Name: Stosowanie pionowo ustawionych układów nanowłókien węglowych na sztywnych lub elastycznych podłożach do dostarczania biomolekuł i barwników do roślin (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 32 s
Description: Odkryj metodę dostarczania barwników i DNA do roślin za pomocą nanowłókien węglowych VACNF na elastycznych podłożach. Technika ta jest szybka, uniwersalna i skuteczna dla wielu gatunków roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Matryce z nanowłókien zostały wyprodukowane w Centrum Nauk o Materiałach Nanofazowych, które jest Biurem Naukowym Departamentu Energii (ID propozycji: CNMS2019-103 i CNMS2022-A-1182). Wsparcie ze strony CNMS jest przyznawane za pośrednictwem systemu wzajemnie ocenianych wniosków i jest udzielane bezpłatnie wybranym wnioskodawcom, którzy zamierzają opublikować swoje wyniki (http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml). Dziękujemy Kevinowi Lesterowi i CNMS za pomoc w produkcji matryc z nanowłókien. Dziękujemy dr Johnowi Caughmenowi, dr Timothy'emu McKnightowi, dr Amber Webb, Darylowi Briggsowi i Travisowi Bee za krytyczne dyskusje na temat projektowania eksperymentalnego. Dziękujemy dr Adamowi Rondinone za schemat maszyny PECVD. Dziękujemy Leslie Carol za ilustracje naukowe. Praca ta została sfinansowana przez Bioimaging Science Program, Departament Energii Stanów Zjednoczonych, Biuro Nauki, Badań Biologicznych i Środowiskowych, DE-SC0019104 oraz Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych, 2021-67013-34835. JMM był wspierany przez Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych: National Institute of Food and Agriculture: Stypendium przeddoktoranckie Agriculture and Food Research Initiative 2021-67034-35167.

1. Produkcja VACNFs (<silna klasa="xfig">Rysunek 2 i <silna klasa="xfig">Rysunek 3)
<ol>
	<li>Przędzić płytkę krzemową polimetakrylanem metylu (PMMA) 495 A4 o temperaturze 4000 obr./min i piec w temperaturze 180 °C przez 5 min. 
	UWAGA: Pozwól wafli ostygnąć przez 10 sekund przed przejściem do następnego kroku.</li>
	<li>Drugą warstwę materiału rezystancyjnego (PMMA 950 A2) pokryć warstwą rezystancji i piec w temperaturze 180 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Litografia wiązką elektronów służy do definiowania kropek katalizatora o średnicy 300 nm w określonych odstępach bocznych (skok: 10 μm lub 35 μm) w układach 3 mm x 3 mm.</li>
	<li>Rozwinąć rezystant w 30-40 ml ketonu metylowo-izobutylowego w stosunku 1:3: alkohol izopropylowy (IPA) przez 1,5 minuty, a następnie przepłukać go IPA i wysuszyć N2, 
	UWAGA: Sprawdź układ punktów za pomocą mikroskopu jasnego pola (obiektyw 20x).</li>
	<li>Oczyść płytkę z resztkowego oporu za pomocą 6-sekundowej ekspozycji w plazmie tlenowej (descum) w wytrawiaczu krzemowym.</li>
	<li>Za pomocą parowania wiązką elektronów należy najpierw nałożyć warstwę kleju z metalu (Ti lub Cr, 10 nm), a następnie nałożyć drugą warstwę, którą jest katalizator Ni (130 nm lub 150 nm). Podczas osadzania metalu Ti lub Ni należy utrzymywać prąd poniżej 0,2 A przy 10 kV, ciśnienie poniżej 5 x 10-6 Torr, a szybkość stapiania na poziomie ~1 A/s dla osadzania w linii wzroku.</li>
	<li>Użyj sekwencyjnej sonikacji w kąpieli, aby usunąć metal (Ni) osadzony na leżącej poniżej warstwie rezystancyjnej, pozostawiając Ni osadzony bezpośrednio na płytce krzemowej. Ten proces nazywa się lift-off.
	<ol>
		<li>W tym celu należy przygotować 3 pojemniki z acetonem i zanurzyć płytkę w sonikacji w acetonie przez 1 minutę; powtórzyć 3 razy w temperaturze pokojowej (RT, 20 °C) z częstotliwością 35 kHz. Spłukać IPA i osuszyć N2, 
		UWAGA: Nigdy nie pozwól, aby aceton wyschł na płytce. Po ostatniej sonikacji acetonu natychmiast spłukać IPA, a następnie osuszyć gazemN2. Jeśli w którymkolwiek momencie wafel stanie się przedwcześnie suchy (przed płukaniem IPA), istnieje możliwość, że nie cały nadmiar metalu i oporu zostanie usunięty, a aceton może pozostawić osad.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdź geometrię kształtu katalizatora za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Aby przechwycić obrazy SEM chipów VACNF, przechyl stolik pod kątem 30° i użyj napięcia 1-3 kV, z prądem wiązki ~100 pA i odległością roboczą ~5 mm. 
	UWAGA: Katalizator powinien wyglądać jak krążek hokejowy (kompaktowy cylinder) (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). Wysokość zwartego cylindra powinna odzwierciedlać grubość Ni osadzonego na płytce krzemowej. Jeśli profil kropki Ni jest wysoki i wydaje się być wklęsły u góry, przypominając wulkan (<silna klasa="xfig">Rysunek 4), to jest bardziej prawdopodobne, że katalizator rozpadnie się na wiele kropelek Ni, co spowoduje rozgałęzienie się nanowłókien węglowych9(Rysunek 4 i <silna klasa="xfig">Rysunek 5). Takie problemy mogą wynikać z odporności na topnienie podczas parowania metalu z powodu długiego czasu osadzania lub problemów z procedurą podnoszenia (<silna klasa="xfig">Rysunek 4 i <silna klasa="xfig">Rysunek 5).</li>
	<li>Poćwiartuj płytkę krzemową na ćwiartki i umieść ją w komorze do chemicznego osadzania z fazy gazowej wzmocnionej plazmą prądu stałego (dc-PECVD) z mieszaniną acetylenu i amoniaku. Zoptymalizuj parametry wzrostu, aby kontrolować długość i stożek nanowłókien (końcówki <200 nm).
	<ol>
		<li>Użyj prądu 1-1,5 A i voltage zakres 440-560 V. Podczas uprawy włókien należy zastosować fazę obróbki wstępnej z przepływem amoniaku, podczas gdy maszyna i podłoże nagrzewają się do 620 °C. Upewnij się, że włączyłeś źródło węgla (acetylen) 10 s przed uruchomieniem plazmy. 
		UWAGA: Ćwiartki wafli stosuje się w przypadku, gdy konieczna jest optymalizacja parametrów pracy maszyny PECVD. Do produkcji włókien o długości większej niż 40 μm i końcówkach o średnicy mniejszej niż 200 nm sugeruje się następujące parametry: przy grubości katalizatora Ni 130 nm należy użyć prądu 1,75 A, czasu wzrostu 70 min i stosunku acetylenu do amoniaku 45 standardowych centymetrów sześciennych na minutę (sccm) : 100 sccm. Przy grubości Ni 150 nm należy użyć prądu 1,5 A, czasu wzrostu 80 min i stosunku acetylenu do amoniaku 48 sccm : 100 sccm. Do hodowli VACNF należy użyć następujących parametrów, niezależnie od grubości katalizatora: temperatura wzrostu 620 °C, ciśnienie 10 torów podczas plazmy i wysokość głowicy prysznicowej 20 mm (<klasa silna = "xfig">Rysunek 6).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń geometrię powstałych włókien za pomocą SEM przy nachyleniu 30° z potencjałem przyspieszenia 1 kV. 
	UWAGA: Optymalne włókna będą proste i nierozgałęzione. Niemożliwe jest kontrolowanie orientacji krystalicznej katalizatora Ni za pomocą parownika wiązki elektronów. W rezultacie niektóre włókna będą się rozgałęziać z powodu odwilżania katalizatora9. Ponadto orientacja kryształów powoduje, że VACNF rosną do różnych wysokości, więc jednolita wysokość na wszystkich VACNF jest trudna.</li>
	<li>Pokryj warstwę fotorezystu (SPR955) na włóknach z prędkością 1000 obr./min przez 45 s. Następnie pokrój 1/4 wafla w kostkę na tablice 3 mm x 3 mm za pomocą piły do krojenia w kostkę. W tym momencie przechowuj włókna do późniejszego wykorzystania. 
	UWAGA: Nie wykonuj kroku 1.11, jeśli planujesz przenieść włókna na elastyczne podłoże.</li>
</ol>
2. Transfering VACNFs do elastycznego podłoża (Rysunek 7 i Rysunek 8)
<ol>
	<li>Po zsyntetyzowaniu włókien, spincoat SU-8 2015 fotorezystor na płytkach lub ćwiartkach płytek z prędkością 4000 obr./min przez 45 s.</li>
	<li>Piecz wafel na miękko przez 3 minuty w temperaturze 95 °C.</li>
	<li>Za pomocą wyrównywacza kontaktowego naświetl płytkę z maską o wzorze 3 mm i średnicy 3 mm, która jest zgodna ze zdefiniowanym wzorem z litografii wiązką elektronów przy 95 mJ/cm2, 
	UWAGA: Użyj trybu kontaktu zbliżeniowego z odstępem ekspozycji o 20 μm większym niż w przypadku najwyższego włókna. Istnieje możliwość, że włókna mogą zostać przewrócone na tym etapie procesu.</li>
	<li>Piecz po ekspozycji przez 6 minut w temperaturze 95 °C.</li>
	<li>Rozwijaj wafel w wywoływaczu SU-8 przez 15 s, opłucz go IPA i wysusz wafel za pomocą N2, przesuwając się od góry do dołu. 
	UWAGA: Podczas opracowywania wafla upewnij się, że jest on całkowicie zanurzony.</li>
	<li>Wafle wzorzyste Spincoat z ochronną warstwą cienkiego fotorezystu (SPR 955 CM 0,7) przy 3000 obr./min przez 45 s i softbake przez 30 s w temperaturze 90 °C.</li>
	<li>Umieścić cienką warstwę tlenku krzemu na płytce (2-3 nm), umieszczając ją w warstwie atomowej osadzanej przez 22 cykle w temperaturze 100 °C.</li>
	<li>Za pomocą piły do krojenia w kostkę pokrój wafel na kwadraty o wymiarach 3 mm x 3 mm. Dopasuj piłę do krojenia w kostkę do istniejącego wcześniej wzoru na płytce.</li>
	<li>Oceń geometrię powstałych włókien za pomocą SEM przy nachyleniu 30° z potencjałem przyspieszenia 3 kV.</li>
	<li>Zatrzymaj się tutaj, jeśli przechowujesz chipsy do długotrwałego użytku (>1 tydzień). Przechowuj chipsy w ciemności.</li>
	<li>Aby oddzielić podłoża elastyczne od sztywnych, należy umieścić pojedyncze wióry w acetonie na 30 minut lub do momentu, gdy SU-8 zacznie się zwijać.</li>
	<li>Folie SU-8 (dołączone lub oderwane od sztywnych podłoży) myć IPA przez 5 minut, a następnie wodą przez 5 minut. Podczas transportu umieść chipsy w komercyjnym pudełku z lepką podkładką.</li>
	<li>OPCJONALNIE: Umieść bezwłóknistą stronę folii SU-8 na taśmie rozpuszczalnej w wodzie lub na cienkiej gumie silikonowej z cienkim podłożem z politereftalanu etylenu (PET) (o grubości 12,5 μm).
	<ol>
		<li>Użyj pęsety, aby przenieść folię SU-8. Naciśnij krawędzie kwadratu SU-8, aby pomóc mu przykleić się do taśmy/gumy silikonowej-PET; Ma to na celu uniknięcie zrywania włókien. W tym momencie folie VACNF są gotowe do natychmiastowego użycia.</li>
		<li>Aby przygotować uchwyt z gumy silikonowej/PET, wykonaj następujące czynności: używając 2-częściowego zestawu do gumy silikonowej, wymieszaj ze sobą dwie części (elastomer i środek sieciujący). Następnie wytnij kwadrat PET i przyklej go taśmą do przezroczystego plastikowego naczynia. Wylej bardzo cienką warstwę gumy silikonowej na wierzch PET i utwardź go w temperaturze 80 °C przez 1-2 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Metoda na roślinie (gdzie kropla roztworu do dostarczenia jest umieszczana na powierzchni rośliny) przy użyciu włókien w sztywnym podłożu (Rysunek 1A)
<ol>
	<li>Przed użyciem usunąć fotorezystor za pomocą stopniowego płukania acetonem (100%, 5 min), IPA (100%, 5 min) i ddH2O (5 min).</li>
	<li>Umieść tkankę roślinną, która ma zostać nabity, na twardej powierzchni, aby uzyskać podparcie.</li>
	<li>Umieść 1 μl kropli barwnika lub DNA (200 ng) na powierzchni tkanki roślinnej.</li>
	<li>Umieść chip VACNF ze sztywnym podłożem na wierzchu kropli, z włóknami zorientowanymi tak, aby miały kontakt z kroplą. 
	UWAGA: Orientację wiórów można określić na podstawie "połysku" płytki. Błyszcząca strona chipa ma włókna, a nieprzezroczysta strona nie.</li>
	<li>Używając płaskiej strony pęsety, dotknij chipa. Zaznacz obszar rośliny, z którym zetknął się wiór, za pomocą markera z miękką końcówką. Wyjmij chipy VACNF po dostarczeniu. 
	UWAGA: Siła przyłożona podczas stukania będzie się różnić w zależności od rodzaju użytej tkanki roślinnej. Zaleca się przećwiczenie stukania wiórów przed przystąpieniem do nabijania włókien. Unikaj uszkodzeń tkanek roślinnych. Uszkodzenie jest widoczne, gdy można zobaczyć zarys chipa VACNF w tkance roślinnej.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.1-3.5 dla kontroli (+Barwnik/DNA, -Włókna; -Barwnik/DNA, +Włókna; i -Barwnik/DNA, -Włókna). -Włókna to bezwłóknowa strona chipa.</li>
	<li>W razie potrzeby przechowuj nienaruszone rośliny lub wycięte organy roślinne w wilgotnych komorach w warunkach długiego dnia (16 godzin światła, 8 godzin ciemności). Do wycinania narządów należy używać plastikowej szalki Petriego z mokrymi ręcznikami papierowymi.</li>
</ol>
4. Metoda on-chip (gdzie kropla roztworu do dostarczenia jest umieszczana na chipie VACNF), sztywne podłoże (Rysunek 1B)
<ol>
	<li>Przed użyciem usunąć fotorezystor za pomocą stopniowego płukania acetonem (100%, 5 min), IPA (100%, 5 min) i ddH2O (5 min).</li>
	<li>Upuść 1 μl kropli barwnika lub plazmidowego DNA (200 ng) na stronę włókna chipa VACNF ze sztywnym podłożem. Upewnij się, że umieściłeś kroplę na środku chipa i przykryj kilka włókien. Pozostaw kroplę do wyschnięcia na 15 min. 
	UWAGA: Orientację wiórów można określić na podstawie "połysku" płytki. Błyszcząca strona chipa ma włókna, a nieprzezroczysta strona nie.</li>
	<li>Podczas pracy z liśćmi lub innymi wyciętymi narządami umieść je na twardej powierzchni. Podczas pracy z nienaruszonymi roślinami umieść twardą powierzchnię pod organem, na który nakładane są VACNF.</li>
	<li>Po 15-minutowym etapie suszenia ustaw chip VACNF tak, aby strona włókna stykała się z tkanką roślinną. Dotknij chipa tylnym końcem pęsety. 
	UWAGA: Siła przyłożona podczas stukania będzie się różnić w zależności od rodzaju użytej tkanki roślinnej. Zaleca się ćwiczenie stukania wiórów.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 3.6-3.7 metody roślinnej.</li>
</ol>
5. Zastosowanie VACNFów w foliach SU-8 do tkanki roślinnej metodą on-chip (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C)
<ol>
	<li>Umieść 1 μl kropelki barwnika lub DNA (200 ng) po stronie włókien folii SU-8 i pozostaw do wyschnięcia na 10 minut. Pamiętaj, aby umieścić kroplę na środku chipa. 
	UWAGA: Czas schnięcia różni się w zależności od użytego podłoża.</li>
	<li>Za pomocą ostrej pęsety umieść folię VACNF na powierzchni rośliny. 
	UWAGA: Im dłużej folie SU-8 są pozostawione w powietrzu, tym bardziej stają się kruche. Aby ograniczyć ryzyko utraty folii SU-8, należy upewnić się, że wszystkie rośliny/próbki i sprzęt znajdują się w pobliżu folii SU-8.</li>
	<li>Delikatnie natocz mały aplikator do makijażu po folii VACNF. Zaznacz obszary, w których umieszcza się elastyczne podłoża, markerem z miękką końcówką. Usuń elastyczne podłoża z powierzchni rośliny za pomocą taśmy. 
	UWAGA: Siła przyłożona podczas zwijania aplikatora do makijażu będzie się różnić w zależności od użytych tkanek roślinnych. Przećwicz nakładanie folii VACNF przed przeprowadzeniem biomolekuły lub dostarczania barwnika. Widoczne uszkodzenia tkanek roślinnych są widoczne, gdy można zobaczyć kontury filmu VACNF w tkance roślinnej.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 5.1-5.3 dla roślin kontrolnych i magazynowych, jak wspomniano w kroku 3.7 metody na roślinie.</li>
</ol>
6. Mikroskopia i analiza obrazu dla wszystkich metod dostarczania
<ol>
	<li>Zobrazuj próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego przy użyciu długości fal emisji i wzbudzenia odpowiednich dla dostarczonej sondy fluorescencyjnej/reportera. 
	UWAGA: Czas potrzebny na przejściową przemianę różni się w zależności od gatunku rośliny i dostarczonego markera. Na przykład ekspresję markerów fluorescencyjnych wykryto po 48 godzinach u Arabidopsis w porównaniu z 96 godzinami u liści sałaty7.</li>
	<li>Podczas obrazowania spróbuj skupić się na regionie z oderwanymi włóknami. Włókna będą miały różne orientacje. Powodzenie dostawy nie zależy od pojawienia się zerwanych włókien. 
	UWAGA: Włókna będą fluorescencyjne z najczęstszymi ustawieniami wzbudzenia/emisji ze względu na tworzenie się warstwy azotku krzemu wynikającej z powstania światłowodu w PECVD18.</li>
	<li>Uchwyć co najmniej 5 obrazów dla każdej próbki. Wynikowy sygnał będzie się różnił.</li>
	<li>Zmierz wartości fluorescencji jako całkowitą fluorescencję (gęstość zintegrowaną) w konfokalnych obszarach obrazu o wymiarach 20 μm x 20 μm7 za pomocą ImageJ19.</li>
</ol>

Using Carbon Nanofiber Arrays for Efficient Biomolecule and Dye Delivery to Plants

<ol><li>Canto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+systems+in+plants%3A+potentialities+and+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Transient expression systems in plants: potentialities and constraints.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).</li>
<li>Gou, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+protoplast+transient+expression+system+for+gene+functional+studies+in+strawberry+%28Fragaria+vesca%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%2C+Tissue%2C+and+Organ+Culture%22%5BJournal%5D)">Optimization of the protoplast transient expression system for gene functional studies in strawberry (Fragaria vesca).</a> Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 141, 41-53 (2020).</li>
<li>Baltes, N. J., Gil-Humanes, J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+and+agriculture%3A+Opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Genome engineering and agriculture: Opportunities and challenges.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 149, 1-26 (2017).</li>
<li>Ren, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+protoplast+isolation+and+transient+expression+system+for+functional+characterization+of+flowering+related+genes+in+Cymbidium+orchids%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Highly efficient protoplast isolation and transient expression system for functional characterization of flowering related genes in Cymbidium orchids.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2264(2020).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanovehicles+for+plant+modifications+towards+pest-and+disease-resistance+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Nanovehicles for plant modifications towards pest-and disease-resistance traits.</a> Trends in Plant Science. 25 (2), 198-212 (2020).</li>
<li>Davern, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+nanofiber+arrays%3A+a+novel+tool+for+microdelivery+of+biomolecules+to+plants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Carbon nanofiber arrays: a novel tool for microdelivery of biomolecules to plants.</a> PLoS One. 11 (4), e0153621(2016).</li>
<li>Morgan, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+broadly+applicable+method+for+transient+transformation+of+plants+using+vertically+aligned+carbon+nanofiber+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">An efficient and broadly applicable method for transient transformation of plants using vertically aligned carbon nanofiber arrays.</a> Frontiers in Plant Science. 13, 1051340(2022).</li>
<li>Melechko, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertically+aligned+carbon+nanofibers+and+related+structures%3A+Controlled+synthesis+and+directed+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Vertically aligned carbon nanofibers and related structures: Controlled synthesis and directed assembly.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 97, 041301(2005).</li>
<li>Melechko, A. V., Desikan, R., McKnight, T. E., Klein, K. L., Rack, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+vertically+aligned+carbon+nanofibres+for+interfacing+with+live+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Synthesis of vertically aligned carbon nanofibres for interfacing with live systems.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 42 (19), 193001(2009).</li>
<li>Nelson-Fitzpatrick, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Novel+Materials+for+the+Design+of+Cantilever+Transducers+%5B%5D%22">Novel Materials for the Design of Cantilever Transducers [dissertation]</a>. , University of Alberta, Edmonton, Alberta. (2011).</li>
<li>Fletcher, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+flexible+arrays+of+vertically+aligned+carbon+nanofiber+electrodes+to+temperature-sensitive+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Transfer of flexible arrays of vertically aligned carbon nanofiber electrodes to temperature-sensitive substrates.</a> Advanced Materials. 18 (13), 1689-1694 (2006).</li>
<li>Keller, S., Blagoi, G., Lillemose, M., Haefliger, D., Boisen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+thin+SU-8+films%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Processing of thin SU-8 films.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (12), 125020(2008).</li>
<li>Wouters, K., Puers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusing+and+swelling+in+SU-8%3A+insight+in+material+properties+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Diffusing and swelling in SU-8: insight in material properties and processing.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (9), 095013(2010).</li>
<li>Jamal, M., Zarafshar, A. M., Gracias, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+photo-crosslinked+polymers+enable+self-assembling+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Differentially photo-crosslinked polymers enable self-assembling microfluidics.</a> Nature Communications. 2, 527(2011).</li>
<li>Williams, R., Goodman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wetting+of+thin+layers+of+SiO2+by+water%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Wetting of thin layers of SiO2 by water.</a> Applied Physics Letters. 25 (10), 531-532 (1974).</li>
<li>Kundu, A., Nogueira Campos, M. G., Santra, S., Rajaraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+vascular+delivery+of+agrochemicals+with+micromilled+microneedles+%28%C2%B5MMNs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Precision vascular delivery of agrochemicals with micromilled microneedles (µMMNs).</a> Scientific Reports. 9, 14008(2019).</li>
<li>Acanda, Y., Welker, S., Orbović, V., Levy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+agroinfiltration+method+for+transient+gene+expression+in+Citrus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient agroinfiltration method for transient gene expression in Citrus.</a> Plant Cell Reports. 40 (7), 1171-1179 (2021).</li>
<li>Pearce, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+properties+of+SiNx+coatings+as+stable+fluorescent+markers+on+vertically+aligned+carbon+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Materials+Science%22%5BJournal%5D)">Synthesis and properties of SiNx coatings as stable fluorescent markers on vertically aligned carbon nanofibers.</a> AIMS Materials Science. 1 (2), 87-102 (2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Crafts, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Translocation in plants.</a> Plant Physiology. 13 (4), 791(1938).</li>
<li>Martens, H. J., Hansen, M., Schulz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caged+probes%3A+a+novel+tool+in+studying+symplasmic+transport+in+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Caged probes: a novel tool in studying symplasmic transport in plant tissues.</a> Protoplasma. 223, 63-66 (2004).</li>
<li>Liu, J., Essner, J., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+supercapacitor+based+on+coaxially+coated+manganese+oxide+on+vertically+aligned+carbon+nanofiber+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Hybrid supercapacitor based on coaxially coated manganese oxide on vertically aligned carbon nanofiber arrays.</a> Chemistry of Materials. 22 (17), 5022-5030 (2010).</li>
<li>Saleem, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+temperature+and+cost-effective+growth+of+vertically+aligned+carbon+nanofibers+using+spin-coated+polymer-stabilized+palladium+nanocatalysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science+and+Technology+of+Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Low temperature and cost-effective growth of vertically aligned carbon nanofibers using spin-coated polymer-stabilized palladium nanocatalysts.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 16, 015007(2015).</li>
<li>Merkulov, V. I., Lowndes, D. H., Wei, Y. Y., Eres, G., Voelkl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+growth+of+individual+and+multiple+vertically+aligned+carbon+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Patterned growth of individual and multiple vertically aligned carbon nanofibers.</a> Applied Physics Letters. 76 (24), 3555-3557 (2000).</li>
<li>Retterer, S. T., Melechko, A., Hensley, D. K., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+control+of+catalyst+nanoparticles+for+the+synthesis+of+high+density+carbon+nanofiber+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Carbon%22%5BJournal%5D)">Positional control of catalyst nanoparticles for the synthesis of high density carbon nanofiber arrays.</a> Carbon. 46 (11), 1378-1383 (2008).</li>
<li>Rooks, M. J., Wind, S., McEuen, P., Prober, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+30-nm-scale+structures+for+electron+transport+studies+using+a+polymethylmethacrylate+bilayer+resist%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vacuum+Science+%26+Technology+B%3A+Microelectronics+Processing+and+Phenomena%22%5BJournal%5D)">Fabrication of 30-nm-scale structures for electron transport studies using a polymethylmethacrylate bilayer resist.</a> Journal of Vacuum Science & Technology B: Microelectronics Processing and Phenomena. 5 (1), 318-321 (1987).</li>
<li>Lee, G., Sohn, D. K., Seok, S. H., Ko, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+hole+density+variation+in+the+PECVD+reactor+showerhead+on+the+deposition+of+amorphous+carbon+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Vacuum%22%5BJournal%5D)">The effect of hole density variation in the PECVD reactor showerhead on the deposition of amorphous carbon layer.</a> Vacuum. 163, 37-44 (2019).</li>
<li>Fowlkes, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+catalyst+particle+crystallographic+orientation+in+vertically+aligned+carbon+nanofiber+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Carbon%22%5BJournal%5D)">Control of catalyst particle crystallographic orientation in vertically aligned carbon nanofiber synthesis.</a> Carbon. 44 (8), 1503-1510 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule przedstawiliśmy metody konstruowania pionowo ustawionych układów nanowłókien węglowych, przenoszenia włókien na elastyczne podłoże i nakładania włókien na sztywnym lub elastycznym podłożu do roślin w celu wykorzystania w dostarczaniu biomolekuł lub barwników do roślin. Opisaliśmy dwa ogólne podejścia, metodę on-chip i metodę on-plant, do osadzania wprowadzonych materiałów i wykazaliśmy pomyślne wyniki we włóknach na sztywnym podłożu, a także w metodzie on-chip z wykorzystaniem folii VACNF. Zastosowanie tych włókien jest prostsze w praktyce i teorii niż tradycyjne metody transformacji roślin (bombardowanie cząstkami, transformacja protoplastów za pomocą PEG lub elektroporacji) i mogą być stosowane w przypadku roślin opornych na przemiany za pośrednictwem Agrobacterium. Jednak tylko kilka komórek ulega transformacji.
Pionowo ustawione nanowłókna węglowe zostały wyprodukowane w Oak Ridge National Laboratory Center for Nanophase Materials Sciences za pomocą ich programu użytkownika. Użytkownicy mogą ubiegać się o korzystanie z tego obiektu do produkcji VACNF. Alternatywnie, chipy VACNF mogą być produkowane w pomieszczeniach czystych za pomocą maszyn do chemicznego osadzania z fazy gazowej wzmocnionej plazmą prądu stałego ze źródłem węgla22,23. Dzięki opisanym metodom istnieje kilka kroków, które mają kluczowe znaczenie dla produkcji włókien, przenoszenia włókien i stosowania chipów/folii VACNF. Aby aplikacja włókien działała, włókna muszą być proste i mieć zwężającą się średnicę <200 nm na końcu, aby dostarczyć je do komórek roślinnych, aby były skuteczne 6,7 (rysunek 3). Aby stworzyć nanowłókna węglowe o określonym rozmiarze i skoku, istnieje wiele parametrów, które można zmienić, w tym rozmiar kropki, skok boczny i ilość osadzonego katalizatora. Aby wybrać optymalny rozmiar kropki, który zostanie użyty do produkcji nanowłókien węglowych, włókna wyhodowano z różnych rozmiarów kropek (jak pokazano na rysunku 5). Odkryliśmy, że średnice 300 nm wytwarzają najlepsze włókna, stąd wybrano ten rozmiar kropki (ryc. 5). Po znalezieniu odpowiednich parametrów postanowiliśmy użyć wiórów, które mają >50% włókien o idealnej geometrii (proste i średnica końcówki <200 nm). Aby sprawdzić geometrię włókien, użyliśmy skaningowej mikroskopii elektronowej do zobrazowania losowych pól widzenia na próbce chipów/filmów VACNF.
Dodatkowo włókna muszą mieć określoną minimalną długość, aby osiągnąć dostawę w komórkach roślinnych. Znaczenie wytwarzania włókien o różnej długości polega na tym, że dłuższe włókna mogą być używane do penetracji głębszych warstw tkanek. Dłuższe włókna (o długości >40 μm) są niezbędne w przypadku folii elastycznych, ponieważ przenoszenie włókien polega na oderwaniu włókien od ich podstawy i wymaga nałożenia warstw SU-8 na wierzch włókien. Grubość robocza warstwy SU-8 użytej w tym protokole wynosi 20-35 μm. Minimalna wysokość niezbędna do przeprowadzenia porodu w obrębie naskórka różnych roślin (zakrzywionych lub płaskich) wynosi 10-15 μm 6,7. W związku z tym włókna o długościach >40 μm są niezbędne do produkcji folii VACNF. Istnieje kilka różnych parametrów, które należy wziąć pod uwagę podczas produkcji nanowłókien węglowych: materiał katalizatora, geometria katalizatora, grubość materiału katalizatora, a także warunki w komorze PECVD (stosunek gazu, ciśnienie, temperatura, prąd, wysokość głowicy prysznicowej i czas wzrostu)8,9,24,25. Aby wytworzyć nanowłókna węglowe dłuższe niż 25 μm używane przez Morgana i wsp.7 oraz Daverna i wsp.6, zwiększyliśmy ilość katalizatora Ni, zmieniliśmy stosunek acetylenu do amoniaku oraz zwiększyliśmy prąd i czas wzrostu. Dodatkowo zwróciliśmy większą uwagę na geometrię materiału katalizatora. Aby wytworzyć wysokie, proste włókna, osadzony katalizator musiał mieć kształt krążka hokejowego, a nie kształt przypominający wulkan (ryc. 4). Struktury wulkaniczne powstają z resztek fotorezystu po starcie. Aby zapobiec powstawaniu wulkanów, podczas litografii wiązką elektronów użyto podwójnej warstwy PMMA do stworzenia podcięcia26. Podcięcie pomaga w unoszeniu się osadzonego katalizatora metalowego (rysunek 2). Gruba warstwa katalizatora jest ważna dla wzrostu wysokich VACNF. Morfologia VACNF została zbadana przez Merkulova i wsp.24. Pionowe ustawienie VACNF wynika zarówno ze wzrostu końcówki katalizatora Ni, jak i z wyrównania potencjału prądu stałego prostopadłego do podłoża (ilustracja 6). Głowica prysznicowa opisuje geometrię reaktora PECVD (rysunek 6) i służy jako źródło potencjału pola elektrycznego27.
Aby zdefiniować układ kropek katalizatora za pomocą litografii wiązką elektronów, zastosowaliśmy rezystancję wiązki elektronów (polimetakrylan metylu), a następnie użyliśmy wiązki elektronów do wykonania małych otworów w rezyście o określonym kształcie i w określonych miejscach na płytce. Otwory o żądanej średnicy umieszczano na regularnej siatce o zdefiniowanym rozstawie (skoku), a przed załadowaniem podłoża do maszyny do narzędzia do litografii wiązką elektronów ładowano plik określający pożądany wzór. Oprócz wysokości włókien, kolejnym krytycznym parametrem dla udanego transferu włókien jest ilość czasu spędzonego w kąpieli acetonowej. Folie VACNF należy pozostawić w kąpieli acetonowej na tyle długo, aby ich krawędzie zaczęły się zwijać; Jeśli zostaną pozostawione w kąpieli acetonowej zbyt krótko, trudniej będzie je oderwać od wiórów i mogą pęknąć. Im starsze są wióry, tym dłużej będą musiały pozostać w kąpieli acetonowej. Po kąpieli acetonowej folie/wióry umieszczono w izopropanolu i wodzie w celu usunięcia acetonu dostępowego, a także usunięcia ochronnego fotorezystu z włókien.
Aby wykonać powlekanie wirowe, wafle lub kawałki wafli umieszcza się na uchwycie próżniowym w powlekarce wirowej, a środkowe położenie płytki jest weryfikowane za pomocą funkcji testowej powlekarki wirowej. Mała kałuża (~ 2,5 cm średnicy) rezystu jest nakładana na środek wafla i przędzona (3000 obr./min przez 45 s) Obrazy włókien przed i po powlekaniu wirowania są zawarte na rysunku 8 pokazującym zachowanie geometrii włókien (wysokość, orientacja i skok). Obecność włókien powoduje pęcznienie oporu u podstawy włókien i skutkuje grubszymi niż oczekiwano warstwami. Powlekanie wirowe po wzroście VACNF było badane przez inne grupy11,18.
Kolejnym krokiem w procesie, który ma kluczowe znaczenie, jest zapewnienie, że do chipów/folii VACNF zostanie przyłożona odpowiednia siła. Mechanizm dostarczania jest zależny od włókien tworzących małe nakłucia w ścianach komórkowych za pomocą siły impulsu pęsety stukającej w sztywne podłoża 6,7 lub toczącej się mini-aplikatorem do makijażu na elastycznych podłożach. Włókna mogą, ale nie muszą, odrywać się i pozostawać osadzone w komórkach roślinnych 6,7 bez wpływu na wynik, ale praktyka w połączeniu z badaniem pod kątem wychwytu barwnika i uszkodzenia tkanek jest konieczna, aby uzyskać właściwe ciśnienie. Ponadto ważne jest, aby wybrać odpowiednie punkty czasowe obrazowania po dostarczeniu DNA za pomocą chipów/folii VACNF, ponieważ czas do wykrytej ekspresji różni się w zależności od gatunku rośliny i typów dostarczanych wektorów7 (Figura 16).
Choć metoda ta ma szerokie zastosowanie do roślin, ma kilka ograniczeń. Na przykład dodanie cienkiej warstwy tlenku krzemu do folii VACNF nie zawsze powoduje, że folie są całkowicie hydrofilowe ze względu na ochronną warstwę fotorezystu dodaną na wierzch SU-8. Jeśli ten problem się zmaterializuje, grubsze warstwy tlenku krzemu mogą zostać zastosowane do VACNF. Aby sprawdzić, czy folie są hydrofobowe czy hydrofilowe, można je umieścić w wodzie. Jeśli folie toną, są hydrofilowe, a jeśli unoszą się na wodzie, są hydrofobowe. Dodatkowo mogą występować różnice między partiami wyprodukowanych włókien. Istnieje kilka parametrów, które można zmienić podczas uprawy włókien w maszynie dc -PECVD; to, co jest opisane w tym protokole, to zestaw parametrów dla dwóch różnych ilości katalizatora Ni. Dodatkowo, orientacja krystaliczna katalizatora Ni nie może być kontrolowana28 i pewne rozgałęzienia nieuchronnie doprowadzą do powstania włókien.
Podczas gdy w tym artykule wykazaliśmy dostarczanie barwnika fluoresceiny i DNA do komórek roślinnych przy użyciu zarówno sztywnych, jak i elastycznych substratów, metoda ta powinna mieć szerokie zastosowanie w przypadku innych biomolekuł i podejść do modyfikacji genetycznej, na przykład wyciszania RNAi dla systemów roślinnych, takich jak jabłka lub inne owoce, gdzie wytworzenie stabilnych linii transgenicznych zajęłoby lata. Co więcej, włókna te mogą być również wykorzystywane do dostarczania materiałów do edycji genetycznej lub do stabilnych przemian w roślinach.

Transformacja roślin (zarówno przejściowa, jak i stabilna) nie stała się jeszcze powszechnie osiągalna we wszystkich tkankach i gatunkach roślin. Przejściowa transformacja roślin to proces, w którym geny kodowane w plazmidach są tymczasowo wprowadzane do roślin, ale nie są stabilnie włączane do genomu. Tradycyjne metody, które wykorzystują bombardowanie cząstkami, agrobakterie, elektroporację lub obróbkę protoplastów glikolem polietylenowym, są powolne lub mogą być kłopotliwe. Co więcej, nie mają one zastosowania do każdego gatunku roślin1,2,3,4. Wykorzystanie nanomateriałów do dostarczania DNA to rozwijająca się dziedzina, która wciąż jest w powijakach5. Nanomateriały, w szczególności nanowłókna węglowe, zostały również z powodzeniem wykorzystane do dostarczania białek, dektransu i barwników do liści roślin bez wywoływania reakcji na rany6. Celem tych prac jest opracowanie szczegółowego protokołu wykorzystania jednego rodzaju nanomateriału, nanowłókien węglowych, do dostarczania biomolekuł lub barwników roślinom. Tutaj skupiamy się na DNA jako biomolekułach z wyboru, która umożliwia przejściową transformację komórek w różnych organach roślinnych.
Poprzednio, Morgan et al.7 zademonstrowali użycie nanowłókien węglowych przymocowanych do sztywnego podłoża krzemowego do przejściowego przekształcania liści sałaty, N. benthamiana i topoli, a także liści i korzeni Arabidopsis. Chociaż transformacje zakończyły się sukcesem na różnych narządach, włókna były trudniejsze do zastosowania w tkankach roślinnych o zakrzywionych powierzchniach, takich jak korzenie czy owoce. Doszliśmy do wniosku, że elastyczny nośnik dla nanowłókien może poprawić ich wydajność dostarczania poprzez lepsze dopasowanie do kształtu narządu.
Tutaj szczegółowo opisujemy metody wykorzystywane do wytwarzania i projektowania pionowo ustawionych nanowłókien węglowych, przenoszenia VACNFów na elastyczne podłoża i stosowania VACNFów zarówno na sztywnych, jak i elastycznych podłożach dla roślin, aby dostarczyć biomolekuły i barwniki. Nanowłókna węglowe wyprodukowano metodą katalitycznego osadzania chemicznego z fazy gazowej wspomaganej plazmą prądu stałego (dc C-PECVD) z katalizatorem Ni. Położenie, średnica i wysokość kropek katalizatora Ni były kontrolowane za pomocą kombinacji litografii wiązką elektronów, parowania metalu i procesów lift-off, zgodnie z opisem Melechko et al.8,9. Korzystając z dwuwarstwowego rezystu wiązki elektronów, grubszy katalizator Ni może zostać osadzony na podłożu, aby uzyskać dłuższe włókna10. Przenoszenie włókien ze sztywnego podłoża na elastyczne opiera się na modyfikacji metod opisanych w Fletcher et al.11, przy czym obecne metody rezygnują z użycia amorficznej warstwy węgla lub protektorowej warstwy fotorezystu. Start SU-8 z transferem włókien uzyskuje się poprzez wykorzystanie wewnętrznego naprężenia rozciągającego wynikającego z niedopieczenia i niedoświetlenia SU-812,13,14. SU-8, złożony polimer, jest naturalnie hydrofobowy, co utrudnia jego wykorzystanie do ułatwiania dostarczania DNA. Aby przeciwdziałać hydrofobowej naturze SU-8, nakładamy cienką warstwę tlenku krzemu poprzez osadzanie warstwy atomowej15 po osadzeniu włókien w SU-8. Nakładanie włókien na sztywne podłoże w celu dostarczania biomolekuły/barwnika wykorzystuje siłę uderzenia pęsety opisaną w Davern et al.6 oraz metody on-plant i on-chip opisane w Morgan et al.7. Elastyczne folie VACNF są nakładane na zakrzywione powierzchnie roślin poprzez najpierw półsuszenie kropelek DNA lub barwnika na folii, tak jak w przypadku metody on-chip firmy Morgan et al.7, a następnie zwijanie folii na zakrzywionych powierzchniach roślin za pomocą małego aplikatora do makijażu16,17. Rysunek 1 przedstawia różne podejścia do stosowania włókien w sztywnych i elastycznych podłożach dla roślin.

<table><tbody><tr><td>13" x 13" Biały 1/4-krotny wytrzymały przemysłowy ręcznik sklepowy Brawny 70Ct</td><td>Fastenal&nbsp;</td><td></td><td></td>690535</tr><tr><td>2-Propanol (IPA)&nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>A451-4</td><td></td></tr><tr><td>4" Pokrywa</td><td>Entegris</td><td>H22-401-0615</td><td>Nośniki wafli</td></tr><tr><td>4" Taca</td><td>Entegris</td><td>H22-40-0615</td><td>Nośniki wafli Piła</td></tr><tr><td>do krojenia w kostkę Accretech SS10 Accreteck</td><td></td><td>SS10</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fischer Scientific</td><td>A18-4</td><td></td></tr><tr><td>Aceton stosowany w pomieszczeniu czystym w ORNL</td><td>JT Baker</td><td>9005-05</td><td></td></tr><tr><td>Jabłka</td><td>Sklep spożywczy</td><td>Brak numeru</td><td></td>produktu</tr><tr><td>Arabidopsis thaliana&nbsp;</td><td>Nasiona akcesji Columbia z laboratorium profesora Jeana Greenberga na Uniwersytecie w Chicago</td><td>Brak numeru</td><td></td>produktu</tr><tr><td>Maszyna do chemicznego osadzania z fazy gazowej wzmocnionej plazmą węglową</td> prądem stałym <td>Oak Ridge National Laboratory&nbsp;</td><td>Sałata</td> zielona Cobham na <td></td>zamówienie</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Nasiona z laboratorium profesora Richarda Michelmore'a na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis</td><td>Brak numeru produktu</td><td>Sałata maślana</td></tr><tr><td>Barwnik fluoresceinowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2456-2.5G</td><td></td></tr><tr><td>Gel-box&nbsp;</td><td>Żel-Pak</td><td>&nbsp; AD-23C-00-X4</td><td></td></tr><tr><td>Heidelberg DWL 66 narzędzie do litografii bezpośredniego zapisu&nbsp;</td><td>Heidelberg</td><td>DWL 66</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Narodowe Instytuty Zdrowia&nbsp;</td><td>Brak numeru</td><td></td>produktu</tr><tr><td>Izoproponal (IPA) stosowany w pomieszczeniach czystych w ORNL</td><td>Doe and Ingalls</td><td>CMOS Grade 9079-05</td><td></td></tr><tr><td>JEOL 9300FS 100kV system litografii wiązką elektronów</td><td>JEOL</td><td>8100</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>Kimberly-Clark Professional 34120</td><td></td></tr><tr><td>Kord-Valmark jednorazowa polistyrenowa szalka Petriego</td><td>VWR</td><td>11019-554</td><td></td></tr><tr><td>Edytor układu&nbsp;</td><td>&nbsp; juspertor GmbH</td><td>Brak numeru produktu&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny LSM 710</td><td>Zeiss</td><td>Brak numeru</td><td></td>produktu</tr><tr><td>Mikroskop konfokalny LSM 800</td><td>Zeiss</td><td>Brak numeru</td><td></td>produktu</tr><tr><td>Aplikator do makijażu&nbsp;</td><td>Amazon</td><td>G2PLUS</td><td>500 SZTUK Jednorazowe mikro aplikatory Pędzel do makijażu i higieny osobistej (średnica głowy: 1,5 mm) - 5 x 100 sztuk</td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy z emisją pola Merlin</td><td>Zeiss</td><td>Merlin</td><td></td></tr><tr><td>MIBK/IPA&nbsp; (keton metylowo-izobutylowy/izopropanol) (1:3)</td><td>Microchem</td><td>M089025</td><td></td></tr><tr><td>Cebula</td><td>Sklep spożywczy</td><td>Brak numeru</td><td></td>produktu</tr><tr><td>Oxford FlexAl Osadzanie warstw atomowych</td><td>Oxford</td><td>FlexAl</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 495 A4</td><td>Microchem</td><td>M130004</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 950 A4</td><td>Microchem</td><td>M230004</td><td>Może rozcieńczać do A2</td></tr><tr><td>Politereftalan etylenu (PET)</td><td>Amazon</td><td>KS-6304-21-11</td><td>Typ D Przezroczysty arkusz PET (poliester) .0005" Gruby x 27" Szerokość x 10 stóp Długość 1 szt</td></tr><tr><td>Precyzyjna pęseta</td><td>Aven Inc.&nbsp;</td><td>18032TT</td><td></td></tr><tr><td>pUBQ10:YFP-GW</td><td>Arabidopsis Biological Resource Center</td><td>CD3-1948</td><td></td></tr><tr><td>Wytrawiacz krzemowy (używany do descum)&nbsp;</td><td>Oxford</td><td>Plasmalab</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw gumy silikonowej</td><td>Smooth-On Inc</td><td>Ecoflex 00-20</td><td></td></tr><tr><td>Wafle silikonowe</td><td>Pure Wafer</td><td>4N0.001-.005SSP-INV</td><td></td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa</td><td>Brewer Sciences</td><td>Model 100CB</td><td></td></tr><tr><td>SPR 955cm 0,7&nbsp;</td><td>Megaposit</td><td>10018314</td><td></td></tr><tr><td>Truskawki</td><td>Sklep spożywczy</td><td>Brak numeru</td><td></td>produktu</tr><tr><td>SU-8 2015</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000</td><td>Series Toksyczny. Obchodź się ostrożnie. Podczas pracy z SU-8 2000 należy nosić okulary chemiczne, rękawice chemiczne i odpowiednią odzież ochronną. Nie dostać się do oczu, na skórę lub ubranie.</td></tr><tr><td>SU-8 developer</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000 Series</td><td>Obchodzić się ostrożnie. Podczas pracy z SU-8 2000 należy nosić okulary chemiczne, rękawice chemiczne i odpowiednią odzież ochronną. Nie dostać się do oczu, na skórę lub ubranie.</td></tr><tr><td>Suss MicroTec aligner kontaktowy</td><td>Suss MicroTec</td><td>MA6/BA6</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stołowy</td><td>Phenom XL</td><td>służy do sprawdzania katalizatorów Ni po osadzaniu</td><td></td>metalu</tr><tr><td>Parownik e-beam Thermionics VE-240</td><td>Thermionics</td><td>VE-240</td><td></td></tr></tbody></table>

stosowanie pionowo ustawionych układów nanowłókien węglowych na sztywnych lub elastycznych podłożach do dostarczania biomolekuł i barwników do roślin

Using Vertically Aligned Carbon Nanofiber Arrays on Rigid or Flexible Substrates for Delivery of Biomolecules and Dyes to Plants

Dostarczanie biomolekuł i nieprzepuszczalnych barwników do nienaruszonych roślin jest dużym wyzwaniem. Nanomateriały to rozwijające się narzędzia do dostarczania DNA roślinom. Choć te nowe narzędzia są ekscytujące, nie zostały jeszcze powszechnie zastosowane. Nanomateriały wytwarzane na sztywnym podłożu (podłożu) są szczególnie trudne do skutecznego zastosowania w zakrzywionych strukturach roślin. Badanie to opisuje proces mikrowytwarzania pionowo ustawionych matryc z nanowłókien węglowych i przenoszenia ich ze sztywnego podłoża na elastyczne podłoże. Szczegółowo opisujemy i pokazujemy, w jaki sposób te włókna (zarówno na sztywnych, jak i elastycznych podłożach) mogą być wykorzystywane do przejściowej przemiany lub dostarczania barwnika (np. fluoresceiny) do roślin. Pokazujemy, w jaki sposób można przenieść VACNF ze sztywnego podłoża krzemowego na elastyczne podłoże epoksydowe SU-8 w celu utworzenia elastycznych układów VACNF. Aby przezwyciężyć hydrofobowy charakter SU-8, włókna w elastycznej folii pokryto cienką warstwą tlenku krzemu (2-3 nm). Aby użyć tych włókien do dostarczenia do zakrzywionych organów roślinnych, umieszczamy 1 μl kropli barwnika lub roztworu DNA po stronie włókien folii VACNF, czekamy 10 minut, umieszczamy folie na organie roślinnym i używamy wacika z ruchem tocznym, aby wprowadzić włókna do komórek roślinnych. Dzięki tej metodzie uzyskaliśmy dostarczanie barwnika i DNA do organów roślinnych o zakrzywionych powierzchniach.

Tutaj opisujemy metody mikrofabrykacji pionowo ustawionych nanowłókien węglowych (VACNF), przenoszenia VACNFów na elastyczne podłoża i stosowania VACNFów zarówno na sztywnych, jak i elastycznych podłożach do roślin w celu dostarczania biomolekuł i barwników.

Stosowanie pionowo ustawionych układów nanowłókien węglowych na sztywnych lub elastycznych podłożach do dostarczania biomolekuł i barwników do roślin

The delivery of biomolecules and impermeable dyes to intact plants is a major challenge. Nanomaterials are up-and-coming tools for the delivery of DNA to ...

Staramy się zademonstrować ogólną metodę dostarczania barwnika lub DNA do roślin za pomocą układów nanowłókien węglowych. Wiele roślin jest opornych na tradycyjne metody transformacji. Nasza metoda może rozwiązać ten problem za pomocą układów z nanowłókien węglowych na elastycznych sztywnych podłożach.Nasza technika jest szybka i przyjazna dla użytkownika. Może być stosowany do praktycznie każdego gatunku roślin lub organów roślinnych. Może być również używany do dostarczania innych odczynników, takich jak barwniki i białka.Zacznij od przygotowania pionowo ustawionych nanowłókien węglowych lub VACNF. Aby przenieść VACNF na elastyczne podłoże, najpierw umieść poszczególne wióry w acetonie, aby oddzielić elastyczne podłoże od sztywnego podłoża. Następnie myj folie SU-8 alkoholem izopropylowym przez pięć minut, a następnie myj wodą przez pięć minut.Podczas transportu umieść chipsy w komercyjnym pudełku z lepką podkładką. Przygotuj uchwyt PET z gumy silikonowej, mieszając elastomer i środek sieciujący z dwuczęściowego zestawu. Wytnij kwadrat PET i przyklej go taśmą w przezroczystym plastikowym naczyniu.Następnie wylej bardzo cienką warstwę gumy silikonowej na wierzch PET i utwardź go w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 1 do 2 godzin. Przenieś folię SU-8 do uchwytu PET za pomocą pęsety i umieść bezwłóknistą stronę folii SU-8 na gumie silikonowej. Naciśnij krawędzie kwadratu SU-8, aby przykleił się do PET z gumy silikonowej i uniknął odrywania włókien.Następnie umieść 1 mikrolitrową kroplę barwnika po stronie włókna folii SU-8 i pozostaw do wyschnięcia na 10 minut. Po wyschnięciu umieść folię VACNF na powierzchni rośliny za pomocą ostrej pęsety. Następnie delikatnie przetocz mały aplikator do makijażu po folii VACNF, zaznacz obszary, w których umieszcza się elastyczne podłoża markerem z miękką końcówką.Następnie usuń elastyczne podłoża z powierzchni rośliny za pomocą taśmy. Powtórz aplikację VACNF w celu kontroli, takich jak umieszczanie barwnika po bezwłóknistej stronie folii, używanie folii bez barwnika i używanie bezwłóknistej strony folii. Metoda on-chip została wykorzystana do dostarczenia barwnika fluoresceinowego do zakrzywionych powierzchni, takich jak truskawki, w których natychmiast zaobserwowano silny sygnał fluoresceiny.Natomiast w jabłkach silny sygnał fluoresceiny zaobserwowano po dwóch godzinach od porodu. Podobnie, dostarczenie plazmidu zawierającego żółte białko fluorescencyjne osiągnięto w jabłkach. Przeprowadzono również udaną przejściową transformację cebuli poprzez dostarczenie plazmidu zawierającego żółte białko fluorescencyjne za pomocą folii VACNF.Na początek usuń fotorezystor z VACNF, myjąc 100% acetonem przez pięć minut, następnie pięciominutowym myciem 100% IPA, a następnie podwójnie destylowaną wodą przez pięć minut. Następnie umieść tkankę roślinną, która ma zostać nabita, na twardej powierzchni, aby uzyskać wsparcie. Umieść 1 mikrolitrową kroplę barwnika na powierzchni tkanki roślinnej.Umieść chip VACNF ze sztywnym podłożem na wierzchu kropli z włóknami zorientowanymi tak, aby miały kontakt z kroplą. Używając płaskiej strony pęsety, dotknij wióra, zaznacz obszar rośliny, z którym wiór miał kontakt, za pomocą markera z miękką końcówką. Usuń chipy VACNF po dostawie.Powtórz te kroki dla elementów sterujących, takich jak umieszczanie barwnika po stronie bez włókien folii, używanie folii bez barwnika i używanie bezwłóknistej strony folii. Przechowuj nienaruszone rośliny lub wycięte organy roślinne w wilgotnych komorach w długich warunkach dziennych. Do wycinania narządów należy używać plastikowej szalki Petriego z mokrymi ręcznikami papierowymi.Za pomocą tej metody barwnik fluoresceinowy został dostarczony do liści Arabidopsis. Zdjęcia wykonane w różnych punktach czasowych wykazały, że barwnik fluoresceinowy został zaobserwowany natychmiast po porodzie. Podobnie, dostarczenie plazmidu zawierającego żółte białko fluorescencyjne osiągnięto w liściach Arabidopsis.

using-vertically-aligned-carbon-nanofiber-arrays-on-rigid-or-flexible

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Transport makromolekularny między komórkami roślinnymi można oceniać poprzez przejściową ekspresję białka docelowego znakowanego fluorescencyjnie oraz analizę jego rozkładu wewnątrz- i międzykomórkowego za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Analiza makromolekularnego transportu międzykomórkowego in planta z wykorzystaniem bombardowania biolistycznego

Biokompatybilne nanoczujniki zol-żel reagujące na pH mogą być wbudowane w elektrowirowane rusztowania z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA). Wyprodukowane rusztowania samoraportujące mogą być wykorzystywane do monitorowania warunków mikrośrodowiskowych in situ podczas hodowli komórek na rusztowaniu. Jest to korzystne, ponieważ konstrukt komórkowy 3D może być monitorowany w czasie rzeczywistym bez zakłócania eksperymentu.

Rusztowania samoraportujące do trójwymiarowej hodowli komórkowej

Przedstawiamy prostą metodę wytwarzania ultrawysokiej gęstości pionowo uporządkowanych małocząsteczkowych nanodrutów organicznych. Metoda ta pozwala na syntezę złożonych, heterostrukturalnych hybrydowych geometrii nanodrutów, które można niedrogo hodować na dowolnych podłożach. Struktury te mają potencjalne zastosowania w elektronice organicznej, optoelektronice, detekcji chemicznej, fotowoltaice i spintronice.

Układ ultrawysokiej gęstości pionowo ustawionych małocząsteczkowych nanodrutów organicznych na dowolnych podłożach

Ta technologia druku mikroprzepływowego 3D drukuje tablice komórek na zanurzonych powierzchniach.  Opisujemy, w jaki sposób układy komórek są dostarczane mikroprzepływowo w komórkach przepływowych 3D na zanurzone powierzchnie.  Drukując na zanurzonych powierzchniach, stworzono mikromacierze komórkowe, które umożliwiają badania przesiewowe leków i ocenę cytotoksyczności w wielu obszarach.

Zanurzone drukowanie komórek na zmodyfikowanej powierzchni za pomocą mikroskopu z ciągłym przepływem

Istniejące metody modyfikacji roślin mają ograniczone zastosowanie. Zaproponowana tu nowatorska technologia oparta na peptydach obiecuje zarówno prostotę, jak i skuteczność we wprowadzaniu egzogennych białek lub genów do pożądanych przedziałów wewnątrzkomórkowych nienaruszonych roślin.

Peptydowa metoda transportu genów i białek przez bariery komórkowe i organellarne w roślinach

Przedstawiamy protokół inżynierii fazy koronowej w bliskiej podczerwieni fluorescencyjnych jednościennych nanorurek węglowych (SWNT) przy użyciu amfifilowych polimerów i DNA do opracowania czujników dla celów molekularnych bez znanych elementów rozpoznających.

Inżynieria rozpoznawania molekularnego za pomocą polimerów biomimetycznych na jednościennych nanorurkach węglowych

Ten artykuł demonstruje technikę rozbudowy tradycyjnej, dwuwymiarowej (2D) elektroprzędzonej maty z nanowłókien w trójwymiarowe (3D) rusztowanie poprzez rozhermetyzowanie podkrytycznego płynu CO2. Te rozszerzone rusztowania są 3D, ściśle naśladują komórkowe wskazówki nanotopograficzne i zachowują funkcje cząsteczek biologicznych zamkniętych w nanowłóknach.

Ekspansja dwuwymiarowych mat z nanowłókien elektroprzędzonych do rusztowań trójwymiarowych

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak załadować CFDA do różnych miejsc w dolnych częściach Arabidopsis. Następnie przedstawiamy wynikowy wzór rozmieszczenia mukowiscydozy w pędach.

Ruch w kierunku strzału smugi CFDA załadowanej do tkanek dennego zlewu Arabidopsis

Ten manuskrypt opisuje nowatorskie urządzenie do bezpośredniego naparu roślinnego do badania skuteczności cząsteczek przeciwko bakteriom (Candidatus Liberibacter asiaticus) lub ich owadziczemu wektorowi (Diaphorina citri, Kuwayama), które w połączeniu są związane z chorobą cytrusów Huanglongbing.

Urządzenie do bezpośredniej infuzji do dostarczania cząsteczek w roślinach

Generowanie wyrównanej tkanki mięśnia sercowego jest kluczowym wymogiem dla dostosowania najnowszych osiągnięć w biologii komórek macierzystych do klinicznie użytecznych celów. W tym artykule opisujemy podejście do druku mikrokontaktowego w celu precyzyjnej kontroli kształtu i funkcji komórki. Korzystając z wysoce oczyszczonych populacji embrionalnych komórek progenitorowych serca pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych, generujemy anizotropową funkcjonalną tkankę mięśnia sercowego.

Generowanie wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego poprzez drukowanie mikrokontaktowe

Odkryj metodę dostarczania barwników i DNA do roślin za pomocą nanowłókien węglowych VACNF na elastycznych podłożach. Technika ta jest szybka, uniwersalna i skuteczna dla wielu gatunków roślin.

Stosowanie pionowo ustawionych układów nanowłókien węglowych na sztywnych lub elastycznych podłożach do dostarczania biomolekuł i barwników do roślin (Wideo) | JoVE Journal

Stosowanie pionowo ustawionych układów nanowłókien węglowych na sztywnych lub elastycznych podłożach do dostarczania biomolekuł i barwników do roślin

Przeglądaj więcej filmów