Transformacja owłosionych korzeni soi w celu analizy funkcji genów

Nasza metoda transformacji owłosionych korzeni soi jest wystarczająca do jednoczesnego badania funkcji kilku genów lub sieci i może określić optymalne strategie inżynieryjne przed podjęciem decyzji o długoterminowej, stabilnej transformacji. Transformacja owłosionych korzeni soi jest użytecznym narzędziem do analizy funkcji genów w roślinach soi. Technologie, które są obecnie stosowane, obejmują edycję genomu CRISPR-Cas9, interferencję RNA, transkryptomikę i proteomikę oraz technologie obrazowania.

Głównym wyzwaniem we współczesnej erze genomiki funkcjonalnej jest wystarczająca analiza funkcji wielu genów. Większość trendów ma charakter poligeniczny, osiągany w wyniku interakcji wielu genów. Nasz protokół dotyczący owłosionych korzeni ułatwi analizę funkcji genów z wystarczającą przepustowością, aby można było zacząć rozumieć sieci poligeniczne.

Ustaliliśmy znaczenie plazmidu Ti w szczepach ryzogennych agrobacterium. Odkryliśmy, że bez badań przesiewowych w kierunku plazmidu Ti zwiększa się ryzyko, że ich przekształcone liścienie sojowe nie będą wytwarzać żadnych kolorów. W rezultacie, badania przesiewowe w kierunku ich plazmidu stały się istotnym krokiem przed ich transformacją.

W porównaniu z innymi technikami ekspresji genów, nasz system ekspresji owłosionych korzeni jest łatwy w obsłudze, mniej czasochłonny i opłacalny. Ponadto nasz nowy protokół poprawił tempo transformacji owłosionych korzeni nawet o 50% poprzez sprawdzenie plazmidu Ti w agrobacterium przed transformacją liścienia. Charakteryzując funkcję kilkunastu genów czynników transkrypcyjnych, nasze ostatnie wyniki utorowały drogę do badań inżynierii wielogenowej mających na celu odblokowanie biosyntezy cennych fitolity i metabolitów w roślinach.

W przyszłości wykorzystamy tę metodę transformacji owłosionych korzeni do analizy sieci genów czynników transkrypcyjnych, które regulują biosyntezę fitoaleksyn. Podejście to może zostać wykorzystane do zwiększenia produkcji tych wyspecjalizowanych metabolitów dla przemysłu farmaceutycznego i rolniczego. Na początek umieść od 16 do 20 nieskazitelnych okrągłych nasion soi Williams 82 w 50-mililitrowej probówce wirówkowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Dodaj 30 mililitrów 70% alkoholu izopropylowego do probówki i wstrząsaj przez 30 sekund. Zdekantować alkohol. Następnie delikatnie potrząśnij nasionami z 30 mililitrami 10% wybielacza przez 10 sekund i pozostaw nasiona w roztworze na pięć minut w temperaturze pokojowej.

Po pięciu minutach odcedź wybielacz. Następnie opłucz nasiona trzy razy 30 mililitrami sterylnej ultraczystej wody przez jedną minutę na płukanie i wylej wodę między każdym płukaniem. Umieść wysterylizowane nasiona na bibule filtracyjnej nasączonej pięcioma mililitrami pożywki do kiełkowania i kouprawy na sterylnej szalce Petriego.

Umieść płytki w ciemności w temperaturze pokojowej na trzy dni przed przeniesieniem ich w temperaturze 22 stopni Celsjusza pod 16-godzinnymi chłodnymi białymi lampami fluorescencyjnymi T5 na cztery dni, aby nasiona mogły wykiełkować. Aby zainfekować liścienie soi Agrobacterium rhizogenes, zaprojektuj startery do wykrywania genu plazmidu Ti virD2 przy użyciu sekwencji plazmidu Agrobacterium rhizogenes pRI2659. Po transformacji przetestuj kolonie Agrobacterium pod kątem zatrzymywania wirusa D2 metodą PCR przy użyciu zestawu do PCR.

Po wybraniu kolonii Agrobacterium rhizogenes zawierających zarówno wirus D2, jak i gen będący przedmiotem zainteresowania, umieść kilka kolonii na płytkach LB zawierających 100 miligramów na litr spektynomycyny dla interesującego plazmidu. Następnego dnia, za pomocą końcówki pipety P200, zeskrob 1,5 centymetra długości Agrobacterium z płytki LB i ponownie zawieś ją w jednym mililitrze buforu fosforanowego. Rozcieńczyć zawieszoną zawiesinę komórkową i wysterylizować do ultraczystej wody w acetosyringonie.

Zmierzyć absorbancję za pomocą rurki kuwetowej o gęstości optycznej 600 nanometrów. Następnie w komorze bezpieczeństwa biologicznego zanurz wysterylizowany skalpel w roztworze Agrobacterium i wykonaj nacięcie o głębokości jednego milimetra wzdłuż wewnętrznej powierzchni liścienia. Umieść sześć do ośmiu liścieni ściętą stroną do dołu na szalce Petriego zawierającej bibułę filtracyjną nasyconą kiełkowaniem i pożywkę hodowlaną z acetosyringonem.

Inkubuj płytki w temperaturze pokojowej przez trzy dni w 16-godzinnym okresie fotograficznym. Po trzech dniach przenieś zainfekowane liścienie na owłosiony wzrost korzeni lub płytki HRG. Inkubuj płytki w komorach wzrostowych ustawionych na 22 stopnie Celsjusza i natężenie światła 100 mikromoli podczas 16-godzinnego okresu fotograficznego, aż do zaobserwowania korzeni pierwotnych z korzeniami wtórnymi o długości od dwóch do trzech centymetrów.

Po trzech do czterech tygodniach zbierz korzenie pierwotne, które wyrastają z kalusa i zawierają korzenie wtórne, za pomocą sterylnego skalpela i kleszczy. Przenieś korzenie na wybrane płytki HRG zawierające odpowiednie antybiotyki i pozwól im rosnąć przez dodatkowe pięć dni. Piątego dnia zbierz transgeniczne owłosione korzenie z korzeniami wtórnymi o długości od trzech do sześciu centymetrów.

Jeśli obserwujesz białka fluorescencyjne, upewnij się, że korzenie wtórne mają małą autofluorescencję. Następnie, aby wykonać zabiegi chemiczne elicytorowe, pokrój korzenie wtórne na jednocentymetrowe kawałki i umieść około 100 miligramów na agarze HRG w stosie. Następnie nasącz stos 80 mikrolitrami odpowiedniego roztworu do leczenia i pozwól płytce inkubować w temperaturze pokojowej.

Po 24 godzinach, w celu ekstrakcji RNA, szybko osusz korzenie na wysterylizowanym ręczniku papierowym i zbierz je bezpośrednio do dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej. Natychmiast uszczelnij górną część rurki za pomocą parafilmu i wykonaj dwa małe otwory za pomocą spiczastych kleszczy. Przedstawiono wyniki PCR kolonii przekształconego Agrobacterium.

Dodatnie kolonie w PCR wskazywały na gen będący przedmiotem zainteresowania. Jednak 1/3 do 1/2 kolonii była ujemna w badaniu przesiewowym genu virD2. Mikroskopia fluorescencyjna wykazuje subkomórkową lokalizację GFP-GmJAZ 1-6.

Analiza ekspresji genów potwierdziła nadekspresję czynnika transkrypcyjnego glicyny GmHSF6-1 i wyciszenie RNAi GmMYB29A2 w owłosionych korzeniach Williamsa 82.