Udany ortotopowy przeszczep wątroby u myszy z wykorzystaniem angiografii tomografii mikrokomputerowej
September 22nd, 2023
W tym protokole omawiamy implementację modelu udanego ortotopowego przeszczepu wątroby (OLT) u myszy. Dodatkowo omówiono adiuwanty do dalszej analizy drożności przeszczepu allogenicznego po udanym OLT u myszy, w szczególności z wykorzystaniem skanów tomografii mikrokomputerowej (microCT).
Transplantacja jest często jedyną skuteczną terapią w końcowym stadium choroby narządów. Aby zrozumieć złożone mechanizmy nieodłącznie związane z uszkodzeniem po przeszczepieniu wątroby, opracowano solidne modele przeszczepów małych zwierząt, aby podsumować fizjologię i patofizjologię uszkodzenia przeszczepu allogenicznego. Konieczne będzie opracowanie innowacyjnych strategii w celu dogłębnego zbadania szlaków mechanistycznych zaangażowanych w uszkodzenie tkanek obserwowane podczas przeszczepiania oraz w celu poszerzenia puli dawców.
Wykorzystanie myszy do badania transplantacji jest niezbędne, ponieważ pozwala na wykorzystanie edytowanych genów i transgenicznych linii myszy do badania roli określonych szlaków molekularnych w patofizjologii uszkodzenia przeszczepu allogenicznego. Istnieje wiele wyzwań technicznych związanych z przeszczepem wątroby u myszy, w tym mała średnica zespolenia naczyniowego i wynikające z tego ryzyko zakrzepicy prowadzącej do niewydolności przeszczepu allogenicznego. Chociaż zastosowano wiele technologii, takich jak angiografia ultrasonograficzna, tomografia mikrokomputerowa ma zalety, w tym możliwość uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości zespolenia naczyniowego w całej jamie brzusznej.
Badania te można przeprowadzać podłużnie w celu oceny drożności naczyń krwionośnych i obfitości wątroby w czasie. Istnieje wiele wyzwań związanych z wykonywaniem dokładnych i wyraźnych badań angiografii mikro CT u gryzoni. Odkryliśmy, że zastosowanie bramkowania serca i dostosowanie stężeń fluoru ISO w celu zmniejszenia częstości oddechów daje najwyraźniejsze obrazy.
Odkryliśmy również, że wykorzystanie czasu kontrastu specyficznego dla gryzoni dla określonych faz również poprawiło wizualizację. Na początek umieść znieczuloną mysz dawcy pod mikroskopem o dużej mocy. Za pomocą nożyczek wykonaj laparotomię w linii środkowej od wyrostka mieczykowatego do syntezy łonowej.
Następnie wykonaj poprzeczne nacięcie poniżej żeber, aby stworzyć wzór przypominający krzyż. Po cofnięciu wyrostka mieczykowatego wypatroszyć jelita i umieścić je na mokrej gąbce z gazy po lewej stronie jamy brzusznej. Aby zmobilizować wątrobę, oddziel ją od wszystkich przyczepów więzadłowych.
Po odsłonięciu właściwej tętnicy wątrobowej lub PHA, za pomocą zakrzywionych kleszczy, zeszkieletuj ją. Po podwiązaniu PHA należy rozciąć całą długość wspólnego przewodu żółciowego lub CBD. Włóż stent do przewodu żółciowego do CBD i zabezpiecz go nylonowym szwem 10-0.
Następnie podwiązaj dystalny aspekt CBD. Za pomocą mokrej gąbki z gazy cofnij prawy płat wątroby w kierunku mieczykowatego i odsłoń żyłę główną dolną lub IVC. Zmobilizuj wewnątrzwątrobową żyłę główną dolną lub IHIVC z dala od przestrzeni zaotrzewnowej i kauteryzuj prawą żyłę nadnercza.
Po wypreparowaniu i podwiązaniu prawej tętnicy nerkowej i żyły należy przeciąć obie i pozostałe przyczepy więzadłowe. Po usunięciu prawej nerki wstrzyknąć 0,5 mililitra zimnego roztworu ketoglutaranu tryptofanu histydyny ze 100 jednostkami heparyny przez żyłę wrotną lub PV. Po jednej minucie od wstrzyknięcia należy przeciąć żyłę wrotną górną nad żyłą śledzionową i żyłą krezkową górną. Aby wykonać perfuzję wątroby, powoli wstrzyknij zimny roztwór konserwujący ketoglutaran tryptofanu histydyny do IHIVC, aż płyn pochodzący z PV będzie czysty.
Umieść mikrozacisk lub cienki szew na IHIVC tuż nad prawą żyłą nerkową i przeciąć nieco niżej od zacisku. Gdy CBD zostanie przecięte dystalnie do stentu, zidentyfikuj i podwiąż przewód torbielowaty za pomocą nylonowego szwu 10-O. Za pomocą kleszczy chwyć kopułę pęcherzyka żółciowego i za pomocą nożyczek sprężynowych przeciąć przewód torbielowaty powyżej szwu, aby zakończyć cholecystektomię.
Cofnij wątrobę dolnie, aby odsłonić żyłę główną nadwątrobową dolną lub SHIVC i przeciąć ją. Zachowanie odpowiedniej długości zespolenia u myszy biorcy. Po usunięciu dodatkowych przyczepów więzadłowych umieść wątrobę w zimnej soli fizjologicznej.
Po goleniu i zdezynfekowaniu miejsca operacyjnego znieczulonej myszy biorcy, należy zastosować laparotomię w linii środkowej, aby odsłonić właściwą tętnicę wątrobową lub PHA. Po mobilizacji wątroby podwiązaj lewe naczynia przeponowe i okołoprzełykowe za pomocą nylonowego szwu 10-0. Następnie cofnij wątrobę niżej i wypreparuj żyłę główną nadwątrobową dolną lub SHIVC z zaotrzewnowej.
Cofnij wątrobę wyżej i wypreparuj żyłę główną podwątrobową dolną lub IHIVC z zaotrzewnowej. Następnie podwiąż prawą żyłę nadnerczy i odsłoń wnękę wątroby. Podwiązywać PHA za pomocą nylonowego szwu 10-0.
Wyciąć wspólny przewód żółciowy lub CBD z żyły wrotnej lub PV i podwiązać go szwem 7-0 w pobliżu rozwidlenia, tworząc odpowiednią przestrzeń dla zespolenia CBD. Po zaciśnięciu IHIVC tymczasowo podwiązać PV za pomocą szwu 7-0. Za pomocą igły o rozmiarze 30 przepłucz 0,5 mililitra soli fizjologicznej heparyny do natywnej żyły wrotnej wątroby.
Po zaciśnięciu SHIVC i IHIVC przeciąć natywne SHIVC, IHIVC, PV i wszelkie pozostałe przyczepy więzadłowe do natywnej wątroby biorcy. Umieścić alloprzeszczep wątroby dawcy w jamie brzusznej i cofnąć wnękę alloprzeszczepu dawcy, aby odsłonić PV. Po przepłukaniu dawcy i natywnej PV należy wprowadzić wcześniej wykonany mankiet PV dawcy do światła PV wątroby biorcy. Po zabezpieczeniu zespolenia należy wykonać zespolenie szyte ręcznie za pomocą nici nylonowego 10-0 z dawcą i rodzimym SHIVC. Na koniec całkowite zespolenie ściany górnej.
Następnie usuń szew podwiązany PV, a następnie zaciski naczyniowe z SHIVC, aby rozpocząć reperfuzję. Wykonaj ręcznie szyte zespolenie dla IHIVC, jak pokazano dla SHIVC. Po zakończeniu rekonstrukcji należy usunąć mikrozacisk lub szew z IHIVC w celu reperfuzji.
Po wykonaniu duktotomii należy wprowadzić stent CBD dawcy do światła CBD biorcy i zabezpieczyć zespolenie szwem 10-0. Na początek użyj taśmy, aby przymocować podkładkę EKG do lewej, prawej i prawej tylnej kończyny znieczulonej myszy z przeszczepioną wątrobą. Aby zapewnić prawidłowe zespoły QRS na karcie ustawień źródła, wybierz EKG jako przewód sprawdzania źródła do logiki i wybierz odprowadzenie, które oferuje najwyraźniejszą krzywą EKG.
Na karcie ustawień wyzwalacza upewnij się, że kanał A jest zaznaczony, a następnie wybierz żądane wyjście i wybierz parametry wyzwalacza kanału A. Następnie na karcie ustawień wyświetlacza dostosuj ustawienia wyświetlania, aby uzyskać wyraźny sygnał view. Weź pole obok EKG ustawionego na 500.
Ustaw prezentowane parametry obrazowania. Upewnij się, że próg EKG jest poniżej wartości histerezy i powyżej szczytu odcinka ST. Po umieszczeniu myszy w skanerze naciśnij Aktualizuj obraz.
Następnie uzyskaj zdjęcie rentgenowskie myszy zwiadowczej, aby wybrać odpowiednie pole view i pokrycie skanu anatomicznego. W celu wykonania akwizycji obrazu angiografii mikro CT należy ustawić prezentowane parametry. Aby zrekonstruować obrazy mikrotomografii komputerowej, prześlij obraz i ustaw niebieskie paski tak, aby znajdowały się okrakiem na anatomicznym obszarze zainteresowania.
Otwórz ekran narzędzia do rekonstrukcji i wybierz plik danych do odtworzenia. Włącz kontur głośności zainteresowania, aby zoptymalizować granicę obrazu. Następnie wybierz rozmiar woksela 40 mikronów, filtr do projektora ręcznego i filtr objętościowy Gaussa 80 mikronów.
Wybierz opcję Podgląd plasterka, aby zmniejszyć rozmiar pliku i określić pole widzenia na podstawie konturu objętości zainteresowania. Następnie przeprowadź koelodowanie obrazu rentgenowskiego, aby usunąć niechcianą przestrzeń lub obszary. Przejdź do sekcji Zaawansowane i kliknij opcję Bramkowanie oparte na obrazie.
Wybierz 10 faz bramkowania serca. Zaktualizuj nazwę pliku, a następnie naciśnij przycisk rekonstrukcji woluminu. Na koniec zmień nazwę pliku, aby uwzględnić opcje parametrów i wybierz rekonstrukcję woluminu.
Udana angiografia mikrotomografii komputerowej dostarcza szczegółowych informacji na temat zespolenia naczyniowego. Kontrast widziany przez IVC i PV świadczy o drożności zespolenia nadwątrobowego i wewnątrzwątrobowego. Dodatkowo, rekonstrukcja 3D udanych mikrotomografii komputerowych dostarcza szczegółowych informacji na temat anatomii naczyń krwionośnych.
Przegląd
Ten protokół opisuje model pomyślnej ortotopowej transplantacji wątroby (OLT) u myszy, koncentrując się na użyciu mikroskopowych skanów tomografii komputerowej (microCT) do analizy przepuszczalności przeszczepu po transplantacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia transplantacji
- Modele małych zwierząt
- Tomografia komputerowa z wysoką rozdzielczością
Tło
- Transplantacja jest krytyczną terapią dla końcowej fazy choroby narządowej.
- Modele myszy są niezbędne do badania mechanizmów uszkodzenia przeszczepu.
- MicroCT oferuje wysokorozdzielcze obrazy do oceny zrostu naczyniowego.
- Istnieją wyzwania techniczne związane z wykonywaniem transplantacji wątroby u myszy.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego modelu OLT u myszy.
- Wykorzystanie microCT do oceny przepuszczalności przeszczepu.
- Rozwiązanie wyzwań w zakresie obrazowania i technik chirurgicznych.
Zastosowane metody
- Ortotopowa transplantacja wątroby u myszy.
- Tomografia komputerowa z wysoką rozdzielczością do oceny naczyń.
- Synchronizacja skurczów serca i dostosowania stężenia izofluoranu dla lepszego obrazowania.
- Szczegółowy protokół chirurgiczny do pobierania i przeszczepiania wątroby.
Główne wyniki
- Pomyślna realizacja OLT w modelu myszym.
- MicroCT zapewniło czyste obrazy struktur naczyniowych.
- Udoskonalone techniki poprawiły jakość obrazowania i ocenę przeszczepu.
- Zidentyfikowano kluczowe kroki w procedurach chirurgicznych, aby zwiększyć szanse na sukces.
Wnioski
- Ustanowiony model jest skuteczny w badaniu transplantacji wątroby.
- MicroCT jest cennym narzędziem do monitorowania przepuszczalności przeszczepu.
- Ciągłe doskonalenie technik poprawi przyszłe badania.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
MicroCT angiography in orthotopic liver transplantation (OLT) mouse models enables high-resolution, non-terminal assessment of vascular anastomosis, supporting mechanistic de-risking and target validation in transplantation research. This imaging approach enhances predictive confidence in allograft patency and facilitates longitudinal studies without sacrificing valuable animal models. The method is strategically positioned to inform early discovery and preclinical decision points in transplantation-focused R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of molecular pathways involved in allograft injury using genetically modified mouse models.
- Supports functional validation of vascular anastomosis and graft patency in real time.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing repeated, non-lethal imaging of the same subject.
- Improves predictive confidence for downstream therapeutic evaluation in transplantation biology.
Screening & Assay Development
- Provides validated, high-fidelity imaging outputs for quantitative assessment of vascular integrity.
- Standardizes evaluation of technical success in surgical models, supporting reproducibility.
- Enables scalable, longitudinal monitoring of therapeutic interventions in preclinical studies.
- Prepares robust biological systems for compound screening and efficacy assessment.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for studying organ transplantation and injury mechanisms.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling repeated measurements.
- Reduces biological risk by providing early, quantitative readouts of graft function.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions for transplantation-focused therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through preclinical validation, enabling hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking in transplantation research.
- Discovery Biology: Supports mechanistic studies of allograft injury and vascular patency using genetically engineered models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for technical and therapeutic evaluation.
- Analytics: Provides high-resolution, 3D vascular reconstructions for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Enables longitudinal, non-terminal assessment of graft function, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and surgical workflow for diverse transplantation studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence and target validation in transplantation models.
- Operational Value: Standardizes imaging and surgical protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in transplantation R&D.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of transplantation-focused assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery and small animal anesthesia.
- Demands access to microCT imaging systems with cardiac gating and advanced reconstruction capabilities.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and surgical techniques.
- Adaptation may be needed for different organ systems or animal models.
- Imaging quality depends on precise control of anesthesia and contrast timing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:39
Midline Laparotomy Surgery in Donor Mice for Orthotopic Liver Transplantation
4:16
Midline Laparotomy Surgery in Recipient Mice for Orthotopic Liver Transplantation
6:45
Mouse MicroCT Angiography Imaging to Evaluate Allograft Patency and Durability of Anastomoses After Liver Transplantation
