Name: Wykorzystanie eksplantatów ze skóry ptaków do badania wzorców tkanek i organogenezy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Poznaj metody eksplantatów skóry zarodkowej ptaków do badania wzorców tkanek i organogenezy. Techniki te pozwalają analizować procesy molekularne oraz komórkowe, wspierając rozwój medycyny regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez NIH NIAMS grant R37 AR 060306, R01 AR 047364 i RO1 AR078050. Prace są również wspierane przez umowę badawczą o współpracy między USC a Chińskim Uniwersytetem Medycznym na Tajwanie. Dziękujemy klasie USC BISC 480 Developmental Biology 2023 za pomyślne przetestowanie tego protokołu hodowli skóry ptaków podczas kilku modułów laboratoryjnych.

1. Hodowla eksplantatów skóry kurczaka (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
<ol>
	<li>Inkubuj zapłodnione jaja kurze w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 38 °C i ułóż je zgodnie z Hamburger i Hamilton14.
	<ol>
		<li>Na etapie 28 (~E5.5) drugi palec kończyny i trzeci palec u nogi są dłuższe od pozostałych; trzy palce u nóg i cztery palce u nóg są różne.</li>
		<li>Na etapie 29 (~E6) skrzydło jest zgięte w łokciu; drugi palec jest wyraźnie dłuższy od pozostałych.</li>
		<li>Na etapie 30 (~E6.5) na poziomie ramienia widoczne są dwa rzędy pąków piór grzbietowych po obu stronach rdzenia kręgowego, a trzy rzędy są widoczne na poziomie nóg.</li>
		<li>Na etapie 31 (~E7) znajduje się ~7 rzędów piór na poziomie jumbo-sakralnym.</li>
		<li>Na etapie 32 na poziomie nóg znajduje się jedenaście lub więcej rzędów pąków piór</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić zarodek kurczaka w stadium 28-32 na 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej buforowany roztwór soli Hanksa (HBSS) lub sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
	<ol>
		<li>Wypreparuj skórę grzbietową zarodka między dolną częścią szyi a obszarem ogona. Użyj nożyczek, aby zdjąć głowę z szyi. Delikatnie pociągnij pąki kończyn, aby ustawić brzuszną stronę ciała w dół, tak aby wyrostki rozchodziły się na zewnątrz.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie skóry od przodu do tyłu wzdłuż dwóch bocznych stron ciała zarodka za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich lub ostrych nożyczek sprężynowych. Pamiętaj, aby ustabilizować ciało za pomocą kleszczy, ściskając pąki kończyn wzdłużnie. Delikatnie obierz skórę od szyi do okolicy ogona lub od ogona do szyi za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie usuń tkanki podskórne, które pozostają przyczepione do złuszczonej skóry i wygładź krawędzie skóry ostrymi nożyczkami sprężynowymi.</li>
	<li>Dodaj 2 ml / studzienkę zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i roztworem penicyliny/streptomycyny (rozcieńczonym w stosunku 1:100) do studzienki w naczyniu 6-dołkowym. Po dodaniu pożywki i antybiotyków umieść sterylną wkładkę do hodowli tkankowej wewnątrz studzienki, tak aby pożywka znajdowała się na zewnątrz wkładki hodowlanej.</li>
	<li>Przenieś skórę szpatułką do wkładki hodowlanej naskórkiem skierowanym do góry i mezenchymą skierowaną w dół na membranie wkładki. Aby upewnić się, że skóra leży płasko bez zagnieceń, pociągnij skórę na szpatułkę w HBSS. Zsuń skórę ze szpatułki z płynem, aby ułatwić przenoszenie skóry bez fałdowania.</li>
	<li>Usunąć nadmiar HBSS z wkładki hodowlanej za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Pozostaw cienką warstwę HBSS wewnątrz wkładki hodowlanej, aby eksplant był częściowo mokry, aby zapewnić interfejs powietrze-ciecz.</li>
	<li>Inkubować skórę z eksplantatów w temperaturze 37 °C, używając 5% CO2 i 95% powietrza. Zmieniaj podłoże co 2 dni. 
	UWAGA: Ta procedura została opublikowana4. Ten system hodowli może być również stosowany ze skórą innych ptaków, takich jak kultury eksplantatów przepiórek lub zięb.</li>
</ol>
2. Rekombinacja nabłonkowo-mezenchymalna skóry kurczaka (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
<ol>
	<li>Inkubować zapłodnione jaja kurze w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 38 °C i etapować zarodki zgodnie z Hamburger and Hamilton14 (sekcja 1.1).</li>
	<li>Przygotuj 2x sól fizjologiczną bez wapnia i magnezu (CMF) z 0,25% buforem kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).
	<ol>
		<li>Przygotować 10x bufor CMF (NaCl (1,37 M) 80 g, KCl (0,04 M) 3 g, NaH2PO4 (0,004 M) 0,5 g, KH2PO4 (2 M) 0,25 g, NaHCO3 (0,12 M) 10 g, glukoza (0,1 M) 20 g w 1,000 ml wody destylowanej. Dostosuj pH do 7,3. Aby uzyskać 100 ml 2x CMF z 0,25% buforem EDTA, EDTA należy najpierw rozpuścić w 80 ml wody destylowanej, a następnie dodać 20 ml 10x buforu CMF, aby uzyskać 2x CMF z 0,25% roztworem roboczym EDTA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozciąć skórki grzbietowe zarodków kurczaków w stadium 30-32 w HBSS, jak opisano powyżej (sekcja 1.2) i inkubować je w 2x soli fizjologicznej CMF z 0,25% EDTA na lodzie przez 15-20 minut.</li>
	<li>Ostrożnie oddziel nabłonek i mezenchymę za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich. Przenieś oddzielony nabłonek i mezenchymę do czystego naczynia zawierającego HBSS.</li>
	<li>Ponownie połącz nabłonek z mezenchymą, najpierw umieszczając mezenchymę na szalce Petriego zawierającej HBSS, a następnie umieść nabłonek na mezenchymie. Umieść nabłonek wzdłuż tej samej osi przednio-tylnej co mezenchyma lub obróć nabłonek o 90o od osi przednio-tylnej mezenchymy, aby określić, który składnik reguluje różne aspekty morfogenezy skóry.</li>
	<li>Przenieś zrekombinowane skórki do wkładek hodowlanych w 6-dołkowych naczyniach hodowlanych w celu wzrostu i usuń nadmiar HBSS wokół zrekombinowanej skóry.</li>
	<li>Umieść 2 ml pożywki hodowlanej DMEM z 10% FBS w studzience na zewnątrz wkładki. Umieść cienką warstwę DMEM w komorze wkładania, aby eksplant był częściowo mokry, aby zapewnić interfejs powietrze-ciecz.</li>
	<li>Inkubować rekombinanty skóry w temperaturze 37 °C w mieszaninie 5% CO2 i 95% powietrza. Zmieniaj podłoże co 2 dni. Dokumentuj zmiany fenotypowe w początkowych fazach rozwoju skóry za pomocą fotografii poklatkowej za pomocą kamery zamontowanej na mikroskopie preparacyjnym. 
	UWAGA: Ta procedura została opublikowana11.</li>
</ol>
3. Rekonstrukcja skóry kurczaka (<silna klasa="xfig">Rysunek 3)
<ol>
	<li>Inkubować zapłodnione jaja kurze w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 38 °C i etapować zarodki zgodnie z Hamburger and Hamilton14 (sekcja 1.1).</li>
	<li>Wypreparuj skórę grzbietową zarodka kurczaka w stadium 30-33 w HBSS. Inkubować skórki w 2x soli fizjologicznej CMF z 0,25% EDTA na lodzie przez 15-20 minut, jak opisano powyżej (sekcja 2.3).</li>
	<li>Ostrożnie oddziel nabłonek i mezenchymę za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich. Przenieść oddzielony nabłonek i mezenchymę do HBSS na lodzie. 
	UWAGA: Uważaj, aby nie uszkodzić warstwy podstawnej nabłonka podczas oddzielania nabłonka od mezenchymy.</li>
	<li>Zebrać oddzieloną mezenchymę do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i inkubować z 0,1% roztworem kolagenazy/trypsyny przygotowanym w PBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10-15 minut.</li>
	<li>Odciąć mezenchymę skóry za pomocą pipety Pasteura, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Dodaj DMEM z 10% FBS, aby zatrzymać trawienie.</li>
	<li>Osadzać i odwirowywać komórki w ilości 233 × g przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki za pomocą pożywki hodowlanej o stężeniu 2 × 107 komórek/ml. 
	UWAGA: Na tym etapie komórki mezenchymalne można również ponownie zawiesić w pożywce zawierającej wirusa na 2-3 godziny na lodzie w celu transdukcji genów.</li>
	<li>Umieść wkładkę do hodowli komórkowej w jednym dołku 6-dołkowego naczynia. Upuść 10 μl z 2 × 107 komórek/ml komórek mezenchymalnych na wkładkę do hodowli tkankowej. Umieścić 2 ml pożywki hodowlanej DMEM z 10% FBS w dołku na zewnątrz wkładki. Inkubować posiane komórki mezenchymalne w temperaturze 37 °C przy użyciu inkubatora z 5% CO2 i 95% powietrzem przez 1 godzinę, aby umożliwić komórkom osadzenie się na membranie wprowadzanej.</li>
	<li>Przenieść nienaruszony nabłonek na wierzch posianej kropli mezenchymalnej warstwą komórek podstawnych nabłonka skierowaną w stronę komórek mezenchymalnych za pomocą pipety o pojemności 1 ml. 
	UWAGA: Podczas przenoszenia nabłonka do kropli mezenchymalnej nie należy naruszać komórek mezenchymalnych.</li>
	<li>Spłaszcz nienaruszony nabłonek nad mezenchymią, aby odtworzyć eksplantat skóry. Pozostaw cienką warstwę podłoża na wkładce, aby odtworzony eksplant skóry był półmokry, aby zapewnić granicę powietrzno-cieczową. Odtworzony eksplant skóry inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 i 95% powietrza. Zmieniaj podłoże co 2 dni. 
	UWAGA: Ta procedura została opublikowana13.</li>
</ol>

A Comprehensive Review of Avian Embryonic Skin Explant Culture Protocols

<ol><li>Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLucas%2C+AM+%22Agriculture+Handbook%22">Agriculture Handbook</a>. 362, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Washington D.C.. (1972).</li>
<li>Sengel, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSengel%2C+P+%22In+Morphogenesis+of+Skin%2C+l-277%22">In Morphogenesis of Skin, l-277</a>. , Cambridge Univ. Press. New York. (1976).</li>
<li>Dhouailly, D., Wilehm Roux, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+cutaneous+appendages+in+dermo-epidermal+recombinations+between+reptiles%2C+birds+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Formation of cutaneous appendages in dermo-epidermal recombinations between reptiles, birds and mammals.</a> Archives of Developmental Biology. 177 (4), 323-340 (1975).</li>
<li>Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+feather+morphogenesis%3A+I.+Analyses+with+antibodies+to+Adhesion+Molecules+Tenascin%2C+N-CAM+and+Integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of feather morphogenesis: I. Analyses with antibodies to Adhesion Molecules Tenascin, N-CAM and Integrin.</a> Developmental Biology. 150 (1), 82-98 (1992).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+organs+by+a+Wnt+%2F+Notch+%2F+non-muscle+myosin+module+which+orients+feather+bud+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Shaping organs by a Wnt / Notch / non-muscle myosin module which orients feather bud elongation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110 (16), E1452-E1461 (2013).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+oscillations+coordinate+feather+mesenchymal+cell+movement+by+SHH+dependent+modulation+of+gap+junction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Calcium oscillations coordinate feather mesenchymal cell movement by SHH dependent modulation of gap junction networks.</a> Nature Communications. 9 (1), 5377(2018).</li>
<li>Ting-Berreth, S. A., Chuong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+delivery+of+TGF+beta2+can+restore+epithelium+dependent+organization+of+mesenchymal+condensation+during+skin+appendage+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Local delivery of TGF beta2 can restore epithelium dependent organization of mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis.</a> Developmental Biology. 179 (2), 347-359 (1996).</li>
<li>Widelitz, R. B., Jiang, T. -X., Noveen, A., Chen, C. -W. J., Chuong, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+induces+new+feather+buds+from+developing+avian+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigation+Dermatology%22%5BJournal%5D)">FGF induces new feather buds from developing avian skin.</a> Journal of Investigation Dermatology. 107 (6), 797-803 (1996).</li>
<li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+interactions+in+scale+and+feather+development+as+studies+in+dermal-epidermal+recombinations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Tissue interactions in scale and feather development as studies in dermal-epidermal recombinations.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 11, 765-789 (1963).</li>
<li>McAleese, S. R., Sawyer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+the+phenotype+of+the+epidermis+from+chick+embryos+homozygous+for+the+gene+scaleless+%28sc%2Fsc%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Correcting the phenotype of the epidermis from chick embryos homozygous for the gene scaleless (sc/sc).</a> Science. 214 (4524), 1033-1034 (1981).</li>
<li>Chuong, C. M., Widelitz, R. B., Ting-Berreth, S., Jiang, T. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+events+during+avian+skin+appendage+regeneration%3A+dependence+on+epithelial-mesenchymal+interaction+and+order+of+molecular+reappearance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Early events during avian skin appendage regeneration: dependence on epithelial-mesenchymal interaction and order of molecular reappearance.</a> J Invest Dermatol. 107 (4), 639-646 (1996).</li>
<li>Jiang, T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+feather+orientations+changed+by+electric+current%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Global feather orientations changed by electric current.</a> iScience. 24 (6), 102671(2021).</li>
<li>Jiang, T. X., Jung, H. S., Widelitz, R. B., Chuong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+periodic+patterns+by+dissociated+feather+mesenchymal+cells+and+the+regulation+of+size%2C+number+and+spacing+of+primordia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Self-organization of periodic patterns by dissociated feather mesenchymal cells and the regulation of size, number and spacing of primordia.</a> Development. 126 (22), 4997-5009 (1999).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 188, 49-92 (1951).</li>
<li>Chen, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+early+odontogenic+signaling+pathway+in+Aves%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Conservation of early odontogenic signaling pathway in Aves.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 97 (18), 10044-10049 (2000).</li>
<li>Chuong, C. -M., Ting, S. A., Widelitz, R. B., Lee, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Skin+Morphogenesis%3A+II.+Retinoic+acid+gradient+modulates+axis+orientation+and+phenotypes+of+skin+appendages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Skin Morphogenesis: II. Retinoic acid gradient modulates axis orientation and phenotypes of skin appendages.</a> Development. 115 (3), 839-852 (1992).</li>
<li>Noveen, A., Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+A+and+protein+kinase+C+modulators+have+reciprocal+effects+on+mesenchymal+condensation+during+skin+appendage+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein kinase A and protein kinase C modulators have reciprocal effects on mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis.</a> Developmental Biology. 171 (2), 677-693 (1995).</li>
<li>Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+biological+networks+via+adaptive+patterning+revealed+by+avian+intradermal+muscle+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of biological networks via adaptive patterning revealed by avian intradermal muscle network formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 116 (22), 10858-10867 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Rekombinacja tkanek zapewnia test do zbadania unikalnego wkładu nabłonka i mezenchymy. U kurcząt pióra zaczynają się rozwijać w 7 dniu embrionalnym (E7), podczas gdy łuski zaczynają się w E9. Kiedy mezenchyma w skali E9 jest rekombinowana z nabłonkiem piór E7, zrekombinowana tkanka tworzy łuski, a gdy mezenchyma piór E7 jest rekombinowana z nabłonkiem w skali E9, powstają pióranabłonka 11. Badania te wykazały, że mezenchyma kontroluje formację wzorca, odstępy i tożsamość narządu. Oczywiście nabłon...

Rozwój skóry ptasiego zarodka jest doskonałym modelem do badania mechanizmów morfogenezy ze względu na wyraźne wzorce i dostępność do mikrochirurgii i manipulacji1,2. Jednak ocena zdarzeń komórkowych i molekularnych w nienaruszonych tkankach może być trudna, ponieważ obecność obcych tkanek może komplikować obserwacje mikroskopowe. Co więcej, możliwość manipulowania ekspresją genów w celu zbadania ich roli w morfogenezie skóry nie zawsze jest prostym zadaniem. Odkryliśmy, że możemy testować funkcje genów za pomocą transdukcji retrowirusowej z wyższym wskaźnikiem powodzenia przy użyciu modeli eksplantatów skóry. Tutaj omawiamy zalety trzech opracowanych modeli eksplantacji skóry.
Hodowla embrionalnej skóry ptaków to potężny system do oceny zachowania komórek, regulacji genów i funkcji podczas rozwoju pąków piór skóry3,4,5,6. Pozwala na ocenę molekularnych mechanizmów rozwoju pąków piór poprzez globalne dodawanie czynników wzrostu umieszczonych w pożywkach hodowlanych lub ich lokalne uwalnianie z kulek pokrytych czynnikiem wzrostu. Rozwojowymi genami regulatorowymi można również manipulować za pomocą transdukcji genów wirusa w nienaruszonych lub dominujących formach ujemnych do badań funkcjonalnych oceniających ich rolę w określonych zdarzeniach morfogenetycznych 7,8.
Kultura rekombinacji nabłonkowo-mezenchymalnej ptaków umożliwia badaczom określenie udziału każdego składnika skóry we wczesnych stadiach morfogenezy skóry. Zastosowanie tego podejścia przez Rawlesa ujawniło, że interakcje między mezenchymą a nabłonkiem są niezbędne do tworzenia przydatków skóry9. Mezenchyma może tworzyć kondensacje, a nabłonek jest potrzebny do indukowania i utrzymywania mezenchymalnych formacji kondensacji2. Później podejście to wykorzystano do oceny, dlaczego kurczaki bezłuskowe nie tworzą piór. Odkryto, że wada występuje w mesenchyme10. Dhouailly przeprowadził badania rekombinacji tkankowo-mezenchymalnej na zarodkach różnych gatunków. Badania te dostarczyły rozwojowych i ewolucyjnych informacji na temat komunikacji nabłonkowo-mezenchymalnej, która sprzyja morfogenezie skóry3.
To badanie zostało wykorzystane do lepszego zrozumienia czynników kontrolujących wzrost piór. Metoda poprawia również wizualizację zdarzeń komórkowych i molekularnych związanych z modelowaniem skóry, które mają miejsce podczas inicjacji, rozwoju i wydłużania piór wzdłuż osi przednio-tylnej. Kiedy nabłonek zostanie oddzielony od mezenchymy, a następnie oba składniki zostaną ponownie połączone, nowe interakcje przywracają wzór skóry. Takie podejście pozwala nam ocenić mezenchymalne sygnały indukujące i cząsteczki kompetencji nabłonkowej, które umożliwiają naskórkowi reagowanie na sygnały mezenchymalne11. Można również zbadać późniejszą ekspresję molekularną, która jest wymagana do rozwoju pąków piór i tworzenia wzoru. Badania te wykazały, że lokalizacja pąków jest kontrolowana przez mezenchymę. Rotacja nabłonka o 90o przed rekombinacją z mezenchymą pokazuje, że kierunek wydłużania się pąków piór jest kontrolowany przez nabłonek. Ta metoda była dla nas niezbędna do zbadania mechanizmu molekularnego regulującego orientację pąków piór12.
Kultura rekonstytucji ptasiej skóry, w której mezenchyma skóry jest dysocjowana na pojedyncze komórki przed posiewem o dużej gęstości komórek i pokryta nienaruszonym nabłonkiem, resetuje komórki skóry właściwej do stanu pierwotnego. Następnie eksplant samoorganizuje się, tworząc nowy okresowy wzorzec niezależny od poprzednich cues13. Ten model rekonstytucji skóry może być wykorzystany do badania początkowych procesów okresowego modelowania piór. Zastosowaliśmy to podejście, aby zbadać, w jaki sposób modulowanie stosunku komórek mezenchymalnych do pojedynczego fragmentu nabłonka może wpływać na rozmiar lub liczbę pąków piór. Stwierdzono, że liczba pąków wzrosła, ale nie wielkość pąków, ponieważ zwiększył się stosunek komórek mezenchymalnych. Kolejną zaletą tego podejścia jest to, że transdukcja wirusa w komórkach mezenchymalnych wykazuje wyższą skuteczność niż w pozostałych dwóch warunkach hodowli i może wytwarzać bardziej oczywiste fenotypy.

<table><tbody><tr><td>Naczynie do hodowli 6 dołków&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>REF 353502</td><td>Kultury na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) &nbsp;</td></tr><tr><td>Wkładka do hodowli komórkowych&nbsp;</td><td>Sokół</td><td>REF 353090.</td><td>0,4 &mikro; m Przezroczysta membrana PET</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu 1</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s średni&nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>4,5 g/L glukozy</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól disodowa dwuwodna (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>ThermoFisher</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' s buforowany roztwór soli</td><td>Gibco</td><td>14170-112</td><td>Bez wapnia, bez magnezu</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan pogassium monobasic (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (Nacl)</td><td>EMD&nbsp;</td><td>CAS 7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy (NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Gibco</td><td>27250-042</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie eksplantatów ze skóry ptaków do badania wzorców tkanek i organogenezy

Using Avian Skin Explants to Study Tissue Patterning and Organogenesis

Rozwijająca się skóra ptaków podczas embriogenezy to unikalny model, który może dostarczyć cennych informacji na temat wzorców tkanek. Opisano tutaj trzy warianty kultur eksplantatów skóry w celu zbadania różnych aspektów rozwoju skóry. Po pierwsze, hodowle narządów ex vivo i manipulacje nimi dają naukowcom możliwość bezpośredniej obserwacji i badania rozwoju pąków piór. Hodowla eksplantatów skóry może rosnąć przez 7 dni, umożliwiając bezpośrednią analizę zachowania komórek i obrazowanie 4D w odstępach czasu w tym okresie wzrostu. Pozwala to również na fizyczne i molekularne manipulacje warunkami hodowli w celu wizualizacji odpowiedzi tkanek. Na przykład koraliki pokryte czynnikiem wzrostu mogą być stosowane miejscowo, aby wywołać zmiany w układzie piór na ograniczonym obszarze. Alternatywnie, transdukcja wirusa może być dostarczana globalnie w pożywce hodowlanej w celu zwiększenia lub zmniejszenia ekspresji genów. Po drugie, protokół rekombinacji skóry pozwala naukowcom badać interakcje tkankowe między naskórkiem a mezenchymą, które pochodzą z różnych regionów skóry, różnych etapów życia lub różnych gatunków. Daje to możliwość przetestowania okna czasowego, w którym nabłonek jest kompetentny do reagowania na sygnały i jego zdolności do tworzenia różnych przydatków skóry w odpowiedzi na sygnały z różnych źródeł mezenchymalnych. Po trzecie, rekonstytucja skóry za pomocą zdysocjowanych komórek skóry właściwej pokrytych nienaruszonym nabłonkiem resetuje rozwój skóry i umożliwia badanie początkowych procesów okresowego wzorcowania. Takie podejście zwiększa również naszą zdolność do manipulowania ekspresją genów wśród zdysocjowanych komórek przed utworzeniem odtworzonego eksplantatu skóry. W tym artykule przedstawiono trzy protokoły hodowli i przykładowe eksperymenty, aby wykazać ich użyteczność.

Hodowle eksplantów skóry 
Rozwój zawiązków piór w hodowlach organów skóry ex vivo można bezpośrednio obserwować pod mikroskopem. W modelu hodowli eksplantów skóry grzbietowej kurcząt w stadium 30. placody są widoczne wzdłuż linii środkowej. Front morfogenetyczny rozprzestrzenia się następnie stopniowo bocznie w stronę obwodu skóry, prowadząc do tworzenia się nowych prymordiów piór. Prymordia te rozwiną się w krótkie zawiązki piór po 2 dniach hodowli oraz w długie zawiązki piór po 4 dniach hod...

Tutaj opisujemy protokoły dla trzech typów hodowli eksplantatów skóry embrionalnej ptaków, które mogą być użyte do badania interakcji tkankowych, obrazowania 4D filmu poklatkowego (3D plus czas), globalnych lub lokalnych zaburzeń funkcji molekularnych oraz charakterystyki biologii systemów.

Wykorzystanie eksplantatów ze skóry ptaków do badania wzorców tkanek i organogenezy

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin ...

Celem badawczym mojego zespołu badawczego jest zrozumienie rozwoju i regeneracji tkanek. Cel ten jest szczególnie ważny w dzisiejszych badaniach nad komórkami macierzystymi. Mamy nadzieję, że zrozumiemy zasady, jak kształtuje się narząd, a ta wiedza nie tylko pomoże nam zrozumieć naturę, ale może być również zastosowana w medycynie regeneracyjnej.Wyzwaniem, przed którym stoimy, jest zrozumienie procesu molekularnego i komórkowego zaangażowanego w te procesy morfogenetyczne. Dlatego musimy mieć system hodowli eksplantatów, aby dokładnie analizować procesy molekularne i komórkowe, ponieważ nie jest to możliwe in vivo. Aby wypełnić tę lukę w wiedzy, naukowcy opracowali różne sposoby hodowli organoidów.W hodowli organoidów będziemy mogli nagrywać zbiorowe ruchy komórek, aby zobaczyć, jak komórki oddziałują ze sobą. Jesteśmy również w stanie manipulować komórkami tak, aby wyrażały różne cząsteczki, aby przetestować funkcję cząsteczek. Unikalnym podejściem, które stosujemy, jest kultura eksplantatów ze skóry kurczaka.Skóra kurczaka jest używana, ponieważ są one łatwo dostępne z jaja i tworzą wyraźne pióro, ale ułożone w sześciokątny wzór jako odczyt wzorów tkankowych. Są trzy sposoby, w jakie tworzymy kulturę, jak zobaczysz. Jednym z nich jest to, w jaki sposób hodowla eksplantatów pozwala nam robić filmy lub dostarczać cząsteczki, aby zakłócić system.Po drugie, aby zbadać wkład epicilii lub mezenchymy, możemy je rozebrać i włożyć z powrotem. Po trzecie, aby jeszcze bardziej sprawdzić zdolność każdej komórki, rozdzielamy je na pojedyncze komórki i testujemy, w jaki sposób wracają, aby zreorganizować się we wzorce tkankowe. Dzięki tym podejściu, byliśmy w stanie zdobyć nową wiedzę na temat wzorców tkankowych.Na początek wysiaduj zapłodnione jaja kurze w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 38 stopni Celsjusza. Następnie umieść zarodek kurczaka w wieku od 28 do 32 lat na 60-milimetrowej szalce Petriego wypełnionej HBSS. Po wypreparowaniu grzbietowej skóry i głowy zarodka, delikatnie pociągnij zawiązki kończyn, aby przesunąć brzuszną stronę ciała w dół.Teraz wzdłuż dwóch stron ciała zarodka wykonaj nacięcie przednie do tylnego. Chwyć pąki kończyn wzdłużnie za pomocą kleszczy, aby ustabilizować ciało. Użyj kleszczy zegarmistrzowskich, aby ostrożnie oderwać skórę od szyi w dół do okolicy ogona.Ostrymi nożyczkami delikatnie usuń wszelkie pozostałe tkanki podskórne nadal przyczepione do złuszczonej skóry i wygładź krawędzie skóry. Następnie dodaj dwa mililitry uzupełnionego DMEM do każdej studzienki sześciodołkowego naczynia. Po dodaniu antybiotyków do studzienek umieść sterylną wkładkę do hodowli tkankowej wewnątrz studzienki, upewniając się, że podłoże otacza zewnętrzną część wkładki hodowlanej.Następnie przenieś skórę na szpatułkę zanurzoną w HBSS, aby zapobiec marszczeniu się i fałdowaniu. Po zakończeniu przenieś wyciętą skórę do naczynia zawierającego HBSS. Powoli zsuń skórę ze szpatułki na wkładkę hodowlaną bez składania.Za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów usuń nadmiar HBSS z wkładu. Na koniec inkubuj kultury eksplantatów skóry w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszanką 5% dwutlenku węgla i 95% powietrza. Wymieniaj pożywkę co dwa dni.Zawiązki piór rozwinęły się w krótkie pąki piór po dwóch dniach w hodowli, a długie pąki piór rozwinęły się po czterech dniach w hodowli. Kody płytki skórnej były bardziej dojrzałe w linii środkowej niż po bokach. Na początek wysiaduj zapłodnione jaja kurze w nawilżanym inkubatorze.Następnie przygotuj dwukrotnie sól fizjologiczną CMF z buforem 0,25% EDTA. Następnie oderwij zarodki kurczaka ze skóry w roztworze HBSS i inkubuj je w dwukrotnym roztworze CMF-EDTA na lodzie przez 15 do 20 minut. Użyj kleszczy zegarmistrzowskich, aby ostrożnie oddzielić nabłonek i mezenchymę.Następnie przenieś wyizolowany nabłonek i mezenchymę do jednego czystego naczynia zawierającego HBSS. W celu rekombinacji umieść mezenchymę na szalce Petriego zawierającej HBSS. Następnie umieść na nim nabłonek, wyrównując go wzdłuż osi przednio-tylnej mezenchymy.Alternatywnie obróć nabłonek o 90 stopni od mezenchymalnej osi przednio-tylnej. Następnie przenieś zrekombinowane skórki do wkładek hodowlanych w sześciodołkowych naczyniach hodowlanych. Usuń nadmiar HBSS otaczający rekombinowaną skórę.Po dodaniu DMEM zawierającego 10% FBS do zewnętrznej studzienki wkładki, należy odpipetować cienką warstwę DMEM do komory wkładki, upewniając się, że eksplant pozostaje częściowo uwodniony. Na koniec umieść rekombinanty skóry w inkubatorze w temperaturze 37 stopni w środowisku zawierającym 5% dwutlenku węgla i 95% powietrza. Monitoruj zmiany fenotypowe w początkowych fazach rozwoju skóry za pomocą fotografii poklatkowej z zamontowanym mikroskopem preparacyjnym.Nowe kody płytki nazębnej pojawiły się wkrótce po rekombinacji i rozwinęły się w krótkie pąki piór dwa dni po rekombinacji. Długie pąki piór rozwinęły się w ciągu czterech dni. Kiedy nabłonek został obrócony o 90 stopni, orientacja nowych pąków została określona przez nabłonek.Na początek wysiaduj zapłodnione jaja kurze w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 38 stopni Celsjusza. Teraz przeprowadź sekcję skórek grzbietowych zarodków kurczaka w stadium od 30 do 33 w HBSS, a następnie inkubuj skórki w dwukrotnie roztworze soli fizjologicznej bez wapnia i magnezu z 0,25% EDTA przez 15 do 20 minut. Ostrożnie oddzielić nabłonek i mezenchymę za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich i przenieść oddzielony materiał do HBSS umieszczonego na lodzie.Zbierz oddzieloną mezenchymę do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i dodaj dwa mililitry 0,1% trypsyny kolagenazy wyprodukowanej w PBS. Następnie inkubuj roztwór w łaźni wodnej. Następnie użyj pipety Pasteura, aby rozproszyć mezenchymę skóry w zawiesinie jednokomórkowej.Następnie dodaj osiem mililitrów DMEM zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej, aby zatrzymać trawienie. Odwirować komórki w temperaturze 233G przez pięć minut, a następnie ponownie zawiesić osad w pożywce hodowlanej. Następnie umieść wkładkę do hodowli komórkowej w studzience z sześciodołkowym naczyniem.Upuść 10-mikrolitrową kroplę komórek mezenchymalnych na wkładkę. W studzience na zewnątrz wkładki odpipetować dwa mililitry DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą. Inkubuj posiane komórki w temperaturze 37 stopni w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla i 95% powietrzem przez godzinę.Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra przenieś nienaruszony nabłonek na wierzch platerowanej kropli mezenchymalnej. Spłaszcz nienaruszony nabłonek nad mezenchymą, aby utworzyć odtworzony eksplantat skóry. Pozostaw cienką warstwę podłoża na wkładce, aby skóra była na wpół mokra, zapewniając interfejs powietrzno-płynny.Inkubuj odtworzony eksplant skóry w temperaturze 37 stopni w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla i 95% powietrzem. Hodowle narządów ex vivo wydają się początkowo jednorodne. Krótkie pąki piór powstały po dwóch do trzech dniach w kulturze, a długie pąki piór powstały po czterech do pięciu dniach w kulturze.

using-avian-skin-explants-to-study-tissue-patterning-and-organogenesis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym artykule przedstawiamy prostą metodologię umożliwiającą długotrwałą hodowlę embrionów ptaków ex-ovo. Technika ta jest idealna do eksperymentów podłużnych, które wymagają pełnej dostępności optycznej i/lub sterylnego transportu embrionów ptaków.

System hodowli embrionów kurzych ex-ovo odpowiedni do obrazowania i zastosowań mikrochirurgicznych

W niniejszym artykule opisano technikę transplantacji tkanek, która została opracowana w celu zbadania właściwości sygnalizacyjnych i wzorowania powierzchniowego ektodermy głownej podczas rozwoju kraniofacjalnego.

Ocena właściwości sygnalizacyjnych nabłonków ektodermalnych podczas rozwoju kraniofacjalnego

Ten artykuł przedstawia zaktualizowane podejście do klasycznego systemu chimery kury przepiórczej do badania formowania się narządów, poprzez połączenie nowatorskich procedur eksperymentalnych in vitro i in ovo.

Dwuetapowe podejście do badania wczesnych i późnych etapów powstawania narządów w modelu ptasim: paradygmat organogenezy grasicy i przytarczyc

Tutaj prezentujemy protokół hodowli organotypowej do hodowli embrionalnych organów kurczaka in vitro. Za pomocą tej metody można badać rozwój zarodkowej tkanki kurczaka, przy zachowaniu wysokiego stopnia kontroli nad środowiskiem hodowli.

Metoda hodowli organotypowej do badania rozwoju zarodkowych tkanek kurczaka

Ten artykuł przedstawia metodę izolowania czystych tkanek embrionalnych z zarodków przepiórek i kurczaków, które mogą być łączone w celu utworzenia chimerycznych organów ex vivo.

Izolacja tkanek embrionalnych i tworzenie chimerycznych narządów przepiórki i kurczaka na przykładzie grasicy

Ten artykuł opisuje technikę przeszczepu tkanek, która została zaprojektowana w celu przetestowania właściwości sygnalizacyjnych i wzorcowych podstawy przodomózgowia podczas rozwoju twarzoczaszki.

Tworzenie ptasich chimer przodomózgowia w celu oceny rozwoju twarzy

Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.

Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków

Zarodek Xenopus laevis nadal jest wyjątkowo przydatny w badaniach nad wczesnym rozwojem, ze względu na jego duży rozmiar i łatwość manipulacji.   Przewidziano uproszczony protokół hybrydyzacji całego montażu in situ, który można wykorzystać do identyfikacji określonych narządów w tym modelowym systemie.

Zrozumienie wczesnej organogenezy przy użyciu uproszczonego protokołu hybrydyzacji in situ u Xenopus

Keratocyty danio pręgowanego migrują w arkuszach komórkowych z eksplantatów i dostarczają modelu in vitro do badania mechanizmów zbiorowej migracji komórek w kontekście gojenia się ran nabłonkowych. Protokoły te szczegółowo opisują skuteczny sposób ustanawiania pierwotnych kultur eksplantatów do wykorzystania w zbiorczych testach migracji komórek.

Eksplantaty keratocytów danio pręgowanego w celu zbadania zbiorowej migracji komórek i reepitelializacji w gojeniu się ran skórnych

Hodowla pionowych kropelek ex vivo jest alternatywą dla obecnych technik eksperymentalnych in vitro i in vivo. Protokół ten jest łatwy do wykonania i wymaga mniejszych ilości odczynnika, a jednocześnie umożliwia manipulowanie i badanie unaczynienia, morfogenezy i organogenezy płodu.

Wykorzystanie ex vivo pionowych kultur kropelkowych całych narządów płodu do badania procesów rozwojowych podczas organogenezy myszy

Poznaj metody eksplantatów skóry zarodkowej ptaków do badania wzorców tkanek i organogenezy. Techniki te pozwalają analizować procesy molekularne oraz komórkowe, wspierając rozwój medycyny regeneracyjnej.

Wykorzystanie eksplantatów ze skóry ptaków do badania wzorców tkanek i organogenezy

Przeglądaj więcej filmów