Stosowanie pionowo ustawionych układów nanowłókien węglowych na sztywnych lub elastycznych podłożach do dostarczania biomolekuł i barwników do roślin
21 lipca 2023
Tutaj opisujemy metody mikrofabrykacji pionowo ustawionych nanowłókien węglowych (VACNF), przenoszenia VACNFów na elastyczne podłoża i stosowania VACNFów zarówno na sztywnych, jak i elastycznych podłożach do roślin w celu dostarczania biomolekuł i barwników.
Staramy się zademonstrować ogólną metodę dostarczania barwnika lub DNA do roślin za pomocą układów nanowłókien węglowych. Wiele roślin jest opornych na tradycyjne metody transformacji. Nasza metoda może rozwiązać ten problem za pomocą układów z nanowłókien węglowych na elastycznych sztywnych podłożach.
Nasza technika jest szybka i przyjazna dla użytkownika. Może być stosowany do praktycznie każdego gatunku roślin lub organów roślinnych. Może być również używany do dostarczania innych odczynników, takich jak barwniki i białka.
Zacznij od przygotowania pionowo ustawionych nanowłókien węglowych lub VACNF. Aby przenieść VACNF na elastyczne podłoże, najpierw umieść poszczególne wióry w acetonie, aby oddzielić elastyczne podłoże od sztywnego podłoża. Następnie myj folie SU-8 alkoholem izopropylowym przez pięć minut, a następnie myj wodą przez pięć minut.
Podczas transportu umieść chipsy w komercyjnym pudełku z lepką podkładką. Przygotuj uchwyt PET z gumy silikonowej, mieszając elastomer i środek sieciujący z dwuczęściowego zestawu. Wytnij kwadrat PET i przyklej go taśmą w przezroczystym plastikowym naczyniu.
Następnie wylej bardzo cienką warstwę gumy silikonowej na wierzch PET i utwardź go w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 1 do 2 godzin. Przenieś folię SU-8 do uchwytu PET za pomocą pęsety i umieść bezwłóknistą stronę folii SU-8 na gumie silikonowej. Naciśnij krawędzie kwadratu SU-8, aby przykleił się do PET z gumy silikonowej i uniknął odrywania włókien.
Następnie umieść 1 mikrolitrową kroplę barwnika po stronie włókna folii SU-8 i pozostaw do wyschnięcia na 10 minut. Po wyschnięciu umieść folię VACNF na powierzchni rośliny za pomocą ostrej pęsety. Następnie delikatnie przetocz mały aplikator do makijażu po folii VACNF, zaznacz obszary, w których umieszcza się elastyczne podłoża markerem z miękką końcówką.
Następnie usuń elastyczne podłoża z powierzchni rośliny za pomocą taśmy. Powtórz aplikację VACNF w celu kontroli, takich jak umieszczanie barwnika po bezwłóknistej stronie folii, używanie folii bez barwnika i używanie bezwłóknistej strony folii. Metoda on-chip została wykorzystana do dostarczenia barwnika fluoresceinowego do zakrzywionych powierzchni, takich jak truskawki, w których natychmiast zaobserwowano silny sygnał fluoresceiny.
Natomiast w jabłkach silny sygnał fluoresceiny zaobserwowano po dwóch godzinach od porodu. Podobnie, dostarczenie plazmidu zawierającego żółte białko fluorescencyjne osiągnięto w jabłkach. Przeprowadzono również udaną przejściową transformację cebuli poprzez dostarczenie plazmidu zawierającego żółte białko fluorescencyjne za pomocą folii VACNF.
Na początek usuń fotorezystor z VACNF, myjąc 100% acetonem przez pięć minut, następnie pięciominutowym myciem 100% IPA, a następnie podwójnie destylowaną wodą przez pięć minut. Następnie umieść tkankę roślinną, która ma zostać nabita, na twardej powierzchni, aby uzyskać wsparcie. Umieść 1 mikrolitrową kroplę barwnika na powierzchni tkanki roślinnej.
Umieść chip VACNF ze sztywnym podłożem na wierzchu kropli z włóknami zorientowanymi tak, aby miały kontakt z kroplą. Używając płaskiej strony pęsety, dotknij wióra, zaznacz obszar rośliny, z którym wiór miał kontakt, za pomocą markera z miękką końcówką. Usuń chipy VACNF po dostawie.
Powtórz te kroki dla elementów sterujących, takich jak umieszczanie barwnika po stronie bez włókien folii, używanie folii bez barwnika i używanie bezwłóknistej strony folii. Przechowuj nienaruszone rośliny lub wycięte organy roślinne w wilgotnych komorach w długich warunkach dziennych. Do wycinania narządów należy używać plastikowej szalki Petriego z mokrymi ręcznikami papierowymi.
Za pomocą tej metody barwnik fluoresceinowy został dostarczony do liści Arabidopsis. Zdjęcia wykonane w różnych punktach czasowych wykazały, że barwnik fluoresceinowy został zaobserwowany natychmiast po porodzie. Podobnie, dostarczenie plazmidu zawierającego żółte białko fluorescencyjne osiągnięto w liściach Arabidopsis.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę dostarczania biomolekuł i barwników do roślin z wykorzystaniem pionowo wyrównanych nanowłókien węglowych (VACNFs). Technika ta ma zastosowanie w przypadku różnych gatunków roślin i została opracowana w celu przezwyciężenia ograniczeń tradycyjnych metod transformacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biotechnologia roślin
- Nanotechnologia
- Dostarczanie biomolekuł
Wprowadzenie
- Tradycyjne metody transformacji roślin często napotykają trudności w przypadku gatunków opornych.
- Tablice nanowłókien węglowych oferują nowatorskie podejście do efektywnego dostarczania materiału genetycznego.
- Elastyczność podłoży umożliwia ich zastosowanie na różnych powierzchniach roślin.
- Metodę tę można dostosować do różnych reagentów poza DNA, w tym do barwników i białek.
Cel badania
- Zaprezentowanie łatwego w użyciu sposobu wprowadzania barwników i DNA do tkanek roślinnych.
- Przedstawienie wszechstronnej techniki, którą można zastosować w przypadku wielu gatunków i organów roślin.
- Zwiększenie wydajności dostarczania biomolekuł w badaniach nad roślinami.
Zastosowane metody
- Przygotowanie pionowo zorientowanych nanowłókien węglowych (VACNFs).
- Przeniesienie VACNFs na elastyczne podłoża w celu zastosowania.
- Aplikacja VACNFs na powierzchnie roślin za pomocą kontrolowanej metody.
- Dostarczanie barwnika fluoresceiny oraz plazmidów do różnych tkanek roślinnych.
Główne wyniki
- Skuteczne dostarczenie barwnika fluoresceiny do truskawek i jabłek, z możliwymi do zaobserwowania sygnałami.
- Przejściowa transformacja liści cebuli i Arabidopsis za pomocą plazmidów zawierających żółte białko fluorescencyjne.
- Wykazanie skuteczności metody zarówno na sztywnych, jak i elastycznych podłożach.
- Po dostarczeniu barwnika zarejestrowano natychmiastowe i opóźnione sygnały fluorescencji.
Wnioski
- Metoda VACNF zapewnia szybki i wydajny sposób dostarczania biomolekuł do roślin.
- Technikę tę można stosować w szerokim zakresie gatunków roślin i zastosowań.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć rodzaje biomolekuł, które mogą być dostarczane przy użyciu tej metody.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywne dostarczanie biomolekuł do nienaruszonych tkanek roślinnych pozostaje wąskim gardłem w procesach biotechnologii roślin i inżynierii cech. Macierze pionowo ustawionych nanowłókien węglowych (VACNF) na elastycznych podłożach umożliwiają powtarzalne, szybkie i małoinwazyjne wprowadzanie DNA oraz barwników do szerokiej gamy organów roślinnych, w tym tych o zakrzywionych powierzchniach. Platforma ta wspiera wczesny etap walidacji celów i przyspiesza ocenę konstruktów genetycznych w różnorodnych systemach roślinnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę funkcji genów w trudnych do transformacji gatunkach i organach roślin.
- Ułatwia szybką, przejściową transformację na potrzeby genomiki funkcjonalnej i analizy szlaków sygnałowych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez umożliwienie multipleksowej dostawy i obserwacji wyników fenotypowych.
- Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celów poprzez umożliwienie dostarczenia materiału do tkanek istotnych fizjologicznie.
Przesiewy i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane systemy roślinne do dalszego przesiewania konstruktów genetycznych lub sond molekularnych.
- Standaryzuje warunki dostarczania w celu uzyskania powtarzalnych odczytów ilościowych w różnych eksperymentach.
- Umożliwia skalowalną, wysokoprzepustową ocenę poboru i ekspresji biomolekuł w tkankach roślinnych.
- Wspiera wiarygodną ocenę wydajności dostarczania i lokalizacji przy użyciu barwników fluorescencyjnych i białek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne ze strategiami translacyjnymi w zakresie biomarkerów, umożliwiając dostarczanie i detekcję w całych organach.
- Zapewnia ciągłość od wczesnej fazy odkrywania po walidację przedkliniczną w odpowiednich modelach roślinnych.
- Zmniejsza ryzyko związane z wdrażaniem konstruktów genetycznych poprzez zapewnienie szybkich odczytów funkcjonalnych in situ.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w programach rozwoju cech i ulepszania upraw.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda dostarczania oparta na VACNF integruje się z kontinuum od etapu odkrycia do badań przedklinicznych, łącząc wczesną walidację genetyczną z późniejszą oceną cech w nienaruszonych systemach roślinnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie bezpośredniego dostarczania DNA lub barwników do tkanek docelowych.
- Przesiewanie: Zapewnia systemy roślinne gotowe do analizy, z powtarzalnym dostarczaniem i ilościowymi wynikami fluorescencji.
- Analityka: Dostarcza mierzalne odczyty do porównywania wydajności dostarczania i ekspresji w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie biomarkerów i walidację funkcjonalną w całych organach oraz u różnych gatunków roślin.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku, którą można dostosować do różnych modeli roślin i ładunków molekularnych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji cech roślin.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ustandaryzowane, powtarzalne i skalowalne przepływy pracy w dostarczaniu dla zespołów B+R w obszarze roślin.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywne pod kątem kapitałowym wdrażanie konstruktów genetycznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój aktywów biotechnologii roślinnej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w wytwarzaniu nanowłókien oraz technikach obchodzenia się z roślinami.
- Wymaga dostępu do infrastruktury mikrowytwarzania i obrazowania w celu przygotowania podłoży oraz oceny dostarczania.
- Wymaga standaryzacji protokołów dostarczania i analizy odczytów pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowalna do różnych gatunków i organów roślin, w tym tych o trudnej morfologii.
- Wydajność dostarczania oraz kompatybilność z tkankami powinny zostać empirycznie zweryfikowane dla każdego nowego zastosowania.
