Name: Mezenchymalne komórki zrębowe pochodzące z tkanki tłuszczowej współhodowane z pierwotnym mieszanym glejem w celu zmniejszenia stanu zapalnego wywołanego prionami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Poznaj metodę współhodowli mezenchymalnych komórek zrębowych z tkanki tłuszczowej z pierwotnym mieszanym glejem w celu zmniejszenia stanu zapalnego wywołanego prionami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Lab Animal Resources za ich hodowlę zwierząt. Nasze źródła finansowania tego manuskryptu obejmują Fundusz Boettchera, Fundusz Murphy'ego Turnera, Kolegium Medycyny Weterynaryjnej CSU oraz Radę Badawczą Kolegium Nauk Biomedycznych. Rysunki 2A, Rysunki 2C i Rysunki 3A zostały utworzone za pomocą BioRender.com.

Myszy były hodowane i utrzymywane w Colorado State's Lab Animal Resources, akredytowanym przez Association for Assessment and Accreditation of Lab Animal Care International, zgodnie z protokołem #1138, zatwierdzonym przez Institutional Animal Care and Use Committee na Colorado State University.
1. Izolowanie i infekowanie pierwotnej mieszanej gleju korowej za pomocą prionów
<ol>
	<li>Aby wyizolować pierwotny mieszany glej zawierający zarówno astrocyty, jak i mikroglej, należy uzyskać młode myszy C57Bl/6 w wieku od zera do dwóch dni. 
	UWAGA: Ten protokół jest adaptacją poprzednich protokołów 15,16.</li>
	<li>Eutanazja szczeniąt pojedynczo przez dekapitację i ekstrakcja ich mózgu, oddzielając i odrzucając móżdżek i pień mózgu.
	<ol>
		<li>Umieść mózg na 3 cm szalce Petriego zawierającej zimny MEM/EBSS z 2x penicyliną/streptomycyną/neomycyną (PSN). Pod lunetą sekcyjną oddziel półkule mózgowe i usuń i odrzuć śródmózgowie. Usuń i wyrzuć hipokamp i opony mózgowe z kory.</li>
		<li>Umieść obie półkule korowe w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 5 ml MEM/EBSS + 2x PSN i umieść na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W kapturze do hodowli tkankowej wyjmij pożywkę ze stożkowej probówki o pojemności 50 ml, delikatnie zasysając pipetą, pozostawiając kawałki tkanki korowej na dnie probówki. Za pomocą pipety ze szkła powlekanego dodać 10 ml wstępnie podgrzanego podłoża dysocjacyjnego i rozetrzeć tkankę szklaną pipetą 10-20 razy.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę do zlewki o pojemności 50 ml zawierającej małe mieszadło i umieścić na płytce mieszającej na najniższym ustawieniu, około 30 obr./min, na 10 minut. Wyjąć zlewkę z płytki mieszającej i ustawić ją pod kątem 30° na 3 minuty, aby tkanka osiadła na dnie. Usunąć zawiesinę komórkową (supernatant) i przenieść do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml na lodzie.</li>
	<li>Dodać DNazę-I (4 000 U/ml) do 10 ml pożywki dysocjacyjnej i ponownie zawiesić tkankę i mieszać przez dodatkowe 10 minut. Powtórzyć, dodając świeżą pożywkę dysocjacyjną (bez DNazy-I) dodatkowe 2-4 razy (jeden raz na każde dwa użyte młode myszy) i przenosząc zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 50 ml na lodzie, aż na dnie zlewki pozostanie tylko tkanka włóknista.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową w stożkowej probówce przez 10 minut w temperaturze 1 000 × g w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i zastąpić go pożywką wzrostową glejową. Policz komórki za pomocą hemocytometru i połóż komórki na płytkach o gęstości 106 w 10 cm poddanych hodowli komórkowej. Umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Po 24 godzinach wyjmij pożywkę i zastąp ją nową pożywką glejową. Pozwól komórkom osiągnąć 100% zbieżność w ciągu 2 tygodni; Następnie podziel je i pokryj płytą do eksperymentów.</li>
	<li>W przypadku zakażenia prionami in vitro należy umieścić glej na płytce po 100 000 komórek na studzienkę na płytkach 6-dołkowych i pozwolić osiągnąć 80%-100% konfluencji. Wystaw homogenaty mózgu, zarówno prionowe, jak i normalne, rozcieńczone do 20% w PBS na działanie światła UV przez 30 minut przed dodaniem do hodowli komórkowej. Odessać pożywkę z gleju, który ma być zakażony, a do każdej studzienki dodać 1,5-2 ml pożywki glejowej zawierającej końcową objętość 0,1% normalnego lub prionowego homogenatu mózgu.</li>
	<li>Po 72 godzinach odessać pożywkę i przemyć komórki PBS, aby usunąć wszelkie resztki homogenatu mózgu. Zastąp świeżą pożywką wzrostową glejową (niezawierającą homogenatów mózgu).</li>
	<li>Aby wyizolować komórki AdMSC, użyj pipety serologicznej i delikatnie odessaj tkankę tłuszczową wraz z ~1 ml roztworu HBSS/Trypsyny. Przenieść na 4-centymetrową szalkę Petriego zawierającą 2 ml pożywki DMEM/F12 z 200 U/ml mieszaniny DNazy-I i 400 U/ml kolagenazy/dypazy. Małymi nożyczkami pokrój kawałki tkanki tłuszczowej na małe kawałki (o wielkości mniejszej niż 5 mm) i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 1,5 godziny.</li>
	<li>Przenieść zawartość płytki Petriego do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z pipetą serologiczną i rozcierać mieszaninę ~10x pipetą. Upewnij się, że tkanka łatwo się rozpada i tworzy stosunkowo jednorodną mieszaninę. Odwirować mieszaninę w temperaturze 4 °C przez 5 minut w temperaturze 1 000 × g w celu uzyskania granulki zrębu naczyniowego, która będzie miała kolor czerwony.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant i przemyć osad 5 ml wstępnie podgrzanego, sterylnego PBS i odwirować w temperaturze 4 °C w temperaturze 1 000 × g przez 3 minuty. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki AdMSC (DMEM o niskiej zawartości glukozy zawierający L-glutaminę i uzupełniony 15% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (hiFBS), 1% aminokwasów, 1% aminokwasów endogennych i 1% PSN).</li>
	<li>Umieść sitko o pojemności 40 μm na świeżej sterylnej probówce stożkowej o pojemności 50 ml i odpipetuj zawiesinę komórek przez sitko, aby usunąć wszelkie niezdysocjowane tkanki. Dodać 9 ml pożywki AdMSC do 10-centymetrowego naczynia poddanego działaniu hodowli komórkowej i odpipetować napiętą zawiesinę komórkową do naczynia. Umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Wyjmij i zastąp nową pożywką AdMSC następnego dnia. Poczekaj, aż komórki staną się zlewające się w 80-90%, kiedy będą gotowe do przejścia między 72 godzinami a 96 godzinami.</li>
	<li>Wyizoluj AdMSC zgodnie z powyższym opisem i przejdź dwukrotnie, aby uzyskać spójną jednorodną populację 14. Umyj komórki dwukrotnie sterylnym PBS i odpipetuj 2 ml podgrzanej trypsyny (0,25%) na każdą płytkę. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut lub do momentu, gdy całkowicie oderwą się od płytki. Dodać 8 ml wstępnie podgrzanej pożywki AdMSC do każdej płytki, pipetować w celu wymieszania zawiesiny komórek, przenieść do stożkowej probówki i odwirować w temperaturze 1 000 × g w temperaturze 4 °C do osadzania.</li>
	<li>Zawiesić AdMSC w 3-10 ml pożywki (w zależności od liczby użytych płytek) i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Umieść 100 000 komórek/basenik na 6-dołkowych płytkach zawierających pożywkę AdMSC. Umieścić na noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Następnego dnia stymuluj komórki cytokinami lub homogenatem mózgu.
	<ol>
		<li>W przypadku komórek stymulowanych cytokinami należy przygotować pożywkę AdMSC zawierającą 10 ng/ml TNFα lub 200 ng/ml IFNγ. Użyj świeżej pożywki do studzienek kontrolnych.</li>
		<li>W przypadku leczenia homogenatem mózgu zakażonym prionami, należy uzyskać 20% homogenatu mózgu (w PBS) od nieuleczalnie zakażonych myszy prionowych (szczepy 22L lub RML). Spraw, aby pożywki AdMSC o końcowym stężeniu 0,1% zakażonym prionami lub normalnym mózgu homogenizować dla grupy kontrolnej.</li>
		<li>Odessać pożywkę ze studzienek i odpipetować 1,5 ml pożywki zawierającej cytokiny lub homogenat mózgu do odpowiednich studzienek. Wykonać w trzech egzemplarzach. Włożyć płytki z powrotem do inkubatora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń pożywkę, umyj komórki 2x wstępnie podgrzanym PBS, wyizoluj RNA, dodając 350 ml buforu do lizy zawierającego 1% βME do każdej studzienki i użyj podnośnika komórkowego do usunięcia lizatów komórkowych. Wykonaj izolację RNA zgodnie z protokołem producenta mini zestawu, w tym etap trawienia DNazy. W przypadku RT-qPCR należy dokonać odwrotnej transkrypcji 25 ng RNA na próbkę i amplifikować cDNA za pomocą SYBR Green i starterów dla każdego genu przy 10 mM. Analizuj ekspresję mRNA metodą 2-ΔΔCT i normalizuj do ekspresji genu referencyjnego β-aktyny 17. 
	UWAGA: Wszystkie testy RT-PCR zostały wykonane zgodnie z wytycznymi MIQE.</li>
	<li>Mikroglej BV2 na płytce 50 000 komórek na studzience lub pierwotny mieszany glej na 100 000 komórek na studzienkę na płytce 6-dołkowej. Komórki BV2 należy traktować następnego dnia pożywką zawierającą 0,1% homogenatu mózgu zakażonego prionem lub normalnym. W przypadku mieszanego gleju poczekaj, aż komórki zlewają się w 80-90%, aby zainfekować homogenatem mózgu.</li>
	<li>Inkubować komórki w pożywce zawierającej homogenat mózgu przez 72 godziny. Umyć komórki 2x PBS, aby usunąć pozostały homogenat mózgowy i dodać świeżą pożywkę i wrócić do inkubatora.</li>
	<li>Użyj AdMSC w przejściu 3 dla wspólnej hodowli. W przypadku stymulacji AdMSC należy użyć pożywki zawierającej 10 ng / ml TNFα i leczyć przez 24 godziny przed współhodowlą z BV2 lub mieszanym glejem. Umyj stymulowane AdMSC 3x PBS, aby usunąć wszelkie pozostałe TNFα.</li>
	<li>Trypsynizuj AdMSC zgodnie z opisem w kroku 1.15 i ponownie zawieś na nośniku AdMSC.</li>
	<li>Wirować zawiesinę AdMSC o masie 1 000 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. W tym czasie zastąp pożywkę na komórkach BV2 lub mieszanym gleju 2 ml na studzienkę pożywki AdMSC i umieść wkładki na płytki 6-dołkowe o wielkości porów 0,4 mikrometra w połowie studzienek. Dodaj 2 ml pożywki AdMSC do każdej wkładki i dodatkowe 2 ml pożywki do studzienek, które nie przyjmują wkładek.</li>
	<li>Po zakończeniu granulowania AdMSC, ponownie zawieś osad w pożywce AdMSC. Policz AdMSC za pomocą hemocytometru i dodaj 50 000-100 000 komórek do każdej wkładki.</li>
	<li>W przypadku komórek BV2 inkubować kokultury przez 24 godziny. W przypadku mieszanego gleju inkubować przez zaledwie 24 godziny i aż 7 dni.</li>
	<li>Po inkubacji z AdMSC przez żądany czas, usuń wkładki i wyrzuć lub umieść je na nowej 6-dołkowej płytce, umyj wkładki 2x PBS, dodaj bufor dostarczony przez zestaw do izolacji RNA do mieszanych komórek glejowych lub BV2 i zeskrob inserty w celu analizy RNA AdMSC.</li>
	<li>Traktować AdMSC w pasażu 2 pożywką zawierającą 10 ng/ml TNFα. Następnego dnia umyj komórki wstępnie podgrzanym sterylnym PBS 3x i inkubuj w pożywce AdMSC bez surowicy przez 4 godziny.</li>
	<li>Aby przeprowadzić test na komórkach migrujących, dodaj 25 000 AdMSC na wkładkę i inkubuj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. W tym czasie komórki wędrowne przemieszczą się z górnej komory wkładki i przylgną do spodu wkładki. Ostrożnie zassać zawartość zarówno studzienki, jak i wkładek i przemyć 2x PBS, pozostawiając 1 ml PBS w każdej studzience, aby upewnić się, że wkładki pozostaną wilgotne z każdej strony.</li>
	<li>Pojedynczo za pomocą kleszczy wyjmij wkładki i delikatnie, ale dokładnie przetrzyj górną komorę bawełnianym wacikiem, aby usunąć wszelkie komórki, które nie migrowały. Zassać pozostały PBS i odpipetować 500 μl roztworu fioletu krystalicznego zarówno do studzienki, jak i górnej komory wkładki, upewniając się, że membrana wkładki jest całkowicie zanurzona.</li>
	<li>Inkubować wstawki przez 1 godzinę w roztworze fioletu krystalicznego w temperaturze pokojowej. Aby jak najlepiej zachować kolor, kolejne kroki należy wykonywać szybko, używając tylko jednej wkładki na raz.
	<ol>
		<li>Odessać roztwór fioletu krystalicznego ze studzienki i górnej komory wkładu i przemyć 3x PBS. Ponownie przetrzyj górną komorę bawełnianym wacikiem.</li>
		<li>Umieścić wkładkę w studzience w nowej 24-dołkowej płytce zawierającej 1 ml PBS. Umieść płytkę nad odwróconym mikroskopem z dołączoną kamerą. Korzystając z obiektywu 10x, zrób zdjęcia czterech losowych obszarów w kierunku środka wkładki, skupiając się tylko na dolnej stronie wkładki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wykonaniu tego z każdym dołkiem prześlij obrazy do wybranego oprogramowania do przetwarzania obrazu i dostosuj tło, aby zwiększyć kontrast z fioletowymi komórkami. Policz komórki ręcznie za pomocą licznika komórek.</li>
</ol>

Coculturing AdMSCs and Glia to Reduce Prion-Induced Inflammation

<ol><li>Liddelow, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+reactive+astrocytes+are+induced+by+activated+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia.</a> Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).</li>
<li>Smith, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+unfolded+protein+response+induces+a+specific+reactivity+state+that+causes+non-cell-autonomous+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Astrocyte unfolded protein response induces a specific reactivity state that causes non-cell-autonomous neuronal degeneration.</a> Neuron. 105 (5), 855-866 (2020).</li>
<li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li>
<li>Collinge, J., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+model+of+prion+strains+and+their+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A general model of prion strains and their pathogenicity.</a> Science. 318 (5852), 930-936 (2007).</li>
<li>Gajdusek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmissible+and+non-transmissible+amyloidoses%3A+autocatalytic+post-translational+conversion+of+host+precursor+proteins+to+beta-pleated+sheet+configurations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Transmissible and non-transmissible amyloidoses: autocatalytic post-translational conversion of host precursor proteins to beta-pleated sheet configurations.</a> J Neuroimmunol. 20 (2-3), 95-110 (1988).</li>
<li>Come, J. H., Fraser, P. E., Lansbury, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+model+for+amyloid+formation+in+the+prion+diseases%3A+importance+of+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A kinetic model for amyloid formation in the prion diseases: importance of seeding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (13), 5959-5963 (1993).</li>
<li>Hartmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+3%28%2B%29-astrocytes+are+highly+abundant+in+prion+diseases%2C+but+their+abolishment+led+to+an+accelerated+disease+course+and+early+dysregulation+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Complement 3(+)-astrocytes are highly abundant in prion diseases, but their abolishment led to an accelerated disease course and early dysregulation of microglia.</a> Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 83(2019).</li>
<li>Carroll, J. A., Race, B., Williams, K., Striebel, J., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+are+critical+in+host+defense+against+prion+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Microglia are critical in host defense against prion disease.</a> Journal of Virology. 92 (15), e00549(2018).</li>
<li>Bradford, B. M., McGuire, L. I., Hume, D. A., Pridans, C., Mabbott, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+deficiency+accelerates+prion+disease+but+does+not+enhance+prion+accumulation+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia deficiency accelerates prion disease but does not enhance prion accumulation in the brain.</a> Glia. 70 (11), 2169-2187 (2022).</li>
<li>Li, M., Chen, H., Zhu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+for+regenerative+medicine+in+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells for regenerative medicine in central nervous system.</a> Frontiers in Neuroscience. 16, 1068114(2022).</li>
<li>Sanchez-Castillo, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+roles%3A+beneficial+effects+of+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells+on+microglia+and+their+implication+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Switching roles: beneficial effects of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells on microglia and their implication in neurodegenerative diseases.</a> Biomolecules. 12 (2), 219(2022).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+migration+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell migration and tissue repair.</a> Cells. 8 (8), 784(2019).</li>
<li>Xiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+increases+bone+marrow+mesenchymal+stem+cell+migration+to+ischemic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha increases bone marrow mesenchymal stem cell migration to ischemic tissues.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 62 (3), 409-414 (2012).</li>
<li>Hay, A. J. D., Murphy, T. J., Popichak, K. A., Zabel, M. D., Moreno, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+mesenchymal+stromal+cells+decrease+prion-induced+glial+inflammation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived mesenchymal stromal cells decrease prion-induced glial inflammation in vitro.</a> Scientific Reports. 12 (1), 22567(2022).</li>
<li>Kirkley, K. S., Popichak, K. A., Afzali, M. F., Legare, M. E., Tjalkens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+amplify+inflammatory+activation+of+astrocytes+in+manganese+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Microglia amplify inflammatory activation of astrocytes in manganese neurotoxicity.</a> Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 99(2017).</li>
<li>Popichak, K. A., Afzali, M. F., Kirkley, K. S., Tjalkens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial-neuronal+signaling+mechanisms+underlying+the+neuroinflammatory+effects+of+manganese%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Glial-neuronal signaling mechanisms underlying the neuroinflammatory effects of manganese.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 324(2018).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Hass, R., Otte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+as+all-round+supporters+in+a+normal+and+neoplastic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%3A+CCS%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells as all-round supporters in a normal and neoplastic microenvironment.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 10 (1), 26(2012).</li>
<li>Carroll, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+strain+differences+in+accumulation+of+PrPSc+on+neurons+and+glia+are+associated+with+similar+expression+profiles+of+neuroinflammatory+genes%3A+comparison+of+three+prion+strains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Prion strain differences in accumulation of PrPSc on neurons and glia are associated with similar expression profiles of neuroinflammatory genes: comparison of three prion strains.</a> PLoS Pathogens. 12 (4), 1005551(2016).</li>
<li>Carroll, J. A., Race, B., Williams, K., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+2+confers+partial+neuroprotection+during+prion+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 2 confers partial neuroprotection during prion disease.</a> PLoS One. 13 (12), e0208559(2018).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+low-dose+inflammatory+stimulus+synergistically+enhance+bone+marrow+mesenchymal+stem+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and low-dose inflammatory stimulus synergistically enhance bone marrow mesenchymal stem cell migration.</a> Cell Proliferation. 50 (1), e12309(2017).</li>
<li>Hay, A. J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasally+delivered+mesenchymal+stromal+cells+decrease+glial+inflammation+early+in+prion+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intranasally delivered mesenchymal stromal cells decrease glial inflammation early in prion disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 17, 1158408(2023).</li>
<li>English, K., Barry, F. P., Field-Corbett, C. P., Mahon, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma+and+TNF-alpha+differentially+regulate+immunomodulation+by+murine+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma and TNF-alpha differentially regulate immunomodulation by murine mesenchymal stem cells.</a> Immunology Letters. 110 (2), 91-100 (2007).</li>
<li>Hemeda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+differentially+affect+cytokine+expression+and+migration+properties+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha differentially affect cytokine expression and migration properties of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 19 (5), 693-706 (2010).</li>
<li>Carta, M., Aguzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+foundations+of+prion+strain+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular foundations of prion strain diversity.</a> Current Opinion in Neurobiology. 72, 22-31 (2022).</li>
<li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+microglia+and+macrophages+in+brain+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neuroscience+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Phagocytic microglia and macrophages in brain injury and repair.</a> CNS Neuroscience and Therapeutics. 28 (9), 1279-1293 (2022).</li>
<li>Sinha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+activities+of+reactive+microglia+and+astrocytes+associated+with+prion+diseases+are+dysregulated+in+opposite+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Phagocytic activities of reactive microglia and astrocytes associated with prion diseases are dysregulated in opposite directions.</a> Cells. 10 (7), 1728(2021).</li>
<li>Stansley, B., Post, J., Hensley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+review+of+cell+culture+systems+for+the+study+of+microglial+biology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 115(2012).</li>
<li>Shan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effect+of+autologous+compact+bone-derived+mesenchymal+stem+cell+transplantation+on+prion+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effect of autologous compact bone-derived mesenchymal stem cell transplantation on prion disease.</a> Journal of General Virology. 98 (10), 2615-2627 (2017).</li>
<li>Johnson, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+immune+cells+trafficking+fluorescent+prion+rods+hours+after+intraperitoneal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Monitoring immune cells trafficking fluorescent prion rods hours after intraperitoneal infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2349(2010).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSC-secreted+TGF-beta+regulates+lipopolysaccharide-stimulated+macrophage+M2-like+polarization+via+the+Akt%2FFoxO1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">MSC-secreted TGF-beta regulates lipopolysaccharide-stimulated macrophage M2-like polarization via the Akt/FoxO1 pathway.</a> Stem Cell Research and Therapy. 10, 345(2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Tutaj pokazujemy niezawodny i stosunkowo niedrogi protokół oceny wpływu mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej (AdMSC) w zmniejszaniu stanu zapalnego wywołanego prionami w modelu komórek glejowych. AdMSC można łatwo wyizolować i namnażać w kulturze do użycia w ciągu zaledwie 1 tygodnia. Protokół ten konsekwentnie wytwarza heterologiczną populację komórek, które wyrażają markery zgodne z markerami mezenchymalnych komórek zrębu za pomocą immunofluorescencji i cytometrii przepływowej oraz zachow...

Zapalenie glejowe odgrywa kluczową rolę w różnych chorobach neurodegeneracyjnych, w tym w chorobie Parkinsona, Alzheimera i prionowej. Chociaż nieprawidłowa agregacja białek jest przypisywana dużej części patogenezy choroby i neurodegeneracji, komórki glejowe również odgrywają rolę w zaostrzeniu tego zjawiska 1,2,3. Dlatego celowanie w stan zapalny wywołany glejem jest obiecującym podejściem terapeutycznym. W chorobie prionowej komórkowe białko prionowe (PrPC) nieprawidłowo fałduje się do białka prionowego związanego z chorobą (PrPSc), które tworzy oligomery i agregaty oraz zaburza homeostazę w mózgu 4,5,6.
Jednym z najwcześniejszych objawów choroby prionowej jest reakcja zapalna astrocytów i mikrogleju. Badania tłumiące tę odpowiedź, czy to poprzez usunięcie mikrogleju, czy modyfikację astrocytów, generalnie nie wykazały poprawy lub pogorszenia patogenezy choroby w modelach zwierzęcych 7,8,9. Modulowanie zapalenia glejowego bez jego eliminacji jest intrygującą alternatywą terapeutyczną.
Mezenchymalne komórki zrębowe (MSC) znalazły zastosowanie w leczeniu różnych chorób zapalnych, ze względu na ich zdolność do modulowania stanu zapalnego w sposób parakrynny 10,11. Wykazali zdolność do migracji do miejsc zapalenia i reagowania na cząsteczki sygnałowe w tych środowiskach poprzez wydzielanie cząsteczek przeciwzapalnych, czynników wzrostu, mikroRNA i innych 10,12,13. Wcześniej wykazaliśmy, że MSCs pochodzące z tkanki tłuszczowej (oznaczone jako AdMSC) są zdolne do migracji w kierunku homogenatu mózgu zakażonego prionami i reagują na ten homogenat mózgu poprzez regulację w górę ekspresji genów dla cytokin przeciwzapalnych i czynników wzrostu.
Ponadto, AdMSCs mogą zmniejszać ekspresję genów związanych z Czynnikiem Jądrowym-kappa B (NF-κB), domeną pyryny z rodziny Nod-Like Receptor zawierającą 3 (NLRP3) sygnalizację inflamasomu i aktywację glejową, zarówno w mikrogleju BV2, jak i pierwotnym mieszanym gleju 14. W tym miejscu przedstawiamy protokoły izolowania zarówno AdMSC, jak i pierwotnego mieszanego gleju od myszy, stymulowania AdMSC do zwiększania regulacji genów modulacyjnych, oceny migracji AdMSC i wspólnej hodowli AdMSC z glejem zakażonym prionami. Mamy nadzieję, że procedury te mogą stanowić podstawę do dalszych badań nad rolą MSCs w regulacji stanu zapalnego wywołanego glejem w chorobach neurodegeneracyjnych i innych.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsyna</td><td>Cytiva</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 5 ml</td><td>Celltreat</td><td>229005B</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>Celltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Płytki do hodowli komórkowych</td><td>Peak Serum</td><td>PS-4002</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 10 ml</td><td>Celltreat</td><td>229210</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki</td> <td>stożkoweCelltreat</td><td>667015B</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>Celltreat</td><td>667050B</td><td></td></tr><tr><td>BV2 linia komórkowa mikrogleju</td><td>AcceGen Biotech</td><td>ABC-TC212S</td><td></td></tr><tr><td>Podnośnik komórek</td><td>Biologix Research Company</td><td>70-2180</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia elektronowa</td> fioletu<td>krystalicznego</td> Nauki<td>&nbsp; 12785</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Thermo Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Caisson Labs</td><td>DFL14-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy egzogenne</td><td>Thermo Scientific</td><td>11130051</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (100%)</td><td>EMD Millipore</td><td>EX0276-1</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (ciepło inaktywowany)</td><td>Peak Serum</td><td>PS-FB4</td><td>Można kupić jako inaktywowany termicznie lub inaktywowany w laboratorium</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>EMD Millipore</td><td>1.04003.1000</td><td></td></tr><tr><td>Szklana pipeta serologiczna 10 ml</td><td>Corning</td><td>&nbsp; 7077-10N</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Balances Roztwór soli</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8264-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr/Komora Neubauera</td><td>Daigger</td><td>HU-3100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM o wysokiej zawartości glukozy</td><td>Cytiva</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM o niskiej zawartości glukozy zawierający L-glutaminę</td><td>Cytiva</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>MEM/EBSS</td><td>Cytiva</td><td>SH30024. </td><td></td>FS</tr><tr><td>aminokwasy endogenne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7145-100M</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (16%)</td><td>MP Biomedicals</td><td>219998320</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna/neomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4083-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Cytiva</td><td>&nbsp; SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane mysie białko IFN-gamma</td><td>R& D Systems</td><td>485-MI</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane mysie białko TNF-alfa (aa 80-235), CF</td><td>R& D Systems</td><td>410-MT</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td>Płaszcz wewnątrz szklanych pipet, dwukrotnie zasysając w górę iw dół w Sigmacote i pozostawiając do całkowitego wyschnięcia. Zawiń w folię aluminiową i pipety w autoklawie 24 godziny później.</td></tr><tr><td>Stemxyme</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004106</td><td>Mieszanina kolagenazy i dypazy</td></tr><tr><td>Sterylny, indywidualnie pakowany wacik bawełniany</td><td>Puritan Medical</td><td>&nbsp; 25-8061WC</td><td></td></tr><tr><td>Thincert Wkładki do hodowli tkankowych, 24 dołki, wielkość porów = 8 i mikro; m</td> Wkładki do hodowli tkankowych <td>Greiner Bio-One</td><td>662638</td><td></td></tr><tr><td>Thincert, 6 dołków, wielkość porów = 0,4 i mikro; m</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657641</td><td></td></tr></tbody></table>

mezenchymalne komórki zrębowe pochodzące z tkanki tłuszczowej współhodowane z pierwotnym mieszanym glejem w celu zmniejszenia stanu zapalnego wywołanego prionami

Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells Co-Cultured with Primary Mixed Glia to Reduce Prion-Induced Inflammation

Mezenchymalne komórki zrębu (MSC) są silnymi regulatorami stanu zapalnego poprzez produkcję cytokin przeciwzapalnych, chemokin i czynników wzrostu. Komórki te wykazują zdolność do regulowania zapalenia nerwów w kontekście chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba prionowa i inne zaburzenia nieprawidłowego fałdowania białek. Choroby prionowe mogą być sporadyczne, nabyte lub genetyczne; Mogą one wynikać z nieprawidłowego fałdowania i agregacji białka prionowego w mózgu. Choroby te są niezmiennie śmiertelne, przy braku dostępnych metod leczenia.
Jednym z najwcześniejszych objawów choroby jest aktywacja astrocytów i mikrogleju oraz związane z tym stany zapalne, które występują przed wykrywalną agregacją prionów i utratą neuronów; tak więc, właściwości przeciwzapalne i regulacyjne MSCs mogą być zbierane w celu leczenia astroglejuzy w chorobie prionowej. Niedawno wykazaliśmy, że MSCs pochodzące z tkanki tłuszczowej (AdMSC) hodowane wspólnie z komórkami BV2 lub pierwotnym mieszanym glejem zmniejszają stan zapalny wywołany prionami poprzez sygnalizację parakrynną. W artykule opisano niezawodne leczenie z wykorzystaniem stymulowanych AdMSC w celu zmniejszenia stanu zapalnego wywołanego prionami.
Heterozygotyczną populację AdMSC można łatwo wyizolować z mysiej tkanki tłuszczowej i rozszerzyć w hodowli. Stymulowanie tych komórek cytokinami zapalnymi zwiększa ich zdolność zarówno do migracji w kierunku homogenatu mózgu zakażonego prionami, jak i wytwarzania modulatorów przeciwzapalnych w odpowiedzi. Łącznie techniki te mogą być wykorzystane do zbadania potencjału terapeutycznego MSCs w odniesieniu do infekcji prionowej i mogą być dostosowane do innych chorób związanych z nieprawidłowym fałdowaniem białek i chorobami neurozapalnymi.

Stymulacja AdMSC za pomocą TNFα lub interferonu gamma (IFNγ) przez 24 h indukuje zmiany w ekspresji cząsteczek przeciwzapalnych i czynników wzrostu. Traktowanie AdMSC za pomocą TNFα lub interferonu gamma (IFNγ) zwiększa poziom mRNA genu 6 stymulowanego przez TNF (TSG-6), podczas gdy TNFα, ale nie IFNγ, powoduje wzrost poziomu mRNA czynnika wzrostu przekształcającego beta-1 (TGFβ-1). Stymulacja TNFα lub IFNγ indukuje wzrost poziomu mRNA czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), ale nie powoduje zm...

Mezenchymalne komórki zrębowe pochodzące z tkanki tłuszczowej (AdMSC) mają silne właściwości immunomodulacyjne, przydatne w leczeniu chorób związanych ze stanem zapalnym. Pokazujemy, jak izolować i hodować mysie AdMSC i pierwotny mieszany glej, stymulować AdMSC do zwiększania poziomu genów przeciwzapalnych i czynników wzrostu, oceniać migrację AdMSC i kohodować AdMSC z pierwotnym mieszanym glejem zakażonym prionami.

Mezenchymalne komórki zrębowe pochodzące z tkanki tłuszczowej współhodowane z pierwotnym mieszanym glejem w celu zmniejszenia stanu zapalnego wywołanego prionami

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are potent regulators of inflammation through the production of anti-inflammatory cytokines, chemokines, and growth ...

Nasza praca koncentruje się na chorobach prionowych, które są śmiertelnymi chorobami neurodegeneracyjnymi spowodowanymi nieprawidłowym fałdowaniem białka prionowego w mózgu. Niewiele badań koncentrowało się na wpływie komórek glejowych na śmierć neuronów. Chcemy wiedzieć, czy zatrzymanie stanu zapalnego wywołanego przez komórki glejowe może być podejściem terapeutycznym.Niedawno dokonano odkrycia w polu mezenchymalnych komórek zrębu, ujawniając, że właściwości ochronne wynikają z uwalnianych przez nie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Naszym celem jest zagłębienie się w zawartość tych pęcherzyków i zrozumienie, w jaki sposób zapewniają one ochronę przed zapaleniem gleju wywołanym prionami. Obecnie w dziedzinie neurodegeneracji istnieje kilka sposobów, które skutecznie hamują zapalenie nerwów.Należą do nich małe cząsteczki i modulacja genetyczna za pomocą adenowirusów lub lentiwirusów. Jednak żaden z nich nie był w stanie w pełni zmniejszyć stanu zapalnego, szczególnie w dużych obszarach mózgu. Najważniejszym odkryciem, które udało nam się ustalić, jest to, że poprzez terapię komórkową jesteśmy w stanie spowolnić postęp choroby prionowej poprzez hamowanie zapalenia gleju.Zastosowanie połączonego z pierwotnym modelem choroby komórek glejowych pozwoli nam nadal pytać o komórkowe szlaki stresu ważne w neuroprotekcji, w bardziej efektywny i bezpośredni sposób niż stosowanie modeli wyłącznie in vivo.

adipose-derived-mesenchymal-stromal-cells-co-cultured-with-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym materiale przedstawiamy protokół hodowli neuronów korowych szczura w obecności warstwy zasilającej z gleju. Hodowane neurony wykazują polaryzację i tworzą synapsy; mogą zostać one oddzielone od gleju w celu wykorzystania w różnych zastosowaniach, takich jak elektrofizjologia, obrazowanie wapnia, testy przeżywalności komórek, immunocytochemia oraz izolacja RNA/DNA/białek.

Bilaminarna kokultura pierwotnych neuronów korowych i gleby szczura

Izolowanie pierwotnych mikroglejów z heterogenicznej populacji komórek mózgu jest niezbędne do zbadania ich roli w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Niniejszy protokół opisuje technikę mechanicznej izolacji i mieszanej hodowli komórkowej, która zapewnia wysoką wydajność oraz wysoką czystość żywych, pierwotnych komórek mikrogleju do badań in vitro i dalszych zastosowań.

Izolacja pierwotnych mikroglejów z mieszanych kultur komórek glejowych tkanki mózgu noworodka szczura

Komórki globoidalne są charakterystyczną cechą patologiczną choroby Krabbego, leukodystrofii, która obecnie nie ma skutecznej długoterminowej terapii. Opracowaliśmy model hodowli komórkowej w celu zbadania wrodzonej biologii i potencjału chorobotwórczego aktywowanego mikrogleju oraz jego transformacji w komórki globoidalne.

Model in vitro do badania patofizjologii komórkowej w leukodystrofii komórek globoidalnych

Zwoje korzenia grzbietowego (DRG) to struktury zawierające neurony czuciowe obwodowego układu nerwowego. Po dysocjacji mogą być hodowane wspólnie z komórkami macierzystymi pochodzącymi z tkanki tłuszczowej (ASC) podobnymi do SC, stanowiąc cenny model do badania regeneracji i mielinizacji nerwów in vitro, naśladując środowisko in vivo w miejscu urazu.

Neurony zwojów korzenia grzbietowego i zróżnicowane komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej: model wspólnej hodowli in vitro do badania regeneracji nerwów obwodowych

W organizmach wielokomórkowych wydzielane rozpuszczalne czynniki wywołują reakcje różnych typów komórek w wyniku sygnalizacji parakrynnej. Systemy kohodowli typu insert oferują prosty sposób oceny zmian, w których pośredniczą wydzielane czynniki rozpuszczalne przy braku kontaktu komórka-komórka.

Opracowanie systemu kohodowli inkubacyjnej dwóch typów komórek przy braku kontaktu komórka-komórka

Rozwój bólu neuropatycznego wiąże się z patologicznymi zmianami komórek glejowych rdzenia kręgowego. Brakuje niezawodnego systemu hodowli glejowej pochodzącego z dorosłej tkanki rdzenia kręgowego i przeznaczonego do badania tych komórek in vitro. Dlatego pokazujemy tutaj, jak ustalić pierwotne mieszane kultury glejowe z tkanki rdzenia kręgowego dorosłej myszy.

Przygotowanie pierwotnych mieszanych kultur glejowych z tkanki rdzenia kręgowego dorosłych myszy

Tutaj prezentujemy protokół hodowli 3D komórek glejowych pochodzących z mózgu szczura, w tym astrocytów, mikrogleju i oligodendrocytów. Pokazujemy pierwotną hodowlę komórkową, syntezę hydrożelu metakrylowanego kwasu hialuronowego (HAMA), fotopolimeryzację HAMAfotopolimeryzację i enkapsulację komórek oraz przetwarzanie próbek do konfokalnego i skaningowego obrazowania mikroskopem elektronowym.

Ulepszone hodowle hydrożelowe 3D pierwotnych komórek glejowych do modelowania in vitro zapalenia układu nerwowego

Przedstawiono protokół izolacji pierwotnego mikrogleju z mysich mózgów. Technika ta pomaga w pogłębieniu obecnego zrozumienia schorzeń neurologicznych. Wirowanie w gradiencie gęstości i separacja magnetyczna są połączone w celu uzyskania wystarczającej wydajności próbki o wysokiej czystości. Ponadto przedstawiamy etapy charakterystyki mikrogleju.

Charakterystyka i izolacja pierwotnego mikrogleju myszy za pomocą wirowania w gradifikacji gęstości

Tutaj prezentujemy protokół izolacji in vitro wielu populacji komórek glejowych z ośrodkowego układu nerwowego myszy. Metoda ta pozwala na segregację regionalnego mikrogleju, komórek prekursorowych oligodendrocytów i astrocytów w celu zbadania fenotypów każdego z nich w różnych systemach hodowli.

Rozwarstwienie i izolacja mysiego gleju z wielu regionów ośrodkowego układu nerwowego

Ten protokół opisuje kokulturę mikrogleju i neuronów utworzoną z pierwotnych komórek nerwowych wyizolowanych z embrionalnych zarodków myszy w 15-16 dniach embrionalnych oraz pierwotnego mikrogleju generowanego z mózgów nowonarodzonych myszy w 1-2 dniach po urodzeniu.

Generowanie i kokultura mysich pierwotnych mikrogleju i neuronów korowych

Poznaj metodę współhodowli mezenchymalnych komórek zrębowych z tkanki tłuszczowej z pierwotnym mieszanym glejem w celu zmniejszenia stanu zapalnego wywołanego prionami.

Mezenchymalne komórki zrębowe pochodzące z tkanki tłuszczowej współhodowane z pierwotnym mieszanym glejem w celu zmniejszenia stanu zapalnego wywołanego prionami (Wideo) | JoVE Journal

Mezenchymalne komórki zrębowe pochodzące z tkanki tłuszczowej współhodowane z pierwotnym mieszanym glejem w celu zmniejszenia stanu zapalnego wywołanego prionami

Przeglądaj więcej filmów