Name: Stabilizowane okienko do przyżyciowego obrazowania mysiej trzustki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Poznaj technikę SWIP do stabilizowanego obrazowania przyżyciowego trzustki myszy. Ta metoda umożliwia wielokrotne badania subkomórkowej dynamiki w stanach zdrowia i choroby, wspierając rozwój strategii terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fundacja Charytatywna Evelyn Lipper, Centrum Biofotoniki Gruss-Lipper, Zintegrowany Program Obrazowania dla Badań nad Rakiem, stypendium NIH T-32 (CA200561) oraz grant Departamentu Obrony Programu Badań nad Rakiem Trzustki (PCARP) PA210223P1.

Wszystkie procedury opisane w tym protokole zostały wykonane zgodnie z wytycznymi i przepisami dotyczącymi wykorzystania kręgowców, w tym z uprzednią zgodą Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Pasywacja okien
UWAGA: Pasywacja stali nierdzewnej oczyszcza metal z zanieczyszczeń i tworzy cienką warstwę tlenku, która znacznie zwiększa biokompatybilność metalu z tkankami miękkimi, nawet ponad tytan16.
<ol>
	<li>Proces pasywacji należy rozpocząć od umycia optycznych ram okiennych 1% (w/v) enzymatycznie aktywnym roztworem detergentu.</li>
	<li>Zanurz ramki w 5% (w/v) roztworze wodorotlenku sodu o temperaturze 70 °C na 30 minut w szklanym słoiku.</li>
	<li>Wyjmij ramki i opłucz je wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Zanurz ramki w 7% (w/v) roztworze kwasu cytrynowego o temperaturze 55 °C na 10 minut w nowym szklanym słoiku.</li>
	<li>Zdejmij ramki i ponownie spłucz je wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Powtórz krok 1.2 i na koniec po raz ostatni spłucz ramy okienne wodą dejonizowaną.</li>
</ol>
2. Przygotowanie do implantacji guza lub operacji okna
UWAGA: Do badań nad nowotworami trzustki, komórki nowotworowe muszą być wszczepione i pozwolić im wyrosnąć na jawne guzy. Aby uwidocznić komórki nowotworowe in vivo, zaleca się użycie komórek, które zostały genetycznie zmienione w celu ekspresji białek fluorescencyjnych, takich jak Dendra2. Stosowanie fluorescencyjnych znaczników białek, które są jasne, złagodzi potencjalne problemy z autofluorescencją tkanek. Inne potencjalne białka fluorescencyjne, barwniki i genetycznie kodowane fluorescencyjne modele myszy, które mogą być używane, zostały omówione gdzie indziej17,18. Aby zapobiec zanieczyszczeniu pola operacyjnego, należy wykonać zabieg chirurgiczny w kapturze lub komorze laminarnej i upewnić się, że do przygotowania, operacji i rekonwalescencji używane są odrębne obszary.
<ol>
	<li>Przed zabiegiem należy wysterylizować wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie i w razie potrzeby użyć sterylizatora z gorącymi kulkami do kolejnych zabiegów. Upewnij się, że w gabinecie zastosowano technikę opartą tylko na napiwkach.</li>
	<li>Włącz podgrzewaną podkładkę chirurgiczną i sterylizator kulek i poczekaj, aż osiągnie odpowiednią temperaturę roboczą. Temperaturę poduszki grzewczej należy monitorować za pomocą termometru powierzchniowego, aby uniknąć potencjalnych oparzeń. Umieść sterylną szmatkę na poduszce grzewczej, jeśli nie można odpowiednio kontrolować temperatury. 
	UWAGA: Temperatura ciała podczas krótkich zabiegów (≤20 min), takich jak implantacja guza i okna, jest minimalnie zmieniona podczas korzystania z podgrzewanej podkładki chirurgicznej. Jednak dłuższe okresy znieczulenia, takie jak wydłużone obrazowanie poklatkowe, wymagają umieszczenia myszy w podgrzewanej komorze w celu utrzymania temperatury ciała.</li>
	<li>Znieczulić mysz 5% izofluranem w komorze anestezjologicznej.</li>
	<li>Krok krytyczny: Zmniejsz znieczulenie do 2%, gdy mysz jest nieprzytomna. Uważnie monitoruj poziom znieczulenia i parametry życiowe myszy (np. za pomocą pulsoksymetru)19.</li>
	<li>Umieść małą kroplę lubrykantu do oczu na każdym oku myszy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.</li>
	<li>Przed zabiegiem nałóż obficie krem do depilacji na lewą górną część brzucha, aby usunąć włosy. Po 20 s za pomocą zwilżonej bibuły mocno zetrzyj włosy i krem do depilacji. Powtarzaj proces w razie potrzeby, aż wszystkie włosy zostaną usunięte z obszaru operacyjnego.</li>
	<li>Wstrzyknąć podskórnie 10 μl buprenorfiny (0,1 mg/kg) rozcieńczonej w 90 μl PBS, aby zapewnić przedoperacyjne działanie przeciwbólowe.</li>
</ol>
3. Implantacja guza trzustki
<ol>
	<li>Przygotuj porcje komórek nowotworowych o pożądanym stężeniu (na podstawie czasu podwojenia komórek nowotworowych). Umieść zawiesinę komórkową w strzykawce insulinowej i trzymaj ją na lodzie. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, użyj 106 syngeneic KPC tumor cells20 zawieszonych w maksymalnej ilości 50 μl PBS, zgodnie z protokołem wstrzyknięcia ortotopowego zaadaptowanym z Erstad et al.21 
	UWAGA: Ta linia komórkowa wstrzyknięta w tym stężeniu rutynowo wytwarzała wyczuwalne palpacyjnie lub odpowiednio duże guzy przez 10-14 dni. Subklony tej linii komórkowej i innych linii komórkowych trzustki musiałyby zostać ocenione pod kątem odpowiednich stężeń i ram czasowych, aby wytworzyć guzy o odpowiedniej wielkości).</li>
	<li>Umyj ręce mydłem antyseptycznym.</li>
	<li>Przed każdym nowym zabiegiem należy założyć nowe sterylne rękawiczki.</li>
	<li>Przenieś mysz do sterylnego kaptura chirurgicznego i umieść ją w częściowej prawej bocznej pozycji odleżynowa.</li>
	<li>Zabezpiecz kończyny taśmą papierową. 
	UWAGA: Prawidłowe korzystanie z instrumentów jest ważne podczas całej procedury. Przykłady trzymania kleszczy, nożyczek Castroviejo i narzędzia do pobierania próżniowego są pokazane w <silna klasa="xfig">Rysunek 2A-C.</li>
	<li>Wysterylizuj brzuch środkiem antyseptycznym (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2D).</li>
	<li>Upewnij się, że zwierzę jest w pełni znieczulone, wykonując test szczypania palców u stóp.</li>
	<li>Wykonaj 10-15 mm lewe nacięcie podżebrowe w skórze za pomocą kleszczy i nożyczek Castroviejo (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2E).</li>
	<li>Kontroluj hemostazę za pomocą bawełnianych wacików lub wstrzykiwacza kauterycznego, kiedy/gdzie zostanie to uznane za konieczne.</li>
	<li>Ostrożnie podziel leżący pod spodem mięsień za pomocą kleszczy i nożyczek Castroviejo, aby wejść do otrzewnej (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2F).</li>
	<li>Za pomocą sterylnych wacików bawełnianych atraumatycznie uzewnętrznij trzustkę i śledzionę.</li>
	<li>Rozchyl trzustkę tak, aby nie było fałd (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2G).</li>
	<li>Zidentyfikuj pożądane miejsce wstrzyknięcia guza w ciele lub ogonie trzustki (z dala od naczyń krwionośnych).</li>
	<li>Krok krytyczny: Po dokładnym ustawieniu trzustki, użyj kleszczyków, aby naciągnąć tkankę i włóż końcówkę strzykawki insulinowej, skosem skierowanym do góry, w żądane miejsce trzustki na głębokość 4-5 mm (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2H).</li>
	<li>Powoli wstrzyknij roztwór komórek nowotworowych. Poszukaj małego bąbelka, który potwierdza udane wstrzyknięcie (<silna klasa="xfig">Rysunek 2I).</li>
	<li>Ostrożnie przywróć trzustkę do jamy brzusznej, nie naruszając pęcherzyka iniekcyjnego komórek nowotworowych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2J).</li>
	<li>Używając wchłanialnych szwów 5-0 polidioksanonu, najpierw zamknij warstwę mięśniową, a następnie skórę przerwanymi szwami (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2K-N).</li>
	<li>Przykryj nacięcie klejem cyjanoakrylowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 2O), a następnie umieść mysz z powrotem w czystej klatce pod lampą grzewczą w celu odzyskania. Podawaj antybiotyki w wodzie pitnej, aby zapobiec infekcji. Monitoruj myszy i pozwól im całkowicie wyzdrowieć po operacji. 
	UWAGA: Antybiotyki są podawane zgodnie z wymogami protokołu IACUC. Wszystkie zwierzęta trzymane są indywidualnie.</li>
	<li>Pozwól guzowi rozwijać się przez 10-14 dni, aż będzie wyczuwalny przez ścianę brzucha.</li>
</ol>
4. Chirurgia okien trzustki
<ol>
	<li>Kiedy zwierzęta są gotowe do obrazowania, rozpocznij operację implantacji okna. Na początek umyj ręce mydłem antyseptycznym.</li>
	<li>Przed każdym kolejnym zabiegiem należy założyć świeże sterylne rękawiczki.</li>
	<li>Na podgrzewanym stanowisku chirurgicznym umieść mysz w prawej bocznej pozycji odleżynowa, aby odsłonić lewy brzuch.</li>
	<li>Zakotwicz przednie i tylne kończyny myszy w podgrzewanej fazie chirurgicznej czaszkowo i doogonowo za pomocą taśmy papierowej. Upewnij się, że śledziona (pod skórą) jest widoczna w polu operacyjnym (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
	<li>Aby zachować sterylność, rozpakuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w kapturze.</li>
	<li>Zdezynfekuj miejsce operowane, przecierając wymaz ze skóry myszy z obfitym środkiem antyseptycznym.</li>
	<li>Upewnij się, że zwierzę jest w pełni znieczulone, wykonując test szczypania palców u stóp.</li>
	<li>Krytyczny krok: Podnieś skórę lewego górnego kwadrantu brzucha za pomocą kleszczy i wykonaj ~10 mm okrągłe nacięcie w skórze i mięśniach za pomocą nożyczek Castroviejo (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B, C).</li>
	<li>Kontroluj krwawienie i utrzymuj hemostazę za pomocą wacików bawełnianych lub wstrzykiwacza kauterycznego, jeśli to konieczne.</li>
	<li>Zlokalizuj trzustkę, która jest przyczepiona do śledziony, i określ kierunek, w którym trzustka układa się w nacięciu, aby zdecydować, gdzie należy umieścić podtrzymujący haft krzyżykowy.</li>
	<li>Za pomocą jedwabnego szwu 5-0 umieść pierwszy ścieg w żądanym miejscu w warstwie mięśniowej. Zawiąż ten koniec z 3-5 węzłami. (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D,E)</li>
	<li>Kontynuuj szycie bezpośrednio w poprzek nacięcia. Wytnij i zostaw ogon o długości ~5 cm (<silna klasa="xfig">Rysunek 3F).</li>
	<li>Powtórz kroki 4.11 i 4.12 prostopadle do pierwszego ściegu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3G, H).</li>
	<li>Krytyczny krok: Delikatnie unieś i umieść trzustkę nad haftem krzyżykowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 3I,J). Uważaj, aby nie uszkodzić trzustki podczas manipulacji.</li>
	<li>Krytyczny krok: Używając jedwabnego szwu 5-0, wykonaj ścieg torebkowo-sznurkowy ~1 mm od otworu, obwodowo, przeplatając warstwę skóry i mięśni (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3K).</li>
	<li>Ustaw ramę okienną tak, aby krawędzie okrągłego nacięcia były osadzone w rowku okna (Rysunek 3L).</li>
	<li>Przymocuj wszczepione okno, mocno zawiązując jedwab 5-0.</li>
	<li>Do strzykawki o pojemności 1 ml należy załadować 100 μl płynnego kleju cyjanoakrylowego.</li>
	<li>Osusz tkankę, stosując delikatny strumień sprężonego powietrza przez ~10 s.</li>
	<li>Chwyć ościeżnicę okienną za jej zewnętrzną krawędź kleszczami i delikatnie podnieś, aby zapewnić oddzielenie trzustki od spodu ramy okiennej.</li>
	<li>Krytyczny krok: Dozuj cienką warstwę płynnego kleju cyjanoakrylowego wzdłuż wnęki okna (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3M). Uważaj, aby klej nie dostał się na tkankę trzustki.</li>
	<li>Za pomocą podbieraczy próżniowych podnieś szkiełko nakrywkowe o średnicy 5 mm.</li>
	<li>Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe we wgłębieniu pośrodku ramy okna optycznego. Przytrzymaj z lekkim naciskiem, pozwalając klejowi cyjanoakrylowemu zastygnąć (~25 s).</li>
	<li>Oddziel szkiełko nakrywkowe od przetworników próżniowych za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Zaciśnij szwy do haftu krzyżykowego, aby ściśle przymocować trzustkę do szkiełka nakrywkowego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3N,O). Uwaga: Nie dokręcaj zbyt mocno haftu krzyżykowego, ponieważ może to spowodować uszkodzenie i niedokrwienie trzustki.</li>
	<li>Odetnij końce szwu.</li>
	<li>Zdejmij taśmę z myszy.</li>
	<li>Wyłącz parownik izofluranu.</li>
	<li>Przenieś mysz do czystej klatki lub bezpośrednio do mikroskopu przyżyciowego.</li>
	<li>Trzymaj zwierzęta indywidualnie po operacji okna i monitoruj je aż do pełnego wyzdrowienia.</li>
	<li>Obrazowanie jest następnie przeprowadzane na dwulaserowym mikroskopie wielofotonowym, jak opisaliśmy wcześniej 22,23,24 W przypadku długich sesji obrazowania mysz jest umieszczana w podgrzewanej komorze w celu utrzymania temperatury ciała i zaopatrywana w płyny pomocnicze zgodnie ze standardami IACUC.</li>
</ol>
5. Leczenie ceruleiną w indukcji zapalenia trzustki
<ol>
	<li>Aby zbadać początek zapalenia trzustki, należy leczyć zdrowe myszy ceruleiną po implantacji SWIP. Upewnij się, że myszy są na czczo przez 14-18 godzin i otrzymują wodę ad libitum przed podaniem ceruleiny.</li>
	<li>Wstrzyknąć 50 μg/kg ceruleiny w 100 μl sterylnego 1x DPBS dootrzewnowo w odstępach 1 godziny na maksymalnie osiem wstrzyknięć. Podawać myszom kontrolnym równoważną objętość 1x sam DPBS, wstrzykiwany dootrzewnowo.</li>
	<li>Po obrazowaniu należy złożyć myszy, które należy złożyć w ofierze 24 godziny po pierwszym wstrzyknięciu przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie ze standardami IACUC.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie na dwulaserowym mikroskopie wielofotonowym zgodnie z wcześniejszym opisem22,23,24. W przypadku długich sesji obrazowania umieść mysz w podgrzewanej komorze, aby utrzymać temperaturę ciała i zapewnić mu płyny pomocnicze zgodnie ze standardami IACUC.</li>
</ol>

Murine Pancreatic Imaging Using Implanted Stabilized Window

<ol><li>Peery, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+and+cost+of+gastrointestinal%2C+liver%2C+and+pancreatic+diseases+in+the+United+States%3A+Update+2021%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Burden and cost of gastrointestinal, liver, and pancreatic diseases in the United States: Update 2021.</a> Gastroenterology. 162 (2), 621-644 (2022).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2023%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2023.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 73 (1), 17-48 (2023).</li>
<li>Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+ductal+adenocarcinoma%3A+Current+and+evolving+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338(2017).</li>
<li>Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+techniques+for+biomedical+and+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research.</a> Cytometry A. 97 (5), 448-457 (2020).</li>
<li>Peters, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+an+essential+role+for+neutrophils+in+leishmaniasis+transmitted+by+sand+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals an essential role for neutrophils in leishmaniasis transmitted by sand flies.</a> Science. 321 (5891), 970-974 (2008).</li>
<li>Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+cancer+growth+and+invasion%3A+a+modified+skin-fold+chamber+model%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1147-1154 (2008).</li>
<li>Harney, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+reveals+local%2C+transient+vascular+permeability%2C+and+tumor+cell+intravasation+stimulated+by+TIE2hi+macrophage-derived+VEGFA%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA.</a> Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li>
<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145(2012).</li>
<li>Park, K., You, J., Du, C., Pan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+window+implantation+on+mouse+cortex+to+study+microvascular+change+induced+by+cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Quantitative+Imaging+in+Medicine+and+Surgery%22%5BJournal%5D)">Cranial window implantation on mouse cortex to study microvascular change induced by cocaine.</a> Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 5 (1), 97-107 (2015).</li>
<li>Beerling, E., Oosterom, I., Voest, E., Lolkema, M., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+characterization+of+tumor+cell+migration+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Intravital characterization of tumor cell migration in pancreatic cancer.</a> Intravital. 5 (3), e1261773(2016).</li>
<li>Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+to+study+cancer+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging to study cancer progression and metastasis.</a> Nature Reviews: Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((time-lapsed%2C+large-volume%2C+high-resolution+intravital+imaging+for+tissue-wide+analysis+of+single+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics.</a> Methods. 128, 65-77 (2017).</li>
<li>Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+pancreatic+imaging+window+for+stabilized+longitudinal+in+vivo+observation+of+pancreatic+islets+in+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+%26+Metabolism+Journal%22%5BJournal%5D)">A novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model.</a> Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).</li>
<li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWIP-a+stabilized+window+for+intravital+imaging+of+the+murine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology+Journal%22%5BJournal%5D)">SWIP-a stabilized window for intravital imaging of the murine pancreas.</a> Open Biology Journal. 12 (6), 210273(2022).</li>
<li>DeBold, T. A. M., James, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeBold%2C+TAM+%22How+To+Passivate+Stainless+Steel+Parts%22">How To Passivate Stainless Steel Parts</a>. , https://www.mmsonline.com/articles/how-to-passivate-stainless-steel-parts (2003).</li>
<li>Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+absorption+properties+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon absorption properties of fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 8 (5), 393-399 (2011).</li>
<li>Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+two-photon+imaging+of+in+vivo+cellular+pathophysiology+upon+influenza+virus+infection+using+the+two-photon+IMPRESS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS.</a> Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), pdb prot5563(2011).</li>
<li>Moral, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ILC2s+amplify+PD-1+blockade+by+activating+tissue-specific+cancer+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ILC2s amplify PD-1 blockade by activating tissue-specific cancer immunity.</a> Nature. 579 (7797), 130-135 (2020).</li>
<li>Erstad, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+and+heterotopic+murine+models+of+pancreatic+cancer+and+their+different+responses+to+FOLFIRINOX+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (7), dmm034793(2018).</li>
<li>Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+time-lapse+intravital+imaging+of+real-time+multicellular+dynamics+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54042(2016).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tumor+cell+movement+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging tumor cell movement in vivo.</a> Current Protocols in Cell Biology. Chapter 19, 19.7.1-19.7.19 (2013).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setup+and+use+of+a+two-laser+multiphoton+microscope+for+multichannel+intravital+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).</li>
<li>Rodriguez-Tirado, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+high-resolution+intravital+microscopy+in+the+lung+with+a+vacuum+stabilized+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), 54603(2016).</li>
<li>Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+tumor-associated+vasculature+using+advanced+dorsal+skinfold+window+chambers+on+transgenic+fluorescent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), 55115(2018).</li>
<li>Gorelick, F. S., Lerch, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+animal+models+of+acute+pancreatitis+reproduce+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Do animal models of acute pancreatitis reproduce human disease.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (2), 251-262 (2017).</li>
<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+the+membrane-fusion+regulator+Munc18c+attenuates+caerulein+hyperstimulation-induced+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Depletion of the membrane-fusion regulator Munc18c attenuates caerulein hyperstimulation-induced pancreatitis.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (7), 2510-2522 (2018).</li>
<li>Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caerulein-induced+acute+necrotizing+pancreatitis+in+mice%3A+protective+effects+of+proglumide%2C+benzotript%2C+and+secretin%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin.</a> Gastroenterology. 88 (5 Pt 1), 1192-1204 (1985).</li>
<li>Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+microcartography+and+subcellular+imaging+of+tumor+angiogenesis%3A+a+novel+platform+for+translational+angiogenesis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research.</a> Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).</li>
<li>Shanja-Grabarz, X., Coste, A., Entenberg, D., Di Cristofano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time%2C+high-resolution+imaging+of+tumor+cells+in+genetically+engineered+and+orthotopic+models+of+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-Related+Cancer%22%5BJournal%5D)">Real-time, high-resolution imaging of tumor cells in genetically engineered and orthotopic models of thyroid cancer.</a> Endocrine-Related Cancer. 27 (10), 529-539 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Opisany tutaj protokół SWIP zapewnia ulepszoną metodę stabilizacji tkanki trzustki poprzez wykorzystanie techniki haftu krzyżykowego. Wczesne okna obrazowania jamy brzusznej (AIW) umożliwiały obrazowanie przyżyciowe (IVI) narządów wewnętrznych jamy brzusznej, ale nie ograniczały odpowiednio ruchu tkanek miękkich, takich jak trzustka. W odpowiedzi Park i wsp. opracowali okienko do obrazowania trzustki (PIW), które zawiera poziomą metalową półkę i umożliwia lepszą stabilizację tkanki trzustki przy jednoczesnym utrzymaniu k...

Łagodne i złośliwe choroby trzustki są potencjalnie zagrażające życiu, ze znacznymi lukami w zrozumieniu ich patofizjologii. Zapalenie trzustki - zapalenie trzustki - jest trzecią główną przyczyną przyjęć do szpitala i ponownych przyjęć związanych z chorobami przewodu pokarmowego w USA i wiąże się ze znaczną zachorowalnością, śmiertelnością i obciążeniem społeczno-ekonomicznym1. Sklasyfikowany jako trzecia najczęstsza przyczyna zgonów związanych z rakiem2, gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC) odpowiada za większość nowotworów złośliwych trzustki3 i zwiastuje słaby wskaźnik 5-letniego przeżycia wynoszący zaledwie 11%2. Główną przyczyną śmiertelności związanej z rakiem w PDAC jest przytłaczające obciążenie przerzutami. Niestety, u większości pacjentów występuje choroba z przerzutami. Dlatego zrozumienie dynamiki przerzutów w PDAC jest krytyczną, niezaspokojoną potrzebą w dziedzinie badań nad rakiem.
Mechanizmy leżące u podstaw stanu zapalnego i kaskady przerzutowej trzustki są słabo poznane. Głównym czynnikiem przyczyniającym się do tej luki w wiedzy jest niemożność zaobserwowania dynamiki komórkowej trzustki in vivo. Bezpośrednia obserwacja tej dynamiki komórkowej może ujawnić kluczowe cele, które pozwolą wykorzystać i poprawić diagnostykę i leczenie osób z chorobami trzustki.
Obrazowanie przyżyciowe (IVI) to technika mikroskopowa, która pozwala naukowcom na wizualizację i badanie procesów biologicznych u żywych zwierząt w czasie rzeczywistym. IVI umożliwia bezpośrednią wizualizację dynamiki wewnątrzkomórkowej i mikrośrodowiskowej w wysokiej rozdzielczości in vivo oraz w natywnym środowisku danego procesu biologicznego. Dlatego IVI pozwala na obserwację in vivo zdrowych i patologicznych procesów.
Współczesne metody obrazowania całego ciała, takie jak MRI, PET i CT, oferują doskonałe widoki całych narządów i mogą ujawnić patologie, nawet przed wystąpieniem objawów klinicznych4. Nie są jednak w stanie osiągnąć rozdzielczości pojedynczej komórki ani ujawnić najwcześniejszych stadiów choroby - zapalenia trzustki lub nowotworu złośliwego.
Poprzednie badania wykorzystywały rozdzielczość pojedynczej komórki IVI do obserwacji łagodnych i złośliwych chorób skóry5,6, breast7, lung8, liver9, brain10 i guzy trzustki11, co prowadzi do wglądu w mechanizmy progresji choroby12. Jednak mysia trzustka stanowi poważne przeszkody w osiągnięciu rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą IVI, przede wszystkim ze względu na jej głębokie położenie trzewne i wysoką podatność. Co więcej, jest to rozgałęziony, rozproszony narząd w krezce, który łączy się ze śledzioną, jelitem cienkim i żołądkiem, co utrudnia dostęp. Tkanka jest również bardzo wrażliwa na ruch spowodowany sąsiednią perystaltyką i oddychaniem. Minimalizacja ruchu trzustki jest niezbędna do mikroskopii jednokomórkowej, ponieważ artefakty ruchu nawet o wielkości kilku mikronów mogą rozmazywać i zniekształcać obrazy, uniemożliwiając śledzenie dynamiki poszczególnych komórek13.
Aby wykonać IVI, chirurgicznie musi być wszczepione okno obrazowania jamy brzusznej (AIW)9,11. Aby chirurgicznie wszczepić AIW, w ścianę jamy brzusznej wszywa się metalową ramę okienną. Następnie interesujący go narząd jest mocowany do ramy za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Chociaż jest to wystarczające dla niektórych sztywnych narządów wewnętrznych (np. wątroby, śledziony, sztywnych guzów), próby obrazowania zdrowej mysiej trzustki są zagrożone przez nieoptymalną stabilność boczną i osiową ze względu na zgodną teksturę tkanki i złożoną architekturę14. Aby rozwiązać ten problem, Park et al.14 opracowali okno obrazowania zaprojektowane specjalnie dla zdrowej trzustki. To okienko obrazowania trzustki (PIW) minimalizuje wpływ ruchu jelit i oddychania poprzez włączenie poziomej metalowej półki w ramie okiennej, tuż pod szkiełkiem nakrywkowym, stabilizując tkankę i utrzymując jej kontakt ze szkłem nakrywkowym. Podczas gdy PIW oferuje zwiększoną stabilność boczną, stwierdziliśmy, że to okno nadal wykazuje dryf osiowy i dodatkowo zapobiega obrazowaniu dużych guzów litych ze względu na wąską szczelinę między metalową półką a szkiełkiem nakrywkowym15.
Aby rozwiązać te ograniczenia, opracowaliśmy tabelaryzowany Window dla Intravital obrazowania mysich Pancreas (SWIP), wszczepialne okno obrazowania, które jest w stanie osiągnąć stabilne, długoterminowe obrazowanie zarówno zdrowej, jak i chorej trzustki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)15. W tym miejscu zapewniamy kompleksowy protokół procedury chirurgicznej stosowanej do wszczepienia SWIP. Chociaż głównym celem było zbadanie dynamicznych mechanizmów związanych z przerzutami, metoda ta może być również wykorzystana do zbadania różnych aspektów biologii i patologii trzustki.

<table><tbody><tr><td>1% (w/v) roztwór detergentu enzymatycznego</td><td>Alconox Inc</td><td>NA</td><td>Skoncentrowany, anionowy detergent z enzymami proteazy do czyszczenia ręcznego i ultradźwiękowego</td></tr><tr><td>5% (w/v) roztwór wodorotlenku sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>Odczynnik pasywacyjny</td></tr><tr><td>5 mm szkło nakrywkowe</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72296-05</td><td>Szkiełka nakrywkowe okrągłe&nbsp;</td></tr><tr><td>7% (w/v) roztwór kwasu cytrynowego</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>251275</td><td>Odczynnik pasywacyjny</td></tr><tr><td>28G 1 ml BD Strzykawka insulinowa</td><td>BD</td><td>329410</td><td>Strzykawka do wstrzykiwań komórkowych</td></tr><tr><td>Baytril 100 (enrofloksacyna)</td> <td>Bayer (Santa Cruz Biotechnology)</td> <td>sc-362890Rx</td><td>Antybiotykowa</td></tr><tr><td>lampa grzewcza do montażu na stole</td><td>McMaster-Carr</td><td>3349K51</td><td>Lampa grzewcza</td></tr><tr><td>Buprenorfina 0,3 mg / ml</td><td>Covetrus Ameryka Północna</td><td>059122</td><td>Buprenorfina Analgezja</td></tr><tr><td>Castroviejo Zakrzywione nożyczki</td><td>World Precision Instruments</td><td>WP2220</td><td>Nożyczki do cięcia tkanek</td></tr><tr><td>C57BL/6J Mouse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664&nbsp;</td><td>Mysz C57BL/6J</td></tr><tr><td>Roztwór chlorheksydyny</td><td>Durvet</td><td>7-45801-10258-3</td><td>Roztwór dezynfekujący chlorheksydyny</td></tr><tr><td>Kanister ze sprężonym powietrzem</td><td>Falcon</td><td>DPSJB-12</td><td>Sprężone powietrze do suszenia tkanek</td></tr><tr><td>Akrylan cyjanowy - Żel Superglue</td><td>Staples</td><td>234790-6</td><td>Klej do skóry</td></tr><tr><td>Akrylan cyjanowy - Płynne</td><td>zszywki</td> Superglue <td>LOC1647358</td><td>Klej do szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>DPBS 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>DPBS do wstrzykiwań ceruleiny/komórek</td></tr><tr><td>Zestaw do kauteryzacji Gemini</td><td>Aparat Harvard</td><td>726067</td><td>Długopis kauteryczny</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>CellPoint Scientific</td><td>GER&nbsp; 5287-120V</td><td>Sterylizator koralików</td></tr><tr><td>Graefe Mikro kleszcze preparacyjne; Ząbkowane; Niewielka krzywa; 0.8 mm Szerokość końcówki; Długość 4 "</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5135&nbsp;</td><td>Graefe Mikro kleszczyki preparacyjne</td></tr><tr><td>Mikroskop obrazowania</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Zobacz Entenberg et al. 2011 [27]</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania</td><td>NA</td><td>NA</td><td>See Entenberg et al. 2011 [27]</td></tr><tr><td>Isoethesia (isoflurane)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50033</td><td>Izofluran Anesthesia</td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A&nbsp;</td><td>Chusteczki Kim</td></tr><tr><td>Taśma laboratoryjna</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td>Taśma laboratoryjna</td></tr><tr><td>Zestaw do preparowania myszy Świat</td><td>Instrumenty precyzyjne</td><td>MOUSEKIT</td><td>Instrumenty chirurgiczne</td></tr><tr><td>Mysz Pulsoksymetr łapy Czujnik pulsoksymetru</td><td>Kent Scientific Corpo</td><td>MSTAT Sensor-MSE</td><td>Pulsoksymetr</td></tr><tr><td>Mysz Surgisuite</td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI-M04</td><td>Podgrzewana platforma</td></tr><tr><td>do usuwania włosów Nair Balsam</td><td>Amazon</td><td>B001RVMR7K</td><td>Emulsja do depilacji</td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>TechAir</td><td>OX TM</td><td>Tlen</td></tr><tr><td>PERMA-HAND Czarne plecione jedwabne szewy, ETHICON Rozmiar 5-0</td><td>VWR</td><td>95056-872</td><td>Jedwabny szew</td></tr><tr><td>buforowany fosforanem soli fizjologicznej 1x</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PBS PhysioSuite System</td><td>Kent Scientific</td><td>Podgrzewana platforma PhysioSuite</td><td> Kontroler</td></tr><tr><td>Puralube</td><td>Henry Schein Zdrowie zwierząt</td><td>008897</td><td>Smar do oczu</td></tr><tr><td>Puritan Niesterylne waciki z bawełnianą końcówką&nbsp;</td><td>Waciki bawełniane</td> <td>Fisher Scientific</td><td>867WCNOGLUE</td></tr><tr><td>SHARP Precyzyjne końcówki barierowe, do P-100, 100 i mikro; L</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>P1125</td><td>100 &mikro; L Końcówki do pipet</td></tr><tr><td>Izotiocyjanian tetrametylorodaminy&ndash; Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1287-500MG</td><td>Etykieta naczyniowa</td></tr><tr><td>Płytka mocująca okno</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Wykonana na zamówienie płytka do umieszczenia okienka na stoliku mikroskopowym. Płytka wykonana jest z 0,008 w kolbie ze stali nierdzewnej. Wymiary płytki można znaleźć w Entenberg et al., 2018 [8] .</td></tr><tr><td>Ościeżnica</td><td>okienna NA</td><td>NA</td><td>Okno składa się ze stalowej ramy z centralnym otworem, który akceptuje szkiełko nakrywkowe o grubości 5 mm. Rowek o średnicy 1,75 mm na obwodzie ramy zapewnia przestrzeń na przyleganie warstw mięśni otrzewnej i skóry. Patrz Entenberg i in., 2018 [8].</td></tr></tbody></table>

stabilizowane okienko do przyżyciowego obrazowania mysiej trzustki

Stabilized Window for Intravital Imaging of the Murine Pancreas

Fizjologia i patofizjologia trzustki są złożone. Choroby trzustki, takie jak zapalenie trzustki i gruczolakorak trzustki (PDAC), charakteryzują się wysoką zachorowalnością i śmiertelnością. Obrazowanie przyżyciowe (IVI) to potężna technika umożliwiająca obrazowanie tkanek w wysokiej rozdzielczości zarówno w stanie zdrowym, jak i chorym, pozwalająca na obserwację dynamiki komórek w czasie rzeczywistym. IVI mysiej trzustki stanowi poważne wyzwanie ze względu na głęboką trzewną i podatną naturę narządu, co czyni go bardzo podatnym na uszkodzenia i artefakty ruchowe. 
Tutaj opisany jest proces implantacji Stabilizowanego W indowdo obrazowania I ntravital mysich Pancreas (SWIP). SWIP umożliwia IVI mysiej trzustki w normalnych stanach zdrowia, podczas transformacji ze zdrowej trzustki do ostrego zapalenia trzustki wywołanego przez ceruleinę oraz w stanach złośliwych, takich jak guzy trzustki. W połączeniu z genetycznie znakowanymi komórkami lub podawaniem barwników fluorescencyjnych, SWIP umożliwia pomiar dynamiki pojedynczej komórki i subkomórkowej (w tym migracji pojedynczej komórki i zbiorowej), a także seryjne obrazowanie tego samego obszaru zainteresowania przez wiele dni. 
Zdolność do przechwytywania migracji komórek nowotworowych jest szczególnie ważna, ponieważ główną przyczyną śmiertelności związanej z rakiem w PDAC jest przytłaczające obciążenie przerzutami. Zrozumienie fizjologicznej dynamiki przerzutów w PDAC jest krytyczną, niezaspokojoną potrzebą i ma kluczowe znaczenie dla poprawy rokowania pacjentów. Ogólnie rzecz biorąc, SWIP zapewnia lepszą stabilność obrazowania i rozszerza zastosowanie IVI w zdrowych chorobach trzustki i złośliwych chorobach trzustki.

Rysunek 1, zaadaptowany z Du i wsp.15, przedstawia klatki z filmu IVI z zapisem poklatkowym trzustki mysiej. Podczas początkowego okresu stabilizacji można zaobserwować pewien ruch tkanki (pierwsza godzina obrazowania, Rysunek 1A). Jednakże, przy kontynuowaniu obrazowania po tym okresie stabilizacji (&gt;75 min), zaobserwowaliśmy wzrost stabilności bocznej i osiowej (Rysunek 1B). Porównanie stabilności SWIP z...

Przedstawiamy protokół chirurgicznego wszczepienia stabilizowanego okna optycznego do obrazowania w subkomórkowej rozdzielczości mysiej trzustki, umożliwiając seryjne i podłużne badania zdrowej i chorej trzustki.

Stabilizowane okienko do przyżyciowego obrazowania mysiej trzustki

The physiology and pathophysiology of the pancreas are complex. Diseases of the pancreas, such as pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma (PDAC) have ...

Wykorzystując obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości i ulepszoną metodę stabilizacji trzustki, dążymy do lepszego zrozumienia fizjologicznej dynamiki gruczolakoraka trzustki, zapalenia trzustki i zdrowej trzustki. Takie podejście umożliwia wypełnienie luk w wiedzy patofizjologicznej, potencjalnie rozwijając strategie leczenia tych chorób wysokiego ryzyka. Obrazowanie przyżyciowe z rozdzielczością pojedynczej komórki rzuciło światło na fizjologię i mechanizmy progresji choroby w różnych tkankach.Jednak trzustka stanowi wyjątkowe wyzwanie ze względu na jej głębokie umiejscowienie, podatność i podatność na artefakty ruchowe, co utrudnia skuteczny dostęp do obserwacji zarówno w przypadku łagodnych, jak i złośliwych schorzeń. Nasza technika SWIP poprawia stabilizację lustra i trzustki w porównaniu z wcześniejszymi oknami obrazowania jamy brzusznej. Unikalnie zaprojektowana rama ma wytrawione linie do wykorzystania mikrokartografii, co umożliwia spójną relokalizację regionów podczas wielu sesji obrazowania.Ułatwia to pomiar dynamiki subkomórkowej w ciągu kilku dni, dostarczając cennych informacji. Protokół SWIP umożliwia stabilne, przyżyciowe obrazowanie pojedynczej komórki o wysokiej rozdzielczości w lustrzanym odbiciu trzustki w stanach normalnych i chorych. Jest to szczególnie korzystne w przypadku długotrwałego obrazowania 3D i 4D, oferując wgląd w interakcje komórkowe i mechanizmy chorobowe.Technika ta, nieoceniona w odkrywaniu fizjologii i patologii trzustki, wizualizuje pojedyncze komórki i ich kontekst in vivo. Rozpocznij od przygotowania podwielokrotności syngenicznych komórek nowotworowych KPC o wymaganym stężeniu. Zawiesinę komórkową należy przechowywać w strzykawce insulinowej na lodzie.Następnie przenieś znieczuloną mysz do sterylnego kaptura chirurgicznego i ustaw ją w częściowej prawej bocznej pozycji odleżynowa. Zabezpiecz kończyny taśmą papierową. Wysterylizuj brzuch myszy środkiem antyseptycznym.Użyj kleszczy i nożyczek Castroviejo, aby wykonać lewe podżebrowe nacięcie skóry o długości od 10 do 15 milimetrów. W razie potrzeby kontroluj hemostazę za pomocą wacików. Użyj długopisu kauterycznego, aby kauteryzować naczynia.Następnie podziel mięsień znajdujący się pod spodem, aby wejść do otrzewnej. Uzewnętrznij trzustkę i śledzionę za pomocą sterylnych wacików, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek. Rozchyl trzustkę, aby zapobiec fałdowaniu.Zidentyfikuj punkt wstrzyknięcia guza w ciele lub ogonie trzustki. Po dokładnym ustawieniu trzustki przytrzymaj tkankę kleszczami i włóż końcówkę strzykawki insulinowej na około 4 do 5 milimetrów skośną stroną do góry. Następnie powoli wstrzykuj roztwór komórek nowotworowych.Udane wstrzyknięcie będzie widoczne po utworzeniu małego. Zakończ procedurę, ostrożnie przywracając trzustkę do brzucha, uważając, aby nie naruszyć pęcherzyka. Po zamknięciu miejsca nacięcia umieść mysz z powrotem w czystej klatce umieszczonej pod lampą grzewczą.Podawaj antybiotyki w wodzie pitnej, aby zapobiec infekcji. Pozwól guzowi rozwijać się przez okres od 10 do 14 dni, aż będzie wyczuwalny przez ścianę brzucha. Zacznij od umieszczenia znieczulonej myszy na prawym boku na podgrzewanym stanowisku chirurgicznym, aby odsłonić jej lewy brzuch.Zakotwicz przedni koniec i tylne kończyny myszy taśmą papierową, zapewniając widoczność śledziony. Następnie zdezynfekuj skórę w miejscu operacji, obficie nakładając środek antyseptyczny. Upewnij się, że mysz jest w pełni znieczulona, podając szczypanie palca u nogi.Za pomocą kleszczy unieś skórę górnej lewej części brzucha i wykonaj 10-milimetrowe okrągłe nacięcie w warstwie skóry i mięśni za pomocą nożyczek Castroviejo. Zlokalizuj trzustkę przyczepioną do śledziony, aby określić kierunek, w którym należy umieścić haft krzyżykowy. Użyj jedwabnego szwu 5-0, aby umieścić pierwszy szew w warstwie mięśniowej w określonym miejscu.Zabezpiecz koniec za pomocą trzech do pięciu węzłów. Kontynuuj szycie bezpośrednio w poprzek nacięcia. Następnie wytnij i pozostaw ogon o długości około pięciu centymetrów.Powtórz szycie, tym razem prostopadle do oryginalnego ściegu. Następnie ostrożnie podnieś i umieść trzustkę nad haftem krzyżykowym. Umieść ścieg ze sznurka do torebki około jednego milimetra od otworu przeplatającego warstwę skóry i mięśni.Ustaw ramę okienną tak, aby okrągłe krawędzie nacięcia znajdowały się w rowku okiennym. Teraz przymocuj wszczepione okno, mocno wiążąc jedwab 5-0. Załaduj 100 mikrolitrów płynnego kleju cyjanoakrylowego do 10-milimetrowej strzykawki.Zastosuj delikatny strumień sprężonego powietrza w kierunku tkanki przez około 10 sekund, aby ją wysuszyć. Za pomocą kleszczy chwyć ramę okienną za jej zewnętrzną krawędź i ostrożnie podnieś, aby zapewnić oddzielenie trzustki od podstawy ramy okiennej. Dozuj cienką warstwę płynnego kleju cyjanoakrylowego wzdłuż wgłębienia okna, omijając tkankę trzustki.Następnie użyj przetworników próżniowych, aby podnieść 5-milimetrową szkiełko nakrywkowe. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na środku ramy okna optycznego i utrzymuj lekki nacisk przez około 25 sekund, aby klej stwardniał. Za pomocą kleszczy odczep szkiełko nakrywkowe od przetworników próżniowych.Następnie zaciśnij szwy krzyżykowe, aby przymocować trzustkę do szkiełka nakrywkowego i odetnij końce szwów. Na koniec usuń taśmę z myszy. Wyłącz waporyzator izofluranu i przenieś mysz do czystej klatki.Po okresie osiadania zaobserwowano zwiększoną stabilność boczną i osiową tkanki trzustki. Obrazowanie za pomocą SWIP wykazało niższy poziom dryfu w porównaniu z oknami obrazowania jamy brzusznej i trzustki. Seryjne obrazowanie mysiej trzustki wykonano po leczeniu cerulewiną.Przemieszczenie warg sromowych zaobserwowano po dwóch kolejnych dniach. SWIP może być również używany do obrazowania długoterminowego, umożliwiając wizualizację i ilościowe określenie ruchliwości wakuoli. Na przykład średnia prędkość wakuoli w mysiej trzustce wzrosła o około 10% po leczeniu ceruleiną w porównaniu z PBS.Leczenie ceruleiną zwiększyło również średnią częstotliwość obracania się struktur subkomórkowych o 10%Jednak nie było znaczącej różnicy w prędkości netto, kierunkowości lub skumulowanej odległości między zabiegami. SWIP umożliwia wizualizację i uchwycenie migracji komórek nowotworowych. W krótkich okresach czasu obserwowano zbiorową migrację komórek nowotworowych w klastrach.Zaobserwowano również migrację pojedynczych komórek nowotworowych i makrofagów.

stabilized-window-for-intravital-imaging-of-the-murine-pancreas

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film demonstruje procedurę wszczepienia okna obrazowania trzustki w celu oddzielenia trzustki od jelit w celu podłużnego obrazowania poklatkowego w wysokiej rozdzielczości mikrostruktury trzustki.

Instalacja okna obrazowania przyżyciowego trzustki w modelu mysim: zintegrowane okno obrazowania trzustki do poklatkowego obrazowania in vivo mikrostruktury mysiej trzustki

W tym filmie opisujemy obrazowanie trzustki myszy w trybie przyżyciowym przez ustabilizowane okno do długoterminowej wizualizacji dynamiki komórkowej.

Obrazowanie przyżyciowe: metoda obserwacji trzustki myszy na poziomie komórkowym przez ustabilizowane okno obrazowania

Obrazowanie in vivo trzustki w wysokiej rozdzielczości było ułatwione dzięki oknu obrazowania przyżyciowego trzustki.

Stabilizowana podłużna wizualizacja trzustki na poziomie komórkowym in vivo w modelu mysim z oknem obrazowania przyżyciowego trzustki

Przedstawiono tutaj podejście do długoterminowego obrazowania przyżyciowego za pomocą optycznie przezroczystych, silikonowych okienek, które można przykleić bezpośrednio do tkanki/organu zainteresowania i skóry. Te okna są tańsze i bardziej wszechstronne niż inne obecnie używane w terenie, a chirurgiczne wprowadzenie powoduje ograniczone stany zapalne i stres u zwierząt.

Podłużne obrazowanie przyżyciowe przez przezroczyste okienka silikonowe

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania długoterminowego, wysokorozdzielczego, jednokomórkowego obrazowania nienaruszonego płuca w czasie rzeczywistym przy użyciu stabilizowanego próżniowo okna obrazowania.

Długotrwała mikroskopia przyżyciowa o wysokiej rozdzielczości w płucach z okienkiem obrazowania stabilizowanym podciśnieniowo

Opisujemy metodę wykorzystującą ukierunkowane promieniowanie obwodowe do wywołania u myszy zachowania przypominającego zmęczenie. Wybrana, nieśmiertelna dawka napromieniania prowadzi do tygodniowego ograniczenia dobrowolnej aktywności związanej z bieganiem po kółkach.

Mysi model zmęczenia wywołanego promieniowaniem obwodowym

Ten protokół opisuje nowo ustaloną metodę dostarczania wirusa do mysiej prostaty. Wykorzystując technologię CRISPR/Cas9, nadekspresję genów lub dostarczanie rekombinazy Cre, technika ta umożliwia ortotopową zmianę ekspresji genów i wdraża nowy mysi model raka prostaty.

Dostarczanie wirusów z przewodników CRISPR do mysiej prostaty w celu zmiany genów

Guzy pęcherza moczowego u myszy są wywoływane przez rakotwórczy N-butyl-N-(4-hydroksybutylo)nitrozoaminowy czynnik rakotwórczy (BBN). Wytwarzanie guzów pęcherza moczowego jest niejednorodne; Dlatego konieczna jest dokładna ocena obciążenia guzem przed randomizacją do leczenia eksperymentalnego. Tutaj przedstawiamy szybki, niezawodny protokół MRI do oceny wielkości i stadium guza.

Rezonans magnetyczny Ocena rakotwórczych guzów pęcherza moczowego myszy

Tutaj opisujemy metodę wielofotonowego obrazowania poklatkowego komórek mózgu w wysokiej rozdzielczości przed i po inwazyjnej interwencji chirurgicznej (np. biopsji) u tego samego żywego zwierzęcia. Metoda ta pozwala na badanie wpływu tych inwazyjnych zabiegów chirurgicznych na zachowanie migracyjne, inwazyjne i proliferacyjne komórek nowotworowych na poziomie pojedynczej komórki.

Podłużne obrazowanie przyżyciowe zachowania komórek guza mózgu w odpowiedzi na inwazyjną biopsję chirurgiczną

Ten protokół przedstawia szybką metodę jednoczesnego generowania kultur melanocytów i fibroblastów ze skóry myszy w wieku 0-4 dni. Te pierwotne kultury mogą być utrzymywane i manipulowane in vitro w celu badania różnych fizjologicznie istotnych procesów, w tym biologii komórek skóry, pigmentacji, gojenia się ran i czerniaka.

Szybkie generowanie pierwotnych mysich kultur melanocytów i fibroblastów

Poznaj technikę SWIP do stabilizowanego obrazowania przyżyciowego trzustki myszy. Ta metoda umożliwia wielokrotne badania subkomórkowej dynamiki w stanach zdrowia i choroby, wspierając rozwój strategii terapeutycznych.

Stabilizowane okienko do przyżyciowego obrazowania mysiej trzustki

Przeglądaj więcej filmów