Identyfikacja peptydów małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego
June 30th, 2023
Ten protokół opisuje procedurę izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od makrofagów za pomocą różnicowego ultrawirowania i ekstrakcji peptydomu do identyfikacji za pomocą spektrometrii mas.
Badamy funkcjonalne role pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w odporności wrodzonej. Opracowaliśmy protokół izolacji małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEVs) poprzez ultrawirowanie różnicowe i identyfikację peptydome za pomocą LC-MS / MS, ujawniając kluczowe funkcje biologiczne peptydów w sEV. Wykazano, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pośredniczą w komunikacji międzykomórkowej poprzez transport ładunku do komórek biorcy, takiego jak białka, lipidy i kwasy nukleinowe.
Uwalniając składniki przeciwdrobnoustrojowe, działają jako pierwsza linia obrony przed inwazyjnymi drobnoustrojami w odporności wrodzonej. Podczas gdy ultrawirowanie różnicowe daje bardzo czyste małe zewnątrzkomórkowe sEV, może być czasochłonne i często skutkuje niskimi plonami. W naszym badaniu są to główne wyzwania dla stabilnej identyfikacji peptydów o niskiej liczebności w sEV.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia protokół izolacji małych zewnątrzkomórkowych wezykuł (sEVs) z makrofagów za pomocą różnicowej ultrawirowania. Peptidom tych wezykuł jest następnie wyodrębniany i identyfikowany za pomocą spektrometrii mas, podkreślając ich role w działaniu układu odpornościowego wrodzonego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Immunologia
- Biologia komórki
Tło
- Wezykuły zewnątrzkomórkowe są kluczowe dla komunikacji międzykomórkowej.
- Transportują różne biomolekuły, w tym białka i kwasy nukleinowe.
- sEVs odgrywają istotną rolę w odporności wrodzonej poprzez uwalnianie składników przeciwdrobnoustrojowych.
- Izolowanie sEVs może być wyzwaniem z powodu niskich wydajności i czasochłonnych procesów.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego protokołu izolacji sEVs z makrofagów.
- Identyfikacja peptidomu sEVs i zrozumienie ich funkcji biologicznych.
- Rozwiązanie wyzwań związanych z identyfikacją peptydów o niskiej obfitości w sEVs.
Stosowane metody
- Różnicowe ultrawirowanie do izolacji sEV.
- Spektrometria mas (LC-MS/MS) do identyfikacji peptidomu.
- Analiza funkcyjnych ról peptydów w sEVs.
- Oceny czystości i wydajności izolowanych sEVs.
Główne wyniki
- Udało się odizolować bardzo czyste sEVs z makrofagów.
- Identyfikowano kluczowe peptydy zaangażowane w reakcje odpornościowe wrodzone.
- Ujawniono rolę sEVs w mediacji komunikacji międzykomórkowej.
- Podkreślono wyzwania związane z uzyskaniem stabilnej identyfikacji peptydów o niskiej obfitości.
Konkluzje
- Opracowany protokół poprawia izolację sEVs do dalszych badań.
- Identyfikacja peptidomu dostarcza wglądu w funkcje biologiczne sEVs.
- Przyszłe badania mogą skupić się na poprawie wydajności i stabilności identyfikacji peptydów.
