Stabilizowane okienko do przyżyciowego obrazowania mysiej trzustki

Wykorzystując obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości i ulepszoną metodę stabilizacji trzustki, dążymy do lepszego zrozumienia fizjologicznej dynamiki gruczolakoraka trzustki, zapalenia trzustki i zdrowej trzustki. Takie podejście umożliwia wypełnienie luk w wiedzy patofizjologicznej, potencjalnie rozwijając strategie leczenia tych chorób wysokiego ryzyka. Obrazowanie przyżyciowe z rozdzielczością pojedynczej komórki rzuciło światło na fizjologię i mechanizmy progresji choroby w różnych tkankach.

Jednak trzustka stanowi wyjątkowe wyzwanie ze względu na jej głębokie umiejscowienie, podatność i podatność na artefakty ruchowe, co utrudnia skuteczny dostęp do obserwacji zarówno w przypadku łagodnych, jak i złośliwych schorzeń. Nasza technika SWIP poprawia stabilizację lustra i trzustki w porównaniu z wcześniejszymi oknami obrazowania jamy brzusznej. Unikalnie zaprojektowana rama ma wytrawione linie do wykorzystania mikrokartografii, co umożliwia spójną relokalizację regionów podczas wielu sesji obrazowania.

Ułatwia to pomiar dynamiki subkomórkowej w ciągu kilku dni, dostarczając cennych informacji. Protokół SWIP umożliwia stabilne, przyżyciowe obrazowanie pojedynczej komórki o wysokiej rozdzielczości w lustrzanym odbiciu trzustki w stanach normalnych i chorych. Jest to szczególnie korzystne w przypadku długotrwałego obrazowania 3D i 4D, oferując wgląd w interakcje komórkowe i mechanizmy chorobowe.

Technika ta, nieoceniona w odkrywaniu fizjologii i patologii trzustki, wizualizuje pojedyncze komórki i ich kontekst in vivo. Rozpocznij od przygotowania podwielokrotności syngenicznych komórek nowotworowych KPC o wymaganym stężeniu. Zawiesinę komórkową należy przechowywać w strzykawce insulinowej na lodzie.

Następnie przenieś znieczuloną mysz do sterylnego kaptura chirurgicznego i ustaw ją w częściowej prawej bocznej pozycji odleżynowa. Zabezpiecz kończyny taśmą papierową. Wysterylizuj brzuch myszy środkiem antyseptycznym.

Użyj kleszczy i nożyczek Castroviejo, aby wykonać lewe podżebrowe nacięcie skóry o długości od 10 do 15 milimetrów. W razie potrzeby kontroluj hemostazę za pomocą wacików. Użyj długopisu kauterycznego, aby kauteryzować naczynia.

Następnie podziel mięsień znajdujący się pod spodem, aby wejść do otrzewnej. Uzewnętrznij trzustkę i śledzionę za pomocą sterylnych wacików, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek. Rozchyl trzustkę, aby zapobiec fałdowaniu.

Zidentyfikuj punkt wstrzyknięcia guza w ciele lub ogonie trzustki. Po dokładnym ustawieniu trzustki przytrzymaj tkankę kleszczami i włóż końcówkę strzykawki insulinowej na około 4 do 5 milimetrów skośną stroną do góry. Następnie powoli wstrzykuj roztwór komórek nowotworowych.

Udane wstrzyknięcie będzie widoczne po utworzeniu małego. Zakończ procedurę, ostrożnie przywracając trzustkę do brzucha, uważając, aby nie naruszyć pęcherzyka. Po zamknięciu miejsca nacięcia umieść mysz z powrotem w czystej klatce umieszczonej pod lampą grzewczą.

Podawaj antybiotyki w wodzie pitnej, aby zapobiec infekcji. Pozwól guzowi rozwijać się przez okres od 10 do 14 dni, aż będzie wyczuwalny przez ścianę brzucha. Zacznij od umieszczenia znieczulonej myszy na prawym boku na podgrzewanym stanowisku chirurgicznym, aby odsłonić jej lewy brzuch.

Zakotwicz przedni koniec i tylne kończyny myszy taśmą papierową, zapewniając widoczność śledziony. Następnie zdezynfekuj skórę w miejscu operacji, obficie nakładając środek antyseptyczny. Upewnij się, że mysz jest w pełni znieczulona, podając szczypanie palca u nogi.

Za pomocą kleszczy unieś skórę górnej lewej części brzucha i wykonaj 10-milimetrowe okrągłe nacięcie w warstwie skóry i mięśni za pomocą nożyczek Castroviejo. Zlokalizuj trzustkę przyczepioną do śledziony, aby określić kierunek, w którym należy umieścić haft krzyżykowy. Użyj jedwabnego szwu 5-0, aby umieścić pierwszy szew w warstwie mięśniowej w określonym miejscu.

Zabezpiecz koniec za pomocą trzech do pięciu węzłów. Kontynuuj szycie bezpośrednio w poprzek nacięcia. Następnie wytnij i pozostaw ogon o długości około pięciu centymetrów.

Powtórz szycie, tym razem prostopadle do oryginalnego ściegu. Następnie ostrożnie podnieś i umieść trzustkę nad haftem krzyżykowym. Umieść ścieg ze sznurka do torebki około jednego milimetra od otworu przeplatającego warstwę skóry i mięśni.

Ustaw ramę okienną tak, aby okrągłe krawędzie nacięcia znajdowały się w rowku okiennym. Teraz przymocuj wszczepione okno, mocno wiążąc jedwab 5-0. Załaduj 100 mikrolitrów płynnego kleju cyjanoakrylowego do 10-milimetrowej strzykawki.

Zastosuj delikatny strumień sprężonego powietrza w kierunku tkanki przez około 10 sekund, aby ją wysuszyć. Za pomocą kleszczy chwyć ramę okienną za jej zewnętrzną krawędź i ostrożnie podnieś, aby zapewnić oddzielenie trzustki od podstawy ramy okiennej. Dozuj cienką warstwę płynnego kleju cyjanoakrylowego wzdłuż wgłębienia okna, omijając tkankę trzustki.

Następnie użyj przetworników próżniowych, aby podnieść 5-milimetrową szkiełko nakrywkowe. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na środku ramy okna optycznego i utrzymuj lekki nacisk przez około 25 sekund, aby klej stwardniał. Za pomocą kleszczy odczep szkiełko nakrywkowe od przetworników próżniowych.

Następnie zaciśnij szwy krzyżykowe, aby przymocować trzustkę do szkiełka nakrywkowego i odetnij końce szwów. Na koniec usuń taśmę z myszy. Wyłącz waporyzator izofluranu i przenieś mysz do czystej klatki.

Po okresie osiadania zaobserwowano zwiększoną stabilność boczną i osiową tkanki trzustki. Obrazowanie za pomocą SWIP wykazało niższy poziom dryfu w porównaniu z oknami obrazowania jamy brzusznej i trzustki. Seryjne obrazowanie mysiej trzustki wykonano po leczeniu cerulewiną.

Przemieszczenie warg sromowych zaobserwowano po dwóch kolejnych dniach. SWIP może być również używany do obrazowania długoterminowego, umożliwiając wizualizację i ilościowe określenie ruchliwości wakuoli. Na przykład średnia prędkość wakuoli w mysiej trzustce wzrosła o około 10% po leczeniu ceruleiną w porównaniu z PBS.

Leczenie ceruleiną zwiększyło również średnią częstotliwość obracania się struktur subkomórkowych o 10%Jednak nie było znaczącej różnicy w prędkości netto, kierunkowości lub skumulowanej odległości między zabiegami. SWIP umożliwia wizualizację i uchwycenie migracji komórek nowotworowych. W krótkich okresach czasu obserwowano zbiorową migrację komórek nowotworowych w klastrach.

Zaobserwowano również migrację pojedynczych komórek nowotworowych i makrofagów.