Badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu
12 stycznia 2024
Analityczny przepływ pracy oparty na chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (LC-TIMS-ToF MS/MS) dla wysokiej pewności i wysoce powtarzalnej "oddolnej" analizy modyfikacji histonów i identyfikacji na podstawie głównych parametrów (czas retencji [RT], przekrój zderzenia [CCS] i dokładny stosunek masy do ładunku [m/z]).
Zaproponowano metodę wykorzystującą protokół ekstrakcji histonów z 95% skutecznością. Wraz z LC-TIMS-ToF MS/MS w krótkim czasie możliwe jest uzyskanie badania przesiewowego dla tych PTM obecnych w histonie, a przede wszystkim możliwość separacji izomerów. Jednak rozdzielenie peptydów izomerowych, możliwe przy użyciu samej tandemowej spektrometrii mas, jest często trudne.
Wprowadzając TIMS, wprowadzamy dodatkowy wymiar separacji, upraszczając wiele identyfikacji izomerów pozycyjnych. Ponadto technologia pasywna zwiększa czułość tych eksperymentów, jeszcze bardziej poprawiając naszą zdolność do analizowania zmian epigenetycznych. Wraz ze zwiększoną zdolnością do identyfikacji pozycji PTM pojawia się możliwość dalszego określania korelacji między różnymi czynnikami środowiskowymi lub biologicznymi i ich wpływem na epigenom.
Metody, które usprawniają i ułatwiają analizę histonów, mogą być stosowane w kilku obszarach badawczych, w tym w chemii medycznej i środowiskowej. Dynamika potwierdzenia białek w stanach natywnych lub uszkodzonych zostanie ustalona na podstawie implementacji TIMS MS/MS z HDX Poprzez LC-TIMS-ToF MS/MS i Nano LC-TIMS-ToF MS/MS, zostaną wykreślone różnice w PTM występujące w różnych próbkach biologicznych. Otwórz oprogramowanie sterujące TIMS.
Kliknij kartę Instrument i przełącz na Obsługa. Sprawdź parametry TIMS, a następnie sprawdź ustawienia MS, w tym Początek skanowania, Koniec skanowania, Polaryzacja jonów i Tryb skanowania. Dokładnie sprawdź ustawienia TIMS, w tym tryb, początek mobilności, koniec mobilności, czas narastania, czas akumulacji, cykl pracy, szybkość narastania, szybkość MS, uśrednianie MS i automatyczną kalibrację.
Następnie zmień tryb skanowania na MS w celu kalibracji. Po upewnieniu się, że przyrząd jest w trybie pracy, na karcie Źródło aktywuj strzykawkę Hamilton 500 mikrolitrów zawierającą mieszankę strojeniową. Przejdź do zakładki Kalibracja.
Kliknij masę, którą chcesz naładować, a następnie w trybie kalibracji wybierz tryb kwadratowy. Kontroluj powiększenie do plus lub minus 0,01%Następnie kliknij przycisk Kalibruj, a gdy zostanie osiągnięty wynik 100%, kliknij przycisk Akceptuj. Następnie przejdź do zakładki Mobilność i w obszarze Tryb kalibracji wybierz Tryb liniowy.
Ustaw Zakres wykrywania na plus lub minus 5% i Szerokość na 0,1 daltonów. Następnie kliknij przycisk Kalibruj, a po otrzymaniu wyniku powyżej 98,5% kliknij przycisk Akceptuj. Aby opracować metodę LIC-TIMS-ToF MS/MS do analizy proteolitycznych peptydów histonowych, należy połączyć HPLC wyposażony w kolumnę C18 z komercyjnym instrumentem TIMS-ToF MS z zastrzeżoną technologią pasywną.
Następnie ustaw warunki pracy jonizacji nanoelektronatrysku na 4 500 V napięcia kapilarnego, 800 V przesunięcia płyty końcowej, ciśnienia nebulizatora trzech barów, 10 litrów na minutę suchego gazu i 200 stopni Celsjusza suchej grzałki. Skonfiguruj ustawienia MS na 6 elektronowoltów energii zderzenia, 1, 200 Vpp Collision RF, 75 mikrosekund czasu transferu i pięć mikrosekund pamięci przedimpulsowej. Dostosuj objętość wtrysku do 20 mikrolitrów, co odpowiada ośmiu mikrogramom próbki, i ustaw natężenie przepływu na 0,4 mililitra na minutę.
Po wprowadzeniu określonej osi czasu gradientu i próby acetonidu z 0,1% procentami kwasu mrówkowego, wybierz OK w obu wyskakujących okienkach, aby zapisać metodę. Przeprowadź 60-minutowy nieliniowy gradient LC przy użyciu próby z wodą i acetonidem, w obu przypadkach z 0,1% kwasem mrówkowym. Sprawdzić elucję próbki z HPLC do TIMS-ToF poprzez jonizację nanoelektronrozpylania w trybie jonizacji dodatniej.
Aby zidentyfikować sekwencje peptydów i miejsca modyfikacji za pomocą narzędzia MS-Digest, wygeneruj teoretyczną listę peptydów za pomocą Protein Prospector. Następnie wykonaj teoretyczny przegląd, biorąc pod uwagę warunki trawienia, typowanie modyfikacji potranslacyjnych, zakres wielkości peptydów, zakres wykrywania masy i potencjalną liczbę pominiętych rozszczepienia. Aby przeanalizować uzyskane dane, poszukaj mas w kilku stanach ładunku, w zakresie od 1 do 4 dla każdego teoretycznego peptydu.
Po zidentyfikowaniu każdego stosunku masy do ładunku, wybierz pik i potwierdź MS/MS, korzystając z teoretycznej listy jonów fragmentacyjnych opartych na sekwencji peptydowej, w tym modyfikacji potranslacyjnych. Widma fragmentacji peptydów ujawniły trzy różne warianty peptydów z różnymi modyfikacjami potranskrypcyjnymi, w tym grupy propionylowe i acetylowe w różnych pozycjach. Propionylowany wzorzec histonu H3 wykazywał dłuższe peptydy niż wersja niezmodyfikowana.
Histony wyekstrahowane z komórek HeLa S3 wykazywały wiele wzorców modyfikacji potranslacyjnej w tych samych pozycjach aminokwasów.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia schemat analityczny wykorzystujący chromatografię cieczową, spektrometrię mobilności jonów w pułapce oraz spektrometrię mas z analizą czasu przelotu (LC-TIMS-ToF MS/MS) w celu wysokopoziomowej analizy modyfikacji histonów. Metoda ta znacząco usprawnia identyfikację modyfikacji potranslacyjnych (PTMs) oraz ich izomerów pozycyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biochemia
- Epigenetyka
Wstęp
- Histony odgrywają kluczową rolę w regulacji genów poprzez różnorodne modyfikacje.
- Identyfikacja tych modyfikacji jest niezbędna dla zrozumienia mechanizmów epigenetycznych.
- Tradycyjne metody napotykają trudności w rozdzielaniu izomerów.
- Wprowadzenie techniki TIMS oferuje nowy wymiar pozwalający na lepszą separację.
Cel badania
- Opracowanie metody wydajnej ekstrakcji i analizy histonów.
- Usprawnienie identyfikacji PTM oraz ich izomerów.
- Korelowanie czynników środowiskowych z wariacjami epigenetycznymi.
Zastosowane metody
- Protokół ekstrakcji histonów zapewniający 95% wydajności.
- LC-TIMS-ToF MS/MS do analizy o wysokiej rozdzielczości.
- Technologia pasywna w celu zwiększenia czułości w eksperymentach.
- Przesiewowe badanie modyfikacji potranslacyjnych (PTM) obecnych w histonach.
Główne wyniki
- Skuteczna separacja peptydów izomerycznych z wykorzystaniem TIMS.
- Ulepszona identyfikacja pozycji PTM.
- Zwiększona zdolność do analizy wariacji epigenetycznych.
- Potencjalne korelacje między czynnikami biologicznymi a epigenomem.
Wnioski
- Proponowana metoda znacznie usprawnia analizę modyfikacji histonów.
- Zastosowanie TIMS upraszcza identyfikację izomerów.
- Podejście to otwiera nowe możliwości dalszych badań nad wpływami epigenetycznymi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokoprzepustowe przesiewanie potranslacyjnych modyfikacji (PTM) histonów z wykorzystaniem LC-TIMS-ToF MS/MS odpowiada na krytyczną potrzebę precyzyjnego mapowania epigenetycznego w fazie wczesnego odkrywania i walidacji celów terapeutycznych. Zdolność do pewnego przypisania pozycji PTM i rozróżnienia form izomerycznych zwiększa pewność prognostyczną w wiązaniu stanów epigenetycznych z odpowiedziami biologicznymi. Ten schemat postępowania wspiera decyzje dotyczące portfela projektów w oparciu o analizę ryzyka, umożliwiając solidną, ilościową analizę modyfikacji chromatyny istotnych dla mechanizmów chorobowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie epigenetycznych mechanizmów regulacyjnych dzięki mapowaniu PTM o wysokim stopniu pewności.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez rozróżnianie izomerów pozycyjnych modyfikacji histonów.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez korelację wzorców PTM z czynnikami środowiskowymi lub genetycznymi.
- Zwiększa pewność prognostyczną w procesie wdrażania celów epigenetycznych w potoku odkrywania leków.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane próbki biologiczne do dalszego przesiewania związków modyfikujących chromatynę.
- Dostarcza reprodukowalne, ilościowe profile PTM w celu standaryzacji i benchmarkingu testów.
- Umożliwia skalowalną analizę wysokoprzepustową, odpowiednią dla kampanii przesiewowych.
- Wspiera niezawodną ocenę wpływu związków na krajobraz modyfikacji histonów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie wykrywania PTM z epigenetycznymi biomarkerami istotnymi dla choroby, gdy pozwala na to kontekst próbki.
- Zapewnia ciągłość przejścia od etapu mapowania epigenetycznego w fazie odkrywania do walidacji w modelach przedklinicznych.
- Umożliwia dostosowany do ryzyka postęp prac poprzez kwantyfikację zmian PTM w odpowiedzi na perturbacje biologiczne.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w badaniach translacyjnych dzięki szczegółowemu profilowaniu modyfikacji.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Niniejszy protokół LC-TIMS-ToF MS/MS integruje etapy od wczesnego odkrywania po identyfikację wiodących cząsteczek, wspierając zarówno przepływy pracy oparte na hipotezach, jak i przesiewowe w badaniach nad epigenetyką.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez mapowanie wzorców PTM w odniesieniu do wyników biologicznych.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy ilościowych danych PTM do oceny związków i weryfikacji powtarzalności.
- Analityka: Zapewnia wysokorozdzielcze pomiary pozycji PTM, rozdzielanie izomerów oraz widma fragmentacji do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Umożliwia dopasowanie profili PTM do modeli chorób i strategii biomarkerów, gdy jest to istotne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę analityczną dla trwałych badań epigenetycznych w ramach wielu programów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów epigenetycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje analizę PTM przy wysokiej powtarzalności i przepustowości.
- Wartość strategiczna: Wspiera świadome podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywne pod kątem kapitałowym zarządzanie portfolio.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i programów epigenetycznych z uwzględnieniem ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie spektrometrii mas, chromatografii i analizy danych proteomicznych.
- Wymaga dostępu do zaawansowanej aparatury LC-TIMS-ToF MS/MS oraz odpowiedniego oprogramowania wspierającego.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów przygotowania próbek i interpretacji danych między zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych macierzy biologicznych lub źródeł histonów.
- Kalibracja instrumentu i optymalizacja metody są kluczowe dla powtarzalności i czułości pomiarów.
