Ukierunkowana metabolomika próbek koralowców twardych oparta na chromatografii gazowej i spektrometrii mas

Jak każdy organizm, koralowce są zależne od doskonałego odżywiania, aby rosnąć i budować rafy dla odporności i rozmnażania oraz wytrzymywać zmieniające się warunki środowiskowe. Ale bardzo niewiele wiemy o optymalnym odżywianiu koralowców w normalnych lub zmieniających się warunkach oraz o tym, jak każdy członek holobiontu koralowego przyczynia się do tego stanu odżywienia. Koralowce to holobionty, składające się z gospodarza i różnych symbiotycznych mikroorganizmów.

Należą do nich Symbiodiniaceae, protisty, bakterie, wirusy i grzyby. Sprawność holobiontu zależy od interakcji metabolicznych między tymi członkami. Na przykład Symbiodiniaceae dostarczają fotosyntezy, które wspierają metabolizm gospodarza i pomagają mu przystosować się do zmieniających się warunków.

Aby zrozumieć to kluczowe partnerstwo, musimy osobno przeanalizować skład chemiczny i metaboliczny każdego z partnerów. Odkrycia te wykazały, że więcej informacji można uzyskać, oddzielając frakcje gospodarza i symbionu do analizy metabolicznej. Jednak decyzja o analizie oddzielnych frakcji w porównaniu z holobiontem jest ostatecznie uzależniona od pytania badawczego.

Tak więc w przypadkach, w których analiza holobiontu jest lepsza, przedstawiliśmy metodologię ekstrakcji metabolitów holobiontów oraz sugestie, jak uzyskać jak najwięcej informacji podczas analizy. Metody zastosowane w tym badaniu otwierają nowe możliwości badawcze. Obejmują one ujawnienie potencjalnych biomarkerów, identyfikację kluczowych metabolitów na określonych etapach życia lub w warunkach stresu, zrozumienie korzyści płynących z kojarzenia z określonymi gatunkami i badanie interakcji w obrębie holobiontu.

Przyszłe badania będą koncentrować się na zastosowaniu ustalonych tu protokołów w kilku obszarach badawczych, w tym w wykrywaniu biomarkerów mających zastosowanie w ochronie i odbudowie raf koralowych. Metodologia ta może być również stosowana tam, gdzie rozdzielenie frakcji nie jest możliwe dla innych miar fizjologicznych. Na przykład podczas analizy emisji lotnych metabolitów z kolonii koralowców.

Na początek spuść nadmiar wody morskiej z worka do pobierania próbek zawierającego fragmenty koralowców. Zanurz próbki w ciekłym azocie na co najmniej 30 sekund. Aby usunąć tkankę koralowca ze szkieletu, umieść sterylną torbę do pobierania próbek na lodzie, upewniając się, że jest stabilna i otwarta, ale nie zanurzona w lodzie.

Dodaj do torby 10 mililitrów zimnej, ultraczystej wody. Za pomocą sterylnej pęsety wybierz fragment koralowca umieszczony na lodzie i spłucz go zimną, ultraczystą wodą, aż nie pozostaną resztki wody morskiej. Umieść opłukany fragment koralowca w torbie zawierającej ultraczystą wodę.

Następnie odetnij około pięciomilimetrowy koniec jednomililitrowej końcówki pipety i przyklej ją taśmą do końca pistoletu pneumatycznego za pomocą taśmy izolacyjnej. Skieruj pistolet pneumatyczny na fragment koralowca z workiem do połowy zamkniętym i przepływem powietrza na niskim podłożu, aby delikatnie usunąć tkankę, wykonując okrężny ruch wody nad fragmentem. Po trzech minutach lub gdy cała tkanka zostanie usunięta ze szkieletu, wyłącz powietrze i wyjmij aerograf.

Całkowicie zamknij torbę i ściśnij całą usuniętą tkankę koralową do dolnego rogu torby. Odetnij przeciwległy róg torebki i delikatnie wlej zawartość do 15-mililitrowej rurki na lodzie. Homogenizować próbkę koralowca za pomocą mechanicznego homogenizatora piłokształtnego przez jedną minutę, aż próbka zostanie w pełni zhomogenizowana i nie będą widoczne żadne grudki.

W celu normalizacji należy pobrać jedną mililitrową porcję z homogenizowanej tkanki do liczby komórek Symbiodiniaceae, analizy zawartości białka w tkance koralowej i oszacowania chlorofilu A. W przypadku oddzielania materiału gospodarza i komórek glonów, odwirować pozostały homogenat koralowca w temperaturze 2,500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant zawierający materiał gospodarza do nowej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Dodaj dwa mililitry zimnej, ultraczystej wody do osadu glonów i wiruj, zarówno materiał gospodarza, jak i osad glonów na dwie minuty, aby ponownie zawiesić. Ponownie odwirować wszystkie próbki i przenieść supernatant zawierający materiał gospodarza do nowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Po wyrzuceniu supernatantu z osadu z glonów, należy zachować osad w oryginalnej 15-mililitrowej probówce.

Zamrozić homogenat holobiontu lub oddzielonego gospodarza we frakcjach Symbiodiniaceae w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny. Następnie liofilizuj próbki przez noc w próżni 0,01 milibara w temperaturze minus 85 stopni Celsjusza. Po pobraniu zważ każdą próbkę na wadze laboratoryjnej do oddzielnych dwulitrowych mikroprobówek wirówkowych bez plastyfikatora.

Wizualizacja mikroskopowa wykazała brak komórek Symbiodiniaceae w próbkach tkanek gospodarza po trzech etapach mycia. Podobnie stwierdzono minimalną ilość tkanki gospodarza we frakcjach symbiontów. Jednak pusty homogenat wskazywał, że wewnątrzkomórkowe Symbiodiniaceae nie zostały uwolnione ze swoich symbiosomów poprzez proste aerografowanie.

Aby wyekstrahować wewnątrzkomórkowe metabolity z liofilizowanego holobiontu, dodaj 400 mikrolitrów 100% zimnego metanolu z wewnętrznymi wzorcami do liofilizowanego holobiontu. Następnie dodaj 10 miligramów szklanych kulek przemytych kwasem i umieść probówkę we wstępnie schłodzonej wkładce młynka do perełek o częstotliwości 50 Hz na trzy minuty. Po lizie dodaj 600 mikrolitrów zimnego metanolu i wiruj przez jedną minutę.

Umieść probówkę na rożnie w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 30 minut. Aby wyekstrahować metabolity z oddzielonych liofilizowanych komórek Symbiodiniaceae, dodaj 200 mikrolitrów zimnego metanolu z wewnętrznymi wzorcami do wysuszonych komórek Symbiodiniaceae. Następnie dodaj myte kwasem szklane kulki i umieść rurkę we wstępnie schłodzonej wkładce młynka do perełek z częstotliwością 50 herców.

Po trzech minutach dodaj 800 mikrolitrów metanolu i wiruj przez 30 sekund. W celu ekstrakcji metabolitów z oddzielonej liofilizowanej tkanki gospodarza, dodaj jeden mililitr zimnego metanolu zawierającego wzorce wewnętrzne do wysuszonego materiału gospodarza i wiruj przez 20 sekund. Następnie umieść probówkę w pływającym uchwycie na probówkę w celu sonikacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 30 minut.

Następnie, w celu oczyszczenia ekstraktu metabolitowego, odwirować wszystkie próbki w temperaturze 3000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie przenieść supernatant do nowej dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej, nie naruszając osadu. Ponownie zawiesić granulat w jednym mililitrze 50% zimnego metanolu i energicznie wirować przez jedną minutę.

Ponownie odwirować, a następnie zebrać i połączyć supernatant ekstraktów polarnych z ekstraktami półpolarnymi z tej samej próbki. Odwirować zebrane ekstrakty w temperaturze 16, 100 G przez 15 minut w celu usunięcia osadów. Do analizy podamy 50 mikrolitrów każdego ekstraktu do szklanej wkładki i zagęszczamy za pomocą koncentratora próżniowego przez 30 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Analiza GCMS ujawniła 107 oznaczonych metabolitów we wszystkich zabiegach, w tym zestaw aminokwasów, kwasów organicznych, węglowodanów, kwasów tłuszczowych i steroli. K oznacza, że grupowanie zidentyfikowało trzy odrębne klastry próbek. Próbki holobiontów były pośrednie między oddzielonymi frakcjami gospodarza i symbiontów.

Chociaż K oznacza rozkłady klastrów, współrzędne równoległe i wizualizacja mapy cieplnej we względnej obfitości metabolitów wskazują, że profil holobionta bardziej odpowiadał profilowi frakcji gospodarza, znacznie różnił się zarówno od profilu gospodarza, jak i symbiontów. Profile gospodarza i symbionta znacznie różniły się od siebie, przy czym 100 indywidualnych metabolitów znacznie różniło się między frakcjami gospodarza i symbiontów.