Wywoływanie ciąży rzekomej u samic myszy bez konieczności wazektomii samców przed niechirurgicznym transferem zarodków lub sztucznym zapłodnieniem
7 lipca 2023
Przedstawiona metoda manipulacji szyjką macicy może wywołać pseudociążę u myszy bez potrzeby rozmnażania samic z samcami po wazektomii. Indukcja ciąży rzekomej jest niezbędna do powodzenia niechirurgicznego transferu zarodków i niechirurgicznego sztucznego zapłodnienia, które również zostały przedstawione.
Naszym głównym celem badawczym jest rozwój technik wspomaganego rozrodu, które zapewniają udoskonalenia i redukcje zgodnie z zasadą 3R eksperymentów na zwierzętach. Opracowaliśmy niechirurgiczne procedury transferu zarodków i niechirurgicznego sztucznego zapłodnienia dla myszy oraz niechirurgiczną procedurę transferu zarodków dla szczurów. Wraz z dodaniem procedury manipulacji szyjki macicy w celu zapewnienia samic w ciąży rzekomej, tworzymy ulepszenia 3R i wspomagany rozród u gryzoni.
Opisane tutaj protokoły zapewniają uproszczone metody odzyskiwania młodych przy użyciu niechirurgicznych metod transferu zarodków i sztucznego rozsiewu u myszy. Protokół manipulacji szyjki macicy zapewnia udoskonalenie procedur produkujących biorczynie pseudociężarnych kobiet do technik wspomaganego rozrodu. Zmniejsza liczbę samic potrzebnych jako biorczynie pseudociąży i eliminuje potrzebę wazektomii mężczyzn.
Przedstawione tutaj protokoły mogą być wykorzystywane do strategicznego zarządzania wiwarium. Protokoły mogą być stosowane przy kriokonserwacji, zapłodnieniu in vitro, rederywacji, produkcji kohort dopasowanych do wieku oraz produkcji zwierząt modyfikowanych genetycznie. Aby rozpocząć ocenę cytologiczną w celu potwierdzenia synchronizacji cyklu ESRA, delikatnie zbierz komórki pochwy od myszy CD1, tocząc wacik po ścianie pochwy za pomocą małego, wstępnie zwilżonego wacika.
Rozsmaruj zebrane komórki pochwy w 20-mikrolitrowej kropli sterylnej wody na szkiełku mikroskopowym i wysusz na powietrzu. Pod mikroskopem użyj 100-krotnego powiększenia z oświetleniem jasnego pola, aby ocenić obecność zrogowaciałych komórek nabłonka. W przypadku manipulacji szyjki macicy umieść samicę biorcy na górze klatki z rusztem na około 0,5 godziny przed inseminacją, pozwalając myszy chwycić powierzchnię pręta klatki.
Chwyć w pobliżu podstawy ogona myszy za pomocą kciuka i palca wskazującego, a następnie ustaw ogon w górę, jednocześnie stabilizując zwierzę. Włóż koniec małego plastikowego pręta do pochwy, aby zetknął się z szyjką macicy i wibruj przez 30 sekund w kontakcie z drżeniem. Aby wykonać niechirurgiczny transfer nasienia do sztucznego zapłodnienia, umieść urządzenie do inseminacji na pipecie P200 ustawionej na 40 mikrolitrów i zdejmij osłonę ochronną.
Wyjmij podwielokrotność zpojemnościowej próbki nasienia z naczynia, umieszczonej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, i przenieś ją do 35-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowej bez oleju w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Docisnąć tłok pipety do oporu. Opuść końcówkę cewnika do próbki nasienia i powoli załaduj 40 mikrolitrów próbki do urządzenia transferowego.
Przed odstawieniem pipety na bok usunąć resztki oleju z zewnętrznej części urządzenia do inseminacji za pomocą chusteczki chłonnej. Następnie umieść samicę odbiorcy na górze klatki z rusztu. Przytrzymaj samicę myszy w pozycji, chwytając ją w pobliżu podstawy ogona za pomocą kciuka i palca wskazującego, a następnie ustaw ogon w górę, jednocześnie stabilizując zwierzę.
Umieść mały wziernik w pochwie i wprowadź cewnik urządzenia do inseminacji do wziernika przez szyjkę macicy i do macicy. Gdy koncentrator urządzenia zetknie się ze wziernikiem, dozuj nasienie, naciskając tłok pipety do pierwszego oporu. Po zakończeniu wyjmij urządzenie i wziernik.
Rozpocznij niechirurgiczny transfer zarodków u myszy CD1 w 6 dniu, umieszczając 20-mikrolitrową kroplę pożywki M2 na pokrywie naczynia do hodowli tkankowej. Użyj odblaskowego oświetlenia pod mikroskopem i załaduj od 10 do 20 asyst podmuchu do kropli podłoża M2 za pomocą standardowej pipety do obsługi zarodków. Przymocuj niechirurgiczne urządzenie do transferu zarodków na pipecie P2 o pojemności 1,8 mikrolitra i zdejmij osłonę cewnika ochronnego.
Docisnąć tłok pipety do pierwszego oporu i opuścić końcówkę cewnika do podłoża, a następnie powoli wciągnąć zarodki do końcówki cewnika urządzenia. Następnie wyjmij cewnik z pożywki. Następnie ustaw objętość pipety na 2,0 mikrolitrów, aby wytworzyć mały pęcherzyk powietrza na końcówce cewnika.
Delikatnie połóż pipetę załadowaną zarodkami w pobliżu klatki dla myszy. Umieść samicę biorcy na górze drucianej klatki i przytrzymaj mysz w odpowiedniej pozycji, chwytając w pobliżu podstawy ogona za pomocą palca wskazującego i kciuka, a następnie ustaw ogon pod kątem, stabilizując zwierzę. Umieść mały wziernik w pochwie i wprowadź cewnik urządzenia do przenoszenia do wziernika przez szyjkę macicy i do macicy.
Gdy koncentrator urządzenia zetknie się ze wziernikiem, należy dozować zarodki, naciskając tłok pipety do pierwszego oporu. Unikaj przenoszenia dodatkowego powietrza do rogu macicy. Wyjmij urządzenie i wziernik.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę manipulacji szyjnej indukującej pseudociążę u myszy, co jest niezbędne do skutecznego niechirurgicznego transferu embrionów oraz sztucznego zapłodnienia. Postęp ten ogranicza konieczność rozrodu i poprawia dobrostan zwierząt, zgodnie z zasadami 3R.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Techniki wspomaganej prokreacji
- Dobrostan zwierząt i zasada 3R
- Modele gryzoni
Wprowadzenie
- Aktualne wyzwania w metodach rozrodu samic w stanie pseudociąży
- Znaczenie ograniczenia liczby zwierząt hodowlanych
- Potrzeba wprowadzenia efektywnych procedur transferu embrionów u gryzoni
Zastosowane Metody
- Manipulacja szyjką macicy w celu wywołania pseudociąży
- Myszy (linia CD1)
- Techniki niechirurgicznego transferu embrionów i sztucznego zapłodnienia
Główne wyniki
- Manipulacja szyjkowa pozwala na skuteczne uzyskanie samic w stanie pseudociąży bez konieczności wykorzystania samców po wazektomii.
- Usprawnione protokoły poprawiają odsetność młodych dzięki zastosowaniu technik niechirurgicznych.
- Opisane metody są wartościowe w kriokonserwacji, zapłodnieniu in vitro oraz przy hodowli zwierząt modyfikowanych genetycznie.
Wnioski
- Badanie przedstawia skuteczną metodę indukcji pseudociąży u samic myszy, co usprawnia techniki wspomaganej prokreacji.
- Wyniki mają istotne znaczenie dla zwiększenia efektywności zarządzania w iwarium oraz zapewnienia wyższych standardów dobrostanu w badaniach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Efekcyjne indukowanie pseudociąży u samic myszy jest kluczowe dla skalowalnych i powtarzalnych procesów wspomaganej reprodukcji w badaniach przedklinicznych. Standaryzowana technika manipulacji szyjki macicy eliminuje potrzebę wykorzystywania samców po wazektomii, co usprawnia pracę w wiryarium i wspiera zasady 3R. To udoskonalenie zwiększa niezawodność i przewidywalność generowania biorczyń w stanie pseudociąży do transferu embrionów oraz sztucznego zapłodnienia, co bezpośrednio wpływa na alokację zasobów i wydajność eksperymentalną.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju BioPharma
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia szybkie generowanie kohort biorców dla genetycznie zmodyfikowanych i dobranych pod względem wieku modeli zwierzęcych.
- Wspiera efektywne procesy rederywacji i kriokonserwacji poprzez zapewnienie terminowej dostępności pseudociążnych samic.
- Redukuje zmienność biologiczną dzięki standaryzacji przygotowania biorców we wszystkich eksperymentach.
Przesiew i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych modeli zwierzęcych do dalszego przesiewania fenotypowego i testów funkcjonalnych.
- Poprawia powtarzalność i skalowalność protokołów transferu zarodków oraz sztucznego zapłodnienia.
- Umożliwia uzyskanie spójnych wyników ilościowych do oceny punktów końcowych w zakresie rozrodu i rozwoju.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia ciągłość translacyjną poprzez wspieranie produkcji genetycznie zmodyfikowanych modeli do badań nad chorobami.
- Redukuje wąskie gardła operacyjne w generowaniu modeli przedklinicznych i rozszerzaniu kohort.
- Wspiera progresję dostosowaną do ryzyka poprzez minimalizację błędów proceduralnych oraz liczby wykorzystywanych zwierząt.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Niniejszy protokół manipulacji szyjką macicy integruje się z kontinuum wspomaganej reprodukcji, od wczesnych odkryć, poprzez rozwój modeli przedklinicznych, aż po zarządzanie kohortami.
- Biologia odkryć: Usprawnia weryfikację hipotez i walidację modeli poprzez zapewnienie niezawodnego przygotowania biorców.
- Screening: Standaryzuje gotowość modeli zwierzęcych do wysokoprzepustowych testów reprodukcyjnych i rozwojowych.
- Analityka: Dostarcza ilościowe dane dotyczące ciąży i wielkości miotu w celu optymalizacji planowania eksperymentów i zasobów.
- Badania translacyjne: Umożliwia ciągłość w generowaniu i utrzymywaniu modeli zwierzęcych istotnych dla badania konkretnych chorób.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Oferuje wielokrotnego użytku, niesurgicalną metodę dla wielu zastosowań w obszarze wspomaganej reprodukcji w ramach programów badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie wyników reprodukcyjnych i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną podczas generowania modeli.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów wspomaganej reprodukcji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez ograniczenie liczby wykorzystywanych zwierząt i zmniejszenie złożoności procedur.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój modeli genetycznie zmodyfikowanych i istotnych w badaniach nad chorobami.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy technicznej w zakresie synchronizacji rui oraz procedur manipulacji szyjką macicy.
- Wymaga dostępu do podstawowej aparatury, takiej jak pipety, wzierniki oraz mikroskop do oceny cytologicznej.
- Wymaga standaryzacji między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności i zminimalizowania zmienności.
- Możliwość adaptacji dla różnych szczepów myszy oraz potencjalnie innych modeli gryzoni po optymalizacji protokołu.
- Ograniczenia obejmują konieczność precyzyjnego określania fazy rui oraz przeszkolenia operatora w celu maksymalizacji wydajności.
