Name: Dwufotonowe obrazowanie wapnia aktywności przedmózgu u zachowujących się dorosłych danio (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Poznaj dwufotonowe obrazowanie wapnia w przedmózgu dorosłego danio podczas zachowań. Ta metoda umożliwia badanie aktywności neuronów w odpowiedzi na bodźce sensoryczne u zachowujących się osobników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez Instytut Biologii Molekularnej, Academia Sinica oraz Narodową Radę Nauki i Technologii na Tajwanie. Warsztat maszynowy w Instytucie Fizyki Academia Sinica pomagał w produkcji części projektowanych na zamówienie. Chcemy również podziękować P. Argastowi (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Bazylea, Szwajcaria) za zaprojektowanie mechanizmu szybkiego blokowania stolika głowowego.

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Akademii Sinica. Szczegóły dotyczące narzędzi badawczych można znaleźć w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie komory nagrania
<ol>
	<li>Przygotuj półsześciokątny zbiornik, płytę podstawową oraz stopień głowny (Rysunek 1A; Pliki uzupełniające 1-3). Stopień główny składa się z dwóch metalowych słupów przymocowanych do okrągłej płyty. Okrągła płyta zawiera rowki, które można zablokować na płycie podstawowej. Po zablokowaniu ze sobą stopień głowny i płyta podstawowa układa się na dnie półsześciokątnego zbiornika.</li>
	<li>Umieść półsześciokątny zbiornik na eksperymentalnej platformie mikroskopu. Platforma powinna móc poruszać się w kierunkach X i Y bez osiągania limitu etapu translacji.</li>
	<li>Skieruj światło podczerwieni 810 nm (IR) i kamerę na poziom głowy do rejestrowania zachowań. Upewnij się, że pole widzenia kamery jest wystarczająco duże, aby zmieścić dorosłego danio pręgowanego.<ol>
		<li>Aby zapobiec zakłóceniom dwufotonowego lasera i bodźca wzrokowego rejestracji zachowań, odpowiednio przed kamerą zamontuj filtr krótkprzepustowy o średnicy 875 nm i filtr długprzepustowy 700 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zaprezentować bodziec wizualny, przymocuj folie projekcji wstecznej do wewnętrznej strony trzech ścian półsześciokątnego zbiornika (Rysunek 1A).</li>
	<li>Celuj trzy projektory w trzy powierzchnie czołgu. Trzy obrazy powinny być wyrównane, tworząc ciągłą scenę wizualną. Aby zapobiec zanieczyszczeniu sygnału fluorescencji wapnia w projektorach, przed każdym projektorem umieść filtr neutralnej gęstości oraz filtr kolorowy czerwony (600 nm, długoprzepustowy) przed każdym projektorem oraz filtr pasmowy (510/80 nm) przed lampą fotopowielacza (PMT).</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65526/65526fig1v8.jpg" /> 
Rysunek 1: Narzędzia niezbędne do operacji unieruchomienia głowy. (A) Mechanizm szybkiego blokowania pomiędzy okrągłą płytą stójki głowy a płytą podstawową wewnątrz półsześciokątnego zbiornika. Pliki komputerowo wspomaganego projektowania (CAD) dla niestandardowych części można znaleźć w Plikach Uzupełniających 1-4. (B) Ω-kształtny głowik na zagłówek. (C) Trójosiowy mikromanipulator używany do ustawiania głowicy do miejsca mocowania. Wstawka: orientacja belki głowicy w glinie. (D) Działo do trzymania ryb podczas operacji. Wstawka: orientacja ryb wewnątrz armaty. (E) Moduł załadunku ryb oraz mikromanipulator używany do załadunku ryb na stopień głowy. Wstawka: orientacja ryb w module. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65526/65526fig1v8large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
2. Operacja zabezpieczenia głowy
<ol>
	<li>Przygotuj Ω-kształtny główek (Rysunek 1B; Plik uzupełniający 4) Dla zagłówka danio pręgowanego. Aby to zrobić, przymocuj kawałek olejowej gliny modelarskiej do mikromanipulatora trójosiowego. Upewnij się, że glina jest wystarczająco solidna, by utrzymać gałf, ale jednocześnie na tyle miękka, by po zapięciu głowy odłączyła się od gałbeka.</li>
	<li>Włóż ramię głowicy w glinę i ustawij ją poziomo (rysunek 1C). Dzięki temu późniejsze mocowanie głowicy na danio będzie poziome. UWAGA: Pręt głowicy może być wykonany z tytanu (24 mg) lub stali nierdzewnej (43 mg) i może być wielokrotnie używany do wielu eksperymentów. Materiał pręta nie wpływa na zachowanie dorosłych danio pręgowanych (waga waha się od 300 do 1000 mg) pod zagłówkiem.</li>
	<li>Przygotuj działo, pustą rurę do utrzymywania ciała ryby na miejscu podczas operacji (Rysunek 1D).</li>
	<li>Przygotuj 0,03% i 0,01% tricain-metanonianu (TMS; patrz Tabela materiałów) w wodzie z akwarium. Zostanie ona użyta do znieczulenia i utrzymania ryby w stanie sedacji podczas operacji.</li>
	<li>Przygotuj cztery wymazy tkankowe, aby usunąć nadmiar skóry i wody z miejsc przyczepu czaszki. Aby przygotować każdy wymaz, pokrój ręcznik papierowy na kwadrat o wymiarach 3 cm i złóż go po przekątnej, aby uzyskać strukturę przypominającą rurkę. Skręć końce rurki w cienki punkt. Miejsce przymocowania jest bardzo małe, więc cienki grot pozwala na precyzyjniejszą kontrolę wymazu.</li>
	<li>Przygotuj moduł ładowania ryb dla mikromanipulatora (Rysunek 1E). UWAGA: Moduł składa się z dwóch stalowych słupów połączonych ściskiem o prostym kącie. Jeden słup jest przymocowany do mikromanipulatora, a drugi trzyma obrotowy zacisk do trzymania ryby. Moduł służy do precyzyjnego ustawienia ryby na etapie głowicowym. Obrotowy zacisk na słupku służy jako regulacja kąta nachylenia ryby.</li>
	<li>Znieczulaj rybę 0,03% TMS w wodzie z akwarium. W kolejnych etapach używaj strzykawki, aby dostarczać 0,01% TMS w wodzie z akwarium do ust w krótkich impulsach co 90 sekund. Przepływ wody z perfuzji powinien wywołać ruch skrzeli. Pozwala to rybie przetrwać ponad 40 minut podczas operacji. UWAGA: Tg[neuroD:GCaMP6f] jest stosowany ze względu na szeroką ekspresję wskaźnika wapnia w przednim mózgu zarówno na etapie larwalnym, jak i dorosłym10. UWAGA: Opcjonalnie można stosować perfuzję grawitacyjną, aby zapewnić stały przepływ wody do ust podczas operacji, gdy obie ręce są zajęte.</li>
	<li>Owiń rybę do kapsuły (rysunek 2A), która trzyma ją wewnątrz armaty.<ol>
		<li>Owiń znieczuloną rybę kawałkiem wilgotnej papierowej chusteczki, zaczynając od czubka ogona do około 1 mm ogonowej długości do skrzeli. Upewnij się, że owijanie jest ciasne, aby zapobiec wyślizgowi ryby z tkanki.</li>
		<li>Owiń miękką plastikową rurkę z podłużnym nacięciem (np. średniej wielkości rurką termokurczliwą przeciętą) wokół papierowej chusteczki, aby zakryć rybę od końca ogona aż do około 2 mm ogonowy aż do skrzela. Rurka zapewnia, że ciało ryby pozostaje proste przez cały zabieg.</li>
		<li>Owiń ręcznik papierowy wokół rurki o średnicy mniej więcej zbliżonej do średnicy działka.</li>
		<li>Owiń miękką plastikową rurkę wyciętą z babulki plastikowej pipety transferowej wokół ręcznika papierowego. Zapewnia to płynne ładowanie kapsuły do armaty.</li>
		<li>Załaduj ryby do armaty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj skalpela, aby usunąć skórę pokrywającą miejsca przyczepu, czyli dwa trójkątne obszary czaszki boczno-bocznej od móżdżku i powyżej skrzeli (Rysunek 2B), a następnie usuń skórę pokrywającą obszar między miejscami przyczepu. Użyj wymazów z tkanek, aby wysuszyć miejsca przyczepu i usunąć resztki skóry.<ol>
		<li>Podczas usuwania skóry używaj regulowanej platformy do podparcia głowy, ale platforma nie powinna dotykać oczu, aby uniknąć urazu oczu podczas operacji. UWAGA: Dokładne usunięcie skóry w miejscach przyczepu jest kluczowe dla ograniczenia artefaktów ruchu podczas obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nałóż kroplę kleju do tkanek (patrz Tabela materiałów) na środek każdego miejsca przymocowania, używając końcówki pipety o pojemności 10 μL. UWAGA: Klej tkankowy pokrywa miejsca przyczepu i szybko wysycha. Klej tkankowy tworzy interfejs łączący czaszkę z cementem dentystycznym użytym do klejenia głowki i zapobiega dotarciu wody z skrzeli do miejsca mocowania.</li>
	<li>Ustaw korpus ryby w pozycji pionowej i ustaw głowicę lekko powyżej i ogonowo względem miejsc mocowania, przygotowując się do klejenia głowy.</li>
	<li>Przygotuj cement dentystyczny (patrz Tabela materiałów) i użyj go natychmiast do przyklejenia głowy do czaszki (Rysunek 2C). Zabieg jest pilny i musi zostać wykonany w ciągu 45 sekund.<ol>
		<li>Wymieszaj jedną małą łyżeczkę polimeru z czterema kroplami szybkiego monomeru i jedną kroplą katalizatora V. Równomiernie mieszaj mieszankę przez 15 sekund.</li>
		<li>Użyj mikropipety i końcówki pipety 10 μL, aby nałożyć mieszankę na miejsca przyczepu i obszar między nimi. Unikaj zakrywania skrzeli i oczu.</li>
		<li>Delikatnie dociśnij głowicę do cementu za pomocą mikromanipulatora. Przykryj głowicę resztą cementu.</li>
		<li>Poczekaj 12 minut, aby cement dentystyczny się utwardził. Unikaj kontaktu z cementem z wodą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby poprawić optyczny dostęp do przedniego mózgu do obrazowania wapnia, usuń skórę powyżej telencefalonu. Usunięcie skóry można wykonać w 3 minuty poprzez pięć cięć skalpelem (rysunek 2D). Upewnij się, że krople lipidowe przylegające do powierzchni czaszki są usunięte.</li>
	<li>Po utwardzeniu usuń glinę z główki.</li>
	<li>Przenieś całą kapsułę z działka do regulacji smoły w module ładowania ryb mikromanipulatora.</li>
	<li>Użyj mikromanipulatora, aby ustawić rybę. Uchwyt głowy powinien być umieszczony na metalowych słupkach sceny głowicy. Nieznacznie zwiększ kąt pochylenia ryby, aby powierzchnia przedniego mózgu była lepiej wyrównana z płaszczyzną optyczną podczas obrazowania dwufotonowego.</li>
	<li>Przyklej belkę do metalowych słupków klejem utwardzalnym w promieniowaniu UV. Ekspozycja UV 15 sekund wystarcza do utwardzenia.</li>
	<li>Wyjmij rybę z torebki i przymocuj stopień głowy do płyty podstawowej w półsześciokątnym zbiorniku.</li>
	<li>Zanurz zwierzę w wodzie z akwarium. Ryba powinna zacząć oddychać i wyzdrowieć z znieczulenia w ciągu 1-2 minut. UWAGA: Opcjonalnie użyj perfuzji strzykawkowej, aby dostarczyć świeżą wodę do ust.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65526/65526fig02.jpg" /> 
 
Rysunek 2: Kluczowe kroki podczas operacji założenia głowy. (A) Skład kapsuły wewnątrz armaty. (B) Miejsca przyczepu na czaszce (czerwone). Czerwone strzałki wskazują miejsca naczyń krwionośnych. (C) Góra: pręt głowy przymocowany do czaszki ryby. Dno: ryby załadowane na scenę głowową. (D) Cięcia potrzebne do usunięcia skóry nad mózgiem przednim. Liczby oznaczają sekwencję cięcia. Unikaj usuwania skóry w wyznaczonym miejscu (grocie strzały), aby zapobiec krwawieniu zwierzęcia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65526/65526fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
3. Obrazowanie dwufotonowe
<ol>
	<li>Włącz laser i poczekaj 30 minut, aż moc się ustabilizuje. Ustaw długość fali na 920 nm i moc na około 50 mW przy próbce. UWAGA: Wiązka laserowa kontrolowana przez skaner rezonansowy porusza się powoli w punktach zwrotu ścieżki skanowania. Aby zapobiec uszkodzeniom tkanek, stosuje się komórkę Pockels, która zmniejsza moc lasera w punktach zwrotu.</li>
	<li>Umieść komorę nagrającą z danio danio przypiętym na głowę na platformie eksperymentalnej (Rysunek 3A). Platforma powinna móc poruszać się w kierunkach X i Y bez osiągania limitu etapu translacji.</li>
	<li>Umieść soczewkę obiektywu jak najbliżej powierzchni przedniego mózgu. Soczewka obiektywu powinna być skierowana na przednią krawędź źrenicy (Rysunek 3B).</li>
	<li>Otwórz migawkę laserową i włącz PMT. Stopniowo podnosz soczewkę obiektywu (~1 mm), aż na zdjęciu fluorescencyjnym odsłonię grzbietowy przedni mózg (rysunek 3C).</li>
	<li>Aby zwiększyć liczbę zarejestrowanych neuronów, użyj piezosiłkownika do pobierania obrazów na różnych głębokościach (sześć płaszczyzn obrazu, odstęp 15 μm). To zwiększy wydajność danych kosztem liczby klatek na sekundę. Włączanie szybkiego skanowania osi Z do sterowania siłownikiem piezo-piezologicznym (tryb jednorodny, liczba przekrojów = 6, wielkość kroku = 15 μm, przebieg = piła, czas odlotu = 4 ms, opóźnienie siłownika = 8 ms).</li>
	<li>Aby rejestrować zachowanie, włącz światła podczerwieni 810 nm (IR) po obu stronach zbiornika. Dostosuj kąt, aby oświetlić całe ciało, które powinno być wyraźnie widoczne w aparacie.</li>
	<li>Włącz projektory.</li>
	<li>Zacznij nagrywać dane.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65526/65526fig3v2.jpg" /> 
Rysunek 3: Przygotowanie do wykonywania obrazowania wapnia, rejestrowania zachowań i wyświetlania bodźców wzrokowych. (A) Trzy projektory prezentują bodziec wzrokowy na ścianach półsześciokątnego zbiornika. Światła IR po bokach oświetlają ciało danio. (B) Ustawienie soczewki obiektywu. Po lewej: widok z przodu. Po prawej: widok z boku. Odległość między obiektywem 16x a docelowym obszarem mózgu wynosi około 2,5 mm. (C) Przykład obrazu dwufotonowego. Po lewej: maksymalna projekcja całego grzbietowego przedniego mózgu w Tg[neuroD:GCaMP6f]. Po prawej: powiększone zdjęcie, aby ukazać neurony w wielu obszarach mózgu. Wstawka: większe powiększenie z innego obszaru mózgu. Obrazy to średnie 10 sekund danych rejestrowanych w 5Hz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65526/65526fig03large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.</a>

Behavior Tracking and Neural Activity Pattern in the Zebrafish Forebrain

<ol><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
<li>Chow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+three-photon+imaging+of+the+brain+in+intact+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).</li>
<li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li>
<li>Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+neuroscience+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Circuit neuroscience in zebrafish.</a> Current Biology. 20 (8), R371-R381 (2010).</li>
<li>Kappel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+recognition+of+social+signals+by+a+tectothalamic+neural+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit.</a> Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).</li>
<li>Bartoszek, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ongoing+habenular+activity+is+driven+by+forebrain+networks+and+modulated+by+olfactory+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli.</a> Current Biology. 31 (17), 3861-3874 (2021).</li>
<li>Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+classical+and+operant+learning+behaviors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish.</a> Learning & Memory. 19 (4), 170-177 (2012).</li>
<li>Buske, C., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+shoaling+behavior+is+accompanied+by+changes+in+the+dopaminergic+and+serotoninergic+systems+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Psychobiology%22%5BJournal%5D)">Maturation of shoaling behavior is accompanied by changes in the dopaminergic and serotoninergic systems in zebrafish.</a> Developmental Psychobiology. 54 (1), 28-35 (2012).</li>
<li>Huang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+virtual+reality+system+to+analyze+neural+activity+and+behavior+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).</li>
<li>Rupprecht, P., Prendergast, A., Wyart, C., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+z-scanning+with+a+macroscopic+voice+coil+motor+for+fast+3D+multiphoton+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Remote z-scanning with a macroscopic voice coil motor for fast 3D multiphoton laser scanning microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 7 (5), 1656-1671 (2016).</li>
<li>Papadopoulos, I. N., Jouhanneau, J. -S., Poulet, J. F. A., Judkewitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scattering+compensation+by+focus+scanning+holographic+aberration+probing+%28F-SHARP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Scattering compensation by focus scanning holographic aberration probing (F-SHARP).</a> Nature Photonics. 11 (2), 116-123 (2017).</li>
<li>Torigoe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+capable+of+generating+future+state+prediction+error+show+improved+active+avoidance+behavior+in+virtual+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality.</a> Nature Communications. 12 (1), 5712(2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurujących ze sobą interesów finansowych.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół unieruchomienia głowy dorosłego danio dano w celu dwufotonowego obrazowania wapnia. Istnieją dwa kluczowe kroki, aby uzyskać stabilizację na głowie wystarczająco stabilną do obrazowania laserowego. Najpierw belka na głowę musi być przyklejona do konkretnych miejsc mocowania czaszek. Inne części czaszki są często zbyt cienkie, by zapewnić stabilność mechaniczną, a nawet mogą ulegać pęknięciom podczas silnych ruchów ciała. Po drugie, skóra nad miejscami przyczepu musi zostać dokładnie u...

Obrazowanie fluorescencji wapnia z użyciem genetycznie kodowanych wskaźników lub syntetycznych barwników okazało się potężną metodą pomiaru aktywności neuronów u zachowujących się zwierząt, w tym naczelnych nieludzkich, gryzoni, ptaków i owadów1. Aktywność setek komórek, do około 800 μm poniżej powierzchni mózgu, można jednocześnie mierzyć za pomocą obrazowania wielofotonowego 2,3. Aktywność określonych typów komórek można również mierzyć poprzez ekspresję wskaźników wapnia w genetycznie zdefiniowanych populacjach neuronalnych. Zastosowanie metody obrazowania w modelach małych kręgowców otwiera nowe możliwości w dziedzinie obliczeń neuronalnych w różnych obszarach mózgu.
Danio dano pręgowane to szeroko stosowany system modelowy w badaniach neurobiologicznych. Larwy danio dano w około 6 dniach po zapłodnieniu były wykorzystywane do obrazowania wapnia ze względu na miniaturowy mózg i przezroczyste ciało4. Młode danio pręgowane (3-4 tygodnie) są również wykorzystywane do badania mechanizmów nerwowych leżących u podstaw szlaków sensoryczno-ruchowych 5,6. Jednak maksymalny poziom wydajności dla złożonych zachowań, w tym uczenia się asocjacyjnego i zachowań społecznych, osiąga się w wieku 7,8 lat. Dlatego niezawodny protokół jest potrzebny do badania wielu funkcji poznawczych w mózgach dorosłych danio za pomocą metod obrazowania. Podczas gdy larwy danio pręgowanego i młode danio pręgowane mogą być osadzone w agarozie do obrazowania in vivo, dorosłe danio pręgowane w wieku 2 miesięcy lub starsze cierpią na hipoksję w takich warunkach i są fizycznie zbyt silne, by mogły zostać powstrzymane przez agarozę. Dlatego konieczny jest zabieg chirurgiczny, aby ustabilizować mózg i umożliwić zwierzęciu swobodne oddychanie przez skrzela.
Tutaj opisujemy protokół zabezpieczenia głowy, który wykorzystuje nowatorską konstrukcję pojedynczej głowy. Skrócony czas operacji o 25 minut jest dwukrotnie szybszy niż poprzednia metoda9. Opisujemy także konstrukcję komory zapisującej (półsześciokątny zbiornik), stopień głowicowy oraz mechanizmu szybkiego blokowania łączącego obie części9. Na koniec opisano także przygotowanie do prezentowania immersyjnego bodźca wzrokowego do badania aktywności i zachowań mózgu wywołanych wzrokowo. Ogólnie rzecz biorąc, opisane tutaj procedury mogą być wykorzystywane do wykonywania dwufotonowego obrazowania wapnia w genetycznie zdefiniowanych populacjach komórek u dorosłego danio ryba przypiętego na głowę, umożliwiając badanie aktywności mózgu podczas różnych paradygmatów behawioralnych.

<table><tbody><tr><td>Karta akwizycji</td><td>MBF Bioscience</td><td>Vidrio vDAQ</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Film projekcji wzadnej</td><td>Kimoto</td><td>Ekran Dilanda - GSK</td><td>obecny bodziec wzrokowy</td></tr><tr><td>Filtr pasmowy (510/80 nm)</td><td>Chroma</td><td>ET510/80m</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Płyta podstawowa zbiornika półsześciokątnego</td><td>Wykonano na zamówienie</td><td>Zobacz pliki uzupełniające</td><td>Komora nagrań</td></tr><tr><td>Filtr kamery (< 875 nm)</td><td>Optyka Edmunda</td><td>#86-106</td><td>Rejestracja zachowań</td></tr><tr><td>Filtr kamery (>700 nm)</td><td>Optyka Edmunda</td><td>#43-949</td><td>Rejestracja zachowań</td></tr><tr><td>Obiektyw aparatu</td><td>Thorlabs</td><td>MVL50M23</td><td>Rejestracja zachowań</td></tr><tr><td>Chameleon Vision-S</td><td>Spójność</td><td>Vision-S</td><td>Laser</td></tr><tr><td>Okrągła płytka do stójki głowicy</td><td>Wykonano na zamówienie</td><td>Zobacz pliki uzupełniające</td><td>Komora nagrań</td></tr><tr><td>Sterownik siłownika piezo-piezo-gazowego</td><td>Physik Instrumente&nbsp;</td><td>E-665. CR</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Wzmacniacz prądowy</td><td>Thorlabs</td><td>TIA60</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Elitedent Q-6</td><td>Rolence Enterprise</td><td>Q-6</td><td>Operacja: lampa UV</td></tr><tr><td>Filtr emisyjny 510/80 nm</td><td>Chroma</td><td>ET510/80m</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Głowica</td><td>Wykonano na zamówienie</td><td>Zobacz pliki uzupełniające</td><td>Komora nagrań</td></tr><tr><td>Światło podczerwone</td><td>Thorlabs</td><td>M810L3</td><td>Rejestracja zachowań</td></tr><tr><td>Projektor LED</td><td>AAXA</td><td>P2B LED projektor Pico</td><td>obecny bodziec wzrokowy</td></tr><tr><td>Wilgotna papierowa chusteczka (Kimwipe)</td><td>Nauka Kimtech</td><td>34155</td><td>Operacja: wilgotna papierowa chusteczka</td></tr><tr><td>Zmotoryzowany etap próbki XY</td><td>Zaber</td><td>X-LRM050</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Filtry o neutralnej gęstości (50% transmisji)</td><td>Thorlabs</td><td>NE203B</td><td>obecny bodziec wzrokowy</td></tr><tr><td>&Oslash; Uchwyt na słupek 1/2"</td><td>ThorLabs</td><td>PH1.5V</td><td>Operacja: pusta rura na armatę</td></tr><tr><td>&Oslash; Słupek optyczny ze stali nierdzewnej 1/2"</td><td>ThorLabs</td><td>TR150/M</td><td>Operacja: moduł ładowania ryb</td></tr><tr><td>Obiektyw obiektywowy 16x, 0,8NA</td><td>Nikon</td><td>CF175</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Modelarska glina na bazie oleju</td><td>Ly Hsin Clay</td><td>C4086</td><td>Operacja: uchwyt na pręt na głowę</td></tr><tr><td>Klej optyczny</td><td>Norland Products</td><td>NOA68</td><td>Operacja: klej utwardzalny UV</td></tr><tr><td>Lampa fotopowielacza</td><td>Hamamatsu</td><td>H11706P-40</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Siłownik piezo-piezo-gazetowy</td><td>Physik Instrumente&nbsp;</td><td>P-725.4CA PIFOC</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Komórka Pockelsów</td><td>Okulary konoptyczne</td><td>M350-80-LA-BK-02</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Filtr Red Wratten (> 600 nm)</td><td>Optyka Edmunda</td><td>#53-699</td><td>obecny bodziec wzrokowy</td></tr><tr><td>System skanowania rezonansowo-galwo</td><td>INSS</td><td>RGE-02</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Zacisk prostokątny dla oslash; Słupek 1/2"</td><td>ThorLabs</td><td>RA90/M</td><td>Operacja: moduł ładowania ryb</td></tr><tr><td>Zacisk obrotowy dla i Oslash; Słupek 1/2"</td><td>ThorLabs</td><td>SWC/M</td><td>Operacja: moduł ładowania ryb</td></tr><tr><td>ScanImage</td><td>MBF Bioscience</td><td>Wersja podstawowa</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Zbiornik półsześciokątny</td><td>Wykonano na zamówienie</td><td>Zobacz pliki uzupełniające</td><td>Komora nagrań</td></tr><tr><td>Super-Bond C& Zestaw B</td><td>Sun Medical Co.</td><td>Super-Bond C& B</td><td>Operacja: cement dentystyczny</td></tr><tr><td>Trikainowy metanonian</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td>Operacja: znieczulenie</td></tr><tr><td>Kamera USB</td><td>FLIR</td><td>BFS-U3-13Y3M-C</td><td>Rejestracja zachowań</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>Operacja: klej tkankowy</td></tr></tbody></table>

dwufotonowe obrazowanie wapnia aktywności przedmózgu u zachowujących się dorosłych danio

Two-Photon Calcium Imaging of Forebrain Activity in Behaving Adult Zebrafish

Dorosłe danio danio (Danio rerio) wykazują bogaty repertuar zachowań służących do badania funkcji poznawczych. Posiadają także miniaturowy mózg, który może być używany do pomiaru aktywności w różnych obszarach mózgu za pomocą metod obrazowania optycznego. Jednak raporty dotyczące rejestracji aktywności mózgu u zachowujących się dorosłych danio były nieliczne. Niniejsze badanie opisuje procedury przeprowadzania dwufotonowego obrazowania wapnia w grzbietowej części przedniego mózgu dorosłych danio pręgowanych. Skupiamy się na działaniach mających na celu powstrzymanie dorosłych danio przed poruszaniem głową, co zapewnia stabilność umożliwiającą laserowe obrazowanie aktywności mózgu. Zwierzęta związane z głową mogą swobodnie poruszać swoimi częściami ciała i oddychać bez pomocy pomocniczej. Zabieg ma na celu skrócenie czasu operacji unieruchomienia głowy, zminimalizowanie ruchu mózgu oraz maksymalizację liczby zarejestrowanych neuronów. Opisano tutaj także sposób prezentacji immersyjnego środowiska wizualnego podczas obrazowania wapniowego, który może posłużyć do badania korelatów nerwowych leżących u podstaw zachowań wywołanych wzrokowo.

Protokół składa się z dwóch części: operacji unieruchomienia głowy oraz dwufotonowego obrazowania wapnia aktywności neuronów w przednim mózgowi. Sukces operacji zależy od przeżycia zwierzęcia oraz stabilności zabezpieczenia głowy. Wskaźnik przeżycia można znacznie poprawić poprzez częstą perfuzję roztworu 0,01% TMS przez jamę ustną podczas operacji. Ryby powinny wyzdrowieć z znieczulenia i aktywnie oddychać w ciągu 1-2 minut po zanurzeniu w wodzie z akwarium. Dwufotonowe obrazowanie wapnia umożliwia rejestrowanie aktywno...

Przedstawiamy tutaj protokół przeprowadzania dwufotonowego obrazowania wapnia w grzbietowej części przedniej mózgu dorosłego danio pręgowanego.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia aktywności przedmózgu u zachowujących się dorosłych danio

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used ...

Przedni mózg ryb mieści obszary podejrzewane o homologiczne do obszarów mózgu ssaków, zaangażowanych w złożone zachowania. Należą do nich hipokamp, kora mózgowa oraz ciało migdałowate. Obecnie staramy się zrozumieć wpływ informacji sensorycznej na aktywność tych obszarów mózgu.Obecne badania w neurobiologii danio pręgowanego wykorzystują dwufotonowe obrazowanie wapnia unieruchomionych larw w połączeniu z testami zachowań opartymi na wirtualnej rzeczywistości do badania przetwarzania motorycznego w mózgu. Większość badań nad mózgiem danio pręgowanego prowadzona jest na larwach, jednak niektóre złożone zachowania u ryb rozwijają się w pełni dopiero w dorosłości. Nasz protokół pozwala badać aktywność mózgu u dorosłych podczas zachowania.Ten protokół skrócił czas operacji o 50% w porównaniu do poprzedniej metody. To bardziej efektywne podejście do ograniczania głowy danio pręgowanego dla obrazu mózgu. Ten protokół zabezpieczenia głowy otworzył możliwość przeprowadzenia eksperymentu in vivo na mózgu dorosłego danio pręgowanego.Oprócz dwuzdjęciowego obrazu wapnia, zatrzymywanie głowy potencjalnie umożliwiało manipulacje optogenetyczne, elektrofizjologiczne, a nawet ultradźwiękowe u żywyc

two-photon-calcium-imaging-forebrain-activity-behaving-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje metodę badania wizualnego wykrywania zdobyczy u transgenicznych larw danio pręgowanego za pomocą obrazowania fluorescencyjnego opartego na wskaźniku wapnia z ich neuronami wyrażającymi fluorescencyjne kompleksy wskaźnikowe wapnia.

Analiza aktywności neuronalnej wywołanej przez zdobycz w transgenicznej larwie danio pręgowanego

Źródło: Schramm, P. et al. Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw danio pręgowanego i osobników młodocianych poprzez usunięcie czaszki i skóry. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje obrazowanie in vivo neuronów móżdżku u transgenicznych larw danio pręgowanego, które wyrażają białka fluorescencyjne w neuronach Purkinjego. Proces polega na znieczuleniu larw, unieruchomieniu ich w agarozie i ostrożnym usunięciu pigmentowanej skóry w celu zwiększenia penetracji...

Obrazowanie in vivo mózgu larw danio pręgowanego w celu wizualizacji neuronów móżdżku

Opisana jest prosta metoda rejestrowania potencjałów pola zewnątrzkomórkowego w przodomózgowiu larwy danio pręgowanego. Metoda ta zapewnia solidny odczyt in vivo aktywności podobnej do napadowej. Technika ta może być stosowana w przypadku genetycznie zmodyfikowanych larw danio pręgowanego będących nosicielami genów związanych z padaczką lub napadów wywołanych podawaniem leków przeciwdrgawkowych.

Zapis elektrofizjologiczny przodomózgowia u larw danio pręgowanego

Ten artykuł opisuje, jak dorosły danio pręgowany może zostać unieruchomiony, zaintubowany i wykorzystany do eksperymentów elektrofizjologicznych in vivo, aby umożliwić rejestrację i manipulację aktywnością neuronalną u nienaruszonego zwierzęcia.

Zapis elektrofizjologiczny w mózgu nienaruszonego dorosłego danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół do ablacji genetycznie znakowanej subpopulacji neuronów za pomocą dwufotonowego lasera z larw danio pręgowanego.

Ablacja populacji neuronów za pomocą lasera dwufotonowego i jej ocena za pomocą obrazowania wapnia i rejestracji behawioralnej u larw danio pręgowanego

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem, które może być użyte do zbadania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego. W tym miejscu opisujemy technikę wykorzystania poklatkowej mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dużej liczby wielokolorowych komórek znakowanych Brainbow w czasie rzeczywistym w rozwijającym się układzie nerwowym danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwijającego się mózgu u żyjących danio pręgowanych za pomocą Brainbow i poklatkowego obrazowania konfokalnego

Tutaj prezentujemy metodę obrazowania embrionalnego mózgu danio pręgowanego in vivo, aż do stadium larwalnego i młodocianego. Ta mikroinwazyjna procedura, zaadaptowana z podejść elektrofizjologicznych, zapewnia dostęp do szczegółów komórkowych i subkomórkowych dojrzałego neuronu i może być połączona z badaniami optogenetycznymi i neurofarmakologicznymi w celu scharakteryzowania funkcji mózgu i interwencji farmakologicznej.

Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego poprzez usunięcie czaszki i skóry

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania in vivo całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej. Procedura eksperymentalna obejmuje przygotowanie próbki, akwizycję obrazu i wizualizację.

In vivo (in vivo) Obrazowanie całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania aktywności neuronalnej w obszarach mózgu transgenicznego danio pręgowanego, które wyrażają wskaźniki wapnia GCaMP za pomocą mikroskopii konfokalnej.

In vivo (in vivo) Konfokalne obrazowanie fluorescencyjne aktywności neuronalnej wywołanej stymulacją sensoryczną u częściowo unieruchomionych larw danio pręgowanego

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Poznaj dwufotonowe obrazowanie wapnia w przedmózgu dorosłego danio podczas zachowań. Ta metoda umożliwia badanie aktywności neuronów w odpowiedzi na bodźce sensoryczne u zachowujących się osobników.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia aktywności przedmózgu u zachowujących się dorosłych danio

Przeglądaj więcej filmów