Profilowanie społeczności bakteryjnej fermentujących winogron traminette podczas produkcji wina przy użyciu sekwencjonowania amplikonów metagenomicznych

Zakres badań koncentruje się na zrozumieniu mikrobiomu fermentacyjnego. Ma to na celu udzielenie odpowiedzi na pytania, takie jak różnorodność drobnoustrojów w naturalnej fermentacji i jakie geny kodujące metabolit są niezbędne dla smaku i bezpieczeństwa? Jednym z najnowszych osiągnięć w naszej dziedzinie jest zrozumienie, w jaki sposób dynamika mikrobiomu koreluje z profilem metabolicznym obserwowanym w sfermentowanej żywności i napojach.

Sekwencje nowej generacji wyróżniają się jako kluczowa technologia, która obecnie napędza postęp w naszej dziedzinie badawczej. Na początek przenieś 20 mililitrów sfermentowanej próbki winogron do sterylnej 50-mililitrowej probówki z nakrętką. Następnie dodaj 10 mililitrów zimnej wody do probówki i wiruj w celu homogenizacji.

Odwirować próbkę o masie 800 g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant do nowej 50-mililitrowej probówki i odwirować przy 3 000 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze PBS.

Przenieś zawiesinę komórek do dwumililitrowej probówki z nakrętką i odwiruj przy 14 000 g przez dwie minuty. Teraz ponownie zawiesić osad w 978 mikrolitrach buforu fosforanu sodu o pH 7,4 i 122 mikrolitrach buforu DNA. Zwiruj rurkę i umieść ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 45 minut do jednej godziny.

Przenieś jeden mililitr próbki do jednorurkowej probówki roztworu do lizy i dokręć nakrętkę. Homogenizować próbkę trzy razy w młynku do ubijania kulek przez 60 sekund każdy. Następnie odwiruj rurkę elektroniczną Lysing Matrix przez jedną minutę przy 16 800 g.

Przenieś sat do czystej mikroprobówki i dodaj do probówki 250 mikrolitrów roztworu do wytrącania białek. Wstrząśnij probówką 10 razy, aby wymieszać zawartość. Odwirować próbkę przez pięć minut przy 16 800 g i przenieść supernatant do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Następnie dodać jeden mililitr zawiesiny matrycy wiążącej do supernatantu i mieszać, odwracając probówki przez dwie minuty przed umieszczeniem ich w stojaku na trzy minuty. Po usunięciu jednego mililitra supernatantu, ponownie zawiesić matrycę w pozostałym supernatancie. Przenieść 600 mikrolitrów mieszaniny do rurki z filtrem wirowym i odwirować.

Następnie zdekantować przepływ i dodać 500 mikrolitrów roztworu myjącego do rurki z filtrem wirowym. Wyjmij filtr wirowy i umieść go w świeżej rurce wychwytującej na pięć minut. Po wysuszeniu dodaj 50 mikrolitrów ciepłej wody wolnej od DNA na membranę filtracyjną i delikatnie wymieszaj matrycę końcówką pipety.

Wirować przy 14, 500 g przez jedną minutę, aby wymyć DNA. Załadować próbkę do żelu agarozowego. Na koniec zmierz stężenie DNA.

Na początek użyj specyficznych starterów 515F i 806R do amplifikacji hiperzmiennego regionu V4 genu 16S rRNA. Wykonaj PCR w podanych warunkach. Następnie dodaj do probówki 3,5 mikrolitra buforu sekwencjonującego i 1,5 mikrolitra mieszanki enzymatycznej.

Po wymieszaniu i odwirowaniu próbki należy przeprowadzić reakcję termocyklera. Teraz dodaj mieszaninę do podwiązania adaptera do probówki i inkubuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 15 minut w termocyklerze. Dodaj 1,5 mikrolitra enzymu odczynnika przedłużającego specyficznego dla uracylu do mieszaniny ligacyjnej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Teraz dodaj 43,5 mikrolitra kulek magnetycznych do DNA ligacji adaptera i wymieszaj 20 razy. Po pięciu minutach umieść probówkę w stojaku magnetycznym na pięć do 10 minut w celu oddzielenia kulek i wyrzuć supernatant. Umyj granulat 100 mikrolitrami 80% etanolu i susz kulki przez 30 sekund.

Aby wymyć kulki i osad, dodaj 8,5 mikrolitra 10-milimolowego Tris-Hcl do probówki i inkubuj przez dwie minuty. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym i usuń 7,5 mikrolitra wymykającego się DNA jako supernatantu do nowej probówki. Dodaj odczynniki PCR do adaptera ligowanej probówki zawierającej DNA, aby wywołać reakcję o objętości 25 mikrolitrów.

Aby oczyścić amplifikowane DNA, dodaj 22,5 mikrolitra kulek magnetycznych do probówki i wymieszaj 20 razy. Po pięciu minutach usuń 50 mikrolitrów supernatantu i umyj kulki 100 mikrolitrami 80% etanolu. Ponownie zawieś ciemnobrązowe kulki w 16 mikrolitrach wody i wymieszaj 20 razy.

Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na 30 do 60 sekund i przenieś 15 mikrolitrów do nowej probówki. Wymieszaj 90 mikrolitrów buforu, jeden mikrolitr barwnika i dwa mikrolitry próbki z biblioteki DNA i odczytaj stężenie DNA na fluorometrze. Po rozcieńczeniu DNA do dwóch nanomolowców załaduj od 27 do 30 mikrolitrów komórki przepływowej i umieść ją w sekwencerze.

Zapisz pliki FASTQ uzyskane z sekwencera. Kliknij, aby otworzyć plik arkusza kalkulacyjnego i utworzyć plik mapowania lub metadanych. Otwórz stronę internetową Nephele, prześlij pliki FASTQ i przeczytaj QC.In QIIME 2, wykonaj filtrowanie i przycinanie.

Następnie, korzystając z DADA2, wykonaj demultipleksowane odczyty sparowanych końców, podstawienie filtrów, błędy chimery i scalanie. Użyj naiwnego klasyfikatora Bayesa wyszkolonego w bazie danych SILVA w wersji 132, 99%Operational Taxonomic Unit lub OTU, aby wykonać przypisanie taksonomiczne bakterii z 97% podobieństwem. Otwórz stronę MicrobiomeDB, kliknij, aby przesłać pliki i wygenerować różnorodność alfa OTU, różnorodność beta, względną liczebność i krzywe rozrzedzenia.

Na koniec otwórz arkusz kalkulacyjny i przenieś dane, aby utworzyć mapy cieplne, diagramy Venna i rozmiar efektu liniowej analizy dyskryminacyjnej. Mapa cieplna oparta na względnej liczebności bakterii na różnych etapach produkcji wina wykazała dominację takich typów jak Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota i Fusobacteriota. Na poziomie rodzaju zidentyfikowano ważne genary, takie jak Enterobacteriaceae i Lactobacillaceae.

Analiza diagramu Venna ujawniła 15 wspólnych unikalnych OTU, od moszczu winogronowego po końcowe wino. Wyniki sekwencjonowania Amplicon w oparciu o region zmiennej V4 wykazały również różnorodność alfa w dwóch analizach Traminette R i L. Beta różnorodność wykazała zmianę bakterii podczas fermentacji, ale skład bakteryjny w końcowym winie był podobny do tego na etapie moszczu i drożdży.