Name: Badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T12:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Poznaj metodę LC-TIMS-ToF MS/MS do analizy modyfikacji histonów z 95% wydajnością ekstrakcji. Technika ta umożliwia skuteczne rozdzielanie izomerów peptydowych i identyfikację pozycji modyfikacji potranslacyjnych w badaniach epigenetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten materiał jest oparty na pracy wspieranej przez National Science Foundation w ramach grantu nr. HRD-1547798 i nr grantu HRD-2111661. Granty NSF zostały przyznane Florida International University w ramach programu Centers of Research Excellence in Science and Technology (CREST). Jest to wkład numer 1672 z Institute of Environment, wybitnego programu na Florida International University. Dodatkowego wsparcia udzielił Narodowy Instytut Zdrowia w ramach Grantu nr Piłsudskiego. R21AI135469 Francisco Fernandez-i Grant No. R01HD106051 Benjaminowi A. Garcii, a także przez National Science Foundation w ramach grantu nr CHE-2127882 do Benjamina A. Garcii. Autorzy chcieliby podziękować za początkowe wsparcie dr Mario Gomeza Hernandeza podczas początkowego rozwoju metody.

Histone Proteomic Analysis and Post-Translational Modification Characterization

<ol><li>Zhao, Z., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+modifications+of+histones+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic modifications of histones in cancer.</a> Genome Biology. 20, 245(2019).</li>
<li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li>
<li>Bentley, G. A., Lewit-Bentley, A., Finch, J. T., Podjarny, A. D., Roth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+16+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 16 Å resolution.</a> Journal of Molecular Biology. 176 (1), 55-75 (1984).</li>
<li>Kornberg, R. D., Thomas, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure%3A+Oligomers+of+the+histones%3A+The+histones+comprise+an+%28F2A1%292%28F3%292+tetramer%2C+a+different+oligomer+of+F2A2+and+F2B%2C+and+monomer+of+F1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure: Oligomers of the histones: The histones comprise an (F2A1)2(F3)2 tetramer, a different oligomer of F2A2 and F2B, and monomer of F1.</a> Science. 184 (4139), 865-868 (1974).</li>
<li>Borghini, A., Cervelli, T., Galli, A., Andreassi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+modifications+in+atherosclerosis%3A+From+the+past+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">DNA modifications in atherosclerosis: From the past to the future.</a> Atherosclerosis. 230 (2), 202-209 (2013).</li>
<li>Jeanne Dit Fouque, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BDouble-Down%26%2334%3B+mass+spectrometry+of+histone+H4+proteoforms%3A+Tandem+ultraviolet-photon+and+mobility%2Fmass-selected+electron+capture+dissociations%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">34;Double-Down&#34; mass spectrometry of histone H4 proteoforms: Tandem ultraviolet-photon and mobility/mass-selected electron capture dissociations.</a> Analytical Chemistry. 94 (44), 15377-15385 (2022).</li>
<li>Lawrence, M., Daujat, S., Schneider, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+thinking%3A+How+histone+modifications+regulate+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Lateral thinking: How histone modifications regulate gene expression.</a> Trends in Genetics. 32 (1), 42-56 (2016).</li>
<li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+accumulation-serial+fragmentation+%28PASEF%29%3A+Multiplying+sequencing+speed+and+sensitivity+by+synchronized+scans+in+a+trapped+ion+mobility+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF): Multiplying sequencing speed and sensitivity by synchronized scans in a trapped ion mobility device.</a> Journal of Proteome Research. 14 (12), 5378-5387 (2015).</li>
<li>Chernushevich, I. V., Loboda, A. V., Thomson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+quadrupole-time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">An introduction to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 36 (8), 849-865 (2001).</li>
<li>Andrews, G. L., Simons, B. L., Young, J. B., Hawridge, A. M., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+characteristics+of+a+new+hybrid+quadrupole+time-of-flight+tandem+mass+spectrometer+%28TripleTOF+5600%29%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Performance characteristics of a new hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer (TripleTOF 5600).</a> Analytical Chemistry. 83 (13), 5442-5446 (2011).</li>
<li>Bhanu, N. V., Sidoli, S., Garcia, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Workflow+for+ultra-rapid+analysis+of+histone+posttranslational+modifications+with+direct-injection+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">A Workflow for ultra-rapid analysis of histone posttranslational modifications with direct-injection mass spectrometry.</a> Bio-Protocol. 10 (18), e3756(2020).</li>
<li>Xue, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+serum+biomarkers+for+pancreatic+adenocarcinoma+using+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Discovery of serum biomarkers for pancreatic adenocarcinoma using proteomic analysis.</a> British Journal of Cancer. 103 (3), 391-400 (2010).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversed-phase+chromatography+with+multiple+fraction+concatenation+strategy+for+proteome+profiling+of+human+MCF10S+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10S cells.</a> Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).</li>
<li>Mertins, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+proteomic+analysis+of+posttranslational+modifications+by+serial+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Integrated proteomic analysis of posttranslational modifications by serial enrichment.</a> Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2012).</li>
<li>Meier, F., Park, M. A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapped+ion+mobility+spectrometry+and+parallel+accumulation-serial+fragmentation+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100138(2021).</li>
<li>Romson, J., Emmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+calibration+options+for+accurate+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Mass calibration options for accurate electrospray ionization mass spectrometry.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 467, 11619(2021).</li>
<li>Dupree, E. J., Jayathirtha, M., Yorkie, H., Mihasan, M., Petre, B. A., Darie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+review+of+bottom-up+proteomics%3A+The+good%2C+the+bad%2C+and+the+future+of+this+field%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomes%22%5BJournal%5D)">A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field.</a> Proteomes. 8 (3), 14(2020).</li>
<li>Ho, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+structural+proteomics%3A+cryoEM+of+protein+complexes+enriched+from+the+cellular+milieu%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu.</a> Nature Methods. 17 (1), 79-85 (2020).</li>
<li>Eickbush, T., Moudrianakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+core+complex%3A+an+octamer+assembled+by+two+sets+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The histone core complex: an octamer assembled by two sets of protein-protein interactions.</a> Biochemistry. 17 (23), 4955-4964 (1978).</li>
<li>Sadakierska-Chudy, A., Filip, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+view+of+the+epigenetic+landscape.+Part+II%3A+Histone+posttranslational+modification%2C+nucleosome+level%2C+and+chromatin+regulation+by+ncRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicity+Research%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive view of the epigenetic landscape. Part II: Histone posttranslational modification, nucleosome level, and chromatin regulation by ncRNAs.</a> Neurotoxicity Research. 27 (2), 172-197 (2015).</li>
<li>Tan, H. T., Low, J., Lim, S. G., Chung, M. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+autoantibodies+as+biomarkers+for+early+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection.</a> The FEBS Journal. 276 (23), 6880-6904 (2009).</li>
<li>Huang, R. X., Zhou, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response+pathways+and+targets+for+radiotherapy+sensitization+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">DNA damage response pathways and targets for radiotherapy sensitization in cancer.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 60(2020).</li>
<li>Dantuma, N. P., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+regulation+of+posttranslational+modifications+in+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal regulation of posttranslational modifications in the DNA damage response.</a> The EMBO Journal. 35 (1), 6-23 (2016).</li>
<li>Tanner, S., Pevzner, P. A., Bafna, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unrestrictive+identification+of+posttranslational+modifications+through+peptide+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Unrestrictive identification of posttranslational modifications through peptide mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 1 (1), 67-72 (2006).</li>
<li>Dolan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC+column+problems+everywhere+1%5BTitle%5D)+AND+%22LCGC+North+America%22%5BJournal%5D)">LC column problems everywhere 1.</a> LCGC North America. 28 (9), 500-504 (2015).</li>
<li>Brusniak, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+current+bioinformatic+solutions+for+analyzing+LC-MS+data+acquired+by+selected+reaction+monitoring+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">An assessment of current bioinformatic solutions for analyzing LC-MS data acquired by selected reaction monitoring technology.</a> Proteomics. 12 (8), 1176-1184 (2012).</li>
<li>Cham, J. A., Bianco, L., Bessant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+computational+resources+for+designing+selected+reaction+monitoring+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Free computational resources for designing selected reaction monitoring transitions.</a> Proteomics. 10 (6), 1106-1126 (2010).</li>
<li>Colangelo, C. M., Chung, L., Bruce, C., Cheung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+software+tools+for+design+and+analysis+of+large+scale+MRM+proteomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Review of software tools for design and analysis of large scale MRM proteomic datasets.</a> Methods. 61, 287-298 (2013).</li>
</ol>

Melvin A. Park i Matthew Willetts są pracownikami firmy Bruker Daltonics Inc., producenta przyrządu timsTOF.

Histony to podstawowe białka, które regulują strukturę chromatyny poprzez interakcję z DNA w postaci oktamerów składających się z czterech histonów rdzeniowych (po dwa z H2A, H2B, H3 i H4)20. Histony zawierają liczne reszty lizyny i argininy, które są łatwo modyfikowane, co prowadzi do rozległych PTM, które zmieniają chemię chromatyny, wpływając na funkcję histonów lub wiążąc się z innymi białkami komórkowymi21. PTM mogą wywoływać reakcje biologiczne poprzez pracę w tandemie, przy czym określone grupy PTM zostały zgłoszone w kilku chorobach, w szczególności w kilku typach raka22.
Kiedy uszkodzenie DNA zostanie rozpoznane na poziomie komórkowym, natychmiast następuje działanie złożonej kaskady sygnalizacyjnej, w której zaznaczane są zmiany, a następnie następuje koordynacja progresji cyklu komórkowego i aktywacja wymaganych szlaków naprawczych. Ponadto uszkodzenie DNA indukuje różne modyfikacje, takie jak addukty acetylowe i metylowe, które ułatwiają rekrutację białek23. Ogromna różnorodność PTM, które są zaangażowane w uszkodzenia DNA, prowadzi do pytania, w jaki sposób te mechanizmy molekularne regulują swoje współistnienie i jakie jest funkcjonalne znaczenie obrony integralności genomu za pomocą niezwykle złożonej zintegrowanej sieci. Na przykład trimetylacja histonu H3 (H3K9me3) lizyny 9 została powiązana z różnymi patologiami w różnych chorobach24. Z takich powodów konieczne jest opracowanie instrumentalnych metodologii analitycznych, które pozwolą na pełną charakterystykę tych modyfikacji na poziomie komórkowym23.
Analiza ekstrakcji histonów HeLa S3 przy użyciu oprogramowania do ręcznej analizy danych i oprogramowania do analizy proteomicznej ujawniła PTM, w tym acetylację (+42,01 Da), metylo-propionylację (+70,04 Da), dimetylację (+28,03 Da) i trimetylację (+42,05) dla kilku białek histonowych. Ponadto metoda MS/MS oparta na projekcie PASEF była w stanie zróżnicować niektóre pozycyjne peptydy izomeryczne przenoszące te same PTM.
We wstępie opisano pokrótce zalety sprzężenia LC-TIMS-ToF MS/MS w badaniu PTM w celu pokazania najnowszych osiągnięć DDA wykorzystujących równoległą akumulację w pułapce mobilności, po której następuje sekwencyjna fragmentacja i dysocjacja wywołana zderzeniem. Główną ideą jest ustanowienie metodologii, która pozwoli na rozdzielczość sygnałów pochodzących z różnych peptydów, a do tej pory klasyczne techniki nie były w stanie tego rozwiązać. Proces derywatyzacji przy użyciu bezwodnika propionowego zapobiega rozszczepianiu C-końców lizyny przez trypsynę, generując dłuższe, bardziej informacyjne peptydy. Peptydy o tym samym m/z i czasie retencji były w stanie zidentyfikować na podstawie ich wzorców fragmentacji, ale zaobserwowano również, że niektóre z tych gatunków można oddzielić w domenie mobilności za pomocą tej metody LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS.
Aby lepiej to zrozumieć, rysunek 8 przedstawia trzy główne cechy dowolnej cząsteczki, umożliwiając w ten sposób identyfikację związku, niezależnie od tego, czy są to nienaruszone białka, lipidy czy peptydy (w tym przypadku histon H3 18-26), by wymienić tylko kilka przykładów. Cechy te obejmują czas retencji (min) związku w kolumnie chromatograficznej, stosunek masy do ładunku (m/z) każdego związku oraz ruchliwość (1/Ko), jaką wykazują te związki podczas interakcji z gazem dryfującym. Na rysunku 8A pokazano, że niezmodyfikowany peptyd H3 18-26 ma RT 28,15 min i że prezentuje dwa pasma w swoim spektrum ruchliwości, co wskazuje, że ma co najmniej dwie konformacje, wynik, który podejrzewa się, że jest wynikiem dwóch lizyn (18 i 23), które zostały propionylowane zgodnie z wcześniej opisanym protokołem. Poniższe widma (Rysunek 8B,C) pokazują ten sam peptyd (H3 18-26), ale zmieniający położenie grupy acetylacyjnej (42.02) między B, K18Ac i C, K23Ac. Te dwa izomery (K18Ac i K23Ac) zostały zidentyfikowane za pomocą mobilogramu, ponieważ mają różne rozkłady przestrzenne, co skutkuje różnymi interakcjami z gazem w komórce TIMS. Znaczenie tej metody polega na możliwości zidentyfikowania i bardziej szczegółowego zbadania różnych PTM, które zostały powiązane z różnymi chorobami, na przykład poprzez uszkodzenie DNA.
W przypadku gdy dane dotyczące fragmentacji są nieliczne, identyfikacja modyfikacji w określonej pozostałości jest trudna, ponieważ dwie lub więcej różnych modyfikacji może wystąpić jednocześnie w tych samych pozostałościach (lub w pobliżu) tych samych pozostałości i może być rozumiana jako pojedyncza modyfikacja25. Problem ten można rozwiązać, upewniając się, że niezmodyfikowany peptyd został zidentyfikowany, zwłaszcza przy użyciu wzorca do potwierdzenia lub zaprzeczenia obecności pojedynczej modyfikacji, a nie wielu modyfikacji (Tabela 1).
Aby uniknąć nadmiernego zanieczyszczenia lub ekstrakcji zanieczyszczonych histonów, ważne jest, aby przed użyciem sprawdzić jakość odczynników. Na przykład, jeśli roztwór buforowy NIB jest przechowywany i używany luzem, należy upewnić się, że roztwór jest klarowny i nie wykazuje zmętnienia lub nieprawidłowej prezentacji. Zmętnienie może być wynikiem rozwoju bakterii, które zanieczyściłyby próbki i mogłyby doprowadzić do powstania mieszaniny histonów i białek bakteryjnych. Ponadto zaleca się przygotowanie świeżych krzywych kalibracyjnych do testów, takich jak test BCA lub test Bradforda stosowany do oznaczania stężenia białka, zapewniając, że białko użyte do krzywej kalibracyjnej nie jest wygasłe lub zdegradowane.
Metodę tę można rozszerzyć na inne typy komórek lub organizmów, na przykład komary. W przypadku organizmów całych lub częściowych wybór odpowiedniej liczby organizmów jest szczególnie ważny, aby zapewnić, że końcowe stężenie histonów jest odpowiednie do analizy.
Ponadto, jako ogólną wskazówkę dotyczącą konserwacji spektrometru masowego, przód powinien być okresowo czyszczony, aby zapobiec gromadzeniu się osadów na przyrządzie i zanieczyszczeniu między cyklami. To czyszczenie powinno obejmować kurtynę, kryzę i kwadrupol, w zależności od potrzeb.
Ogólnie rzecz biorąc, w przypadku stosowania LC należy wziąć pod uwagę przygotowywanie co tydzień świeżej fazy ruchomej przy użyciu rozpuszczalników klasy MS. Dobrą praktyką jest przechowywanie dedykowanych pipet i naczyń szklanych do mobilnego przygotowywania faz oraz czyszczenie przewodów LC za każdym razem, gdy do systemu wprowadzane są nowe roztwory. Kolumny ochronne i separacyjne należy zwykle wymieniać odpowiednio co 100-200 iniekcji i 500-1500 iniekcji26. Należy pamiętać o wstrzyknięciu ślepych prób przed i po uruchomieniu partii próbek. Jeżeli w danej partii znajduje się duża liczba próbek, można również rozważyć przeprowadzenie ślepej próby w różnych odstępach czasu w partii.
Protokół zapewnia oparty na PASEF przepływ pracy DDA do wykrywania histonów PTM i różnicowania gatunków izobarycznych i izomerycznych na podstawie ruchliwości jonów.
Protokół ten wymaga intensywnego przygotowania próbki i należy wziąć pod uwagę całkowity czas przygotowania próbki eksperymentalnej. Protokół przygotowania próbki trwa średnio 2-3 dni robocze. Ponadto różnice między laboratoriami i wersjami urządzeń mogą wpływać na ogólną czułość analizy.
Bardzo niewiele programów do analizy danych proteomicznych zostało uznanych za odpowiednie do wykorzystania w analizie histonów metodami oddolnymi bez ręcznej regulacji lub korekty 27,28,29. Wyniki powinny być (przynajmniej na początku) potwierdzone za pomocą ręcznej analizy, która również jest czasochłonna. Jeśli używane jest oprogramowanie analityczne, powinno ono mieć możliwość adnotacji MS/MS, które na ogół są łatwe do potwierdzenia lub odrzucenia.
Warto również wspomnieć, że niemożliwe jest rozdzielenie izomerów za pomocą spektrometrii mas, chyba że wstawi się ogniwo TIMS i nie zastosuje się wartości ruchliwości; na przykład pozycje modyfikacji histonów można określić za pomocą wzorców fragmentacji (PASEF).

W komórkach eukariotycznych DNA jest pakowane jako chromatyna w funkcjonalne jednostki zwane nukleosomami. Jednostki te składają się z oktamera czterech rdzeniowych histonów (po dwa H2A, H2B, H3 i H4)1,2,3,4. Histony są jednymi z najliczniejszych i najbardziej konserwatywnych białek u eukariontów, które są w dużej mierze odpowiedzialne za regulację genów5. Modyfikacje potranslacyjne histonów (PTM) odgrywają dużą rolę w regulacji dynamiki chromatyny i sterują różnymi procesami biologicznymi, takimi jak transkrypcja, replikacja i naprawa DNA6. PTM występują przede wszystkim na dostępnej powierzchni N-końcowych obszarów histonów, które są w kontakcie z DNA3,7. Jednak modyfikacje ogona i rdzenia wpływają na strukturę chromatyny, zmieniając interakcje międzynukleosomowe i rekrutując określone białka3,8.
Obecnym wyzwaniem podczas proteomiki opartej na chromatografii cieczowej i spektrometrii mas (LC-MS) jest potencjalna koelucja analitów będących przedmiotem zainteresowania. W przypadku analiz zależnych od danych (DDA) przekłada się to na potencjalną utratę kilku jonów prekursorowych podczas procesu akwizycji MS/MS9. Instrumenty do pomiaru czasu przelotu (ToF) rejestrują widma o bardzo wysokiej częstotliwości9,10 (do kilkudziesięciu kHz)11; to sprawia, że są one zdolne do szybkiego skanowania całkowitej ilości jonów prekursorowych w złożonej próbce (MS1), obiecując w ten sposób optymalną czułość i szybkość sekwencjonowania MS/MS (do 100 Hz)9 i czyniąc je idealnymi do analizy próbek biologicznych10. Niemniej jednak czułość dostępna przy tych wysokich szybkościach skanowania jest ograniczona przez szybkość MS/MS9. W celu złagodzenia tych ograniczeń zastosowano dodanie spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów (TIMS) w połączeniu z ortogonalnym kwadrupolowym spektrometrem mas czasu przelotu (qToF). W TIMS wszystkie jony prekursorowe są akumulowane w tandemie i eluowane w funkcji ich ruchliwości, zamiast wybierać pojedyncze masy prekursorów za pomocą kwadrupola9. Równoległa akumulacja szeregowa (PASEF) pozwala na setki zdarzeń MS/MS na sekundę bez utraty czułości9.
Głównym celem tej pracy było pokazanie ostatnich osiągnięć DDA za pomocą równoległej akumulacji w pułapce mobilności, po której następuje sekwencyjna fragmentacja i dysocjacja wywołana kolizją (CID). PTM histonów zostały pewnie przypisane na podstawie ich czasów retencji (RT), ruchliwości i wzorców fragmentacji.

<table><tbody><tr><td>-80 stopni Celsjusza; C Zamrażarka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>Końcówki</td></tr><tr><td>do pipet</td> pochodzenia zwierzęcego 1 ml <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>94060710</td><td>Finntip Flex 1000 &mu; L, niesterylne, niefiltrowane, z końcówkami zębatkowymi</td></tr><tr><td>1,5 ml Probówki do mikrowirówek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-282-300</td><td>Używaj tych probówek do prostego i bezpiecznego przetwarzania próbek o objętości do 1,5 ml</td></tr><tr><td>10 &micro; L Końcówki do pipet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>94060100</td><td>Finntip Flex, 10 &mu; L, niesterylny, niefiltrowany, z koszem</td></tr><tr><td>10% NP-40</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28324</td><td>NP-40 Roztwór detergentu Surfact-Amps</td></tr><tr><td>10x Dulbecco' s PBS bez Ca2+/Mg2+</td><td>(Mediatech)</td><td>MT21031CM</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Probówki stożkowe</td><td>Corning</td><td>352196</td><td>Falcon Stożkowe probówki wirówkowe</td></tr><tr><td>200 &mikro; L Żelowe końcówki do pipet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-707-138</td><td>Fisherbrand&nbsp; Końcówki do ładowania żelu, 1&ndash; 200 &mu; L</td></tr><tr><td>200 i mikro; L Końcówki do pipet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>94060310</td><td>Finntip Flex 200&mu; L, niesterylne, niefiltrowane, z końcówkami zębatymi</td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610737</td><td>Wstępnie zmieszany bufor do próbek białkowych SDS-PAGE</td></tr><tr><td>50 mL Probówki stożkowe</td><td>Corning</td><td>352070</td><td>Falcon</td></tr><tr><td>96-dołkowa płaska płyta dolna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa, V-Bottom 600 &mu; L</td><td>Axygen</td><td>P-DW-500-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>179124</td><td>odczynnik ACS, &ge; 99,5%</td></tr><tr><td>Acetonitryl (ACN)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A998</td><td>HPLC, Fisher Chemical</td></tr><tr><td>Acetonitryl z 0,1% kwasem mrówkowym (v/v), klasa LC/MS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LS120</td><td>Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific</td></tr><tr><td>AEBSF</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>328110500</td><td>Chlorowodorek AEBSF, 98%</td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu, NH4HCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09830</td><td>BioUltra, &ge; 99,5% (T)</td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku amonu, NH4OH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AX1303</td><td>Spełnia specyfikacje ACS, spełnia specyfikacje odczynników do testowania Monografie USP / NF GR ACS</td></tr><tr><td>Argon (Ar)</td><td>Airgas</td><td>AR HP 300</td><td></td></tr><tr><td>BEH C18 Kolumna HPLC</td><td>Wody</td><td>186003625</td><td>XBridge Peptyd BEH C18 Kolumna, 300 & Aring;, 5 & mikro; m, 4.6 mm X 250 mm, 1K&ndash; 15K</td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906 Frakcja</td><td>szoku cieplnego, pH 7, &ge; 98%</td></tr> <tr><td>Chlorek wapnia, CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td>Bezwodny, proszek, &ge; 97%</td></tr><tr><td>Bufor dysocjacji komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13151014</td><td></td></tr><tr><td>Ceramiczny wafel punktacji</td><td>Restek</td><td>20116</td><td></td></tr><tr><td>Kompas DataAnalysis 6.0</td><td>Kompas Bruker Datonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyStar 6.2</td><td>Kompas daltoniczny Bruker</td> IzotopWzór Kompas daltoniczny <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>timsControl 4.1</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Bio-Rad</td><td>1610436</td><td></td></tr><tr><td>Deep Well, 96-dołkowa mikropłytka, 2,0 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89237526</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe podnośniki komórkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 08100240</td><td>Podnośniki komórkowe Fisherbrand; Jednorazowe podnośniki szybko usuwają warstwy komórek</td></tr><tr><td>Jednorazowe tłuczki do pelletu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-141-363</td><td>Fisherbrand&nbsp; tłuczki do peletów; Zawiesić granulki białka i DNA lub zmielić tkanki miękkie w probówkach do mikrowirówek</td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P2325</td><td>1 M</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy (FA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695076</td><td>odczynnik ACS, &ge; 96%</td></tr> <tr><td>Kapilara z topionej krzemionki 75 &mu; m ID x 363 &mu; m OD(</td><td>Molex (Polymicro)</td><td>TSP075375</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A38S</td><td>Kwas octowy, lodowaty (certyfikowany ACS),</td></tr><tr><td>pipety Pasteura ze szkła</td> chemicznego <td>Fisher Sigma Aldrich</td><td>BR747725-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Wysokowydajny chromatograf cieczowy</td><td>&nbsp; Shimadzu</td><td></td><td>Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System</td></tr><tr><td>Kwas solny, HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>258148</td><td>odczynnik ACS, 37%</td></tr><tr><td>Hypercarb 30-40 &mu; m Węgiel 150&ndash; 300 i Aring;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60106-402</td><td></td></tr><tr><td>Wkład Hypersep</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60109-404</td><td></td></tr><tr><td>LC/MS Wzorzec kalibracji, do ESI-ToF</td><td>Agilent</td><td>G1969-85000</td><td>TuningMix</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu, MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>Bezwodny, &ge; 98%</td></tr><tr><td>Metanol, do HPLC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A454</td><td>Optima do HPLC, Fisher Chemical&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Adaptery probówek do mikrowirówek</td><td>GL Sciences</td><td>501021514</td><td></td></tr><tr><td>Microcystin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-200-8727</td><td>Enzo Life Sciences&nbsp; Fiolka na próbkę Microcystin-LA</td></tr><tr><td>MS, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm</td><td>LEAP PAL Części</td><td>LAP.11190933</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Model naukowy</td><td>: ND3300</td><td></td></tr><tr><td>Azot (N2)</td><td>Airgas</td><td>NI UHP300</td><td></td></tr><tr><td>PEAKS Studio X+</td><td>Bioinformatic Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paski wskaźnika pH, Instachek</td><td>Micro Essential Lab</td><td>JR-113</td><td>Model: Hydrion</td></tr><tr><td>Chlorek potasu, odczynnik KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td>ACS, 99,0%&ndash; 100,5%</td></tr> <tr><td>ciśnieniowa komórka iniekcyjna</td><td>Next Advance</td><td>&nbsp; model: PC77</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik propionowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8.00608</td><td>Do syntezy</td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem (700&ndash; 18 000 x g)</td> <td>NuAire, model: Nuwind</td><td>NU-C200V</td><td></td></tr><tr><td>Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 &mu; m, 3 g</td><td>ESI Source Solutions</td><td>r13.aq.0003</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Żele</td><td>Bio-Rad</td><td>4569035</td><td>Dowolna prefabrykowany żel poliakrylamidowy kD, 8,6 cm i razy; 6,7 cm (W &czas; L), do stosowania z komórkami do elektroforezy Mini-PROTEAN</td></tr><tr><td>Maślan sodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11079.06</td><td>98+%</td></tr><tr><td>chlorek sodu, odczynnik ACS NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td>, <td>&ge; 99.0%</td></tr><tr><td>Dysk SPE, C18</td><td>VWR</td><td>76333-134</td><td>Empore Dysk SPE, C18, CDS Analityczny, 90 mm x 0.5 mm, 12 i mikro; m</td></tr><tr><td>Pompa próżniowa SpeedVac+ i wirnik płytowy</td><td>Model Savant</td><td>: SC210A</td> Milipor sacharozy <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>1.07651</td><td>odpowiedni do mikrobiologii</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy, H2SO4&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>339741</td><td>99,999%</td></tr><tr><td>Spektrometr masowy TIMS-ToF</td> Model <td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>Tims tof ms</td></tr><tr><td>Roztwór kwasu trichlorooctowego, TCA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0699</td><td>6.1&nbsp; N</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031</td><td>Nadaje się do HPLC, &ge; 99,0%</td></tr> <tr><td>Triversa Nanomate</td><td>Advion</td><td>model: TR263</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza trypsynowa, MS Grade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90057</td><td></td></tr><tr><td>Rotator rurowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88881001</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik Vortex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88880017</td><td></td></tr><tr><td>Woda z 0,1% kwasem mrówkowym (v/v), LC/MS Grade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LS118</td><td>Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific&nbsp;</td></tr></tbody></table>

badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu

Histone Modification Screening using Liquid Chromatography, Trapped Ion Mobility Spectrometry, and Time-Of-Flight Mass Spectrometry

Białka histonowe są bardzo obfite i zachowane wśród eukariontów i odgrywają dużą rolę w regulacji genów w wyniku struktur znanych jako modyfikacje potranslacyjne (PTM). Identyfikacja pozycji i charakteru każdego PTM lub wzorca PTM w odniesieniu do czynników zewnętrznych lub genetycznych pozwala na statystyczne skorelowanie tych informacji z reakcjami biologicznymi, takimi jak transkrypcja, replikacja lub naprawa DNA. W niniejszej pracy opisano wysokoprzepustowy protokół analityczny do wykrywania histonów PTM w próbkach biologicznych. Zastosowanie komplementarnej chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (LC-TIMS-ToF MS/MS) umożliwia separację i przypisanie PTM najbardziej istotnych biologicznie modyfikacji w jednej analizie. Opisane podejście wykorzystuje najnowsze osiągnięcia w zakresie zależnej akwizycji danych (DDA) z wykorzystaniem równoległej akumulacji w pułapce mobilności, po której następuje sekwencyjna fragmentacja i dysocjacja wywołana zderzeniem. Histonowe PTM są pewnie przypisywane na podstawie ich czasu przechowywania, mobilności i wzorca fragmentacji.

Przepływ pracy w proteomice oddolnej (Rycina 7) zazwyczaj obejmuje następujące etapy: ekstrakcję białka lub białek docelowych z surowej próbki, następnie oznaczanie stężenia białek, a następnie frakcjonowanie, zazwyczaj za pomocą elektroforezy w żelu lub chromatografii cieczowej. Po frakcjonowaniu białka są trawione za pomocą enzymu proteolitycznego (często trypsyny), a na koniec przeprowadza się analizę spektrometrią mas powstałych peptydów oraz identyfikację białek z wykorzystaniem uznanej bazy danych18. Informacje o sekwencji są wyprowadzane z jonów prekursorowych w wskazanym zakresie stosunku masy do ładunku (m/z), które poddawane są dysocjacji indukowanej zderzeniem (CID), co generuje wzory fragmentacji poddawane identyfikacji i sekwencjonowaniu przy użyciu bazy danych19 (Rycina 8).
Głównym celem niniejszej pracy było opracowanie i zastosowanie metody LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS DDA zgodnie z krokami opisanymi wcześniej w sekcji protokołu. Wyznaczenie pozycji modyfikacji potranslacyjnych w peptydach izomerycznych i izobarycznych stanowiło szczególne wyzwanie w zakresie identyfikacji i interpretacji widm. W badaniu tym jako próbki wykorzystano rekombinowane ludzkie standardy histonów oraz komórki HeLa S3.
Analiza PTM histonów w standardach histonów ludzkich za pomocą ESI-TIMS-PASEF-ToF MS/MS pozwoliła na uzyskanie peptydów o średniej i dużej wielkości (od 3 do 30 aminokwasów długości), wykrywanych z ładunkiem sięgającym 5 ładunków na peptyd. Procedura propionylacji pozwoliła na otrzymanie dłuższych i bardziej informatywnych peptydów niż te, które są zazwyczaj uzyskiwane w wyniku trawienia trypsyną. Podczas analizy danych zidentyfikowano peptydy w różnych stanach modyfikacji. Zaletą metody opartej na TIMS była zdolność do rozróżniania niektórych izomerów pozycyjnych peptydów posiadających te same PTM. Na przykład dwa gatunki izomeryczne mogą nakładać się pod względem czasu retencji i m/z, jednak dwa sygnały te mogły zostać rozdzielone w domenie mobilności (Rysunek 9).
Odpowiadające spektra fragmentacji dla peptydów przedstawionych na Rysunku 9 zostały zinterpretowane przez oprogramowanie do analizy proteomicznej przy użyciu odpowiednich plików FASTA. Na Rysunku 9A widoczny jest niezmodyfikowany peptyd z trzema grupami propionylowymi (+56,03) (na N-końcu, lizynie 18 i lizynie 23). Na Rysunku 9B obserwuje się peptyd z grupą acetylową (+42,02) na lizynie 18 i dwiema grupami propionylowymi (jedną na N-końcu i jedną na lizynie 23). Wreszcie, na Rysunku 9C widoczny jest peptyd z acetylacją na lizynie 23 i dwiema grupami propionylowymi (na N-końcu i lizynie 18). Jak opublikowano wcześniej, zaletę techniki PASEF można wykorzystać do zwiększenia szybkości i czułości sekwencjonowania poprzez wielokrotne celowanie w tę samą cechę9. Pozwala to użytkownikowi uzyskać więcej informacji strukturalnych z próbek biologicznych. W tym przypadku zastosowano to do określenia rodzaju i pozycji PTM występujących na każdej histonie.
Analizę modyfikacji potranslacyjnych można również przedstawić wizualnie w formie wykresu pokrycia sekwencji, co pokazano w Rysunek 10W Rycina 10A, standard histony H3, który został propionylowany przed trawieniem, wykazuje dłuższe peptydy niż te, które powstałyby w przeciwnym razie, co zaznaczono niebieskimi liniami. Histony wyekstrahowane z komórek HeLa S3 przetworzono w ten sam sposób, co przedstawiono za pomocą Rysunek 10BWskazano na obecność kilku modyfikacji potranslacyjnych (PTM), w tym wiele różnych wzorów w tych samych pozycjach aminokwasowych. Jest to zjawisko oczekiwane w przypadku próbek biologicznych. Warto zauważyć, że nieliczne szare linie w Rysunek 10B oznaczać peptydy, które zostały zidentyfikowane jednoznacznie z powodu braku widma MS2 wynikający z niskiej intensywności.
<img alt="Schemat chromatografii z narzędziami igłowymi i zestawem strzykawkowym, używany do separacji i analizy DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65589/65589fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie i wykonanie końcówek StageTip. (A-G) Instrukcja krok po kroku dotycząca wykonania końcówki StageTip z dyskiem krzemionkowym C18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65589/65589fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Interfejs oprogramowania do analizy spektrometrii mas wyświetlający chromatogram i wyniki widma dla peptydu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65589/65589fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przetwarzanie danych: 20210804 Propionylated Standard Histones Mix_QC Peptide. Przed rozpoczęciem przetwarzania danych należy przygotować teoretyczną listę możliwych stanów ładunku i ich fragmentacji (1550.9013; 775.9543; 517.6386; itd.), aby wyekstrahować te wartości z chromatogramu piku bazowego (BPC +All MS). Po wyekstrahowaniu każdego peptydu należy upewnić się, że odpowiada on liście analizy przedstawionej na rysunku. Jako przykład wybrano pik 775.9543. Po prawej stronie rysunku przedstawiono trzy wykresy: pierwszy odpowiada chromatogramowi (wykres natężenia w funkcji czasu), drugi mobilogramowi, a trzeci widmu mas z uwzględnieniem fragmentacji PASEF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65589/65589fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Metoda chromatograficzna, interfejs oprogramowania, analiza danych spektrometrii mas, wykres intensywności piku." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65589/65589fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Kroki 1-4 protokołu timsControl. Rysunek przedstawia pierwsze cztery kroki procedury timsControl. W górnej lewej części należy kliknąć przycisk Instrument, aby włączyć lub wyłączyć połączenie między instrumentem a oprogramowaniem. Przed wykonaniem jakiegokolwiek zadania należy upewnić się, że oprogramowanie znajduje się w trybie operacyjnym. Na koniec należy zweryfikować poprawność parametrów TIMS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65589/65589fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza danych chromatograficznych; interfejs oprogramowania systemu HPLC przedstawia wykres wyników rozdziału próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65589/65589fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Parametry źródłowe. W tym przypadku strzykawka Hamilton 500 µL została użyta wyłącznie do TuneMix. Należy sprawdzić, czy pozostałe parametry są prawidłowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65589/65589fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki chromatografii; dane spektrometrii mas; kalibracja w interfejsie oprogramowania do chemii analitycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65589/65589fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Kalibracja stosunku masy do ładunku (m/z). Wybieraj opcję Calibrate, aż w lewym dolnym panelu Calibration Mode zostanie uzyskany wynik 100%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65589/65589fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza danych chromatograficznych; wykres kalibracyjny; układ spektroskopowy; oczyszczanie białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65589/65589fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Kalibracja mobilności. Wybieraj opcję Calibrate aż do uzyskania wyniku co najmniej 98.5% w lewym dolnym panelu Calibration Mode. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65589/65589fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu analizy proteomicznej; izolacja białek, trawienie proteolityczne, spektrometria mas." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65589/65589fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Typowy schemat analizy proteomicznej bottom-up. Kroki procedur bottom-up od przygotowania próbki do identyfikacji9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65589/65589fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres chromatografii i spektrometrii mas; intensywność w funkcji czasu retencji, m/z i mobilności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65589/65589fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Profile czasu retencji, wzoru izotopowego i mobilności H3 18-26. (A) Niezmodyfikowany peptyd propionilowany, (B) peptyd K23Ac propionilowany w dwóch pozostałych pozycjach oraz (C) peptyd K18Ac propionilowany w dwóch pozostałych pozycjach. Zwrócono uwagę na zalety rozdziału mobilnościowego w przypadku izomerów strukturalnych przedstawionych na panelach B i C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65589/65589fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Profil spektrometrii mas; sekwencjonowanie peptydów; intensywność vs. m/z; wykres analizy danych spektralnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65589/65589fig09.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9: Przykład sekwencjonowania peptydów poprzez fragmentację MS/MS z użyciem PASEF. Widma fragmentacyjne uzyskano z oprogramowania do analizy proteomicznej dla peptydu H3 z pozycjami aminokwasowymi 18-26. (A) niezmodyfikowany propionylany, (B) peptyd K23Ac propionylany w dwóch pozostałych pozycjach oraz (C) K18Ac propionylany w dwóch pozostałych pozycjach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65589/65589fig09large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza modyfikacji białek, schemat z sekwencją aminokwasową, miejscami fosforylacji i metylacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65589/65589fig10.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 10"> 
Rycina 10: Przykład wizualnego podsumowania analizy PTM histonów. Wyniki zaobserwowanych peptydów i PTM dla (A) standardu H3 oraz (B) H3 z komórek HeLa S3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65589/65589fig10large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Charakterystyka LC-TIMS-ToF MS/MS dla peptydów standardowych i z linii HeLa S3. Lista peptydów docelowych i zaobserwowanych, zawierająca właściwości eksperymentalne (tj. czas retencji, m/z, 1/Ko oraz powierzchnie pików LC). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65589/Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Analityczny przepływ pracy oparty na chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (LC-TIMS-ToF MS/MS) dla wysokiej pewności i wysoce powtarzalnej "oddolnej" analizy modyfikacji histonów i identyfikacji na podstawie głównych parametrów (czas retencji [RT], przekrój zderzenia [CCS] i dokładny stosunek masy do ładunku [m/z]).

Badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu

Histone proteins are highly abundant and conserved among eukaryotes and play a large role in gene regulation as a result of structures known as ...

Zaproponowano metodę wykorzystującą protokół ekstrakcji histonów z 95% skutecznością. Wraz z LC-TIMS-ToF MS/MS w krótkim czasie możliwe jest uzyskanie badania przesiewowego dla tych PTM obecnych w histonie, a przede wszystkim możliwość separacji izomerów. Jednak rozdzielenie peptydów izomerowych, możliwe przy użyciu samej tandemowej spektrometrii mas, jest często trudne.Wprowadzając TIMS, wprowadzamy dodatkowy wymiar separacji, upraszczając wiele identyfikacji izomerów pozycyjnych. Ponadto technologia pasywna zwiększa czułość tych eksperymentów, jeszcze bardziej poprawiając naszą zdolność do analizowania zmian epigenetycznych. Wraz ze zwiększoną zdolnością do identyfikacji pozycji PTM pojawia się możliwość dalszego określania korelacji między różnymi czynnikami środowiskowymi lub biologicznymi i ich wpływem na epigenom.Metody, które usprawniają i ułatwiają analizę histonów, mogą być stosowane w kilku obszarach badawczych, w tym w chemii medycznej i środowiskowej. Dynamika potwierdzenia białek w stanach natywnych lub uszkodzonych zostanie ustalona na podstawie implementacji TIMS MS/MS z HDX Poprzez LC-TIMS-ToF MS/MS i Nano LC-TIMS-ToF MS/MS, zostaną wykreślone różnice w PTM występujące w różnych próbkach biologicznych. Otwórz oprogramowanie sterujące TIMS.Kliknij kartę Instrument i przełącz na Obsługa. Sprawdź parametry TIMS, a następnie sprawdź ustawienia MS, w tym Początek skanowania, Koniec skanowania, Polaryzacja jonów i Tryb skanowania. Dokładnie sprawdź ustawienia TIMS, w tym tryb, początek mobilności, koniec mobilności, czas narastania, czas akumulacji, cykl pracy, szybkość narastania, szybkość MS, uśrednianie MS i automatyczną kalibrację.Następnie zmień tryb skanowania na MS w celu kalibracji. Po upewnieniu się, że przyrząd jest w trybie pracy, na karcie Źródło aktywuj strzykawkę Hamilton 500 mikrolitrów zawierającą mieszankę strojeniową. Przejdź do zakładki Kalibracja.Kliknij masę, którą chcesz naładować, a następnie w trybie kalibracji wybierz tryb kwadratowy. Kontroluj powiększenie do plus lub minus 0,01%Następnie kliknij przycisk Kalibruj, a gdy zostanie osiągnięty wynik 100%, kliknij przycisk Akceptuj. Następnie przejdź do zakładki Mobilność i w obszarze Tryb kalibracji wybierz Tryb liniowy.Ustaw Zakres wykrywania na plus lub minus 5% i Szerokość na 0,1 daltonów. Następnie kliknij przycisk Kalibruj, a po otrzymaniu wyniku powyżej 98,5% kliknij przycisk Akceptuj. Aby opracować metodę LIC-TIMS-ToF MS/MS do analizy proteolitycznych peptydów histonowych, należy połączyć HPLC wyposażony w kolumnę C18 z komercyjnym instrumentem TIMS-ToF MS z zastrzeżoną technologią pasywną.Następnie ustaw warunki pracy jonizacji nanoelektronatrysku na 4 500 V napięcia kapilarnego, 800 V przesunięcia płyty końcowej, ciśnienia nebulizatora trzech barów, 10 litrów na minutę suchego gazu i 200 stopni Celsjusza suchej grzałki. Skonfiguruj ustawienia MS na 6 elektronowoltów energii zderzenia, 1, 200 Vpp Collision RF, 75 mikrosekund czasu transferu i pięć mikrosekund pamięci przedimpulsowej. Dostosuj objętość wtrysku do 20 mikrolitrów, co odpowiada ośmiu mikrogramom próbki, i ustaw natężenie przepływu na 0,4 mililitra na minutę.Po wprowadzeniu określonej osi czasu gradientu i próby acetonidu z 0,1% procentami kwasu mrówkowego, wybierz OK w obu wyskakujących okienkach, aby zapisać metodę. Przeprowadź 60-minutowy nieliniowy gradient LC przy użyciu próby z wodą i acetonidem, w obu przypadkach z 0,1% kwasem mrówkowym. Sprawdzić elucję próbki z HPLC do TIMS-ToF poprzez jonizację nanoelektronrozpylania w trybie jonizacji dodatniej.Aby zidentyfikować sekwencje peptydów i miejsca modyfikacji za pomocą narzędzia MS-Digest, wygeneruj teoretyczną listę peptydów za pomocą Protein Prospector. Następnie wykonaj teoretyczny przegląd, biorąc pod uwagę warunki trawienia, typowanie modyfikacji potranslacyjnych, zakres wielkości peptydów, zakres wykrywania masy i potencjalną liczbę pominiętych rozszczepienia. Aby przeanalizować uzyskane dane, poszukaj mas w kilku stanach ładunku, w zakresie od 1 do 4 dla każdego teoretycznego peptydu.Po zidentyfikowaniu każdego stosunku masy do ładunku, wybierz pik i potwierdź MS/MS, korzystając z teoretycznej listy jonów fragmentacyjnych opartych na sekwencji peptydowej, w tym modyfikacji potranslacyjnych. Widma fragmentacji peptydów ujawniły trzy różne warianty peptydów z różnymi modyfikacjami potranskrypcyjnymi, w tym grupy propionylowe i acetylowe w różnych pozycjach. Propionylowany wzorzec histonu H3 wykazywał dłuższe peptydy niż wersja niezmodyfikowana.Histony wyekstrahowane z komórek HeLa S3 wykazywały wiele wzorców modyfikacji potranslacyjnej w tych samych pozycjach aminokwasów.

histone-modification-screening-using-liquid-chromatography-trapped

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Ten protokół przedstawia w pełni zintegrowany przepływ pracy do charakteryzowania modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą spektrometrii mas (MS). Przepływ pracy obejmuje oczyszczanie histonów z kultur komórkowych lub tkanek, derywatyzację i trawienie histonów, analizę MS za pomocą nanoprzepływowej chromatografii cieczowej oraz instrukcje analizy danych. Protokół jest przeznaczony do wypełnienia w ciągu 2 - 3 dni.

Kompletny przepływ pracy do analizy modyfikacji potranslacyjnych histonów przy użyciu spektrometrii mas od dołu do góry: od ekstrakcji histonów do analizy danych

Tutaj opisujemy test chromatograficzny połączony z separacją ruchliwości jonów prekursorów peptydów, po której następuje detekcja MS w wysokiej rozdzielczości (~30 000) MS dla kwantyfikacji wzorców peptydów wzbogaconych w trawieniu przeciwciał monoklonalnych.

Test HS-MRM do oznaczania ilościowego białek komórek gospodarza w biofarmaceutykach białkowych za pomocą chromatografii cieczowej Mobilność jonów Spektrometria mas QTOF

Protokół został opracowany w celu skutecznego wydobywania nienaruszonych histonów z materiałów z liści sorgo w celu profilowania modyfikacji histonów po translacji, które mogą służyć jako potencjalne markery epigenetyczne do pomocy w inżynierii upraw odpornych na suszę.

Izolacja histonu z tkanki liści sorgo w celu profilowania potencjalnych markerów epigenetycznych metodą spektrometrii mas z góry na dół

Ten protokół opisuje, jak trójwymiarowy system hodowli komórkowej może być używany do modelowania, leczenia i analizowania modyfikacji chromatyny w stanie zbliżonym do fizjologicznego.

Kwantyfikacja na poziomie globalnym modyfikacji potranslacyjnych histonów w modelu 3D hodowli komórkowej tkanki wątrobowej

Ten protokół przedstawia zweryfikowaną metodę chromatografii cieczowej, mobilności jonów i spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości, do określania obecności alkaloidów sporyszu w żywności, zgodnie z niedawno wydanym rozporządzeniem Komisji (UE) 2023/915.

Wykrywanie regulowanych alkaloidów sporyszu w matrycach spożywczych za pomocą chromatografii cieczowej - spektrometria ruchliwości jonów uwięzionych w elektronice - spektrometria mas czasu przelotu

Protokół ten umożliwia efektywną ekstrakcję histonów z różnych próbek klinicznych do późniejszej analizy modyfikacji translacyjnej przez LC-MS/MS. Ułatwiając solidne wykrywanie kluczowych modyfikacji histonów, stanowi cenne narzędzie do kompleksowego profilowania epigenetycznego w dużych kohortach klinicznych.

Ekstrakcja histonów z próbek klinicznych do profilowania epigenetycznego za pomocą spektrometrii masowej

Przedstawiamy tutaj protokół automatyzacji analizy posttranslacyjnej modyfikacji histonów pojedynczych komórek, wykorzystując strategię znakowania izotopowego dwu-plexowego oraz trawienie ArgC. Ten workflow umożliwia ilościowe, powtarzalne i wysokoczułe profilowanie heterogeniczności chromatyny oraz odpowiedzi epigenetycznych w rozdzielczości pojedynczych komórek.

Automatyczne przygotowanie próbki do multipleksowanej analizy pojedynczokomórkowych modyfikacji histonów po translacji (sc-hPTM2)

Profilowanie metabolitów nieukierunkowanych za pomocą ultra wydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas (UPLC-MS) jest potężną techniką badania metabolizmu.  W tym artykule przedstawiono typowy przepływ pracy wykorzystywany do nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy, w tym organizację i przygotowanie próbki, pozyskiwanie danych, analizę danych, kontrolę jakości i identyfikację metabolitów.

Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS)

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Poznaj metodę LC-TIMS-ToF MS/MS do analizy modyfikacji histonów z 95% wydajnością ekstrakcji. Technika ta umożliwia skuteczne rozdzielanie izomerów peptydowych i identyfikację pozycji modyfikacji potranslacyjnych w badaniach epigenetycznych.

Badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (Wideo) | JoVE Journal

Badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu

Przeglądaj więcej filmów