Name: Oczyszczanie powinowactwa enzymu fibrynolitycznego z Sipunculus nudus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T12:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania powinowactwa enzymu fibrynolitycznego z Sipunculus nudus przy użyciu chromatografii argininowej lub lizynowej. Prosty, niedrogi i wydajny protokół ułatwia dalsze badania nad enzymami rozpuszczającymi skrzepy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Biuro Nauki i Technologii miasta Xiamen (3502Z20227197) oraz Biuro Nauki i Technologii prowincji Fujian (nr 2019J01070, No.2021Y0027).

1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przykładowe traktowanie
	<ol>
		<li>Ostrożnie wypreparuj świeży S. nudus (100 g) i zbierz jelito oraz jego płyn wewnętrzny.</li>
		<li>Dodać 300 ml buforu Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4) do homogenizacji (1,000 obr./min, 60 s).</li>
		<li>Zamroź i rozmroź homogenat 3x.</li>
		<li>Odwirować próbkę (10,956 × g, 0,5 h, 4 °C) i zebrać supernatant. Przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytrącanie białek
	<ol>
		<li>Zmieszać supernatant z nasyconym roztworem siarczanu amonu (dziewięć objętości) i pozostawić mieszaninę na 12 godzin w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Protokół można wstrzymać w tym miejscu i kontynuować później.</li>
		<li>Odwirować (10,956 × g, 0,5 h, 4 °C) w celu uzyskania osadu białkowego; przechowywać go w temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Resuspensja białek
	<ol>
		<li>Zawiesić osad białkowy za pomocą 30 ml buforu Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4). Przechowywać ten surowy roztwór białka w temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Chromatografia powinowactwa
<ol>
	<li>Filtracja roztworu
	<ol>
		<li>Przefiltrować surowy roztwór białka przez membranę filtracyjną o wielkości 0,22 μm. Przechowywać tę próbkę w temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypełnienie kolumn
	<ol>
		<li>Kolumnę chromatograficzną powinowactwa do matrycy argininowo-agarozowej i kolumnę chromatografii powinowactwa do chromatografii z matrycą lizyny-agarozy należy załadować odpowiednią ilość pożywki z matrycy lizyny-agarozy i pożywki z matrycą argininowo-agarozową do 5 ml pustych kolumn chromatograficznych. 
		UWAGA: Kolumna może być przechowywana w temperaturze 2-8 °C, z matrycą zanurzoną w buforze magazynowym (20% etanolu).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie powinowactwa
	<ol>
		<li>Zrównoważyć kolumnę chromatograficzną powinowactwa najpierw z ddH2O (1 ml/min, 10 objętości kolumny), a następnie buforem Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, 1 ml/min, 5 objętości kolumny).</li>
		<li>Załadować próbkę roztworu białka do wstępnie zrównoważonej kolumny (1 ml/min, objętość 1/3 kolumny). 
		UWAGA: Objętość załadowanej próbki zależy od stężenia sFE.</li>
		<li>Przemyć kolumnę buforem Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, pięć objętości kolumny).</li>
		<li>Eluować kolumnę kolejno 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M i 0,65 M NaCl (1 ml / min, pięć objętości kolumny).</li>
		<li>Poszukaj piku elucji, który powinien pojawić się w elucji 0,15 M NaCl, a następnie zbierz frakcje w probówkach o pojemności 5 ml.</li>
		<li>Zagęścić próbkę elucyjną przy użyciu ultrafiltra odśrodkowego o masie 3 kD (3,944 × g, 1,5 h, 4 °C). Przechowywać tę próbkę w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ocena czystości
<ol>
	<li>Preparat w żelu do elektroforezy poliakryloamidowej dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE)
	<ol>
		<li>Przygotuj żel SDS-PAGE zgodnie z metodą Laemmli, używając 5% skoncentrowanego żelu i 12% żelu separacyjnego13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektroforezy
	<ol>
		<li>Wymieszać próbkę (15 μl) z 5x buforem ładującym białko SDS-PAGE (1/4 objętości), podgrzewać we wrzącej wodzie przez 5 minut, naładować na żel SDS-PAGE i uruchamiać żel przy napięciu 80 V, 60 mA przez 1,5 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>analiza
	<ol>
		<li>Po elektroforezie należy wybarwić żel zestawem Silver Stain Kit, zgodnie z protokołem producenta, a następnie obserwować zabarwiony żel za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego.</li>
		<li>Analizuj czystość białka docelowego, stosując następujący wzór: czystość białka docelowego = wartość intensywności białka docelowego/wartość intensywności białka całkowitego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ocena aktywności fibrynolitycznej
<ol>
	<li>Przygotowanie płytki fibrynowej
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór fibrynogenu, mieszając 25 mg fibrynogenu z 1,25 ml soli fizjologicznej.</li>
		<li>Przygotować roztwór trombiny, całkowicie mieszając 100 j. trombiny z 1,05 ml soli fizjologicznej.</li>
		<li>Przygotować roztwór agarozy, dodając 0,5 g agarozy do 22,5 ml buforu Tris-HCl (0,02 mol/l, pH 7,4). Wymieszać i podgrzać roztwór agarozy w temperaturze 100 °C aż do całkowitego rozpuszczenia.</li>
		<li>Schłodzić roztwór agarozy do temperatury około 50 °C i dodać roztwór fibrynogenu. Następnie natychmiast dodaj roztwór trombiny, szybko wymieszaj i wlej do naczynia hodowlanego o średnicy 60 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ładowania
	<ol>
		<li>Przebić dołki o średnicy 3 mm na przygotowanych płytkach fibrynowych za pomocą sterylnego świdra i napełnić studzienki próbkami o objętości 10 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>analiza
	<ol>
		<li>Po 18 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C zmierzyć aktywność fibrynolityczną poprzez obliczenie wielkości ich stref rozkładu. Aktywność fibrynolityczna = (wielkość strefy próbki/ wielkość strefy urokinazy) x 100 U. Wielkość strefy = średnica x średnica. 
		UWAGA: Bufor soli fizjologicznej, białko surowe (próbka uzyskana w kroku protokołu 1.3.1) i urokinaza zostały użyte odpowiednio do ślepej próby, kontroli ujemnej i kontroli pozytywnej. W porównaniu z urokinazą stwierdziliśmy, że aktywność fibrynolityczna oczyszczonego sFE wynosiła ~19 200 U/ml.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Purifying a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus via Affinity Chromatography

<ol><li>Rosell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patients+with+COVID-19+have+elevated+levels+of+circulating+extracellular+vesicle+tissue+factor+activity+that+is+associated+with+severity+and+mortality-brief+report%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).</li>
<li>Schultz, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombosis+and+thrombocytopenia+after+ChAdOx1+nCoV-19+vaccination.+The+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England.</a> Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).</li>
<li>von Kaulla, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urokinase-induced+fibrinolysis+of+human+standard+clots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots.</a> Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).</li>
<li>Van de Werf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+thrombolysis+with+tissue-type+plasminogen+activator+in+patients+with+evolving+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction.</a> The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).</li>
<li>Schaller, J., Gerber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmin-antiplasmin+system%3A+structural+and+functional+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).</li>
<li>Ge, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+antithrombotic+protease+from+marine+worm+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023(2018).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+novel+fibrinolytic+enzyme+from+culture+supernatant+of+Pleurotus+ostreatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).</li>
<li>Choi, J. -H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starase%3A+A+bi-functional+fibrinolytic+protease+from+hepatic+caeca+of+Asterina+pectinifera+displays+antithrombotic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential.</a> Biochimie. 105, 45-57 (2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fibrinolytic+protein+From+Pheretima+vulgaris%3A+purification%2C+identification%2C+antithrombotic+evaluation%2C+and+mechanisms+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419(2022).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant%2C+hypolipidemic+and+hepatic+protective+activities+of+polysaccharides+from+Phascolosoma+esculenta%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta.</a> Marine Drugs. 18 (3), 158(2020).</li>
<li>Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en">https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en</a> (2019).</li>
<li>Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+expressed+differentially+in+female+and+male+gametes+of+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus.</a> Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).</li>
<li>Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+renature+DNA-binding+proteins+separated+by+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).</li>
<li>Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+barcoding+reveals+cryptic+diversity+in+the+peanut+worm+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus.</a> Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).</li>
<li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen-plasmin+system.+I.+Purification+and+properties+of+human+plasminogen%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).</li>
<li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen-plasmin+system.+II.+Purification+and+properties+of+human+plasmin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).</li>
<li>Wiman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-chromatographic+purification+of+human+%CE%B12-antiplasmin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin.</a> The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).</li>
<li>Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+purification+and+characterization+of+a+new+fast-acting+plasmin+inhibitor+from+human+platelets.+Evidence+for+non-identity+with+the+known+plasma+proteinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors.</a> The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).</li>
<li>Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+plasma%2Fcellular+fibronectin+and+fibronectin+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments.</a> Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).</li>
<li>Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+and+purification+of+human+recombinant+tissue+type+plasminogen+activator+%28rt-PA%29+from+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Preparative+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants.</a> Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).</li>
<li>Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+abnormalities+of+human+plasminogen+isolated+from+synovial+fluid+of+rheumatoid+arthritis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients.</a> Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Ze względu na niedostępność dokładnej sekwencji genu sFE, obecnie stosowany sFE został wyekstrahowany ze świeżego S. nudus14. Co więcej, procedury oczyszczania sFE opisywane w literaturze były skomplikowane i kosztowne, ponieważ opierały się na pewnych ogólnych cechach sFE, takich jak masa cząsteczkowa, punkt izoelektryczny, siła jonowa i polarność15,16. Do tej pory nie zgłoszono żadnego protokołu oczyszczania powinowactwa sFE. W ...

Zakrzepica jest poważnym zagrożeniem dla zdrowia publicznego, zwłaszcza po globalnej pandemii Covid-191,2. Klinicznie wiele aktywatorów plazminogenu (PA), takich jak tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) i urokinaza (Wielka Brytania), jest szeroko stosowanych jako leki trombolityczne. PA mogą aktywować plazminogen pacjentów do aktywnej plazminy w celu degradacji fibryny. W związku z tym ich skuteczność trombolityczna jest silnie ograniczona przez status plazminogenu pacjentów3,4. Leki fibrynolityczne, takie jak plazmina metaloproteinazy i plazmina serynowa, są innym rodzajem klinicznych leków trombolitycznych, które obejmują również enzymy fibrynolityczne (FE), takie jak plazmina, które mogą bezpośrednio rozpuszczać skrzepy, ale są szybko inaktywowane przez różne inhibitory plazminy5. Następnie doniesiono o nowym typie środka fibrynolitycznego, który może rozpuścić skrzeplinę, nie tylko poprzez aktywację plazminogenu w plazminę, ale także bezpośrednią degradację fibryny6-enzym fibrynolitytyczny ze starożytnego robaka arachidowego Sipunculus nudus (sFE)6. Ta dwufunkcyjna daje sFE inne zalety w porównaniu z tradycyjnymi lekami trombolitycznymi, zwłaszcza pod względem nieprawidłowego statusu plazminogenu. W porównaniu z innymi dwufunkcyjnymi środkami fibrynolitycznymi7,8,9, sFE wykazuje kilka zalet, w tym bezpieczeństwo, w porównaniu ze środkami niepochodzącymi z żywności w opracowywaniu leków, zwłaszcza w przypadku leków doustnych. Dzieje się tak dlatego, że bezpieczeństwo biologiczne i biokompatybilność Sipunculus nudus zostały dobrze ugruntowane10.
Podobnie jak w przypadku innych naturalnych czynników fibrynolitycznych wyizolowanych z mikroorganizmów, dżdżownic i grzybów, oczyszczanie sFE z S. nudus jest bardzo skomplikowane i obejmuje wiele etapów, takich jak homogenizacja tkanek, wytrącanie siarczanu amonu, odsalanie, chromatografia wymiany anionowej, chromatografia oddziaływań hydrofobowych i przesiewanie molekularne10,11,12. Taki system oczyszczania zależy nie tylko od biegłych umiejętności i drogich materiałów, ale także wymaga kilku dni na wykonanie całej procedury. Dlatego prosty program oczyszczania sFE ma ogromne znaczenie dla dalszego rozwoju sFE. Na szczęście dwa kryształy sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) zostały pomyślnie uzyskane (patrz Plik Uzupełniający 1 i Plik Uzupełniający 2). Dzięki analizie strukturalnej i eksperymentom dokowania molekularnego odkryliśmy, że katalityczny rdzeń sFE może specyficznie wiązać się z celami zawierającymi reszty argininy lub lizyny.
Tutaj po raz pierwszy zaproponowano system oczyszczania powinowactwa, oparty na strukturze krystalicznej sFE. Postępując zgodnie z tym protokołem, wysoce czysty i wysoce aktywny sFE może zostać oczyszczony z surowych ekstraktów w jednym etapie oczyszczania z powinowactwem. Opracowany tutaj protokół jest ważny nie tylko dla przygotowania sFE na dużą skalę, ale może być również stosowany do oczyszczania innych środków fibrynolitycznych.

<table><tbody><tr><td>30% Akrylamid-Bisakryloamid (29:1)</td><td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroza G-10</td><td>Biowest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arginina-Sefaroza 4B</td><td>Solarbio</td><td>Matryca argininowo-agarozowa</td><td></td></tr><tr><td>Niebieski bromoksylenol (BPB)</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fast Silver Bejca</td><td>Beyotime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kinaza</td><td>RHAWN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lizyna-Sefaroza 4B</td><td>Solarbio</td> Macierz <td></td><td>lizynowo-agarozowa</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prestained Color Protein Marker (10-170 kD)</td><td>Beyotime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiulfonian sodu (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trombin</td><td>Meilunbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(Hydroksymetylo)Aminometan</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(Hydroksymetylo)Aminometan Chlorowodorek</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKT Aprotein Purification System czysty</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny pionowy sterylizator parowy MLS-3750</td> System obrazowania <td>chemiluminescencyjnego SANYO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa o stałym przepływie GE</td><td></td> Inkubator stałej temperatury BT-100 QITE <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> Wirówka z chłodzeniem JINGHONG 3-30KS SIGMA DHG Series Piec grzewczy i suszący <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DGG-9140AD</td><td>SENXIN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektryczny homogenizator szkła DY89-II</td><td>SCIENTZ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroniczna waga analityczna</td><td>DENVER</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektrotermostatyczna łaźnia wodna DK-S12</td><td>SENXIN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pozioma wytrząsarka do odbarwiania</td><td>Kylin-Bell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do lodu AF 103</td><td>Scotsman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KQ-500E Myjka ultradźwiękowa</td><td>ShuMei</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>Zhi wei</td><td></td><td></td></tr> Mikrowirówka z <tr><td>chłodzeniem H1650-W</td><td>Cence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td>Galanz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Referencyjna</td> pipeta <td>miliporowa</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjny pH-metr na biurko</td><td>Sartorious</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mały oscylator wirowy</td><td>Kylin-Bell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pionowy system elektroforezy</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiał eksploatacyjny&nbsp; </mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 i mikro; L Probówka do PCR (200 &mikro; L)</td>Probówka wirówkowa <td>Axygene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(1,5 ml)</td><td></td>Probówka wirówkowa Biosharp <td></td><td></td></tr><tr><td>(5 mL)</td>Probówka wirówkowa <td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(50 ml)</td><td></td>Probówka wirówkowa NEST <td></td><td></td></tr><tr><td>(7 mL)</td>Naczynie hodowlane <td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(60 mm)</td><td></td>Membrana filtracyjna NEST <td></td><td></td></tr><tr><td>(0,22 &mikro; m)</td> Końcówka do pipet <td>Millex GP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(1 ml) Końcówka</td> do pipet <td>KIRGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(10 &mikro; L)</td> Końcówka do pipet <td>Axygene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(200 &mikro; L)</td> Specjalny papier wskaźnikowy <td>Axygene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra Filtr odśrodkowy TZAKZY</td><td></td> (15 ml 3 KDa)Filtr ultra odśrodkowy Millipore <td></td><td></td></tr><tr><td>(4 ml 3 KDa)</td><td>Uniwersalny</td> odczynnik SSS do wskaźnika pH Millipore <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie powinowactwa enzymu fibrynolitycznego z sipunculus nudus

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

Enzym fibrynolityczny z Sipunculus nudus (sFE) to nowy czynnik fibrynolityczny który może zarówno aktywować plazminogen do plazminy, jak i bezpośrednio rozkładać fibrynę, wykazując ogromne zalety w porównaniu z tradycyjnymi środkami trombolitycznymi. Jednak ze względu na brak informacji strukturalnych wszystkie programy oczyszczania sFE opierają się na wieloetapowych oczyszczaniach chromatograficznych, które są zbyt skomplikowane i kosztowne. W tym przypadku po raz pierwszy opracowano protokół oczyszczania powinowactwa sFE w oparciu o strukturę krystaliczną sFE; obejmuje przygotowanie próbki surowej i kolumny chromatografii powinowactwa matrycy lizyny/argininy-agarozy, oczyszczanie powinowactwa i charakterystykę oczyszczonego sFE. Zgodnie z tym protokołem partię sFE można oczyścić w ciągu 1 dnia. Co więcej, czystość i aktywność oczyszczonego sFE wzrasta do 92% i 19,200 U/mL, odpowiednio. Jest to więc proste, niedrogie i wydajne podejście do oczyszczania sFE. Opracowanie tego protokołu ma ogromne znaczenie dla dalszego wykorzystania sFE i innych podobnych środków.

Zgodnie z niniejszym protokołem wyekstrahowano surowe lizaty tkankowe, przygotowano kolumny do chromatografii powinowactwa z macierzą arginino-agarozową oraz lizyno-agarozową, otrzymano oczyszczone sFE, a następnie za pomocą SDS-PAGE oraz płytek fibrynowych zmierzono odpowiednio czystość i aktywność fibrynolityczną oczyszczonego sFE.
Po wirowaniu zebrany nadsącz stanowił przezroczysty, beżowy, lepki płyn. Wytrącanie rozpoczęło się po zmieszaniu tego nadsączu z nasyconym roztworem siarczanu amo...

Tutaj prezentujemy metodę oczyszczania powinowactwa enzymu fibrynolitycznego z Sipunculus nudus, która jest prosta, tania i efektywna.

Oczyszczanie powinowactwa enzymu fibrynolitycznego z Sipunculus nudus

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...

Nasze badania dotyczą głównie oczyszczania enzymu fibrynolitycznego. Niniejsza praca ma na celu ustalenie prostej metody oczyszczania enzymu fibrynolitycznego. W tej pracy po raz pierwszy przedstawiamy system oczyszczania enzymu fibrynolitycznego z najlepszym powinowactwem do argininy lub lizyny.W porównaniu z konwencjonalnymi metodami oczyszczania jest to proste, niedrogie i skuteczne podejście do oczyszczania enzymów fibrynolitycznych z Sipunculus nudus. Opracowanie tego protokołu ma większe znaczenie dla dalszego wykorzystania enzymów fibrynolitycznych z Sipunculus nudus i innych podobnych środków. Rozpocznij obróbkę próbki od wycięcia 100 gramów świeżego Sipunculus nudus i zebrania ich jelita i płynu wewnętrznego.Dodaj 300 mililitrów buforu Tris-HCl i homogenizuj przy 1 000 obr./min przez 60 sekund. Zamroź i rozmroź homogenat trzy razy. Po odwirowaniu homogenatu rozmrożonego przez zamrożenie, zebrać supernatant i przechowywać go w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia.Aby rozpocząć wytrącanie białka, usuń supernatant z czterech stopni Celsjusza i wymieszaj go z dziewięcioma objętościami nasyconego roztworu siarczanu amonu. Inkubuj mieszaninę przez 12 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie wytrącić białko przez odwirowanie mieszaniny i przechowywać wytrącone białko w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Zawiesić osad białkowy w 30 mililitrach buforu Tris-HCl i przechowywać ten surowy roztwór białka w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania. Przefiltrować surowe białka wyekstrahowane z jelita Sipunculus nudus przez membranę filtracyjną o średnicy 0,22 mikrometra. Przechowuj tę próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania.Upakować kolumnę chromatografii powinowactwa do matrycy argininowo-agarozowej, ładując podłoże z matrycą argininowo-agarozową do pustej kolumny chromatograficznej o pojemności pięciu mililitrów. Podobnie, załadować kolumnę chromatografii powinowactwa do matrycy lizyny-agarozy, ładując pożywkę z matrycą lizyny-agarozy do pustej kolumny chromatograficznej. Zrównoważyć kolumny chromatografii powinowactwa z wodą podwójnie destylowaną, a następnie buforem Tris-HCl.Załadować przefiltrowaną próbkę białka do kolumny o wstępnej równowadze. Przemyć kolumnę pięcioma objętościami 0,02-molowego buforu Tris-HCl przed wylucowaniem jej kolejno 0,15, 0,25, 0,35, 0,45, 0,55 i 0,65 molowych roztworów chlorku sodu. Gdy pik elucji pojawi się w 0,15 molowej elucji chlorku sodu, zbierz frakcje w pięciomililitrowych probówkach.Zagęścić próbkę elucyjną za pomocą ultrafiltra odśrodkowego o sile 3 kDa i przechowywać tę próbkę w temperaturze 80 stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania. Kiedy roztwór białka został załadowany na kolumnę powinowactwa do macierzy argininy-agarozy, pik przepływu pojawił się od około 40 do 66 minut. Na etapie elucji gradientowej elucja 0,15 molowym chlorkiem sodu osiągnęła szczyt od około 94 do 110 minut.Gdy roztwór białka załadowano do kolumny powinowactwa do macierzy lizynowo-agarozowej, pik przepływu pojawił się od około 38 do 60 minut. W fazie elucji gradientowej elucja 0,15 molowym chlorkiem sodu osiągnęła szczyt od 80 do 86 minut. Przygotowanie płytki fibrynowej należy rozpocząć od zmieszania 25 miligramów fibrynogenu z 1,25 mililitra soli fizjologicznej.Następnie przygotuj roztwór trombiny, dokładnie mieszając 100 jednostek trombiny z 1,05 mililitra soli fizjologicznej. Następnie przygotuj roztwór agarozy, dodając 0,5 grama agarozy do 22,5 mililitra 0,02-molowego buforu kwasu Tris-Hcl. Podgrzej roztwór agarozy w temperaturze 100 stopni Celsjusza, aż całkowicie się rozpuści.Schłodzić roztwór agarozy do około 50 stopni Celsjusza. Przed dodaniem do niego roztworu fibrynogenu. Natychmiast dodaj roztwór trombiny, szybko wymieszaj i wlej mieszaninę do 60-milimetrowego naczynia hodowlanego.Aby załadować próbkę, wbij trzymilimetrowe studzienki w płytki fibrynowe za pomocą sterylnego świdra i wypełnij je 10 mikrolitrami próbek. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 godzin przed zmierzeniem wielkości ich stref degradacji i obliczeniem aktywności fibrynolitycznej. Ocena aktywności fibrynolitycznej wykazała 1,3-centymetrową strefę lizy w kontroli urokinazy.Brak strefy lizy w buforze soli fizjologicznej, 2,1 centymetra strefy lizy w studzience białka surowego i 1,8 centymetra średnicy strefy lizy w studzience oczyszczonego enzymu fibrynolitycznego.

affinity-purification-of-a-fibrinolytic-enzyme-from-sipunculus-nudus

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

MamA jest unikalnym białkiem powiązanym z magnetosomami, o którym wykazano, że bierze udział w ich aktywacji. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół oczyszczania mutanta z delecją MamA (MamAΔ41) z M. magneticum AMB-1.

Oczyszczanie białka MamAΔ41 związanego z magnetosomami szczepu AMB-1 M. magneticum

Tandemowa puryfikacja powinowactwa (TAP) jest skuteczną metodą identyfikacji białek wiążących. W ramach dowodu koncepcji metodologię tę zastosowano do dobrze scharakteryzowanego czynnika inicjacji translacji eIF4E w celu koprecypitacji czynników komórkowych gospodarza zaangażowanych w inicjację translacji. Metoda ta może być łatwo zaadaptowana do dowolnego białka komórkowego lub wirusowego.

Identyfikacja partnerów oddziaływań białkowych z wykorzystaniem tandemowej oczyszczania powinowactwa

Rekombinowany prototyp pienistego białka integrazy wirusa jest często zanieczyszczony nukleazą bakteryjną podczas oczyszczania. Metoda ta identyfikuje zanieczyszczenie nukleazą i usuwa je z końcowego przygotowania enzymu.

Wykrywanie i usuwanie zanieczyszczeń nukleazami podczas oczyszczania rekombinowanej prototypowej integrazy wirusa pienistego

Ten protokół opisuje, jak ekstrahować białko 1 zawierające hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu (FAHD1) z nerki świni i wątroby myszy. Wymienione metody mogą być dostosowane do innych białek będących przedmiotem zainteresowania i zmodyfikowane dla innych tkanek.

Ekstrakcja i oczyszczanie białka FAHD1 z nerki świń i wątroby myszy

Ten artykuł przedstawia procedurę oczyszczania powinowactwa ludzkiego białka rekombinowanego, endonukleazy płatowej 1 (FEN1), które zostało oznaczone znacznikiem 6X-histydyny. Protokół polega na wykorzystaniu dwóch odrębnych unieruchomionych kolumn jonów metalu do oczyszczania znakowanego białka.

Oczyszczanie powinowactwa białka oznaczonego 6X-His-His-Tagged przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek

Tutaj prezentujemy protokół elektroforezy w żelu fibrynogenowo-poliakrylamidowym (PAGE) do szybkiego oddzielania i wyświetlania czynników fibrynogenolitycznych Sipunculus nudus.

Szybka separacja i wyświetlanie aktywnych czynników fibrynogenolitycznych w Sipunculus nudus za pomocą elektroforezy w żelu fibrynogenowo-poliakryloamidowym

W artykule opisano metodologię nadekspresji rekombinowanej Nsp15, toksycznej nukleazy, w systemie ekspresji C41(DE3), a następnie oczyszczania znakowanego białka za pomocą chromatografii wykluczania powinowactwa i wielkości. Protokoły te można dostosować do innych trudnych toksycznych białek.

Nadekspresja i oczyszczanie toksycznej nukleazy z Escherichia coli

Przedstawiono protokół produkcji, oczyszczania i stosowania pęcherzyków z zewnętrzną błoną upakowaną enzymem (OMV), zapewniający zwiększoną stabilność enzymów do zastosowania w różnych zastosowaniach.

Ukierunkowane pakowanie białka w pęcherzykach błony zewnętrznej z Escherichia coli: projektowanie, produkcja i oczyszczanie

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Opisujemy tutaj nowatorską, solidną i efektywną metodę tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP) do ekspresji, izolacji i charakterystyki kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych. Protokół ten może być wykorzystany do biochemicznej charakterystyki dyskretnych kompleksów, a także do identyfikacji nowych interaktorów i modyfikacji potranslacyjnych, które regulują ich funkcję.

Tandemowe oczyszczanie kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych

Poznaj metodę oczyszczania powinowactwa enzymu fibrynolitycznego z Sipunculus nudus przy użyciu chromatografii argininowej lub lizynowej. Prosty, niedrogi i wydajny protokół ułatwia dalsze badania nad enzymami rozpuszczającymi skrzepy.

Oczyszczanie powinowactwa enzymu fibrynolitycznego z Sipunculus nudus

Przeglądaj więcej filmów