten odczynnik służy do przenoszenia kulek do koralików komórek HEK293T i Vero.</td></tr><tr><td>Uszczelniacz do rur</td><td>Yingqi Biotech</td><td>Tube Sealer I</td><td>Ten uszczelniacz jest kompatybilny zarówno z rurkami C-Flex, jak i rurkami PVC.</td></tr><tr><td>Spawarka do rur PVC</td><td>Chu Biotech</td><td>Tube Welder Micro I</td><td>Służy do spawania rur PVC.</td></tr><tr><td>Spawarka do rur TPE</td><td>Yingqi Biotech</td><td>Spawarka do rur I-V2</td><td>Służy do spawania rur TPE.</td></tr><tr><td>ViaStain AO / PI Viability Stains</td><td>Nexcelom</td><td>CS2-0106-25mL</td><td>Dual-Fluorescence Viability, wykorzystujące oranż akrydynowy (AO) i jodek propydyny (PI), jest zalecaną metodą dokładnej analizy żywotności komórek pierwotnych, takich jak PBMC, i komórek macierzystych w próbkach zawierających szczątki.</td></tr></tbody></table>

produkcja ogniw na dużą skalę w oparciu o rozpuszczalne porowate mikronośniki klasy gmp

Large-Scale Cell Production Based on GMP-Grade Dissolvable Porous Microcarriers

Badacze z branży terapii komórkowej i genowej (CGT) od dawna stoją przed ogromnym wyzwaniem w zakresie efektywnej i zakrojonej na szeroką skalę ekspansji komórek. Aby wyeliminować podstawowe niedociągnięcia dwuwymiarowego (2D) systemu hodowli płaskiej, w innowacyjny sposób opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę produkcji komórek na skalę przemysłową (ACISCP) opartą na rozpuszczalnym i porowatym mikronośniku klasy GMP do hodowli 3D przylegających komórek, w tym ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (hMSC), komórek HEK293T i komórek Vero. Aby osiągnąć ekspansję na dużą skalę, przeprowadzono dwuetapową ekspansję za pomocą bioreaktorów ze zbiornikiem mieszadłem o pojemności 5 l i 15 l, aby uzyskać 1,1 x 1010 hMSC o łącznej 128-krotnej ekspansji w ciągu 9 dni. Komórki zebrano poprzez całkowite rozpuszczenie mikronośników, zagęszczono, przemyto i sformułowano za pomocą systemu przetwarzania komórek opartego na wirówce o ciągłym przepływie, a następnie podano za pomocą systemu napełniania komórek. W porównaniu z hodowlą planarną 2D nie ma istotnych różnic w jakości hMSC pobranych z hodowli 3D. Zastosowaliśmy również te rozpuszczalne porowate mikronośniki do innych popularnych typów komórek w sektorze CGT; w szczególności komórki HEK293T i komórki Vero hodowano do szczytowej gęstości komórek wynoszącej odpowiednio 1,68 x 107 komórek/ml i 1,08 x 107 komórek/ml. Badanie to dostarcza protokołu korzystania z platformy inżynierii bioprocesowej wykorzystującej cechy rozpuszczalnych mikronośników klasy GMP i zaawansowanego zamkniętego sprzętu w celu osiągnięcia produkcji komórek adherentnych na skalę przemysłową.

Platforma ACISCP to całkowicie zamknięty system, który wykorzystuje szereg bioreaktorów z mieszadłem do ekspansji w celu zwiększenia skali, system przetwarzania komórek do zautomatyzowanego zbierania i formułowania komórek oraz system napełniania komórek (Rysunek 1). Komórki adherentne przywierają do porowatych mikronośników, które mogą zostać rozproszone w bioreaktorze, co umożliwia hodowlę zawiesinową komórek adherentnych.
Zgodnie z opisanym protokołem, 2,5 x 10...

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający produkcję na dużą skalę komórek przylegających za pomocą całkowicie zamkniętego systemu opartego na rozpuszczalnych mikronośnikach klasy GMP. Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, komórek HEK293T i komórek Vero została zwalidowana i spełniła zarówno wymagania ilościowe, jak i kryteria jakościowe dla branży terapii komórkowej i genowej.

Produkcja ogniw na dużą skalę w oparciu o rozpuszczalne porowate mikronośniki klasy GMP

Researchers in the cell and gene therapy (CGT) industry have long faced a formidable challenge in the efficient and large-scale expansion of cells. To ...

Branża terapii komórkowej i genowej była świadkiem wykładniczej ekspansji w ciągu ostatnich dwóch dekad. Istnieje jednak duża luka technologiczna między badaniami laboratoryjnymi a wytwarzaniem umiejętności przemysłowych. Zgodnie z polityką regulacyjną i aby sprostać ekologicznym wymaganiom branży CGT, do produkcji terapii komórkowych zastosowano zautomatyzowane systemy zamknięte.W przypadku komórek adherentnych hodowla z użyciem mikronośników w skalowalnych bioreaktorach z mieszadłem jest obiecującą metodą. Konwencjonalnie skomercjalizowane mikronośniki nie są pożądane. Pobieranie komórek za pomocą trypsynizacji i odsiewanie mikronośników według wielkości jest nie tylko nieefektywne i trudne, ale także wpływa na jakość komórek i powoduje obawy dotyczące bezpieczeństwa.W tym badaniu udało nam się osiągnąć produkcję komórek na dużą skalę w oparciu o rozpuszczalne mikronośniki 3D TableTrix klasy GMP w zautomatyzowanym i zamkniętym systemie. Ponad 11 miliardów ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych uzyskano w dwuetapowej ekspansji w ciągu dziewięciu dni. Wykazaliśmy również wysoką gęstość hodowli komórek HEK293T i komórek Vero, w których obie gęstości osiągnęły ponad 10 milionów komórek na mililitr.Ta zaawansowana platforma bioprodukcyjna pozwala na skuteczne namnażanie i całkowite pobieranie komórek adhezyjnych w sposób zautomatyzowany i zamknięty. Nasz protokół daje możliwość zwiększenia wydajności produkcji i udoskonalenia kontroli jakości przy produkcji produktów CGT na skalę przemysłową. Aby rozpocząć, wykonaj dwupunktową kalibrację sondy pH za pomocą sterownika bioreaktora.Następnie, aby zmontować zbiornik bioreaktora, zainstaluj części, takie jak rury ze stali nierdzewnej i wirniki, na płycie głowicy zgodnie z instrukcjami producenta. Podłącz gotowy do użycia jednorazowy zestaw materiałów eksploatacyjnych do hodowli do odpowiednich części, rurek i portów ze stali nierdzewnej na płycie głównej, postępując zgodnie ze wskazówkami producenta. Po zmontowaniu zbiornika należy przeprowadzić kontrolę szczelności w pełni zmontowanego zbiornika zgodnie z instrukcjami producenta.Autoklaw naczynia z zestawem materiałów eksploatacyjnych przy ciśnieniu 15 PSI i 121 stopniach Celsjusza przez 60 minut. Po schłodzeniu naczynia do temperatury pokojowej włóż sondę temperatury do rurki termostudziennej i podłącz monitora, sondy pH i sondy DO ze sterownika do odpowiednich części naczynia. Owiń szczelnie matę grzewczą wokół naczynia.Zaloguj się do systemu sterownika bioreaktora i wprowadź parametry do systemu zgodnie z instrukcją producenta. Przyspawaj rurkę wylotową na pożywce do rurki C-flex wlotowej na butelce zawierającej 10 gramów wstępnie wysterylizowanych mikronośników W01 dla MSC. Przepompować 500 mililitrów pożywki hodowlanej z worka do przechowywania do butelki z mikronośnikami W01.Z naczynia bioreaktora z mieszadłem zatrzymaj kontrolę temperatury, pH i tlenu rozpuszczonego, a sterownik bioreaktora tymczasowo i całkowicie dozuje cały PBS z naczynia do butelki na odpady. Przyspawaj jednorazowy moduł filtracyjny do portu w 10-litrowej jednorazowej torbie do przechowywania. Przefiltruj i przenieś kompletną pożywkę MSC bez surowicy do torby do przechowywania.Ustaw prędkość PUMP1 na 300 obr./min i dozuj jeden litr pożywki z worka na paszę do naczynia. Zatrzymaj pompę i ponownie uruchom temperaturę, pH i rozpuszczony DO zgodnie z instrukcjami producenta. Uszczelnij i odłącz rurkę łączącą worek zasilający z rurką zasilającą.Przyspawaj rurkę z butelki z rozproszonymi mikronośnikami do rurki zasilającej i przepompuj całą zawartość z butelki do naczynia. Następnie ponownie zawiesić 2,5 razy 10 do 8 hMSC w podłożu bez surowicy i przenieść je do pustej butelki zawierającej wcześniej zawiesinę mikronośnika. Dodaj pożywkę bez surowicy do łącznie 500 mililitrów wewnątrz butelki i wymieszaj zawiesinę komórkową.Przepompuj całą zawartość butelki do naczynia. Uszczelnij i odłącz rurkę łączącą butelkę z rurką zasilającą, a następnie przyspawaj z powrotem worek do karmienia. Dostosuj ustawienia mieszania w sterowniku, aby zainicjować inokulację komórek do mikronośników.I skonfiguruj zautomatyzowany system uzupełniania i wymiany pożywki. Przyspawaj jednorazowe worki do pobierania próbek do rurki do pobierania próbek i pobieraj próbki w żądanych punktach czasowych. W czasie pobierania komórek, na sterowniku, ustaw prędkość mieszania na zero, aby mikronośniki mogły się osiąść, i dozuj supernatant do reżimu karmienia, pozostawiając około jednego litra zawiesiny hodowli w naczyniu.Zespawać worek zawierający 50 mililitrów świeżo przygotowanego roztworu trawiącego z 500 mililitrami HBSS w celu rozcieńczenia i przepompować cały roztwór do naczynia przez rurkę zasilającą. Ustaw prędkość mieszania w zakresie od 40 do 45 obr./min, aby rozpuścić mikronośniki. Po rozpuszczeniu mikronośników w ciągu 40 do 60 minut, przyspawaj jednorazową trzylitrową torbę do przechowywania do probówki zbiorczej i całkowicie wypompuj zawiesinę komórek.Włącz system przetwarzania komórek podczas pobierania komórek i zainstaluj jednorazowy zestaw do przetwarzania komórek na urządzeniu zgodnie z instrukcjami producenta. Przyspawać worki z zawiesiną komórkową, buforem do przemywania i pożywką hodowlaną do zestawu. Wprowadź parametry operacyjne i rozpocznij automatyczny proces mycia i ponownego zawieszania.Pobrać próbkę komórek z komory wirówkowej zgodnie ze wskazaniami systemów przetwarzania komórek w celu obliczenia gęstości komórek. Po zliczeniu dostosuj gęstość komórek do 2 razy 10 do 6 komórek na mililitr, używając kompletnej pożywki bez surowicy. W procesie formulacji komórek w bioreaktorze o pojemności 15 litrów należy użyć buforu do ponownego zawieszenia pobranych komórek.Przyspawać 250 mililitrów zawieszonych komórek do wypełnienia komórki. Zamontuj jednorazowy zestaw materiałów eksploatacyjnych do napełniania i wykańczania w systemie napełniania ogniw i włącz system chłodzenia wstępnego zgodnie z instrukcjami producenta przed ponownym podwieszeniem ogniw. Postępuj zgodnie z instrukcjami w systemie i ustaw go tak, aby napełniał 30 mililitrów na worek, co daje łącznie 20 worków w zestawie.Przyspawaj nowy zestaw 20 worków do kriokonserwacji z jednorazowym zestawem materiałów eksploatacyjnych do napełniania i wykańczania, a następnie powtórz napełnianie i zakończenie, aż wszystkie komórki zostaną podzielone. W przypadku hMSC osiągnięto skumulowaną 128-krotną ekspansję przy żywotności komórek powyżej 90% Spożycie glukozy wykazało ujemną korelację z ekspansją komórek, wykazując metabolizm związany ze zdrowym wzrostem komórek. Świeżo zebrane MSCs zachowują klasyczne markery fenotypowe z ponad 95% ekspresją dla markerów dodatnich i mniej niż 2% dla markerów ujemnych.Kriokonserwowane komórki wykazywały dobrą przyczepność, normalne rozprężanie i typowy kształt wrzeciona ze spiralnym wzrostem po rozmrożeniu i ponownym platerowaniu do kolb 2D. Co więcej, komórki zachowują również zdolność do różnicowania się w linie osteogenne, adipogenne i chondrogenne. Platforma ta może być również zaadoptowana do hodowli innych komórek zależnych od zakotwiczenia, takich jak komórki HEK293T i Vero.Po procesie przenoszenia kulek do kulek w 15-litrowym bioreaktorze HEK293T komórki osiągnęły szczytowe stężenie komórek 1,68 razy 10 do 7 komórek na mililitr. Podczas gdy komórki Vero osiągnęły stężenie 1,08 razy 10 do 7 komórek. Oba typy komórek zachowały wysoką żywotność.

large-scale-cell-production-based-on-gmp-grade-dissolvable-porous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Łącząc generowanie monodyspersyjnych kropli z inercyjnym porządkowaniem komórek i cząsteczek, opisujemy metodę enkapsulacji pożądanej liczby komórek lub cząsteczek w pojedynczej kropli z częstotliwością rzędu kHz. Wykazujemy wydajność dwukrotnie przekraczającą wydajność enkapsulacji nieuporządkowanej w przypadku kropli z jedną lub dwiema cząsteczkami.

Wysokoprzepustowa mikroenkapsulacja pojedynczych komórek i wielu komórek

Tkankowa matryca zewnątrzkomórkowa (ECM) jest kluczowym mediatorem funkcji komórki. W artykule opisano metody syntezy czystych pianek i mikronośników pochodzących z ECM, które są stabilne w hodowli bez konieczności sieciowania chemicznego do zastosowań w zaawansowanych modelach hodowli komórkowych 3D in vitro lub jako proregeneracyjne biorusztowania.

Wytwarzanie pianek i mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej jako specyficznych tkankowo platform do hodowli i dostarczania komórek

Proponujemy protokół ekspansji komórek na makroporowatych mikronośnikach i ich wykorzystanie jako systemu dostarczania w bioreaktorze perfuzyjnym do tworzenia zdecelularizowanej matrycy tkankowej. Uwzględniamy również różne techniki określania proliferacji komórek i żywotności komórek hodowanych na mikronośnikach. Ponadto wykazujemy funkcjonalność komórek po hodowlach w bioreaktorach.

Rekombinowane mikronośniki peptydowe kolagenu I do ekspansji komórek i ich potencjalne zastosowanie jako system dostarczania komórek w modelu bioreaktora

Tutaj prezentujemy protokół produkcji dużej liczby egzosomów klasy GMP z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego za pomocą bioreaktora 3D.

Przygotowanie na dużą skalę egzosomów pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego za pomocą hodowli bioreaktora 3D

Prezentowana tutaj jest łagodna technika druku 3D napędzana zmiennymi siłami lepko-inercyjnymi, aby umożliwić budowę mikronośników hydrożelowych. Dysze domowej roboty oferują elastyczność, umożliwiając łatwą wymianę dla różnych materiałów i średnic. Można uzyskać mikronośniki wiążące komórki o średnicy 50-500 μm i pobrać je do dalszej hodowli.

Druk 3D mikronośników hydrożelowych in vitro metodą natryskiwania naprzemienną siłą lepko-inepunktualną

Obecny protokół opisuje wytwarzanie wysoce otwartych porowatych mikrosfer (HOPM) na bazie poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) za pomocą opartej na pojedynczej emulsji technologii mikroprzepływowej. Mikrosfery te mają potencjalne zastosowania w inżynierii tkankowej i badaniach przesiewowych leków.

Wytwarzanie wysoce otwartych porowatych mikrosfer (HOPM) za pomocą technologii mikroprzepływowej

To badanie wprowadza nowatorską sub-mikrożelową kąpiel zawiesinową κ-karagenową, wykazującą niezwykłe właściwości odwracalnego przejścia między zakleszczeniem a odblokowaniem. Atrybuty te przyczyniają się do budowy biomimetycznych tkanek i narządów w osadzonym biodruku 3D. Udane drukowanie tkanek przypominających serce/przełyk o wysokiej rozdzielczości i wzroście komórek świadczy o wysokiej jakości biodruku i zastosowaniach inżynierii tkankowej.

Osadzony biodruk struktur tkankopodobnych przy użyciu submikrożelowej pożywki κ-karagenowej

Opisano protokół produkcji komórek zależnych od kotwiczenia mikronośnikowo-mikrobioreaktorowymi jako potencjalne terapie oparte na komórkach. Ukierunkowane na ostry zespół niedociągania oddechowego ilustruje porównywalną wydajność komórek i korzystną ekspresję genów w porównaniu do warunków procesów opartych na kolbach. Protokół ten jest rozszerzalny na inne komórki zależne od kotwiczenia oraz wskazania celowe.

Produkcja komórek stromalnych zależnych od kotwiczenia mezenchymalnych opartych na mikrobioreaktorze, przygotowanych do ostrego zespołu niedociągania oddechowego

Protokół ten opisuje skalowalną metodę rozszerzania produktów Adoptive Cell Therapies (ACT), mianowicie komórek Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T oraz komórek zabójczych indukowanych cytokinami (CIK), wykorzystujących urządzenia Gas-permeable Rapid Expansion (G-Rex), wykazując efektywny i solidny wzrost w klinicznie istotnych warunkach.

Efektywna i szybka generacja komórek zabójczych indukowanych przez CAR-T i cytokiny w urządzeniach skalowalnych GMP

Pomimo wyjątkowych właściwości mechanicznych i biochemicznych jedwabiu pająków, materiał ten nie może być pozyskiwany w dużych ilościach metodami konwencjonalnymi. W niniejszej pracy opisujemy efektywną strategię przędzenia sztucznych włókien jedwabiu pająka, co stanowi istotny proces dla badaczy analizujących produkcję jedwabiu pająków oraz jego zastosowanie jako biomateriałów nowej generacji.

Produkcja syntetycznego jedwabiu pajęczego w skali laboratoryjnej

Poznaj metodę produkcji ogniw na dużą skalę przy użyciu rozpuszczalnych mikronośników klasy GMP w zamkniętym systemie bioreaktorowym. Protokół umożliwia wydajną hodowlę komórek mezenchymalnych, HEK293T i Vero z zachowaniem standardów terapii komórkowej i genowej.

Produkcja ogniw na dużą skalę w oparciu o rozpuszczalne porowate mikronośniki klasy GMP

Przeglądaj więcej filmów