Name: Oparta na uczeniu maszynowym metoda charakterystyki i kwantyfikacji złogów lipidowych LipidUNet przy użyciu nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPSC (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Poznaj metodę LipidUNet do analizy złogów lipidowych w nabłonku barwnikowym siatkówki pochodzącym z iPSC. To półautomatyczne podejście umożliwia badanie patogenezy AMD i poszukiwanie nowych celów terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy rdzeniowi histologicznemu National Eye Institute (NEI) za użycie systemu konfokalnego Zeiss. Prace te zostały wsparte ze środków IPB (nr grantu ZIA EY000533-04).

Modeling and Analyzing Retinal Degeneration

<ol><li>Kanow, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+adaptations+of+the+retina+and+retinal+pigment+epithelium+support+a+metabolic+ecosystem+in+the+vertebrate+eye%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye.</a> eLife. 6, e28899(2017).</li>
<li>Adijanto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+utilizes+fatty+acids+for+ketogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium utilizes fatty acids for ketogenesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20570-20582 (2014).</li>
<li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li>
<li>Curcio, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+drusen+in+age-related+macular+degeneration%3A+Biology+and+targeting+via+the+oil+spill+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Soft drusen in age-related macular degeneration: Biology and targeting via the oil spill strategies.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (4), AMD160-AMD181 (2018).</li>
<li>Cankova, Z., Huang, J. D., Kruth, H. S., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+of+low-density+lipoproteins+through+Bruch%27s+membrane+and+choroid%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Passage of low-density lipoproteins through Bruch's membrane and choroid.</a> Experimental Eye Research. 93 (6), 947-955 (2011).</li>
<li>Curcio, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esterified+and+unesterified+cholesterol+in+drusen+and+basal+deposits+of+eyes+with+age-related+maculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Esterified and unesterified cholesterol in drusen and basal deposits of eyes with age-related maculopathy.</a> Experimental Eye Research. 81 (6), 731-741 (2005).</li>
<li>Miyagishima, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK+modulation+ameliorates+dominant+disease+phenotypes+of+CTRP5+variant+in+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration.</a> Communications Biology. 4 (1), 1360(2021).</li>
<li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+phenotype+restoring+drugs+suppress+macular+degeneration+phenotypes+in+an+iPSC+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Epithelial phenotype restoring drugs suppress macular degeneration phenotypes in an iPSC model.</a> Nature Communications. 12 (1), 7293(2021).</li>
<li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li>
<li>Hallam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+induced+pluripotent+stem+cell+patient+specific+model+of+complement+factor+H+%28Y402H%29+polymorphism+displays+characteristic+features+of+age-related+macular+degeneration+and+indicates+a+beneficial+role+for+UV+light+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+%28Dayton%2C+Ohio%29%22%5BJournal%5D)">An induced pluripotent stem cell patient specific model of complement factor H (Y402H) polymorphism displays characteristic features of age-related macular degeneration and indicates a beneficial role for UV light exposure.</a> Stem Cells (Dayton, Ohio). 35 (11), 2305-2320 (2017).</li>
<li>Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triphasic+developmentally+guided+protocol+to+generate+retinal+pigment+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101582(2022).</li>
<li>Issa, P. C., Barnard, A. R., Herrmann, P., Washington, I., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+the+Stargardt+phenotype+in+Abca4+knockout+mice+through+inhibition+of+vitamin+A+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rescue of the Stargardt phenotype in Abca4 knockout mice through inhibition of vitamin A dimerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8415-8420 (2015).</li>
<li>GBD 2019 Blindness and Vision Impairment Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blindness+and+Vision+Impairment+Collaborators.+Causes+of+blindness+and+vision+impairment+in+2020+and+trends+over+30+years%2C+and+prevalence+of+avoidable+blindness+in+relation+to+VISION+2020%3A+the+Right+to+Sight%3A+an+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Blindness and Vision Impairment Collaborators. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet Global Health. 9 (2), e144-e160 (2021).</li>
</ol>

Brak ujawniania informacji.

Protokół ten zapewnia metodę skutecznego znakowania, obrazowania i ilościowego oznaczania złogów lipidów w monogenowych i poligenicznych modelach chorób in vitro dla zwyrodnieniowych chorób oczu. Oprogramowanie oparte na sztucznej inteligencji, LipidUNet, można zastosować do trzech popularnych markerów lipidowych: APOE, czerwieni Nilowej i BODIPY, i zapewnia szybką, automatyczną metodę analizy, która pozwala na standardowe i bezstronne określanie ilościowe.
Głównym ograniczeniem LipidUNet jest fakt, że zestaw danych treningowych dla sztucznej inteligencji był ograniczony do obrazów komórek hodowanych na 96-dołkowej płytce w 40-krotnym powiększeniu. W wyniku zestawu obrazów treningowych, LipidUNet w swojej obecnej formie ogranicza się do analizy obrazów w powiększeniu 40x. Oprogramowanie może być używane do analizy 40-krotnych obrazów komórek hodowanych na innych powierzchniach hodowlanych poza płytką 96-dołkową, ale należy zachować ostrożność w celu zbadania wygenerowanych masek wyjściowych w celu sprawdzenia dokładnego progowania przez oprogramowanie. Potrzeba więcej zestawów obrazów (przy różnych powiększeniach), aby rozszerzyć zakres próbek/obrazów, które może analizować.
Protokół składa się z kilku krytycznych kroków. Na etapie markera lipidowego użytkownik powinien potwierdzić, że wybrany przez niego związek znakujący (BODIPY, APOE, czerwień nilowa) skutecznie oznaczył próbkę. Dojrzałe komórki RPE są często silnie pigmentowane, co może osłabiać sygnał fluorescencyjny barwienia immunologicznego przeciwciał. Gdy sygnał fluorescencyjny jest słaby lub gdy występuje zbyt duże zabarwienie tła, LipidUNet nie jest w stanie dokładnie rozróżnić kropelek lipidów. Z podobnego powodu należy stosować odpowiednio dobrane ustawienia akwizycji dla kroku automatycznego obrazowania protokołu. Jeśli uzyskane obrazy są niskiej jakości, LipidUNet będzie miał trudności z prawidłowym maskowaniem obrazów, a zatem kwantyfikacja będzie niedokładna (Rysunek 6A-L). Wreszcie, przetwarzanie końcowe obrazów jest ważnym krokiem, ponieważ LipidUNet ma określone wymagania dotyczące działania oprogramowania.
W porównaniu z przepływami pracy do analizy lipidów, które wykorzystują ręczne progowanie lub techniki, które obejmują automatyczne progowanie w oprogramowaniu takim jak Fidżi, LipidUNet oferuje bezstronną i wiarygodną segmentację obrazów ze zmiennym osadzaniem lipidów, co znajduje odzwierciedlenie w niewielkim poziomie błędów w identyfikacji cząstek lipidów (ryc. 7). Oprogramowanie pozwala na wprowadzanie przez użytkownika dodatkowych obrazów treningowych, co pozwala na analizę zestawów obrazów poza tymi, które wykorzystują obiektyw o 40-krotnym powiększeniu, a nawet tymi, które wykorzystują inny marker lipidowy, zgodnie z opisem w protokole. W przyszłości oprogramowanie zostanie przeszkolone w zakresie analizy obrazów 3D, tak aby możliwe było ilościowe określenie objętości złogów lipidowych. Choroby zwyrodnieniowe oczu, które wiążą się z odkładaniem się lipidów jako głównym czynnikiem przyczyniającym się do patologii, są powszechne i przewiduje się, że liczba przypadków wzrośnie wraz z powiększaniem się populacji osób starszych13. Dokładne modele chorób i skuteczne narzędzia analityczne, jak opisaliśmy w niniejszym protokole, pozwolą na opracowanie nowatorskich interwencji terapeutycznych.

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to jednowarstwowa warstwa komórek znajdująca się w tylnej części oka, sąsiadująca z fotoreceptorami siatkówki. RPE odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu prawidłowego wzroku, zapewniając wsparcie metaboliczne i strukturalne fotoreceptorom. Zdrowe komórki RPE charakteryzują się wyraźną morfologią sześciokątną. Są one połączone przez połączenia ścisłe, które pozwalają RPE pełnić funkcję bariery między choriocapillaris znajdującą się po stronie podstawnej a fotoreceptorami położonymi po stronie apikalnej. Aby utrzymać ekosystem siatkówki, RPE transportuje kluczowe metabolity, np. glukozę, do fotoreceptorów w sposób, który minimalizuje zużycie glukozy w samym RPE1. Ze względu na to ograniczenie, RPE polega na innych metabolitach w celu zaspokojenia swoich potrzeb metabolicznych, w tym na kwasach tłuszczowych, które RPE przekształca w ketony poprzez β-oksydację2. Biorąc pod uwagę skłonność RPE do wykorzystywania kwasów tłuszczowych, które prawdopodobnie pochodzą z recyklingu podczas trawienia zewnętrznych odcinków fotoreceptorów (POS), jako źródła energii, niekorzystne zmiany w szlakach przetwarzania lipidów w RPE często prowadzą do degeneracyjnych chorób siatkówki o podłożu monogenicznym i poligenicznym lub są w nich uwikłane3.
Związana z wiekiem zwyrodnienie plamkiżółtej (AMD) to poligeniczna choroba zwyrodnieniowa oka powodująca degenerację RPE, która została również powiązana z zaburzeniami autofagii i metabolizmu lipidów w warstwie RPE. Niezdolność dysfunkcjonalnej warstwy RPE do przetwarzania POS i wykonywania innych krytycznych funkcji prowadzi do powstawania zewnątrzkomórkowych (pod-RPE) złogów nazywanych bazalnymi złogami liniowymi (BLinD), zlokalizowanych pomiędzy RPE a błoną Brucha – co jest charakterystyczną cechą patologii AMD. Główne składniki BLinD to lipoproteiny, z których najliczniejszą jest apolipoproteina E (APOE)4. Nagromadzenie cienkich warstw BLinD może prowadzić do powstania miękkich druz, które są rozpoznawane jako objaw kliniczny AMD5,6.
Kilka grup badawczych wykazało, że pochodzące z komórek macierzystych modele chorób in vitro, w których dochodzi do dysfunkcji RPE, charakteryzują się akumulacją lipidów pod RPE7,8,9. Hallam i wsp. (2017) uzyskali RPE pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iRPE) od pacjentów z wysokim ryzykiem wystąpienia AMD ze względu na polimorfizm genu CFH. W iRPE stwierdzono akumulację druz, znakowaną przez APOE, przy czym RPE wysokiego ryzyka wykazywało większe złogi niż iRPE uzyskane od pacjentów niskiego ryzyka10.
Aby stworzyć model in vitro odtwarzający cechy komórkowe AMD, takie jak kropelki lipidowe i odkładanie się druz, opracowano linie iRPE generowane z próbek krwi pacjentów, wykorzystując wcześniej opublikowany protokół kierowany rozwojowo11. Komórki iRPE poddano działaniu surowicy ludzkiej z aktywnym układem dopełniacza (CC-HS), czyli roztworu zawierającego anafilatoksyny, które naśladują jedną z możliwych przyczyn AMD: zwiększone sygnalizowanie alternatywnej drogi dopełniacza8. Wynikowe odkładanie się lipidów na poziomie komórkowym i podkomórkowym mierzono przy użyciu powszechnie stosowanych markerów lipidów i lipoprotein: APOE, Nile Red oraz BODIPY. Za pomocą tych markerów wykazano, że aktywowane sygnalizowanie dopełniacza poprzez CC-HS nasilało akumulację lipidów w komórkach iRPE8.
W celu opracowania modelu choroby monogenicznej degeneracji siatkówki, stworzono linie iRPE z pacjentów cierpiących na chorobę Stargardta – schorzenie wywołane mutacjami genu ABCA4 w RPE. Wykazano wcześniej, że po wyeliminowaniu genu ABCA4 wewnątrz RPE gromadzi się lipofuscyna A2E, wewnątrzkomórkowy złóg znany z wysokiej zawartości fosfolipidów i produktów peroksydacji lipidów zależnej od światła12. Równolegle z liniami pacjentów opracowano linie z nokautem ABCA4, a obie poddano podawaniu POS. iRPE z chorobą Stargardta wykazały patologię wywołaną fagocytozą POS, przejawiającą się zwiększoną akumulacją lipidów, co określono ilościowo za pomocą barwienia BODIPY. RPE pochodzące z iPSC z nokautem ABCA4 poddano traktowaniu CC-HS; analiza ilościowa sygnału BODIPY wykazała defekt w gospodarce lipidowej również w modelu choroby Stargardta9.
Biorąc pod uwagę powszechność tych chorób i potrzebę opracowania skutecznych terapii, a także opisane powyżej odpowiednie modele chorób, istnieje potrzeba ustanowienia rzetelnych metod ilościowego określania skuteczności potencjalnych leków. Aby w sposób obiektywny, zautomatyzowany i ustandaryzowany określić ilość złogów lipidowych, stworzono oprogramowanie oparte na uczeniu maszynowym, LipidUNet, które w połączeniu z narzędziami do analizy masek pozwala na szybką i skuteczną identyfikację odkładania się lipidów przy użyciu powszechnych markerów, takich jak Nile Red, BODIPY i APOE. Statystyki podsumowujące uzyskane przy użyciu tego potoku analitycznego mogą być następnie analizowane i przedstawiane graficznie, co umożliwia łatwe porównanie warunków leczenia. Schemat protokołu przedstawiono na Rysunku 1.
<img alt="Schemat eksperymentu z hodowlą komórkową; obrazowanie mikroskopowe; analiza depozycji lipidów; przetwarzanie danych przez AI." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat protokołu: Komórki RPE są hodowane na płytce 96-dołkowej i poddawane działaniu aktywnej ludzkiej surowicy lub oczyszczonych zewnętrznych segmentów pręcików bydlęcych w celu modelowania różnych typów degeneracji siatkówki in vitro. Komórki RPE są utrwalane i barwione pod kątem złogów lipoprotein za pomocą Nile Red, BODIPY oraz APOE. Mikroskop konfokalny jest wykorzystywany do pozyskiwania stosów Z (Z-stacks) fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek lipidów, które następnie są przetwarzane na dwuwymiarowe projekcje maksymalnej intensywności. Algorytm uczenia maszynowego został przeszkolony w celu rozpoznawania i prawidłowej segmentacji cząsteczek lipoprotein. Generowane są tabele podsumowujące zawierające liczbę cząsteczek oraz różne parametry kształtu, które mogą być wykorzystane do późniejszego wykreślania i analizy statystycznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig01large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; m System filtrów Steriflip</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5-Triiodo-L-tyronina</td><td>Sigma</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>Albumina bydlęca, frakcja V</td><td>MP Biomedical</td><td>160069</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 królik anty-kozi IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21431</td><td>APOE przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>APOE przeciwciało pierwszorzędowe</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB947</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen</td><td>D3922</td><td>Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Uzupełnij kompetentną ludzką surowicę</td><td>Millipore Sigma</td><td>S1-LITR</td><td></td></tr><tr><td>CTS N2 Suplement</td><td>Life Technologies</td><td>A13707-01</td><td></td></tr><tr><td>Hyklon płodu bydlęcego</td><td></td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>Nośniki do montażu szkiełek</td></tr> ślizgowych <tr><td>Szkiełka nakrywkowe #1 1/2 22 mm x 22 mm</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72204-01</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe 25 mm x 75 mm - grubość 1,2 mm</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>71870-01</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Alpha Life Technologies</td><td>12571-063</td><td></td></tr><tr><td>MEM endogenne aminokwasy</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr> Nil <tr><td>Red</td><td>Sigma</td><td>72485-100MG</td><td>Ochrona przed światłem</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16% roztwór,</td><td>mikroskopia elektronowa</td> klasy EM Nauki <td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Paciorkowiec</td> Life <td>Technologies</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami 10x</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Zewnętrzne segmenty pręta (OS)</td><td>InVision Bioresources</td><td>98740</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Master Mix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725274</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Ultrapure</td><td>Affymetrix</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life Technologies</td><td>A14701SA</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorowodorek</td><td>R& Systemy D</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

oparta na uczeniu maszynowym metoda charakterystyki i kwantyfikacji złogów lipidowych lipidunet przy użyciu nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z ipsc

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to monowarstwa sześciokątnych komórek znajdujących się w tylnej części oka. Zapewnia odżywienie i wsparcie dla fotoreceptorów i naczyń włosowatych naczyniówki, przeprowadza fagocytozę zewnętrznych segmentów fotoreceptorów (POS) i wydziela cytokiny w sposób spolaryzowany w celu utrzymania homeostazy siatkówki zewnętrznej. Dysfunkcyjny RPE, spowodowany mutacjami, starzeniem się i czynnikami środowiskowymi, powoduje zwyrodnienie innych warstw siatkówki i powoduje utratę wzroku. Charakterystyczną cechą fenotypową degenerującego się RPE są wewnątrz- i subkomórkowe złogi bogate w lipidy. Złogi te są powszechnym fenotypem w różnych chorobach zwyrodnieniowych siatkówki. Aby odtworzyć fenotyp złogów lipidowych monogenowych zwyrodnień siatkówki in vitro, z fibroblastów pacjentów wygenerowano indukowane pluripotencjalne RPE pochodzące z komórek macierzystych (iRPE). Linie komórkowe wygenerowane od pacjentów z chorobą Stargardta i zwyrodnieniem siatkówki o późnym początku (L-ORD) były karmione POS przez 7 dni w celu odtworzenia fizjologicznej funkcji RPE, która spowodowała patologię wywołaną fagocytozą POS w tych chorobach. Aby wygenerować model zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD), choroby poligenowej związanej z alternatywną aktywacją dopełniacza, w ramach projektu iRPE podano anafilatoksyny alternatywnego dopełniacza. Wewnątrz- i subkomórkowe złogi lipidowe scharakteryzowano za pomocą czerwieni nilowej, boru-dipyrrometenu (BODIPY) i apolipoproteiny E (APOE). Aby określić ilościowo gęstość złogów lipidowych, opracowano oprogramowanie oparte na uczeniu maszynowym, LipidUNet. Oprogramowanie zostało przeszkolone na obrazach projekcyjnych iRPE o maksymalnej intensywności na powierzchniach hodowlanych. W przyszłości zostanie przeszkolony w zakresie analizy obrazów trójwymiarowych (3D) i ilościowego określania objętości kropelek lipidów. Oprogramowanie LipidUNet będzie cennym źródłem informacji na temat leków, które zmniejszają akumulację lipidów w modelach chorób.

Niniejszy protokół przedstawia schemat postępowania w celu identyfikacji złogów lipidowych barwionych Nile Red, BODIPY i APOE. Opracowane oprogramowanie potrafi automatycznie identyfikować i kwantyfikować złogi lipidowe, wykazując najwyższą skuteczność przy zastosowaniu zoptymalizowanego opisanego protokołu. Dołączono przykłady dobrze zróżnicowanych komórek RPE (Rysunek 3A) oraz słabo zróżnicowanych komórek RPE (Rysunek 3B), ponieważ jakość modelu komórkowego ma znaczący wpływ na jakość prawidłowej segmentacji obrazu.
Dwa z trzech markerów opisanych w protokole, Nile Red oraz BODIPY, są identyfikowane jako małe okrągłe punkty, które są wyraźnie jasne na obrazach fluorescencyjnych (Rysunek 5 oraz Rysunek 6). Obrazem „pozytywnym” w ramach protokołu byłaby właściwa identyfikacja tych wyraźnych złogów (Rysunek 5A-D oraz Rysunek 5E-H). Wynik „negatywny” wykazywałby błędną segmentację obrazu, polegającą na pomyleniu fluorescencji tła ze złogiem, co może wynikać znikłego barwienia (Rysunek 6A-C oraz Rysunek 6D-F) lub z wysokiej intensywności tła (Rysunek 6G-I).
Osady APOE mają różżne rozmiary i kształty, przyjmując formę bardziej owalną lub nieregularną, w przeciwieństwie do kolistych osadów Nile Red i BODIPY. Osady te są również mniej punktowe, a intensywność sygnału może różnić się między nimi ze względu na zmienną stopień permeabilizacji próbki. Prawidłowa identyfikacja pozwoli na wykrycie każdego osadu, w tym tych o mniejszym nasyceniu (Rysunek 5I-L), podczas gdy błędna segmentacja nie wykryje tych osadów (Rysunek 6J-L). Dlatego ważne jest zoptymalizowanie metod barwienia i obrazowania, aby uniknąć drastycznych różnic. Jednym ze sposobów jest zachowanie szczególnej uwagi podczas etapów permeabilizacji próbek w trakcie immunobarwienia. Aby zoptymalizować sygnał fluorescencyjny, można poddać komórki lizie przed fiksacją i immunobarwieniem na APOE, co skutkuje równomiernym nasyceniem i lepszą segmentacją osadów APOE.
Dostarczono również segmentowane obrazy komórek dojrzewających na platformie hodowlanej innej niż płytka 96-dołkowa. Oprogramowanie LipidUNet zostało zastosowane do obrazów komórek hodowanych na wkładce transwell; chociaż złogi lipidowe zostały poddane progowaniu, zrobiono to również w przypadku porów w membranie transwell (Rysunek 6M-O). Ze względu na podobieństwo kształtu i rozmiaru, oprogramowanie LipidUNet w obecnej formie będzie maskować bez rozróżnienia zarówno złogi lipidowe, jak i pory transwell.
<img alt="Obrazowanie lipidów/białek, barwienie Nile Red/BODIPY/APOE, segmentacja, analiza LipidUNet, mikroskopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Reprezentatywne wyniki. (A,E,I) Komórki RPE w płytce 96-dołkowej poddane barwieniu jądra Hoechst (niebieski) oraz barwieniu Nile Red (magenta), BODIPY (zielony) lub APOE (pomarańczowy); przedstawiono maksymalne projekcje intensywności stosu Z. (B,F,J) Wejściowe obrazy w skali szarości dla oprogramowania LipidUNet po procesowaniu obrazu. (C,G,K) Maski wygenerowane przez LipidUNet, w których wszystkie depozyty zostały poprawnie zidentyfikowane. (D,H,L) Ponumerowane obrysy każdej zamaskowanej cząstki. Etykiety te pozwalają powiązać każdą cząstkę na obrazie z wpisem w arkuszu kalkulacyjnym z surowymi danymi. (A-D) przedstawia barwienie Nile Red; oprogramowanie jest w stanie dokładnie rozpoznać depozyty na tle, mimo słabszego sygnału. (E-H) pokazuje silny kontrast między sygnałem BODIPY a tłem, co jest stanem idealnym. LipidUNet poprawnie identyfikuje każdy depozyt na obrazie. (I-L) przedstawia silny sygnał APOE i obrazuje zmienność saturacji sygnału, która często występuje przy tym barwieniu. Mimo to segmentacja obrazu pozwala zidentyfikować granice każdego depozytu APOE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig05large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Barwienie i segmentacja lipidów; mikroskopia fluorescencyjna; detekcja LipidUNet; Nile Red, BODIPY." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Nieoptymalne wyniki. (A,D,G,J,M) Komórki RPE w płytce 96-dołkowej barwione Hoechst (jądra komórkowe, kolor niebieski) oraz Nile Red (magenta), BODIPY (zielony) lub APOE (pomarańczowy); przedstawiono projekcje maksymalnej intensywności ze stosu Z. (B,E,H,K,N) Obrazy wejściowe w skali szarości dla oprogramowania LipidUNet po procesowaniu obrazu. (C,F,I,L,O) Błędne maski wygenerowane przez LipidUNet. Czerwone okręgi wskazują miejsca, w których oprogramowanie błędnie zidentyfikowało złóg lipidowy. (A-C) Procesowanie Nile Red jest błędne, ponieważ oprogramowanie zidentyfikowało barwienie tła jako złóg. Może to zdarzać się częściej przy wysokim poziomie tła i niewielkiej liczbie złogów lipidowych na obrazie. Przedstawiono dwa przykłady barwienia BODIPY: obraz słabej jakości wynikający ze (D-F) słabego barwienia BODIPY oraz (G - I) silny sygnał BODIPY z wysokim poziomem tła. W obu przypadkach oprogramowanie nie jest w stanie odróżnić małych, okrągłych złogów lipidowych od okrągłego pierścienia tła otaczającego jądro. Chociaż barwienie i obrazowanie powinny zostać zoptymalizowane, aby uniknąć tych błędów, najnowsza wersja LipidUNet została w znacznym stopniu ulepszona pod kątem takich obrazów. (J-L) Błędna segmentacja APOE. Ze względu na większą zmienność rozmiaru i nasycenia sygnału złogów, oprogramowanie ma trudności z rozpoznaniem niektórych z nich. (M-O) RPE wysiane na transwell i barwione Nile Red. Przedstawiono przekrój stosu Z z widocznymi złogami lipidowymi Nile Red oraz porami transwell. Oprogramowanie nie potrafi odróżnić tych dwóch elementów, co obrazuje czerwony okrąg zawierający pory transwell oraz zielona strzałka wskazująca złogi Nile Red. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Segmentacja komórek z użyciem masek entropii i LipidUnet; obraz mikroskopowy; porównanie współczynnika błędów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Porównanie narzędzi do tworzenia masek. (A,B,C) Komórki RPE w płytce 96-dołkowej z różnym stopniem odkładania lipidów zostały zidentyfikowane za pomocą Nile Red (czerwony). Obrazy zamaskowano przy użyciu trzech różnych powszechnych metod maskowania: Find Maxima, Max Entropy i Renyi Entropy, a następnie porównano z maską wygenerowaną przez LipidUNet. Obrazowi oryginalnemu towarzyszy ręczne przeliczenie złogów lipidowych, natomiast maski wyświetlają liczby przewidziane przez każdą metodę segmentacji. Średni współczynnik błędów dla każdej metody segmentacji obliczono według następującego wzoru: średnia[(|Liczba Przewidziana - Liczba Ręczna|/Liczba Ręczna) x 100]. Maska wygenerowana przez LipidUNet dokładniej identyfikuje złogi lipidowe na obrazach o zróżnicowanym stopniu odkładania w porównaniu z innymi metodami maskowania (Średnie współczynniki błędów: 23% LipidUnet, 1164% Find Maxima, 851% Max Entropy, 203% Renyi Entropy). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Składnik</td>
			<td >Nr katalogowy</td>
			<td >Stężenie zapasu</td>
			<td >Stężenie końcowe</td>
			<td >mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >MEM alpha</td>
			<td >12571-063</td>
			<td >NA</td>
			<td ></td>
			<td >500</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Suplement N2</td>
			<td >17502-048</td>
			<td >NA</td>
			<td >1%</td>
			<td >5</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >FBS inaktywowany ciepłem</td>
			<td >SH30071.03</td>
			<td >NA</td>
			<td >5%</td>
			<td >25</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >NMEM NEAA</td>
			<td >11140-050</td>
			<td >10mM</td>
			<td >0.01mM</td>
			<td >5</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Pirowinian sodu</td>
			<td >11360-070</td>
			<td >100mM</td>
			<td >1mM</td>
			<td >5</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Penicylina-streptomycyna</td>
			<td >15140-122</td>
			<td >10000u/mL</td>
			<td >100U/mL</td>
			<td >5</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tauryna</td>
			<td >T4571</td>
			<td >50mg/mL</td>
			<td >250ug/mL</td>
			<td >2.5</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Hydrokortyzon</td>
			<td >H6909</td>
			<td >18.1mg/L</td>
			<td >20ug/L</td>
			<td >0.553</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >T3</td>
			<td >T5516</td>
			<td >20ug/L</td>
			<td >0.013ug/L</td>
			<td >0.33</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="4">Objętość całkowita, mL</td>
			<td >548.383</td>
		</tr >
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład odczynników RPE-MM. Lista odczynników i optymalne stężenia dla RPE-MM.

Choroby zwyrodnieniowe oczu, które wpływają na warstwę nabłonka barwnikowego siatkówki, mają pochodzenie monogenowe i poligenowe. Opracowano kilka modeli chorób i aplikację LipidUNet w celu badania mechanizmów choroby, a także potencjalnych interwencji terapeutycznych.

Oparta na uczeniu maszynowym metoda charakterystyki i kwantyfikacji złogów lipidowych LipidUNet przy użyciu nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPSC

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to ...

W tym badaniu staramy się zrozumieć patogenezę zwyrodnienia plamki żółtej związaną z wiekiem i znaleźć potencjalne leczenie. Półautomatyczny rurociąg do analizy kropelek lipidów zapewnia solidny system do badania metabolizmu i chorób związanych ze starzeniem. Nasze laboratorium koncentruje się na poszukiwaniu celów leków do leczenia AMD, za pomocą badań genetycznych lub małocząsteczkowych, które mają na celu zmniejszenie akumulacji złogów lipidowych.Na początek rozpuść proszek czerwieni nilowej w acetonie w stężeniu trzech miligramów na mililitr. Inkubować roztwór przez 15 minut w temperaturze pokojowej z okresowym mieszaniem. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,22 mikrometra raz lub dwa razy, w zależności od ilości osadu pozostałego w roztworze.Następnie przygotuj roztwór roboczy, rozcieńczając roztwór podstawowy w stosunku 1:500 w DPBS. Dodaj 200 mikrolitrów roztworu roboczego do utrwalonych paraformaldehydowych komórek RPE i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej na shakerze, chroniąc przed światłem. Po inkubacji próbki należy dwukrotnie przemyć preparatem DPBS.Następnie dodaj 200 mikrolitrów DPBS i przechowuj je w czterech stopniach Celsjusza. Do barwienia BODIPY należy przygotować 3,8-milimolowe stężenie podstawowe, rozpuszczając BODIPY w bezwodnym DMSO. Następnie przygotuj roztwór roboczy, rozcieńczając roztwór podstawowy w stosunku 1:300 w DPBS.Dodać 200 mikrolitrów roztworu roboczego BODIPY do paraformaldehydowych komórek RPE i inkubować przez noc na bujaku w temperaturze pokojowej. Następnego dnia umyj komórki trzykrotnie DPBS i dodaj 200 mikrolitrów DPBS przed przechowywaniem ich w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W przypadku barwienia immunologicznego APOE należy przygotować roztwór buforowy, łącząc DPBS z 1%BSA 0,5%TWEEN 20 i 0,5%Triton X-100.Zablokuj i przepuszczalność komórek RPE związanych z paraformaldehydem w 200 mikrolitrach roztworu buforowego przez jedną godzinę. Po inkubacji dodać pierwszorzędowe przeciwciało APOE rozcieńczone w stosunku 1:100 do roztworu buforowego i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia należy trzykrotnie przemyć próbki preparatem DPBS.Następnie dodać 200 mikrolitrów roztworu przeciwciał drugorzędowych rozcieńczonego w stosunku 1:1000 przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji umyj komórki trzykrotnie DPBS i dodaj 200 mikrolitrów DPBS przed przechowywaniem ich w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą mikroskopu konfokalnego i obiektywu 40x utwórz profil skanowania z odpowiednimi kanałami fluorescencyjnymi dla zastosowanego markera lipidowego.Po skonfigurowaniu trybu akwizycji i kanałów zoptymalizuj strategię ostrości, klikając Autofokus programowy. Następnie ustaw zakres stosu Z na 20 mikronów. Następnie zoptymalizuj kafelki i otwórz przeglądarkę, aby wybrać pozycje kafelków.Następnie, korzystając z metody przetwarzania obrazu wsadowego, utwórz maksymalne projekcje każdego stosu Z za pomocą metody rozszerzonej głębi ostrości. Przed wyeksportowaniem obrazów ustaw kompresję na brak i upewnij się, że zaznaczona jest opcja Oryginalne dane. Wynikowy obraz jest maksymalną projekcją TIFF w skali szarości tylko kanału fluorescencji wyrażającego marker lipidowy.Zidentyfikuj obrazy TIFF reprezentujące Nile Red, BODIPY lub APOE i przenieś je do folderu Images w katalogu o nazwie Nile Red, BODIPY lub APOE, w zależności od używanej metody. Otwórz oprogramowanie LipidUnet. Na karcie Przewidywanie wybierz odpowiedni katalog, klikając wielokropek i przechodząc do nazwanego katalogu.Upewnij się, że LipidUnet poprawnie zidentyfikował obrazy, sprawdzając wpis klasy. Kliknij przycisk Przewiduj, aby obserwować postęp zadania. Następnie, korzystając z narzędzia Analiza masek, wykonaj iterację wygenerowanych masek i podaj ilościową liczbę progowych depozytów lipidowych z obrazów masek.Pomyślne różnicowanie i dojrzewanie RPE wykazało zlewającą się monowarstwę o pigmentacji i morfologii wielokątnej. W przeciwieństwie do tego, nieudane różnicowanie wykazało skupiska umierających komórek. Na zdjęciach fluorescencyjnych osady czerwieni nilowej i BODIPY wyglądały jak małe, jasne, okrągłe punkty.Wynik ujemny wskazuje na nieprawidłową segmentację obrazu poprzez pomylenie fluorescencji tła z osadem, albo z powodu słabego barwienia, albo wysokiej intensywności tła. Pokazano osady APOE różniące się rozmiarem, kształtem i intensywnością sygnału, wymagające optymalizacji metod barwienia i obrazowania w celu zminimalizowania zmienności.

lipidunet-machine-learning-based-method-characterization

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Porównano profile mikroRNA (miRNA) ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS), nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzącego z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS-RPE) oraz płodowego RPE.

Profile ekspresji mikroRNA ludzkich komórek iPS, nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPS oraz nabłonka barwnikowego siatkówki płodu

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) wspiera siatkówkę czuciową poprzez recykling produktów ubocznych cyklu wzrokowego, które gromadzą się jako lipofuscyna. Produkty te są autofluorescencyjne i mogą być jakościowo obrazowane in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę ilościowego obrazowania lipofuscyny RPE za pomocą konfokalnej skaningowej oftalmoskopii laserowej.

Ilościowa autofluorescencja dna oka w ocenie chorób siatkówki

Opisujemy metodę skutecznego oddzielania nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od siatkówki w ludzkich oczach i generowania całych płaskich komórek RPE/naczyniówki do analiz histologicznych i morfometrycznych RPE.

Wydajne i spójne generowanie płaskich nabłonków barwnikowych siatkówki/naczyniówki z ludzkich oczu do analizy histologicznej

Modele myszy mogą być użytecznymi narzędziami do badania biologii nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Ustalono, że u myszy może rozwinąć się szereg patologii RPE. W tym miejscu opisujemy protokół fenotypowania w celu wyjaśnienia i ilościowego określenia patologii RPE u myszy za pomocą światła, elektronów transmisyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Protokół oceny i ilościowego określenia patologii barwnikowego nabłonka siatkówki w mysich modelach zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem

Ten protokół opisuje model akumulacji lipofuscyny w wysoce zróżnicowanych i spolaryzowanych kulturach ludzkiego nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) oraz ulepszony test fagocytozy zewnętrznego segmentu (OS) w celu wykrycia całkowitej zdolności ZORE/degradacji OS. Metody te przezwyciężają ograniczenia poprzednich modeli lipofuscyny i klasycznych testów fagocytozy zewnętrznego segmentu z pościgiem impulsowym.

Ulepszone modele lipofuscyny i kwantyfikacja zdolności fagocytozy segmentu zewnętrznego w wysoce spolaryzowanych kulturach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki

Niniejsze badanie opisuje oparte na decelularyzacji metodologie wizualizacji i ilościowego określania wewnątrzmięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT) poprzez nienaruszoną objętość mięśni, a także ilościowe określanie metryk poszczególnych adipocytów składających się na IMAT.

Kwantyfikacja nacieku tkanki tłuszczowej mięśni szkieletowych na podstawie decelularyzacji

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to wielofunkcyjny nabłonek oka. W tym miejscu przedstawiamy protokół ustanawiania pierwotnych kultur komórkowych pochodzących z mysiego RPE.

Pierwotne hodowle komórkowe z nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Barwienie czerwienią nilową utrwalonych Caenorhabditis elegans jest metodą ilościowego pomiaru neutralnych złogów lipidowych, podczas gdy barwienie czerwienią olejową O ułatwia jakościową ocenę dystrybucji lipidów wśród tkanek.

Kwantyfikacja obfitości lipidów i ocena rozmieszczenia lipidów w Caenorhabditis elegans za pomocą barwienia czerwienią nilową i czerwienią olejową O

Ta technika opisuje rejestrowanie w czasie rzeczywistym zużycia tlenu i wskaźników zakwaszenia zewnątrzkomórkowego w eksplantowanych tkankach siatkówki myszy za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Pomiar metabolizmu energetycznego w eksplantowanej tkance siatkówki za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Tworzenie właściwej sieci sarkomerowej jest ważne dla dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Przedstawiamy podejście oparte na super rozdzielczości, które pozwala na ilościową ocenę strukturalnego dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, w celu poprawy warunków hodowli sprzyjających rozwojowi serca.

Analiza sieci α-aktininy w ludzkich kardiomiocytach pochodzących z iPSC przy użyciu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek

Poznaj metodę LipidUNet do analizy złogów lipidowych w nabłonku barwnikowym siatkówki pochodzącym z iPSC. To półautomatyczne podejście umożliwia badanie patogenezy AMD i poszukiwanie nowych celów terapeutycznych.

Oparta na uczeniu maszynowym metoda charakterystyki i kwantyfikacji złogów lipidowych LipidUNet przy użyciu nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPSC (Wideo) | JoVE Journal

Oparta na uczeniu maszynowym metoda charakterystyki i kwantyfikacji złogów lipidowych LipidUNet przy użyciu nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPSC

Przeglądaj więcej filmów