Name: In vitro Model płodu ludzkiego naczynia na chipie do badania mechanobiologii rozwojowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj metodę różnicowania komórek śródbłonka z ludzkich komórek iPS i ich stymulacji mechanicznej na chipie. Protokół umożliwia badanie mechanobiologii w kontrolowanych warunkach z wysoką powtarzalnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Research Advanced Grant 2021 od Europejskiego Towarzystwa Hematologicznego, Global Research Award 2021 od American Society of Hematology oraz Fundusz Wsparcia Strategii Wewnętrznej ISSF3 finansowany przez Welcome Trust i Uniwersytet w Edynburgu. Dziękujemy Fionie Rossi z Zakładu Cytometrii Przepływowej za wsparcie w analizie cytometrii przepływowej. Na potrzeby otwartego dostępu autor zastosował licencję Creative Commons Attribution (CC BY) do każdej wersji manuskryptu zaakceptowanej przez autora powstałej w wyniku tego zgłoszenia.

Differentiation and Mechanical Stimulation of hiPSC-Derived Endothelial Cells

<ol><li>Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+before+birth%3A+clues+from+gene+knockouts+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Death before birth: clues from gene knockouts and mutations.</a> Trends in Genetics. 11 (3), 87-93 (1995).</li>
<li>Ji, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+cardiac+function+during+early+mouse+embryogenesis+coincides+with+entry+of+primitive+erythroblasts+into+the+embryo+proper%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper.</a> Circulation Research. 92 (2), 133-135 (2003).</li>
<li>Peacock, H. M., Daems, M., Jones, E. A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+control+of+endothelial+cell+fates+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiac+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic control of endothelial cell fates in development.</a> Cardiac and Vascular Biology. 8, 127-166 (2021).</li>
<li>Chong, D. C., Koo, Y., Xu, K., Fu, S., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+arteriovenous+fate+acquisition+during+mammalian+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stepwise arteriovenous fate acquisition during mammalian vasculogenesis.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2153-2165 (2011).</li>
<li>Jaffredo, T., Gautier, R., Eichmann, A., Dieterlen-Lièvre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraaortic+hemopoietic+cells+are+derived+from+endothelial+cells+during+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Intraaortic hemopoietic cells are derived from endothelial cells during ontogeny.</a> Development. 125 (22), 4575-4583 (1998).</li>
<li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+Tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fate Tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).</li>
<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).</li>
<li>Boisset, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+haematopoietic+cells+emerging+from+the+mouse+aortic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium.</a> Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).</li>
<li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+forces+promote+embryonic+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biomechanical forces promote embryonic haematopoiesis.</a> Nature. 459 (7250), 1131-1135 (2009).</li>
<li>Diaz, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+forces+promote+blood+development+through+prostaglandin+E2+and+the+cAMP-PKA+signaling+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biomechanical forces promote blood development through prostaglandin E2 and the cAMP-PKA signaling axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (5), 665-680 (2015).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+development+is+dependent+on+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow.</a> Cell. 137 (4), 736-748 (2009).</li>
<li>Lundin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP+regulates+hematopoietic+stem+cell+formation+in+response+to+the+biomechanical+forces+of+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP regulates hematopoietic stem cell formation in response to the biomechanical forces of blood flow.</a> Developmental Cell. 52 (4), 446.e5-460.e5 (2020).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicry+of+embryonic+circulation+enhances+the+hoxa+hemogenic+niche+and+human+blood+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mimicry of embryonic circulation enhances the hoxa hemogenic niche and human blood development.</a> Cell Reports. 40 (11), 111339(2022).</li>
<li>Azzoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+onset+of+circulation+triggers+a+metabolic+switch+required+for+endothelial+to+hematopoietic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The onset of circulation triggers a metabolic switch required for endothelial to hematopoietic transition.</a> Cell Reports. 37 (11), 110103(2021).</li>
<li>Li, Y. S. J., Haga, J. H., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+effects+of+shear+stress+on+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells.</a> Journal of Biomechanics. 38 (10), 1949-1971 (2005).</li>
<li>Batsivari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+hematopoietic+stem+cell+development+through+functional+correlation+of+their+proliferative+status+with+the+intra-aortic+cluster+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Understanding hematopoietic stem cell development through functional correlation of their proliferative status with the intra-aortic cluster architecture.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1549-1562 (2017).</li>
<li>Canu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+endothelial-to-haematopoietic+transition+at+the+single+cell+level+identifies+cell+cycle+regulation+as+a+driver+of+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of endothelial-to-haematopoietic transition at the single cell level identifies cell cycle regulation as a driver of differentiation.</a> Genome Biology. 21 (1), 157(2020).</li>
<li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterialization+requires+the+timely+suppression+of+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Arterialization requires the timely suppression of cell growth.</a> Nature. 589 (7842), 437-441 (2020).</li>
<li>Yang, C. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+KLF1+enhances+the+differentiation+and+maturation+of+red+blood+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Activation of KLF1 enhances the differentiation and maturation of red blood cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).</li>
<li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+iPSC+line+capable+of+differentiating+into+functional+macrophages+expressing+ZsGreen%3A+A+tool+for+the+study+and+in+vivo+tracking+of+therapeutic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170219(2018).</li>
<li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+human+macrophages+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 2020 (158), (2020).</li>
<li>Fidanza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analyses+and+machine+learning+define+hematopoietic+progenitor+and+HSC-like+cells+derived+from+human+PSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Single cell analyses and machine learning define hematopoietic progenitor and HSC-like cells derived from human PSCs.</a> Blood. 136 (25), 2893-2904 (2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+development+is+dependent+on+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow.</a> Cell. 137 (4), 736-748 (2009).</li>
<li>Nguyen, J., Lin, Y. Y., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next+generation+of+endothelial+differentiation%3A+Tissue-specific+ECs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The next generation of endothelial differentiation: Tissue-specific ECs.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1188-1204 (2021).</li>
<li>Petazzi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+cells+support+the+development+of+human+hematopoietic+progenitors+in+vitro+via+secretion+of+IGFBP2%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Arterial cells support the development of human hematopoietic progenitors in vitro via secretion of IGFBP2.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Crosse, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-layered+spatial+transcriptomics+identify+secretory+factors+promoting+human+hematopoietic+stem+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Multi-layered spatial transcriptomics identify secretory factors promoting human hematopoietic stem cell development.</a> Cell Stem Cell. 27 (5), 822(2020).</li>
<li>Calvanese, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+human+haematopoietic+stem+cells+from+haemogenic+endothelium+to+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping human haematopoietic stem cells from haemogenic endothelium to birth.</a> Nature. 604 (7906), 534-540 (2022).</li>
<li>Zeng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+first+hematopoietic+stem+cell+generation+in+human+embryo+by+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tracing the first hematopoietic stem cell generation in human embryo by single-cell RNA sequencing.</a> Cell Research. 29 (11), 881-894 (2019).</li>
<li>Hwa, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+arterial-venous+fusions+and+fate+specification+in+mouse+embryos+lacking+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Abnormal arterial-venous fusions and fate specification in mouse embryos lacking blood flow.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11965(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Protokół, który tutaj opisujemy, pozwala na generowanie mechanowrażliwych komórek śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i badanie ich reakcji na stymulację mechaniczną, w której pośredniczy kontrolowane naprężenie ścinające. Protokół ten jest całkowicie oparty na cytokinach i w pełni kompatybilny z odczynnikami GMP w celu potencjalnej translacji na produkcję komórek do terapii komórkowej.
Wyprowadzenie hiPSC dostarcza naukowcom instrumentalnego modelu dla wczesnych etapów rozwoju embrionalnego, który umożliwia badanie procesów, które w innym przypadku byłyby trudne do zbadania in vivo24. W rzeczywistości ludzkie tkanki embrionalne dostępne do badań są pobierane z zarodków pozbawionych krążenia, co może mieć znaczący wpływ na sygnaturę molekularną kontrolowaną przez sygnały mechaniczne. Opisane tutaj podejście umożliwia obrazowanie na żywo i badanie w czasie rzeczywistym odpowiedzi komórek na naprężenia ścinające. Połączenie hiPSC z płynami zapewnia model badania, który przezwycięża ograniczoną dostępność i niedostępność rozwijających się tkanek płodu, gdy inicjacja krążenia przebudowuje i kontroluje tworzenie układu sercowo-naczyniowego i krwionośnego 3,9,10,25.
Ograniczeniem protokołu jest to, że komórki śródbłonka pochodzące z tego protokołu mogą nie odzwierciedlać różnych tożsamości różnych komórek śródbłonka obecnych w rozwijających się tkankach. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, podczas procesu różnicowania poprzedzającego stymulację płynną może być potrzebna specyficzna kombinacja cytokin w celu uzyskania pożądanej tożsamości lub fenotypu specyficznego dla tkanki26. Izolację podzbiorów śródbłonka można uzyskać przy użyciu bardziej wyrafinowanego immunofenotypu na etapie izolacji. Protokół ten izoluje komórki śródbłonka wyłącznie na podstawie ekspresji CD34, umożliwiając w ten sposób izolację kolumn zamiast sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS); Zmniejsza to śmierć komórek i ryzyko zanieczyszczenia. Co więcej, protokół ten został specjalnie zaprojektowany do badania roli naprężeń ścinających, w których pośredniczy przepływ laminarny. Alternatywne podejścia fluidyczne będą musiały zostać zastosowane do zbadania wpływu innych sygnałów mechanicznych, takich jak rozciąganie lub kompresja, lub innych rodzajów przepływu, takich jak przepływ zaburzony lub zakłócony.
Wcześniej wykazaliśmy, że komórki śródbłonka pochodzące z iPSC naśladują heterogeniczne tożsamości komórkowe tętniczo-żylne27 podobne do obserwowanej w aorcie grzbietowej płodu 28,29,30. Ma to szczególne znaczenie w kontekście rozwoju naczyń krwionośnych i specyfikacji komórkowej, o której wiadomo, że jest kontrolowana przez krążenie krwi. Badania na różnych modelach wykazały, że brak krążenia powoduje zmienioną specyfikację tętniczo-żylną 11,14,31. Mechanizmy, które łączą sygnały mechaniczne ze specyfikacją komórki, są nadal nieznane, a opisana tutaj linia pozwala na wyrafinowane badania funkcjonalne, których nie można było przetestować in vivo.
Linia ta opisuje produkcję i stymulację komórek śródbłonka pochodzących z hiPSC przy użyciu dostępnych na rynku kanałów płynowych, unikając konieczności odlewania urządzeń, jak w przypadku szeroko stosowanych urządzeń z polidimetylosiloksanu (PDMS)12. Co więcej, zastosowanie chipów PDMS sprawia, że zbieranie stymulowanych komórek jest szczególnie trudne, podczas gdy dzięki temu protokołowi komórki można łatwo pobrać z kanału. To znacznie poprawia moc analityczną, umożliwiając późniejsze analizy, takie jak analizy proteomiczne i transkryptomiczne, cytometria przepływowa i testy funkcjonalne, które mogą wymagać dalszej hodowli lub testów in vivo .

Podczas rozwoju embrionalnego, serce jest pierwszym organem, który osiąga funkcjonalność1, z wykrywalnymi skurczami od najwcześniejszego etapu tworzenia się rurki wsierdziowej2. Krążenie, wraz z mechanicznymi sygnałami, w których pośredniczy przepływ krwi w naczyniu, kontroluje wiele kluczowych aspektów wczesnego rozwoju. Przed ustanowieniem krążenia płodowego układ naczyniowy jest zorganizowany w pierwotny splot kapilarny; Po funkcjonowaniu serca splot ten reorganizuje się w naczynia żylne i tętnicze3. Rola wskazówek mechanicznych w specyfikacji tętniczo-żylnej znajduje odzwierciedlenie w panśródbłonkowej ekspresji markerów tętniczych i żylnych przed inicjacją przepływu krwi4.
Siły hemodynamiczne nie tylko kontrolują rozwój samego układu krwi, ale także odgrywają fundamentalną rolę w kontrolowaniu tworzenia się krwinek. Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) wyłaniają się z wyspecjalizowanych komórek śródbłonka zwanych śródbłonkiem hemogennym5,6,7,8, obecne w różnych regionach anatomicznych zarodków wyłącznie we wczesnym stadium rozwoju. Modele z niedoborem serca, wraz z modelami in vitro, wykazały, że mechaniczne sygnały instruują i zwiększają produkcję HSPC z hemogennego śródbłonka9,10,11,12,13,14.
Wykazano, że różne rodzaje dynamiki przepływu w różny sposób kontrolują cykl komórkowy15, znane jako ważne zarówno w endothelium hemogennym16,17 i specyfikacji komórek tętniczych18. Ogólnie rzecz biorąc, sygnały mechaniczne są krytycznymi determinantami tożsamości i funkcji komórki podczas rozwoju. Nowatorskie urządzenia fluidyczne in vitro pozwalają nam przezwyciężyć ograniczenia związane z badaniem mechanobiologii rozwojowej podczas rozwoju ludzkiej krwi in vivo.
Ogólnym celem protokołu w tym manuskrypcie jest opisanie, krok po kroku, eksperymentalnego procesu badania wpływu naprężeń ścinających na ludzkie komórki śródbłonka pochodzące in vitro z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące różnicowania hiPSC w komórki śródbłonka, a następnie ich umieszczania w chipach płynnych w celu protokołu stymulacji. Korzystając z tego, różne komórki śródbłonka pochodzące z in vitro mogą być testowane pod kątem ich zdolności do wyczuwania naprężeń ścinających, analizując ich orientację w odpowiedzi na przepływ. Umożliwi to innym laboratoriom zajęcie się pytaniami dotyczącymi reakcji na naprężenia ścinające i ich funkcjonalnych konsekwencji dla różnych tożsamości komórek śródbłonka.

<table><tbody><tr><td>0,6 Niepowlekane szkiełko podstawowe</td><td>ibidi</td><td>IB-80186</td><td></td></tr><tr><td>25% BSA</td><td>Life Technologies</td><td>A10008-01</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>Podawany jako odczynnik dysocjacyjny</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Merck</td><td>A4544-100G</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta aspiracyjna</td><td>Sardtedt</td><td>86.1252.011</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>cytowany jako suplement do hodowli komórek neuronalnych (50x)</td></tr> <tr><td>BD FACS DIVA</td><td>BD Biosciences</td><td>wersja 8.0.1</td><td>Cytowany jako oprogramowanie do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>BD LSR Fortessa 5 Laser</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>CD34 Zestaw mikrokulek</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>30-046-702</td><td></td></tr><tr><td>CD34 PE klon 4H11</td><td>Invitrogen</td><td>12-0349-42</td><td></td></tr><tr><td>CD34 PerCP-eFluor 710 klon 4H11</td><td>Invitrogen</td><td>44-0349-42</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe Cellstar z powierzchnią odstraszającą komórki</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657970</td><td>Cytowany jako płytka odstraszająca komórki</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemicals&nbsp;</td><td>13122-1mg-CAY</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10&nbsp; kriokonserwacja komórek</td><td>Merck</td><td>C2874-100ML</td><td>Cytowany jako roztwór do kriokonserwacji</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek VWR</td><td></td><td>200-664-3</td><td>Cytowany jako DMSO</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>DPB Ca2+ Mg2+</td><td>Life Technologies</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>Filtr siatkowy EASY 40 &mu; m</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542040</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Life technologies</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący FcR</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>Fidżi</td><td></td><td>Wersja 1.53c</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo</td><td></td><td>Wersja 10.7.1</td><td>Cytowany jako analiza cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>FLT3L</td><td>Peprotech</td><td>300-19-10uG</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka fluidyczna</td><td>ibidi</td><td>10903</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050038</td><td>Cytowana jako suplement L-glutaminy</td></tr><tr><td>Ham F-12&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Holo-transferyna</td><td>Merk</td><td>T0665-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Albumina ludzkiej surowicy</td><td>Fujifilm UK LTD</td><td>9988</td><td></td></tr><tr><td>System pomp Ibidi</td><td>ibidi</td><td>10902</td><td>Cytowany jako system pomp</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>ioLight/Thisle Scientific</td><td>IOL-IO-INVERT</td><td>Cytowany jako odwrócony mikroskop inkubatorowy</td></tr><tr><td>Liofilizowany BSA&nbsp;</td><td>Separator Merck</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-102</td><td>Cytowany jako separator magnetyczny</td></tr><tr><td>Kolumny MS</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-201</td><td>Cytowany jako Kolumna magnetyczna</td></tr><tr><td>MTG</td><td>Merck</td><td>M6145-25ML</td><td></td></tr><tr><td>N2 suplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Notebook do systemu pompowego</td><td>ibidi</td><td>10908</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 37-41%</td><td>Fisher Chemicals</td><td>F/1501/PB15</td><td></td></tr><tr><td>Pastette</td><td>Greiner Bio-one</td><td>612398</td><td></td></tr><tr><td>długopis/paciorkowiec</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do perfuzji ŻÓŁTY/ZIELONY: 50 cm, ID 1,6 mm, zbiorniki 10 ml</td><td>Ibidi</td><td>IB-10964</td><td>Cytowany jako zestaw perfuzyjny</td></tr><tr><td>Polistyrenowe rurki z okrągłym dnem</td><td>Falcon</td><td>352008</td><td>Cytowany jako Probówki do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Prism 9</td><td></td><td>Verison 9.4.0</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie sterujące pompą</td><td>ibidi</td><td>wersja 1.6.1</td><td>Cytowane jako Oprogramowanie pompy</td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>5872</td><td>Cytowane jako Rozwiązanie odłączające</td></tr><tr><td>rhBMP4</td><td>R& D</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>rhEPO</td><td>R& D</td><td>287-TC-500</td><td></td></tr><tr><td>rhIGF1</td><td>Peprotech</td><td>100-11-100uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL11</td><td>Peprotech</td><td>200-11-10uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL3</td><td>Peprotech</td><td>200-03-10uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL6</td><td>R& D</td><td>206-IL-010</td><td></td></tr><tr><td>rhLaminin-521</td><td>Life technologies</td><td>A29248 Cytowany</td><td>jako Laminin</td></tr><tr><td>rhSCF</td><td>Life Technologies</td><td>PHC2111</td><td></td></tr><tr><td>rhTPO</td><td>R& D</td><td>288-TPN-025</td><td></td></tr><tr><td>rhVEGF</td><td>R& D</td><td>293-VE-010</td><td></td></tr><tr><td>RLT Lysis Buffer</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>Złącze szeregowe do &mikro-szkiełek: Sterylne, sterylne</td><td>ibidi</td><td>IB-10830</td><td></td></tr><tr><td>StemPro-CD34 SFM</td><td>Media Life Technologies</td><td>10639011</td><td>cytowane jako pożywka bez surowicy dla komórek CD34+ (SFM-34)</td></tr><tr><td>StemPro-CD34 Suplement odżywczy&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10641-025</td><td>Cytowany jako 34 suplement odżywczy</td></tr><tr><td>StemPro hESC SFM</td><td>Life Technologies</td><td>A1000701</td><td>cytowany jako pożywka hodowlana&nbsp;</td></tr><tr><td>Suplement StemPro</td><td>Life Technologies</td><td>A10006-01</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin (VTN-N) rekombinowane białko ludzkie, skrócone</td><td>Invitrogen</td><td>A31804</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorowodorek</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Cytowany jako iRock</td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro model płodu ludzkiego naczynia na chipie do badania mechanobiologii rozwojowej

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

Serce jest pierwszym organem, który jest funkcjonalnie tworzony podczas rozwoju, inicjując w ten sposób krążenie krwi bardzo wcześnie w ciąży. Oprócz transportu tlenu i składników odżywczych w celu zapewnienia wzrostu płodu, krążenie płodu kontroluje wiele kluczowych wydarzeń rozwojowych zachodzących w warstwie śródbłonka za pomocą wskazówek mechanicznych. Sygnały biomechaniczne indukują zmiany strukturalne w naczyniach krwionośnych, ustalają specyfikację tętniczo-żylną i kontrolują rozwój hematopoetycznych komórek macierzystych. Niedostępność rozwijających się tkanek ogranicza zrozumienie roli krążenia we wczesnym rozwoju człowieka; Dlatego modele in vitro są kluczowymi narzędziami do badania mechanobiologii naczyń krwionośnych. W artykule opisano protokół różnicowania komórek śródbłonka od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych, a następnie ich umieszczania w urządzeniu fluidycznym w celu zbadania ich reakcji na sygnały mechaniczne. Takie podejście pozwala na długotrwałą hodowlę komórek śródbłonka pod wpływem stymulacji mechanicznej, a następnie pobranie komórek śródbłonka w celu charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej. Opracowany w ten sposób model in vitro będzie miał zasadnicze znaczenie dla wyjaśnienia wewnątrzkomórkowych mechanizmów molekularnych, które transdukują sygnalizację, w której pośredniczą sygnały mechaniczne, które ostatecznie kierują rozwojem naczyń krwionośnych podczas życia płodowego człowieka.

Opisujemy tutaj protokół różnicowania i mechanostymulacji komórek śródbłonka pochodzących z hiPSC, który umożliwia badanie ich odpowiedzi na bodźce mechaniczne (Rysunek 1). Protokół ten prowadzi do wytworzenia funkcjonalnie mechanowrażliwych komórek śródbłonka. Przedstawiamy tutaj reprezentatywne wyniki i opisujemy oczekiwany fenotyp, aby ocenić, w jaki sposób komórki reagują na stymulację cytokinami podczas różnicowania.
<img alt="Schemat procesu różnicowania iPSC z izolacją komórek CD34+, stymulacją mechaniczną i analizą komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat protokołu różnicowania i stymulacji mechanicznej. Schemat protokołu różnicowania przedstawiający harmonogram podawania poszczególnych mieszanin cytokin, izolację komórek CD34+, zasiewanie chipa mikrofluidycznego oraz końcową analizę komórek stymulowanych mechanicznie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Hodowla hiPSC 
Ważne jest, aby rozpocząć protokół od komórek hiPSC, które prawidłowo rosną w warunkach samoodnowienia. Dobrym wskaźnikiem jakości hodowli jest szybkość ich wzrostu. Po rozmrożeniu komórki mogą potrzebować 2-3 tygodni, aby osiągnąć odpowiednią fazę wzrostu, która zapewni prawidłową dyferencjację. Gdy komórki można pasażować dwa razy w tygodniu w stosunku 1:6, osiągając niemal pełną konfluencję, oznacza to, że są one gotowe do dyferencjacji w dniu, w którym powinny zostać poddane pasażowaniu.
Różnicowanie hiPSC w komórki śródbłonka 
Pierwszy etap różnicowania, polegający na formowaniu ciał embrionalnych (EB), jest zależny od linii komórkowej i może wymagać optymalizacji dla konkretnej użytej linii. Dysocjację opisaną w krokach protokołu 1.3.2.2-1.3.2.4 można zmodyfikować poprzez skrócenie lub wydłużenie inkubacji z odczynnikiem dysocjującym oraz późniejszą dysocjację za pomocą pipety Pasteura. Ponadto, w tym kroku można zastosować inne odczynniki dysocjujące, uzupełniając je o fizyczną dysocjację kolonii za pomocą narzędzia tnącego lub końcówki pipety P100. Ciała embrionalne dobrej jakości wykazują wyraźną krawędź do 2. dnia różnicowania i wydają się przejrzyste oraz jasne podczas obserwacji pod mikroskopem; ciemniejsze obszary mogą wskazywać na obumieranie komórek wewnątrz EB (Rycina 2).
<img alt="Proces agregacji komórek, obraz mikroskopowy; porównanie gęstości kolonii, skala 500 µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig2v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Morfologia ciał embrionoidalnych. (A) Ciała embrionoidalne w 2. dniu, wykazujące wyraźnie zarysowane krawędzie zewnętrzne i jednolity rozmiar. (B) Ciała embrionoidalne w 2. dniu o niskiej jakości, wykazujące rozległą śmierć komórek prowadzącą do dezintegracji struktury. Pasek skali = 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
W 2. dniu dodanie CHIR99021 do ciał embrionalnych (EB) hamuje białko GSK-3, co prowadzi do aktywacji szlaku Wnt. Różne linie komórkowe wykazują odmienne reakcje na traktowanie CHIR, co należy zweryfikować poprzez ilościowe oznaczenie liczby komórek CD34+ uzyskanych w 8. dniu przy zastosowaniu różnych stężeń (Rycina 3).
<img alt="Histogram cytometrii przepływowej, poziomy ekspresji CD34-PE, analiza danych, porównanie trzech próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig3v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Różnicowanie komórek śródbłonka przy różnych stężeniach CHIR. Ilościowe oznaczenie zaangażowania w linię komórek śródbłonka za pomocą cytometrii przepływowej w 8. dniu różnicowania na podstawie ekspresji błonowej CD34 po zastosowaniu CHIR w 2. dniu w stężeniach (A) 3 µM, (B) 5 µM oraz (C) 7 µM. Dane z cytometrii przepływowej uzyskano przy użyciu cytometrów pięciolaserowych i dedykowanego oprogramowania (patrz Tabela materiałów). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Izolacja komórek CD34+ 
Ważne jest potwierdzenie, że wzbogacenie w komórki CD34+ z użyciem kulek magnetycznych zapewnia co najmniej 80% CD34+ po elucji z kolumny. Aby zapewnić wystarczającą czystość, alikwot komórek uzyskanych w wyniku izolacji magnetycznej można poddać analizie cytometrią przepływową, pamiętając o zastosowaniu innego klonu przeciwciała niż ten użyty do wzbogacania magnetycznego. W tym przypadku zastosowano klon 4H11, uzyskując czystość na poziomie ~85% po wzbogaceniu (Rysunek 4).
<img alt="Analiza cytometrii przepływowej, ekspresja CD34-PE przed i po wzbogaceniu komórek, wykres porównania danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig4v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Ekspresja błonowa CD34 przed i po wzbogaceniu metodą sortowania magnetycznego. Zdysocjowane ciała embrionalne w 8. dniu (szare) oraz komórki po wzbogaceniu magnetycznym (zielone) zostały zabarwione pod kątem ekspresji CD34 i przeanalizowane metodą cytometrii przepływowej, co wykazało skuteczne wzbogacenie po sortowaniu. Dane z cytometrii przepływowej uzyskano przy użyciu cytometrów pięciolaserowych i dedykowanego oprogramowania (patrz Tabela materiałów). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wysiewanie komórek do kanału mikroprzepływowego 
Podczas wysiewania komórek do kanału mikroprzepływowego kluczowe jest monitorowanie adhezji i proliferacji komórek śródbłonka. Po wysiewaniu komórki potrzebują ok. 5 h na pełną adhezję do kanału (Rycina 5A). Na tym etapie w celu poprawy adhezji można przetestować alternatywny roztwór do powlekania. Aby potwierdzić, że badane komórki są mechanosensytywne, a tym samym zdolne do reagowania na stymulację mechaniczną, można badać orientację komórek w czasie. Przed stymulacją komórki wykazują losową orientację (Rycina 5A oraz Rycina 5C), a następnie orientują się równolegle do kierunku przepływu (Rycina 5B,C). Opisany tutaj protokół umożliwia odzyskanie komórek z kanału w celu przeprowadzenia dalszych analiz, np. cytometrii przepływowej, do badania immunofenotypu błonowego, co potwierdza tożsamość śródbłonkową stymulowanych komórek (Rycina 5D,E).
<img alt="Obrazy wyrównania komórek i dane z cytometrii przepływowej; widok mikroskopowy, wykres kierunkowy, analiza histogramu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig5v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Mechanoreaktywność komórek śródbłonka pochodzących z hiPSC. (A) Konfluenta warstwa wyizolowanych komórek CD34+ 48 h po wysianiu. (B) Przeorientowana warstwa komórek śródbłonka po 3 dniach hodowli dynamicznej. (C) Analiza orientacji komórek śródbłonka po 5 dniach hodowli dynamicznej. (D) Profil ekspresji CD34 komórek hodowanych w przepływie przez 5 dni. (E) Procent komórek CD34+ w populacji komórek pobranych z kanału płynowego. Obrazy wykonano przy użyciu odwróconego mikroskopu inkubatorowego; dane z cytometrii przepływowej uzyskano za pomocą cytometrów pięciolaserowych i dedykowanego oprogramowania (patrz Tabela materiałów). Paski skali = 100 µm (A,B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynniki</td>
			<td>Stężenie zapasu</td>
			<td>Dodana objętość</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modyfikowane pożywka Dulbecco Iscove’a (IMDM)</td>
			<td>-</td>
			<td>333 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pożywka Ham’s F-12 (F-12)</td>
			<td>-</td>
			<td>167 ml</td>
			<td>-         </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suplement N-2 (100x)</td>
			<td>100 x</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suplement B-27 (50x) </td>
			<td>50 x</td>
			<td>10 ml</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas askorbinowy</td>
			<td>10 mg/ml</td>
			<td>1,25 ml</td>
			<td>25 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>$\alpha$-monotioglicerol (MTG)</td>
			<td>11,5 M</td>
			<td>19.5 µL</td>
			<td>448.5 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ludzka albumina surowicy</td>
			<td>100 mg/ml</td>
			<td>2,5 ml</td>
			<td>0,5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferyna</td>
			<td>100 mg/ml</td>
			<td>0,75 ml</td>
			<td>150 µg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład i receptura na 500 mL pożywki do różnicowania bezsurowiczej (SFD).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dni różnicowania</td>
			<td>Mieszanka cytokin</td>
			<td>Cytokina</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dzień 0–2</td>
			<td>Mieszanina 1</td>
			<td>BMP4</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dzień 2</td>
			<td>Mieszanina 2</td>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>7 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Od trzeciego dnia włącznie</td>
			<td rowspan="2">Wymieszać 3 i 4</td>
			<td>VEGF</td>
			<td>15 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>bFGF</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Od 6. dnia wzwyż</td>
			<td rowspan="8">Mieszanina 4</td>
			<td>IL6</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>FLT3L</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>IGF1</td>
			<td>25 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>IL11</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SCF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EPO</td>
			<td>3 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>TPO</td>
			<td>30 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>IL3</td>
			<td>30 ng/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Mieszaniny cytokin stosowane do różnicowania komórek śródbłonka, dni ich dodawania do medium SFD oraz stężenie końcowe.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Naprężenie ścinające (dyn/cm2)2) </td>
			<td>Czas (h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>Do końca eksperymentu</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Wartości naprężenia ścinającego dla hodowli dynamicznej oraz czas ich stosowania.
Rysunek uzupełniający S1: Geometria i wymiary chipa oraz rurek użytych w tym protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/SF1.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca S2: Instrukcja krok po kroku dotycząca oprogramowania sterującego pompą powietrzną wraz z opisem każdego etapu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492_Supp%20Figure%20S2%20FINAL.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający S3: Instrukcja analizy orientacji z wykorzystaniem oprogramowania FIJI, przedstawiająca obrys kształtu komórki, dopasowanie elipsy oraz pomiar końcowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492_SF3.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca S1: Wielkość jednostki, objętość resuspensji i stężenia roztworów zapasowych cytokin użytych w protokole różnicowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/Ventura%20et%20al,%202023%20-%20Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Opisano tutaj prosty proces różnicowania komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, a następnie szczegółowy protokół ich mechanicznej stymulacji. Pozwala to na badanie mechanobiologii rozwojowej komórek śródbłonka. Podejście to jest kompatybilne z dalszymi testami żywych komórek pobranych z chipa hodowlanego po stymulacji mechanicznej.

In vitro Model płodu ludzkiego naczynia na chipie do badania mechanobiologii rozwojowej

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

Nasze badania badają, w jaki sposób mechaniczne sygnały instruują los komórek śródbłonka podczas rozwoju, dla których łączymy indukowane przez człowieka różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych ze stymulacją mechaniczną za pośrednictwem płynu. Komórki śródbłonka są stale narażone na ruch krwi, więc ważne sygnały są pomijane w badanej hodowli, co sprawia, że jest to główne wyzwanie w badaniu biologii komórek śródbłonka przy użyciu tradycyjnych systemów hodowli. Mechaniczne sygnały w rzeczywistości aktywują wiele kluczowych szlaków sygnałowych, które mogą zostać przeoczone w hodowli komórkowej w warunkach badania.Nasz protokół zawiera prosty przewodnik krok po kroku, jak różnicować i mechanicznie stymulować indukowane pluripotencjalne komórki śródbłonka pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Pomoże to wielu laboratoriom w przyjęciu hodowli, aby łatwo odpowiedzieć na pytania dotyczące zachowania komórek śródbłonka podczas niedopełnienia. Na początek, w dniu zero, wstępnie rozgrzej pożywkę do różnicowania wolnej surowicy lub pożywkę zawierającą SFD, wymieszaj jedną cytokinę do 37 stopni Celsjusza.Następnie pod sterylnym kapturem do hodowli tkanek dodać mieszankę jednej pożywki uzupełnionej cytokinami do każdej studzienki sześciodołkowej płytki odstraszającej komórki. Aby przygotować komórki, należy odessać pożywkę hodowlaną z sześciodołkowej płytki zawierającej ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste lub ludzkie komórki iPS. Umyj je DPBS, a następnie zasysaj DPBS.Następnie dodaj odczynnik dysocjacyjny do komórek i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez minutę. Po zaessaniu odczynnika dysocjacyjnego inkubować komórki przez kolejne trzy minuty w temperaturze pokojowej. Następnie dotknij płytki zawierającej komórki 10 razy z każdej strony, aby odłączyć klastry komórek.Dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanej mieszanki, jedną pożywkę SFD uzupełnioną cytokinami do komórek na studzienkę. Za pomocą pipety Pasteura przenieś skupiska komórek z każdej studzienki do jednego dołka płytki odstraszającej komórki zawierającej pożywkę, mieszając jedną cytokinę. Po wprowadzeniu płytki do inkubatora należy przesuwać ją w przód i w tył, a także na boki, aby równomiernie rozprowadzić zawartość i inkubować ją w celu uzyskania ciał zarodkowych lub utworzenia EB.Następnego dnia zakręć płytką odstraszającą komórki zawierającą EB, aby zebrać je do środka studzienek. Za pomocą pipety Pasteura przenieś zawiesinę EB z dołków do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Odczekaj od pięciu do 10 minut, aż EB osiądą na dnie probówki.W międzyczasie umyj płytki odstraszające komórki sterylną wodą lub DPBS, aby usunąć pojedyncze komórki lub zanieczyszczenia. Dodaj dwa mililitry mieszanki z jedną pożywką SFD uzupełnioną cytokinami do każdego dołka płytki. Teraz delikatnie zassać supernatant z probówki wirówkowej, nie usuwając EBs.Zawiesić EB w obliczonej objętości pożywki SFD zawierającej zmieszanie jednej cytokiny. Dodać jeden mililitr zawiesiny EB do każdej studzienki przemytej płytki odstraszającej komórki, która zawiera już dwa mililitry pożywki. Inkubować płytkę po rozproszeniu EBs, delikatnie przesuwając płytkę, jak wspomniano wcześniej.Po zebraniu EB w środku studzienek dodaj CHIR99021 z boku każdej studzienki, unikając bezpośredniego kontaktu z komórkami. Inkubuj studzienki, jak pokazano wcześniej. W trzecim i szóstym dniu różnicowania zbierz EB i dokonaj zmian w pożywce, jak pokazano wcześniej dla pierwszego dnia.Użyj pożywki SFD uzupełnionej mieszanką trzech cytokin w trzecim dniu i użyj pożywki SFD uzupełnionej mieszanką czterech cytokin w szóstym dniu. Po zebraniu i umieszczeniu Ebs z płytki odstraszającej komórki w 15-mililitrowej probówce wirówkowej, jak pokazano wcześniej, odessać supernatant, a następnie dodać jeden mililitr odczynnika dysocjacji komórek na studzienkę EB zebranej w probówce w celu ponownego zawieszenia EB. Następnie przenieś jeden mililitr tej zawiesiny EB do każdej studzienki płytki odstraszającej komórki przemytej wodą.Po inkubacji płytki przez 10 minut w inkubatorze, użyj pipety P1000 do dysocjacji EB w każdym dołku, delikatnie pipetując w górę i w dół nie więcej niż 10 razy. Następnie dodaj pięć mililitrów buforu płuczącego na studzienkę zdysocjowanych EB. Zbierz komórki do 50-mililitrowej probówki wirówkowej, przepuszczając je przez sitko o średnicy 40 mikronów.Po zliczeniu komórek w przefiltrowanej zawiesinie, wirować komórki przez 10 minut w temperaturze 300 G. Ponownie zawiesić komórki w 300 mikrolitrach buforu do mycia, delikatnie pipetując kilka razy, upewniając się, że nie ma grudek. Przystąp do izolacji komórek CD34 dodatnich za pomocą zestawu mikrokulek CD34 zgodnie z instrukcjami producenta. EB dobrej jakości wykazywały wyraźną krawędź w drugim dniu różnicowania i wydawały się wyraźne i jasne, gdy były obserwowane pod mikroskopem.Obecność ciemniejszych obszarów wskazywała na śmierć komórki w EB. Po CHIR99021 leczeniu różnymi stężeniami w drugim dniu, ilościowe określenie liczby komórek CD34 dodatnich w ósmym dniu różnicowania ujawniło odpowiedź linii komórkowej na leczenie. Cytometria przepływowa wykazała, że wzbogacenie CD34 dodatnie za pomocą kulek magnetycznych dostarczyło około 85% komórek CD34-dodatnich.Na początek odwiruj izolowane komórki CD34 dodatnie i ponownie zawieś osad komórkowy w 300 mikrolitrach wstępnie podgrzanego podłoża SFM-34, które jest uzupełnione mieszanką czterech cytokin i policz komórki za pomocą 10 mikrolitrów zawiesiny komórek. Po zliczeniu i ponownym wymieszaniu komórek w końcowej objętości 150 mikrolitrów cytokiny uzupełnionej SFM-34, dodaj do niej 0,5 mikrolitra inhibitora ROCK. Powoli odsysaj lamininę z płynnych wiórów, umieszczając końcówkę pipety P200 w zbiorniku na krawędzi kanału.Następnie konsekwentnie dodawaj zawiesinę komórkową do kanału, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki. Inkubuj chip przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby całkowicie przymocować komórki do kanału. Gdy komórki śródbłonka są w pełni przyczepione, odessać pożywkę, jak opisano wcześniej.Dodaj 200 mikrolitrów SFM-34 uzupełnionego cytokinami do chipa. Wymieniaj pożywkę codziennie, aż komórki osiągną 90 do 100% zbieżności. Zainstaluj zestaw perfuzyjny w urządzeniu zgodnie z protokołem producenta.Wewnątrz kaptura przymocuj do niego pusty chip płynny i dodaj pożywkę SFM-34 uzupełnioną cytokinami, aby napełnić oba zbiorniki w sterylnych warunkach. Przenieś jednostkę fluidyczną do inkubatora, podłączając ją do pompy w celu usunięcia pęcherzyków i kalibracji. Ostrożnie wyjmij jednostkę fluidyczną z podłączonym zestawem z inkubatora i przenieś ją do kaptura wraz z wiórami zawierającymi komórki.Clamp rurkę po obu stronach chipa testowego. Usuń zaciśniętą rurkę z chipa testowego i podłącz chip zawierający ogniwa do rurki. Po zdjęciu lub otwarciu zacisków przenieś układ do inkubatora i podłącz pompę powietrza do jednostki fluidycznej.Wyjmij jednostkę fluidyczną z pompy i przenieś ją do maski. Clamp rurkę po obu stronach chipa i wyjmij rurkę ze zbiorników na chipie. Po delikatnym usunięciu pożywki z chipa umyj komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami Dulbecco lub DPBS.Dodać 150 mikrolitrów buforu dysocjacyjnego i inkubować przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po odłączeniu ogniw należy pobrać bufor dysocjacyjny z jednego zbiornika i raz przemyć kanał DPBS. Umyj zbiornik buforem myjącym, aby zebrać pozostałe komórki z chipa.Na koniec dodaj jeden mililitr buforu płuczącego do zebranych komórek przed użyciem 10 mikrolitrów z niego do policzenia komórek. Przed stymulacją komórki wykazywały losową orientację, ale pod wpływem stymulacji zmieniały orientację równolegle do kierunku przepływu. Profil ekspresji CD34 w komórkach hodowanych w przepływie przez pięć dni oraz odsetek komórek CD34 dodatnich pobranych z kanału płynowego wykazały skuteczność protokołu.

in-vitro-model-fetal-human-vessel-on-chip-to-study-developmental

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszej pracy opisujemy metodologię podskórnego wprowadzania do myszy z niedoborem odporności ludzkich komórek endotelialnych tworzących kolonie (ECFCs) pochodzących z krwi pępowinowej oraz mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCs) pochodzących z szpiku kostnego, osadzonych w żelu kolagenowo-fibronektynowym. Ta kombinacja komórek i żelu generuje ludzką sieć naczyniową, która łączy się z układem naczyniowym myszy.

Bioinżynieria ludzkich sieci mikro naczyniowych u myszy z niedoborem odporności

Platforma mikrokanałów na chipie została opracowana przez połączenie techniki fotorezystu fotolitografii rozpływowej, miękkiej litografii i mikrofluidyki. Platforma mikrokanalizacyjna naśladuje trójwymiarową (3D) geometrię mikronaczyń in vivo, działa w kontrolowanym ciągłym przepływie perfuzyjnym, umożliwia wysokiej jakości obrazowanie w czasie rzeczywistym i może być stosowana do badań mikronaczyniowych.

Procedura opracowywania wielogłębokościowych, okrągłych, śródbłonkowych mikrokanałów o przekroju międzybłonkowym na chipie

Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zostały wyhodowane do zbiegu w mikroprzepływowym urządzeniu sieciowym. Zilustrowano połączenie komórkowe śródbłonka i rozkład F-aktyny, a zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia i produkcji tlenku azotu w odpowiedzi na adenozynotrójfosforan (ATP) określono ilościowo w czasie rzeczywistym na poszczególnych poziomach komórek.

Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [Ca2+]i i tlenku azotu

Protokoły badania embrionalnej i okołoporodowej mysiej aorty za pomocą analizy klonalnej in vivo i mapowania losu, eksplantatów aorty i izolowanych komórek mięśni gładkich są szczegółowo opisane tutaj. Te różnorodne podejścia ułatwiają badanie morfogenezy aorty zarodkowej i okołoporodowej w prawidłowym rozwoju oraz patogenezy choroby.

Wykorzystanie metod in vivo oraz eksplantatów tkanek i komórek do badania morfogenezy i patogenezy aorty embrionalnej i okołoporodowej

Progenitorzy śródbłonka pochodzący z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC-EPs) mają potencjał, aby zrewolucjonizować leczenie chorób sercowo-naczyniowych i umożliwić tworzenie bardziej wiernych modeli chorób sercowo-naczyniowych. W artykule opisano enkapsulację iPSC-EP w trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach kolagenu oraz analizę ilościową potencjału naczyniowego tych komórek.

Model 3D in vitro i potok obliczeniowy do ilościowego określenia potencjału naczyniopochodnego progenitorów śródbłonka pochodzących z iPSC

Tutaj dostarczamy chip mikroprzepływowy i automatycznie sterowany, wysoce wydajny system mikroprzepływowy krążenia, który podsumowuje początkowe mikrośrodowisko neowaskularyzacji, umożliwiając stymulację komórek śródbłonka (EC) przez wysokie naprężenie ścinające światło, fizjologiczny poziom przepływu przezśródbłonkowego i rozkład różnych czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) jednocześnie.

Model mikroprzepływowy naśladujący początkowe zdarzenie neowaskularyzacji

Ten test wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała embrionalne hodowane w żelu 3D-collagen do analizy procesów biologicznych, które kontrolują angiogenezę kiełkowania in vitro. Technika ta może być stosowana do testowania leków, modelowania chorób oraz do badania określonych genów w kontekście delecji, które są śmiertelne dla zarodka.

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

Tutaj opracowaliśmy model ludzkiego narządu na chipie komórek mięśni gładkich aorty, aby odtworzyć in vivo biomechaniczne napięcie komórek mięśni gładkich w ludzkiej ścianie aorty.

Budowa modelu narządów na chipie komórek mięśni gładkich ludzkiej aorty do rekapitulacji naprężeń biomechanicznych w ścianie aorty

W tym miejscu przedstawiamy protokół budowy systemu narządów na chipie (OOC) mającego naśladować pneumonektomię. System ten bada potencjalną korelację między upośledzeniem glikokaliksu a powikłaniami po pneumonektomii.

Modelowanie glikokaliksu śródbłonka po pneumonektomii w chipie fluidycznym 3D - podejście do wytwarzania systemu narządów na chipie opartych na naczyniach krwionośnych

Ten artykuł opisuje metodę mechanicznego uszkodzenia naczynia krwionośnego u zarodków danio pręgowanego. Ten model urazów stanowi platformę do badania hemostazy, stanów zapalnych związanych z urazami i gojenia się ran w organizmie idealnie nadającym się do mikroskopii w czasie rzeczywistym.

Mechaniczne uszkodzenie naczynia w zarodkach danio pręgowanego

Poznaj metodę różnicowania komórek śródbłonka z ludzkich komórek iPS i ich stymulacji mechanicznej na chipie. Protokół umożliwia badanie mechanobiologii w kontrolowanych warunkach z wysoką powtarzalnością.

In vitro Model płodu ludzkiego naczynia na chipie do badania mechanobiologii rozwojowej

Przeglądaj więcej filmów