Name: Profilowanie społeczności bakteryjnej fermentujących winogron traminette podczas produkcji wina przy użyciu sekwencjonowania amplikonów metagenomicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Odkryj analizę społeczności bakteryjnej podczas fermentacji winogron Traminette przy użyciu sekwencjonowania amplikonów metagenomicznych. Metoda ta pozwala zidentyfikować kluczowe taksony bakteryjne wpływające na jakość wina.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podziękowania za finansowanie z grantu Appalachian State University Research Council (URC) oraz stypendium CAPES Print Travel, które wsparły wizytę FAO na Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto - São Paulo, Brazylia. Badanie to zostało częściowo sfinansowane przez Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brazylia (CAPES) - Kod finansowy 001. ECPDM jest wdzięczna za grant CAPES Print Travel, który wsparł jej wizytę na Uniwersytecie Stanowym Appalachów. ECPDM jest pracownikiem naukowym 2 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico w Brazylii (CNPq).

1. Eksperymentalna produkcja wina
<ol>
	<li>Zdobądź winogrona Traminnette z wina Dynamis Estate w Jonesville w winnicy w Północnej Karolinie, odszypułkuj i zmiażdż, aby uwolnić moszcz do dwóch oddzielnych 600-litrowych otwartych fermentorów i pozostaw na skórkach na około 4 dni z założonymi pokrywkami.</li>
	<li>Raz dziennie przekłuwaj nakrętki, aby skóra była mokra i ograniczała produkcję lotnych kwasów (VA). 
	UWAGA: Chodzi o to, że wiele prekursorów aromatycznych (monoterpenów) znajduje się w skórkach i pozostawia sok w kontakcie ze skórką, aby zwiększyć potencjał aromatyczny wina.</li>
	<li>Po 4 dniach smoła Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand). Drożdże te zostały wybrane, ponieważ są silnym fermentorem i kojarzą się z uwydatnianiem charakteru odmianowego wina z winogron.</li>
	<li>W jednym zbiorniku, Traminette R, dodaj 20 g / hL Fermaid O, gdy brix wynosi 17,7 i 20 g / hL Fermaid O i 12,5 g / hL Fermaid K przy 13,1 g / hL, aby uzyskać bezpieczeństwo fermentacji, podczas gdy drugi zbiornik Traminette L dodaj 40 g / hL Stimula Sauvignon blanc, gdy brix wynosi 17,1. Należy również dodać 20 g/hL Fermaid O, gdy wartość Brix wynosi 13,4, aby wzmocnić charakter odmianowy wina.</li>
	<li>Pobrać podwójne próbki moszczu (dzień 1), dodanych drożdży (dzień 4), sfermentowanego moszczu (dzień 15) i gotowych próbek wina (dzień 30) i przechowywać w temperaturze -20 °C przed ekstrakcją DNA i analizą metagenomiczną.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja DNA do metagenomiki
<ol>
	<li>Wszystkie duplikaty próbek uzyskanych powyżej należy przechowywać na lodzie do czasu pierwszego odwirowania.</li>
	<li>Przenieść 20 ml sfermentowanej próbki do sterylnej probówki z nakrętką o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodać 10 ml zimnej wody i homogenizować (wirować). Wirować przez 1 minutę przy 800 x g w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Ten krok usunie ciała stałe z próbki.</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.3 dwa razy i zebrać supernatanty w tej samej probówce.</li>
	<li>Odwirować supernatant przy 3 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut w celu osadzenia komórek. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml PBS, przenieść do probówki z nakrętką o pojemności 2 ml i odwirować przy 14 000 x g przez 2 minuty. Wykonaj jeszcze dwa płukania za pomocą PBS.</li>
	<li>Na tym etapie zamroź granulki w temperaturze -20°C lub postępuj zgodnie z krokiem 2.8. Ważne jest, aby wszystkie próbki były traktowane w ten sam sposób.</li>
	<li>Dodać 978 μl buforu fosforanu sodu. Przygotować bufor fosforanu sodu, dodać 3,1 g NaH2PO4·H2O i 10,9 g Na2HPO4 (bezwodnego) do destylowanego H2O do uzyskania objętości 1 l i dostosować pH do 7,4.</li>
	<li>Dodać 122 μl buforu DNA (zestaw do wirowania DNA) i wirować.</li>
	<li>Odstawić do lodówki (4 °C) na 45 min-1 h. Próbki należy mieszać co 15 minut. Ten krok można pozostawić na noc (o/n) lub do momentu, gdy będzie gotowy do dalszego korzystania z zestawu do wirowania DNA.</li>
	<li>Przenieś 1 ml próbki do probówki z roztworem do lizy 1 (zestaw do wirowania DNA) i dokręć nakrętkę (napisz numer próbki z boku probówki, a nie na nasadce; odczynniki z zestawu usuną wszystko, co jest napisane na nasadce).</li>
	<li>Homogenizować próbkę w młynku do ubijania kulek (6,5 m/s, CY: 24 x 2) przez 60 s trzy razy. Jeśli młynek do ubijania koralików jest wyposażony w urządzenie do wkładania lodu, włóż 50 g suchego lodu pod rurki. W przeciwnym razie należy przechowywać próbki na mokrym lodzie przez 5 minut między każdym etapem homogenizacji.</li>
	<li>Wirować probówki E z matrycą lizującą (zestaw do wirowania DNA) przez 1 minutę przy 16800 x g (lub maksymalnej prędkości).</li>
	<li>Przenieść supernatant do czystej mikroprobówki. Następnie dodać 250 μl odczynnika do wytrącania białka (PPS) (zestaw do wirowania DNA) i wymieszać, potrząsając probówką ręcznie 10 razy.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 16800 x g w celu osadu.</li>
	<li>Przenieść supernatant do sterylnej probówki o pojemności 15 ml. Dodać 1 ml zawiesiny matrycy wiążącej (zestaw do spinania DNA) do supernatantu. 
	UWAGA: Przed użyciem zawiesinę matrycy wiążącej należy zawiesić do uzyskania jednorodnej konsystencji.</li>
	<li>Odwróć probówki ręcznie na 2 minuty, a następnie pozostaw probówki w stojaku na 3 minuty (aby umożliwić osiadanie matrycy krzemionkowej).</li>
	<li>Ostrożnie usunąć 1 ml supernatantu. Zawiesić matrycę w pozostałym supernatancie.</li>
	<li>Przenieść 600 μl mieszaniny do probówki z filtrem wirowym (zestaw do wirowania DNA) i odwirować przez 1 minutę przy 14500 x g.</li>
	<li>Dodaj pozostałą mieszaninę i odwiruj.</li>
	<li>Zdekantować przepływ i dodać 500 μl roztworu myjącego (zestaw do wirowania DNA) do rurki z filtrem wirowym i wirować przez 1 minutę przy 14500 x g (upewnić się, że dodano EtOH do roztworu do płukania; patrz instrukcja obsługi produktu). Zdekantować przelew i powtórzyć pranie jeszcze dwa razy (w sumie 3 prania).</li>
	<li>Zdekantować przepływ i odwirować na dodatkowe 2 minuty przy 14 500 x g, aby wysuszyć matrycę resztkowego roztworu do płukania.</li>
	<li>Wyjmij filtr wirowy i umieść go w nowej rurce wychwytującej (zestaw do wirowania DNA). Suszyć filtr wirowy na powietrzu przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Podgrzewać wodę bez DNAzy (zestaw do wirowania DNA) w temperaturze 55 °C przez 5 minut. Dodać 50 μl wody wolnej od DNA i delikatnie wymieszać matrycę na membranie filtracyjnej za pomocą końcówki pipety, aby uzyskać skuteczną elucję DNA. Pozostaw próbki w temperaturze pokojowej przez 1 minutę, a następnie odwiruj przez 1 minutę przy 14500 x g w celu wymycia DNA.</li>
	<li>Umieścić próbki na lodzie. Załadować mieszaninę próbek (2 μl próbki + 2 μl wody + 1 μl buforu ładującego) do żelu. Zmierz stężenie DNA.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Użyj spektrofotometru, aby określić ilościowo wyekstrahowane DNA. 
	UWAGA: Objętość DNA o objętości 1 μl została usunięta i określona ilościowo, a jakość DNA została odnotowana w stosunku A260/A280.</li>
</ol>
3. Elektroforeza DNA
<ol>
	<li>Przygotuj 1% żel agarozowy w buforze 0,5 Tris/Boran/EDTA (TBE) (20 ml dla mini żelu, 70-100 ml dla średniego żelu). Zważyć agarozę + bufor, zagotować w kuchence mikrofalowej do stopienia agarozy, ponownie zważyć i dodać dH2O do pierwotnej masy. Schłodzić roztwór agarozy do temperatury 55-60 °C i wlać do formy żelowej z zespołem grzebieniowym. Pozostaw żel do zestalenia.</li>
	<li>Dodać 1 μl 10x buforu ładującego żel do próbki (10 μl) i załadować na żel obok znacznika masy cząsteczkowej. Biegaj od ujemnego (czarnego) do dodatniego (czerwonego) przy napięciu 100-115 V (duży żel) lub 90 V (mini żel), aż niebieski barwnik znajdzie się blisko dna.</li>
	<li>Plamić żel przez 30 minut w 1 μl/ml bromku etydyny lub zielonym SYBR (potrzebne rękawice nitrylowe i gogle), spłukać w wodzie i view pod źródłem światła ultrafioletowego (UV). Spośród zduplikowanych próbek wybierz najwyższą wydajność do dalszego przetwarzania.</li>
</ol>
4. Sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości
<ol>
	<li>Amplifikuj hiperzmienny region V4 genu 16S rRNA za pomocą specyficznych starterów 515F (5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') i 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')22. Ustaw warunki reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) na 94 °C przez 2 min, 30 cykli po 94 °C przez 20 s, 58 °C przez 20 s, 65 °C przez 1 min i 65 °C przez 10 min (końcowe rozszerzenie).</li>
	<li>Przeprowadzić reakcje PCR z główną mieszanką PCR o wysokiej wierności (tabela materiałów).</li>
	<li>Generuj biblioteki za pomocą zestawu do przygotowywania bibliotek DNA, a następnie sekwencjonuj za pomocą sekwencjonowania sparowanych końców na platformie sekwencjonowania. 
	UWAGA: W tym przypadku biblioteki wygenerowane za pomocą NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit zostały zsekwencjonowane przy użyciu sekwencjonowania Illumina na sparowanych końcach (2 × 250 pz) na platformie novaseq6000.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z krokami sekwencjonowania:
	<ol>
		<li>Krok 1: Ścinaj DNA za pomocą enzymu, zwykle metodą, która wybiera ogólny rozmiar.
		<ol>
			<li>Dodać 3,5 μl buforu do sekwencjonowania i 1,5 μl mieszanki enzymatycznej do 25 μl DNA (ok. 1 μg), wymieszać 10 razy pipetą i szybko odwirować.</li>
			<li>Umieścić w termocyklerze w następujących warunkach: rozgrzej pokrywkę w temperaturze 75°C, (1) 30 minut w temperaturze 20 °C (2) 30 minut w temperaturze 65 °C (3) trzymaj w temperaturze 4°C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Krok 2: Dodaj adaptery za pomocą podwiązania
		<ol>
			<li>Dodać pipetą 15 μl głównej mieszanki do ligacji, 1,25 μl adaptera, 0,5 μl wzmacniacza ligacji i 30 μl mieszanki DNA do przygotowania końcowego</li>.
			<li>Inkubować w temperaturze 20 °C przez 15 minut w termocyklerze, a następnie dodać 1,5 μl odczynnika do wycinania swoistego dla uracylu (USER) do mieszaniny ligacyjnej, aby uzyskać łącznie 48,26 μl. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
			<li>Dodać 43,5 μl kulek magnetycznych do DNA ligacji adaptera, wymieszać 20 razy pipetą i inkubować przez 5 minut w temperaturze suchej masy. Oddzielić kulki za pomocą stojaka magnetycznego, następnie inkubować przez 5-10 minut i odrzucić supernatant.</li>
			<li>Umyj granulat 100 μl 80% etanolu, wysusz przez 30 s i ponownie umyj. Kulki i osad elutu eluować w 8,5 μl 10 mM Tris HCl/0,1x Tris-EDTA(TE)/HPLC H20, wymieszać pipetą i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 min.</li>
			<li>Inkubować w stojaku magnetycznym i usunąć 7,5 μl eluowanego DNA jako supernatant. Umieść elucję w nowej probówce i przeprowadź etap PCR.</li>
			<li>Najpierw dodaj 12,5 μl mieszanki wzorcowej, 2,5 μl startera indeksującego i7 i 2,5 μl uniwersalnego startera PCR/startera i5 do 7,5 μl DNA ligowanego adapterem, aby uzyskać 25 μl mieszaniny reakcyjnej PCR. Użyj następujących warunków PCR: rozgrzej pokrywkę do 103 °C. 98 °C przez 30 s, 98 °C przez 10 s, 65 °C przez 75 s, 65 °C przez 5 minut i trzymaj w temperaturze 4 °C po 10 cyklach.</li>
			<li>Oczyść amplifikowane DNA o pojemności 25 μl. Dodaj 22,5 μl kulek magnetycznych i wymieszaj 20 razy. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut i usunąć 50 μl supernatantu. Umyj kulki 100 μl 80% etanolu i usuń cały etanol, delikatnie susząc kulki przez 30 sekund.</li>
			<li>Ponownie zawiesić ciemnobrązowe kulki w 16 μl wody, wymieszać 20 razy pipetą i umieścić w stojaku magnetycznym na 30-60 s. Przenieś 15 μl do nowej probówki.</li>
			<li>Określ stężenie DNA za pomocą fluorometru. Wymieszać 90 μl buforu + 1 μl barwnika + 2 μl próbki z biblioteki DNA i odczytać stężenie. Rozcieńczyć DNA do 2 nM, załadować 27-30 μl do komórki przepływowej i umieścić ją w sekwenatorze.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Krok 3: Zsekwencjonuj adaptery, zhybrydyzuj biblioteki wygenerowane powyżej z matrycą wzorzystej komórki przepływowej i przechwyć DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj go jako szablonu dla drugiej syntezy.
		<ol>
			<li>Następnie amplifikuj drugą nić w klaster klonalny. Linearyzuj klaster i blokuj aktywne lokacje. Dodaj starter do sekwencjonowania, aby zapewnić miejsce do sekwencjonowania przez syntezę w sekwencji zgodnie z protokołem producenta. 
			UWAGA: Chemicznie zmodyfikowane nukleotydy wiążą się z nicią matrycową DNA przy użyciu naturalnej komplementarności. Każdy nukleotyd ma znacznik fluorescencyjny i odwracalny terminator, który blokuje włączenie następnej zasady. Dlatego obecność sygnału fluorescencyjnego wskazuje, który nukleotyd jest wstawiony, a terminator jest rozszczepiany w celu związania następnej zasady.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Krok 4: Amplifikuj pojedynczą nicię, aby uzyskać klastry sekwencji, które są sekwencjonowane w tandemie przez syntezę. 
		UWAGA: Klastry dają jaśniejszy sygnał niż pojedyncza nić dzięki dwukierunkowemu skanowaniu i dwukanałowej chemii sekwencjonowania. Oprogramowanie do sekwencjonowania automatycznie przesyła pliki wywołania podstawowego (*.cbcl) do określonej lokalizacji folderu wyjściowego w celu analizy danych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Bioinformatyka
<ol>
	<li>Wygeneruj dane sekwencji jako pliki FASTQ. Przeanalizuj, aby uwzględnić następujące części.
	<ol>
		<li>Część I:
		<ol>
			<li>Zapisz pliki FASTQ uzyskane z sekwencera, kliknij, aby otworzyć plik arkusza kalkulacyjnego i utwórz pliki mapowania/metadanych.</li>
			<li>Otwórz stronę Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), prześlij pliki FASTQ, przeczytaj QC, filtrowanie i przycinanie w QIIME222. Zdeponuj surowe sekwencje jako archiwum odczytu sekwencji () i GenBank w NCBI BioProject (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Część II: Wejdź na stronę Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), wykonaj demultipleksowane odczyty sparowanych końców, błędy podstawiania filtrów i chimer, a następnie scal za pomocą DADA223. Użyj naiwnego klasyfikatora Bayesa wytrenowanego na bazie danych 99% OTU Silva w wersji 132, aby wykonać przypisanie taksonomiczne bakterii przy 97% podobieństwie24.</li>
		<li>Część III: Otwórz stronę MicrobiomeDB, kliknij, aby przesłać pliki i wygeneruj OTU alfa-różnorodność, beta-różnorodność, względną obfitość i krzywe rozrzedzenia (https://microbiomedb.org/mbio/app).</li>
		<li>Część IV: Otwórz arkusz kalkulacyjny i przenieś dane, aby utworzyć mapy cieplne, diagramy Venna i rozmiar efektu liniowej analizy dyskryminacyjnej (https://microbiomedb.org/mbio/app).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Otwórz QIIME222 i określ znaczące różnice w różnorodności alfa między grupami za pomocą skryptu alpha-group-significance. Zostanie również przeprowadzony test Kruskala-Wallisa.</li>
	<li>Określ różnice w różnorodności beta między grupami za pomocą PERMANOVA, w tym testu parami25.</li>
	<li>Uzyskaj znaczące różnice w strukturze społeczności bakteryjnej między grupami korzystającymi z MicrobiomeDB. Wartość p ≤0,05 uznano za statystycznie istotną.</li>
</ol>

Profiling the Bacterial Community in Grapes Using Amplicon Metagenomics

<ol><li>Skinkis, P. A., Bordelon, B. P., Wood, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+monoterpene+constituents+in+traminette%2C+gew%C3%BCrztraminer%2C+and+riesling+winegrapes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Enology+and+Viticulture%22%5BJournal%5D)">Comparison of monoterpene constituents in traminette, gewürztraminer, and riesling winegrapes.</a> American Journal of Enology and Viticulture. 59, 440-445 (2008).</li>
<li>Bordelon, B. P., Skinkis, P. A., Howard, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+training+system+on+vine+performance+and+fruit+composition+of+Traminette%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Enology+and+Viticulture%22%5BJournal%5D)">Impact of training system on vine performance and fruit composition of Traminette.</a> American Journal of Enology and Viticulture. 59, 39-46 (2008).</li>
<li>Reisch, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReisch%2C+BI+%22Traminette%27+Grape.+New+York+Food+and+Life+Science+Bulletin%22">Traminette' Grape. New York Food and Life Science Bulletin</a>. , Communications Services Cornell University, NYSAES, Geneva, New York. (1996).</li>
<li>Clemente-Jimenez, J. M., Mingorance-Cazorla, L., Martı́nez-Rodrı́guez, S., Las Heras-Vázquez, F. J., Rodrı́guez-Vico, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+and+oenological+properties+of+wine+yeasts+isolated+during+spontaneous+fermentation+of+six+varieties+of+grape+must%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization and oenological properties of wine yeasts isolated during spontaneous fermentation of six varieties of grape must.</a> Food Microbiology. 21, 149-155 (2004).</li>
<li>Attila, K. Ã, Kluz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+microflora+of+wine+grape+berries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Biotechnology+and+Food+Sciences%22%5BJournal%5D)">Natural microflora of wine grape berries.</a> Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences. 4 (special issue 1), 32-36 (2015).</li>
<li>Swiegers, J. H., Bartowsky, E. J., Henschke, P. A., Pretorius, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+and+bacterial+modulation+of+wine+aroma+and+flavor+in+Microbial+modulation+of+wine+aroma+and+flavour%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Journal+of+Grape+and+Wine+Research%22%5BJournal%5D)">Yeast and bacterial modulation of wine aroma and flavor in Microbial modulation of wine aroma and flavour.</a> Australian Journal of Grape and Wine Research. 11 (2), 139-173 (2008).</li>
<li>Alonso-del-Real, J., Pérez-Torrado, R., Querol, A., Barrio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominance+of+wine+Saccharomyces+cerevisiae+strains+over+S.+kudriavzevii+in+industrial+fermentation+competitions+is+related+to+an+acceleration+of+nutrient+uptake+and+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dominance of wine Saccharomyces cerevisiae strains over S. kudriavzevii in industrial fermentation competitions is related to an acceleration of nutrient uptake and utilization.</a> Environmental Microbiology. 21 (5), 1627-1644 (2019).</li>
<li>Virdis, C., Sumby, K., Bartowsky, E., Jiranek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactic+acid+bacteria+in+wine%3A+Technological+advances+and+evaluation+of+their+functional+role%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Lactic acid bacteria in wine: Technological advances and evaluation of their functional role.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 3192(2021).</li>
<li>Burns, T. R., Osborne, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+malolactic+fermentation+on+the+color+and+color+stability+of+Pinot+noir+and+Merlot+Wine%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Enology+and+Viticulture%22%5BJournal%5D)">Impact of malolactic fermentation on the color and color stability of Pinot noir and Merlot Wine.</a> American Journal of Enology and Viticulture. 64, 370-377 (2013).</li>
<li>Piao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+bacterial+community+and+its+temporal+succession+during+the+fermentation+of+wine+grapes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontier+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Insights into the bacterial community and its temporal succession during the fermentation of wine grapes.</a> Frontier of Microbiology. 6, 809(2015).</li>
<li>Figdor, D., Gukabivale, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+against+the+odds%3A+Microbiology+of+root+canals+associated+with+post-treatment+disease+Endodontic+Topics%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Survival against the odds: Microbiology of root canals associated with post-treatment disease Endodontic Topics.</a> 18, 62-77 (2011).</li>
<li>Bokulich, N. A., Joseph, C. M. L., Greg Allen, G., Benson, A. K., Mills, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+reveals+significant+bacterial+diversity+of+botrytized+wine%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+ONE%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing reveals significant bacterial diversity of botrytized wine.</a> Plos ONE. 7 (5), e36357(2012).</li>
<li>Berbegal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metagenomic-based+approach+for+the+characterization+of+bacterial+diversity+associated+with+spontaneous+malolactic+fermentations+in+wine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">A metagenomic-based approach for the characterization of bacterial diversity associated with spontaneous malolactic fermentations in wine.</a> International Journal of Molecular Science. 20, 3980(2019).</li>
<li>Leveau, J. H., Tech, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grapevine+microbiomics%3A+bacterial+diversity+on+grape+leaves+and+berries+revealed+by+high-throughput+sequence+analysis+of+16S+rRNA+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22International+Symposium+on+Biological+Control+of+Postharvest+Diseases%3A+Challenges+and+Opportunities%22%5BJournal%5D)">Grapevine microbiomics: bacterial diversity on grape leaves and berries revealed by high-throughput sequence analysis of 16S rRNA amplicons.</a> International Symposium on Biological Control of Postharvest Diseases: Challenges and Opportunities. 905, 31-42 (2010).</li>
<li>Rubiola, S., Macori, G., Civera, T., Fanning, S., Mitchell, M., Chiesa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+full-length+16s+RNA+metabarcoding+and+whole+metagenome+sequencing+suggests+the+use+of+either+is+suitable+for+large-scale+microbiome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Foodborne+Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Comparison between full-length 16s RNA metabarcoding and whole metagenome sequencing suggests the use of either is suitable for large-scale microbiome studies.</a> Foodborne Pathogens and Disease. 19, 495-504 (2022).</li>
<li>Bokulich, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+among+wine+grape+microbiome%2C+metabolome%2C+and+fermentation+behavior+suggest+microbial+contribution+to+regional+wine+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Mbio%22%5BJournal%5D)">Associations among wine grape microbiome, metabolome, and fermentation behavior suggest microbial contribution to regional wine characteristics.</a> Mbio. 7 (3), e00631-e00716 (2016).</li>
<li>Siren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omics+and+potential+applications+in+wine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multi-omics and potential applications in wine production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 56, 172-178 (2019).</li>
<li>Kidd, S. P., Bastian, S. E. P., Eisenhofer, R., Welsh, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+viable+grapevine+microbiome+to+enhance+the+quality+of+wild+wines%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Australia%22%5BJournal%5D)">Monitoring the viable grapevine microbiome to enhance the quality of wild wines.</a> Microbiology Australia. 44 (1), 13-17 (2023).</li>
<li>Lorenz, P., Eck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomics+and+industrial+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Metagenomics and industrial applications.</a> Nature Reviews Microbiology. 3, 510-516 (2005).</li>
<li>Tosi, E., Azzolini, M., Guzzo, F., Zapparoli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+different+fermentation+behaviours+of+two+indigenous+strains+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+uvarum+isolated+from+Amarone+wine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evidence of different fermentation behaviours of two indigenous strains of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces uvarum isolated from Amarone wine.</a> Journal of Applied Microbiology. 107 (1), 210-218 (2009).</li>
<li>Stefanini, I., Cavalier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+approaches+to+investigate+the+contribution+of+the+vineyard+environment+to+the+quality+of+wine+fermentation%3A+potentials+and+difficulties%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Metagenomic approaches to investigate the contribution of the vineyard environment to the quality of wine fermentation: potentials and difficulties.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 991(2018).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 5, 335-336 (2010).</li>
<li>Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DADA2%3A+High-resolution+sample+inference+from+Illumina+amplicon+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data.</a> Nature Methods. 13, 581-583 (2016).</li>
<li>Quast, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SILVA+ribosomal+RNA+gene+database+project%3A+improved+data+processing+and+web-based+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools.</a> Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).</li>
<li>Anderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+non-parametric+multivariate+analysis+of+variance%5BTitle%5D)+AND+%22Austral+Ecology%22%5BJournal%5D)">A new method for non-parametric multivariate analysis of variance.</a> Austral Ecology. 26 (1), 32-46 (2001).</li>
<li>Bolyen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interactive%2C+scalable+and+extensible+microbiome+data+science+using+QIIME+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2.</a> Nature Biotechnology. 37, 852-857 (2019).</li>
<li>Fadiji, A. E., Babalola, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomics+methods+for+the+study+of+plant-associated+microbial+communities%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Metagenomics methods for the study of plant-associated microbial communities: A review.</a> Journal of Microbiological Methods. 170, 105860(2020).</li>
<li>van Hijum, S. A., Vaughan, E. E., Vogel, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+state-of-art+sequencing+technologies+to+indigenous+food+fermentations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Application of state-of-art sequencing technologies to indigenous food fermentations.</a> Current Opinion in Biotechnology. 24, 178-186 (2013).</li>
<li>Víquez-R, L., Fleischer, R., Wilhelm, K., Tschapka, M., Sommer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jumping+the+green+wall%3A+The+use+of+PNA-DNA+clamps+to+enhance+microbiome+sampling+depth+in+wildlife+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Jumping the green wall: The use of PNA-DNA clamps to enhance microbiome sampling depth in wildlife microbiome research.</a> Ecology and Evolution. 10 (20), 11779-11786 (2020).</li>
<li>Bukin, Y. S., Galachyants, P., Yu,, Morozov, I. V., Bukin, S. V., Zakharenko, A. S., Zemskaya, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+16S+rRNA+region+choice+on+bacterial+community+metabarcoding+results%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results.</a> Scientific Data. 6, 190007(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Protokół metagenomiki rozpoczyna się od pobrania próbek moszczu gronowego, a po dodaniu drożdży do moszczu, fermentującego wina i końcowych próbek wina. Następnie przeprowadzono ekstrakcję zduplikowanego DNA, którą udało się wyekstrahować z tych próbek. Otrzymane ilości różniły się stężeniem od 15 ng/ μL do 87 ng/ μL. To pokazuje, że protokół ekstrakcji DNA jest skuteczny w badaniach metagenomicznych wina. Chociaż jakość DNA w A260/A280 jest różna, można to przypisać różnym parametrom, które mogą wpływać na ekstrakcję, t...

Winogrono Traminette charakteryzuje się produkcją najwyższej jakości wina, a także znaczną wydajnością i częściową odpornością na kilka infekcji grzybiczych1,2,3. Naturalna fermentacja winogron opiera się na powiązanych mikroorganizmach, środowisku produkcji wina i naczyniach fermentacyjnych4,5. Często wiele winiarni opiera się na dzikich drożdżach i bakteriach do fermentacji, produkcji alkoholu, estrów, aromatu i rozwoju smaku6.
Celem tego badania jest zbadanie składu bakteryjnego winogron i monitorowanie ich dynamiki podczas fermentacji. Chociaż współczesne zastosowanie kultur starterowych, takich jak Saccharomyces cerevisiae, do pierwotnej fermentacji, w której wytwarzany jest alkohol, jest wspólne dla różnych stylów wina7. Ponadto wtórna fermentacja, w której kwas jabłkowy jest dekarboksylowany przez Oenococcus oeni do kwasu mlekowego, poprawia profil organoleptyczny i smakowy wina oraz zmniejsza kwasowość wina8,9. Dzięki niedawnym postępom w stosowaniu metod niezależnych od kultur, możliwe jest teraz określenie różnych drobnoustrojów związanych z winogronami oraz gatunków, które są przenoszone do moszczu i uczestniczą w fermentacji w różnym czasie, aż do produktu końcowego10.
Role i dynamika dzikich bakterii z różnych winogron przenoszonych do moszczu podczas fermentacji wina są słabo poznane. Taksonomia wielu z tych bakterii nie jest nawet znana lub ich właściwości fenotypowe nie są scharakteryzowane. To sprawia, że ich zastosowanie w fermentacji kokulturowej jest nadal słabo wykorzystywane. Jednak analiza oparta na kulturach mikrobiologicznych została wykorzystana do określenia populacji bakterii związanych z winogronami i winem10. Powszechnie wiadomo, że selektywne posiewanie kultur jest żmudne, podatne na zanieczyszczenia, ma niską odtwarzalność, a wydajność może być wątpliwa; Brakuje mu również gatunków bakterii, których wymagania dotyczące wzrostu są nieznane. Wcześniejsze badania wskazują, że niezależne od hodowli, oparte na genach 16S rRNA metodologie oferują bardziej niezawodne i opłacalne podejście do charakteryzowania złożonych społeczności drobnoustrojów11. Na przykład sekwencjonowanie hiperzmiennych regionów genu 16S rRNA zostało z powodzeniem wykorzystane do badania bakterii w liściach winogron, jagodach i winie12,13,14. Badania wykazały, że zastosowanie metabarcodingu 16S rRNA lub sekwencjonowania całego metagenomu jest odpowiednie do badań mikrobiomu15. Pojawiają się informacje na temat możliwego związku różnorodności bakterii z ich atrybutami metabolicznymi podczas produkcji wina, co może pomóc w określeniu właściwości enologicznych i terroir16.
Podkreślono potrzebę maksymalizacji zalet narzędzi metagenomicznych wykorzystujących sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) do badania ekologii mikrobiologicznej winogron i wini16,17. Również stosowanie metod niezależnych od kultur opartych na sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości w celu profilowania różnorodności mikrobiologicznej ekosystemu żywności i fermentacji stało się bardzo istotne i cenne dla wielu laboratoriów i jest zalecane do użytku przemysłowego18,19. Zapewnia to przewagę w postaci wykrywania i profilowania taksonomicznego obecnych populacji drobnoustrojów oraz udziału mikroorganizmów środowiskowych, ich względnej liczebności oraz różnorodności alfa i beta20. Sekwencjonowanie zmiennego regionu regionu 16S stało się ważnym genem z wyboru i było wykorzystywane podczas różnych badań ekologicznych nad drobnoustrojami.
Podczas gdy wiele badań skupia się na grzybach, zwłaszcza drożdżach, podczas fermentacji wina21, to badanie wykazało sekwencjonowanie amplikonów 16S i narzędzia bioinformatyczne używane do badania bakterii podczas fermentacji winogron Traminette do produkcji wina.

<table><tbody><tr><td>Żel agarozowy&nbsp;</td><td>Promega, Madison, WI USA</td><td>V3121</td><td>Elektroforeza&nbsp;</td></tr><tr><td>FastPrep DNA spinKit do gleby&nbsp;</td><td>MP Biomedicals, Solon, OH USA</td><td>116560-200</td><td>Ekstrakcja DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie FastQC</td><td>Babraham Institute, Wielka Brytania</td><td></td><td>Bioinformatyka&nbsp;</td></tr><tr><td>Fermaid O</td><td>Scott Laboratory, Petaluma, Kalifornia, Stany Zjednoczone&nbsp;</td><td></td><td>Fermentacja&nbsp;</td></tr><tr><td>Mieszanka wzorcowa PCR o wysokiej wierności&nbsp;</td><td>New England Biolabs, USA</td><td>F630S</td><td>Reakcja łańcuchowa polimerazy do sekwencjonowania&nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra</td><td>New England Biolabs, Stany Zjednoczone</td><td>NEB #E7103</td><td>Przygotowanie biblioteki</td></tr><tr><td>DNA NEBNext Ultra II&nbsp;</td><td>Illumina, San Diego, Kalifornia&nbsp; Sekwencjonowanie DNA w USA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie sterujące NovaSeq (NVCS)</td><td>Illumina, San Diego, CA&nbsp; Sekwencjonowanie DNA w USA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Platforma Novaseq6000&nbsp;</td><td>Illumina, San Diego, Kalifornia&nbsp; Sekwencjonowanie DNA w USA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwantyfikacja DNA QuiBit</td><td>Thermoscientific, Waltham, MA, USA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Spektrofotometr Quickdrop&nbsp;</td><td>Urządzenie molekularne, San Jose, Kalifornia, kwantyfikacja DNA USA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosforan sodu&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>342483</td><td>Bufor do ekstrakcji DNA</td></tr><tr><td>Stimula Sauvignon Blanc</td><td>Scott Laboratory, Petaluma, CA USA&nbsp;</td><td></td><td>Fermentacja&nbsp;</td></tr></tbody></table>

profilowanie społeczności bakteryjnej fermentujących winogron traminette podczas produkcji wina przy użyciu sekwencjonowania amplikonów metagenomicznych

Profiling the Bacterial Community of Fermenting Traminette Grapes during Wine Production using Metagenomic Amplicon Sequencing

Postępy w technologii sekwencjonowania i stosunkowo łatwy dostęp do narzędzi bioinformatycznych do profilowania struktur społeczności mikrobiologicznej ułatwiły lepsze zrozumienie zarówno kulturowych, jak i niekulturowych mikrobów w winogronach i winie. Podczas fermentacji przemysłowej drobnoustroje, znane i nieznane, są często odpowiedzialne za rozwój produktu i jego nieprzyjemny smak. W związku z tym profilowanie bakterii od winogron do wina może umożliwić łatwe zrozumienie dynamiki mikrobiologicznej in situ. W tym badaniu bakterie winogron Traminette muszą przejść fermentację, a końcowe wino poddano ekstrakcji DNA, która dała od 15 ng/μL do 87 ng/μL. Zsekwencjonowano amplikon 16S hiperzmiennego regionu regionu V4, stosunkowo liczne bakterie składające się z gromady Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota, a następnie Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxocococat i Acidobacteriota. Analiza diagramu Venna wspólnych unikalnych operacyjnych jednostek taksonomicznych (OTU) wykazała, że 15 typów bakterii było wspólnych zarówno dla moszczu winogronowego, na etapie fermentacji, jak i końcowego wina. Gromady, które nie były wcześniej zgłaszane, zostały wykryte za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S, a także rodzaje, takie jak Enterobacteriaceae i Lactobacillaceae. Zbadano różnice w stosowaniu organicznych składników odżywczych w winie i ich wpływ na bakterie; Zbiornik Traminette R zawierający Fermaid O i Traminette L stymulowany Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. Różnorodność alfa za pomocą testu Kruskala-Wallisa określiła stopień równomierności. Różnorodność beta wskazywała na zmianę bakterii na etapie fermentacji w przypadku dwóch zabiegów, a końcowe bakterie w winie wyglądały podobnie. Badanie potwierdziło, że sekwencjonowanie amplikonów 16S może być stosowane do monitorowania zmian bakteryjnych podczas produkcji wina w celu wspierania jakości i lepszego wykorzystania bakterii winogronowych podczas produkcji wina.

Najpierw określono ilość i jakość DNA wyekstrahowanego z winogron, wina w procesie fermentacji oraz wina gotowego; wartości ilościowe mieściły się w zakresie 15-87 ng/µL (Tabela 1).
Sekwencjonowanie i bioinformatyka 
Sekwenator wysokoprzepływowy Illumina wygenerował plik FASTQ, który zaimportowano do systemu Nephele i przeanalizowano na platformie QIIME 226. W pierwszej kolejności do sprawdzenia jakości sekwencji uży...

Tutaj prezentujemy protokół opisujący metagenomiczny amplikon do określania społeczności bakteryjnej winogron Traminette, winogron fermentujących i końcowego wina.

Profilowanie społeczności bakteryjnej fermentujących winogron traminette podczas produkcji wina przy użyciu sekwencjonowania amplikonów metagenomicznych

Advances in sequencing technology and the relatively easy access to the use of bioinformatics tools to profile microbial community structures have ...

Zakres badań koncentruje się na zrozumieniu mikrobiomu fermentacyjnego. Ma to na celu udzielenie odpowiedzi na pytania, takie jak różnorodność drobnoustrojów w naturalnej fermentacji i jakie geny kodujące metabolit są niezbędne dla smaku i bezpieczeństwa? Jednym z najnowszych osiągnięć w naszej dziedzinie jest zrozumienie, w jaki sposób dynamika mikrobiomu koreluje z profilem metabolicznym obserwowanym w sfermentowanej żywności i napojach.Sekwencje nowej generacji wyróżniają się jako kluczowa technologia, która obecnie napędza postęp w naszej dziedzinie badawczej. Na początek przenieś 20 mililitrów sfermentowanej próbki winogron do sterylnej 50-mililitrowej probówki z nakrętką. Następnie dodaj 10 mililitrów zimnej wody do probówki i wiruj w celu homogenizacji.Odwirować próbkę o masie 800 g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant do nowej 50-mililitrowej probówki i odwirować przy 3 000 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze PBS.Przenieś zawiesinę komórek do dwumililitrowej probówki z nakrętką i odwiruj przy 14 000 g przez dwie minuty. Teraz ponownie zawiesić osad w 978 mikrolitrach buforu fosforanu sodu o pH 7,4 i 122 mikrolitrach buforu DNA. Zwiruj rurkę i umieść ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 45 minut do jednej godziny.Przenieś jeden mililitr próbki do jednorurkowej probówki roztworu do lizy i dokręć nakrętkę. Homogenizować próbkę trzy razy w młynku do ubijania kulek przez 60 sekund każdy. Następnie odwiruj rurkę elektroniczną Lysing Matrix przez jedną minutę przy 16 800 g.Przenieś sat do czystej mikroprobówki i dodaj do probówki 250 mikrolitrów roztworu do wytrącania białek. Wstrząśnij probówką 10 razy, aby wymieszać zawartość. Odwirować próbkę przez pięć minut przy 16 800 g i przenieść supernatant do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów.Następnie dodać jeden mililitr zawiesiny matrycy wiążącej do supernatantu i mieszać, odwracając probówki przez dwie minuty przed umieszczeniem ich w stojaku na trzy minuty. Po usunięciu jednego mililitra supernatantu, ponownie zawiesić matrycę w pozostałym supernatancie. Przenieść 600 mikrolitrów mieszaniny do rurki z filtrem wirowym i odwirować.Następnie zdekantować przepływ i dodać 500 mikrolitrów roztworu myjącego do rurki z filtrem wirowym. Wyjmij filtr wirowy i umieść go w świeżej rurce wychwytującej na pięć minut. Po wysuszeniu dodaj 50 mikrolitrów ciepłej wody wolnej od DNA na membranę filtracyjną i delikatnie wymieszaj matrycę końcówką pipety.Wirować przy 14, 500 g przez jedną minutę, aby wymyć DNA. Załadować próbkę do żelu agarozowego. Na koniec zmierz stężenie DNA.Na początek użyj specyficznych starterów 515F i 806R do amplifikacji hiperzmiennego regionu V4 genu 16S rRNA. Wykonaj PCR w podanych warunkach. Następnie dodaj do probówki 3,5 mikrolitra buforu sekwencjonującego i 1,5 mikrolitra mieszanki enzymatycznej.Po wymieszaniu i odwirowaniu próbki należy przeprowadzić reakcję termocyklera. Teraz dodaj mieszaninę do podwiązania adaptera do probówki i inkubuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 15 minut w termocyklerze. Dodaj 1,5 mikrolitra enzymu odczynnika przedłużającego specyficznego dla uracylu do mieszaniny ligacyjnej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.Teraz dodaj 43,5 mikrolitra kulek magnetycznych do DNA ligacji adaptera i wymieszaj 20 razy. Po pięciu minutach umieść probówkę w stojaku magnetycznym na pięć do 10 minut w celu oddzielenia kulek i wyrzuć supernatant. Umyj granulat 100 mikrolitrami 80% etanolu i susz kulki przez 30 sekund.Aby wymyć kulki i osad, dodaj 8,5 mikrolitra 10-milimolowego Tris-Hcl do probówki i inkubuj przez dwie minuty. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym i usuń 7,5 mikrolitra wymykającego się DNA jako supernatantu do nowej probówki. Dodaj odczynniki PCR do adaptera ligowanej probówki zawierającej DNA, aby wywołać reakcję o objętości 25 mikrolitrów.Aby oczyścić amplifikowane DNA, dodaj 22,5 mikrolitra kulek magnetycznych do probówki i wymieszaj 20 razy. Po pięciu minutach usuń 50 mikrolitrów supernatantu i umyj kulki 100 mikrolitrami 80% etanolu. Ponownie zawieś ciemnobrązowe kulki w 16 mikrolitrach wody i wymieszaj 20 razy.Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na 30 do 60 sekund i przenieś 15 mikrolitrów do nowej probówki. Wymieszaj 90 mikrolitrów buforu, jeden mikrolitr barwnika i dwa mikrolitry próbki z biblioteki DNA i odczytaj stężenie DNA na fluorometrze. Po rozcieńczeniu DNA do dwóch nanomolowców załaduj od 27 do 30 mikrolitrów komórki przepływowej i umieść ją w sekwencerze.Zapisz pliki FASTQ uzyskane z sekwencera. Kliknij, aby otworzyć plik arkusza kalkulacyjnego i utworzyć plik mapowania lub metadanych. Otwórz stronę internetową Nephele, prześlij pliki FASTQ i przeczytaj QC.In QIIME 2, wykonaj filtrowanie i przycinanie.Następnie, korzystając z DADA2, wykonaj demultipleksowane odczyty sparowanych końców, podstawienie filtrów, błędy chimery i scalanie. Użyj naiwnego klasyfikatora Bayesa wyszkolonego w bazie danych SILVA w wersji 132, 99%Operational Taxonomic Unit lub OTU, aby wykonać przypisanie taksonomiczne bakterii z 97% podobieństwem. Otwórz stronę MicrobiomeDB, kliknij, aby przesłać pliki i wygenerować różnorodność alfa OTU, różnorodność beta, względną liczebność i krzywe rozrzedzenia.Na koniec otwórz arkusz kalkulacyjny i przenieś dane, aby utworzyć mapy cieplne, diagramy Venna i rozmiar efektu liniowej analizy dyskryminacyjnej. Mapa cieplna oparta na względnej liczebności bakterii na różnych etapach produkcji wina wykazała dominację takich typów jak Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota i Fusobacteriota. Na poziomie rodzaju zidentyfikowano ważne genary, takie jak Enterobacteriaceae i Lactobacillaceae.Analiza diagramu Venna ujawniła 15 wspólnych unikalnych OTU, od moszczu winogronowego po końcowe wino. Wyniki sekwencjonowania Amplicon w oparciu o region zmiennej V4 wykazały również różnorodność alfa w dwóch analizach Traminette R i L. Beta różnorodność wykazała zmianę bakterii podczas fermentacji, ale skład bakteryjny w końcowym winie był podobny do tego na etapie moszczu i drożdży.

profiling-bacterial-community-fermenting-traminette-grapes-during

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Scharakteryzowanie społeczności mikrobiologicznej było od dawna celem w mikrobiologii środowiskowej. Metody sekwencjonowania nowej generacji pozwalają obecnie na scharakteryzowanie społeczności drobnoustrojów na niespotykanej dotąd głębokości przy minimalnych kosztach i nakładzie pracy. Szczegółowo opisujemy tutaj nasze podejście do sekwencjonowania bakteryjnych genów rybosomalnego RNA 16S za pomocą sekwenatora laboratoryjnego.

Sekwencjonowanie nowej generacji amplikonów genu rybosomalnego RNA 16S

Opisujemy wydajną, solidną i opłacalną metodę ekstrakcji kwasu nukleinowego z wymazów w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania amplikonów genu 16S rRNA. Metoda ta pozwala na zastosowanie wspólnego podejścia do przetwarzania wielu typów próbek i uwzględnia szereg dalszych procesów analitycznych.

Wydajna ekstrakcja kwasów nukleinowych i sekwencjonowanie genu 16S rRNA w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych

Ten artykuł opisuje zastosowanie nieukierunkowanej metabolomiki, transkryptomiki i wielowymiarowej analizy statystycznej do transkryptów i metabolitów z jagód winogron w celu uzyskania wglądu w koncepcję terroir, tj. wpływ środowiska na cechy jakości jagód.

Koncepcja terroir interpretowana za pomocą metabolomiki i transkryptomiki jagód winogron

Metagenomics została wykorzystana do zbadania mikrobiomu paszy dla bydła na kiszonkę. Analizę przeprowadzono za pomocą sekwencjonowania typu shotgun. Podejście to wykorzystano do scharakteryzowania składu zbiorowiska mikrobiologicznego w paszy dla bydła.

Analiza metagenomiczna kiszonki

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę ilościowego i kompleksowego badania metabolizmu wielu źródeł składników odżywczych. Ten przepływ pracy, oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi i procedury analitycznej, pozwala na określenie losu spożywanych składników odżywczych i pochodzenia metabolicznego cząsteczek syntetyzowanych przez mikroorganizmy.

Przebieg pracy oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi w celu zbadania metabolizmu mikrobiologicznego wielu źródeł składników odżywczych

Ten artykuł opisuje procedurę identyfikacji i charakterystyki rodziny genów w winorośli zastosowanej do rodziny Arabidopsis Tóxicos w ligazach ubikwityny Levadura (ATL) E3.

Kompleksowy przepływ pracy do metaanalizy identyfikacji i ekspresji całego genomu rodziny genów ligazy ubikwityny ATL E3 w winorośli

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy, ustandaryzowany protokół wysokoprzepustowego sekwencjonowania 16S rRNA-amplikon. Protokół wprowadza zintegrowany, ujednolicony, wykonalny i niedrogi protokół, począwszy od pobierania próbek kału poprzez analizę danych. Protokół ten umożliwia analizę dużej liczby próbek z zachowaniem rygorystycznych norm i kilkoma kontrolami.

Protokół z przewodnikiem do charakterystyki drobnoustrojów kałowych za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania danych o sekwencji amplikonów mikrobiomów gleby, ryzosfery i korzeni. Informacje te mogą być wykorzystane do zbadania składu i różnorodności zbiorowisk mikrobiologicznych związanych z roślinami i nadają się do stosowania w odniesieniu do szerokiej gamy gatunków roślin.

Badanie mikrobiomu korzeni: ekstrakcja danych o społeczności bakteryjnej z gleby, ryzosfery i endosfery korzeni

Opisana tutaj jest uproszczona standardowa procedura operacyjna do profilowania mikrobiomu przy użyciu sekwencjonowania metagenomicznego 16S rRNA i analizy przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi. Protokół ten pomoże naukowcom, którzy są nowicjuszami w dziedzinie mikrobiomu, a także tym, którzy potrzebują aktualizacji metod osiągania profilowania bakteryjnego w wyższej rozdzielczości.

Analiza mikrobioty za pomocą dwuetapowej reakcji PCR i sekwencjonowania genów 16S rRNA nowej generacji

Wąskim gardłem w cyklu "zaprojektuj-zbuduj-testuj" inżynierii mikrobiologicznej jest szybkość, z jaką możemy przeprowadzać funkcjonalne badania przesiewowe szczepów. Opisujemy wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych szczepów stosowaną do setek do tysięcy komórek drożdży na eksperyment, która wykorzystuje sekwencjonowanie RNA oparte na kropelkach.

Wysokowydajne fenotypowanie szczepów drożdży z sekwencjonowaniem RNA na bazie kropelek

Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące konstruowania, sterylizacji, montażu, utylizacji i ponownego wykorzystania kolumn autostradowych grzybów w celu wzbogacenia par bakteryjno-grzybowych oddziałujących przez autostrady grzybowe z różnych podłoży środowiskowych.

Badanie interakcji bakteryjno-grzybowych przy użyciu kolumn autostradowych grzybów w różnych środowiskach i podłożach

Odkryj analizę społeczności bakteryjnej podczas fermentacji winogron Traminette przy użyciu sekwencjonowania amplikonów metagenomicznych. Metoda ta pozwala zidentyfikować kluczowe taksony bakteryjne wpływające na jakość wina.

Profilowanie społeczności bakteryjnej fermentujących winogron traminette podczas produkcji wina przy użyciu sekwencjonowania amplikonów metagenomicznych (Wideo) | JoVE Journal

Profilowanie społeczności bakteryjnej fermentujących winogron traminette podczas produkcji wina przy użyciu sekwencjonowania amplikonów metagenomicznych

Przeglądaj więcej filmów