Oczyszczanie powinowactwa enzymu fibrynolitycznego z Sipunculus nudus

Nasze badania dotyczą głównie oczyszczania enzymu fibrynolitycznego. Niniejsza praca ma na celu ustalenie prostej metody oczyszczania enzymu fibrynolitycznego. W tej pracy po raz pierwszy przedstawiamy system oczyszczania enzymu fibrynolitycznego z najlepszym powinowactwem do argininy lub lizyny.

W porównaniu z konwencjonalnymi metodami oczyszczania jest to proste, niedrogie i skuteczne podejście do oczyszczania enzymów fibrynolitycznych z Sipunculus nudus. Opracowanie tego protokołu ma większe znaczenie dla dalszego wykorzystania enzymów fibrynolitycznych z Sipunculus nudus i innych podobnych środków. Rozpocznij obróbkę próbki od wycięcia 100 gramów świeżego Sipunculus nudus i zebrania ich jelita i płynu wewnętrznego.

Dodaj 300 mililitrów buforu Tris-HCl i homogenizuj przy 1 000 obr./min przez 60 sekund. Zamroź i rozmroź homogenat trzy razy. Po odwirowaniu homogenatu rozmrożonego przez zamrożenie, zebrać supernatant i przechowywać go w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia.

Aby rozpocząć wytrącanie białka, usuń supernatant z czterech stopni Celsjusza i wymieszaj go z dziewięcioma objętościami nasyconego roztworu siarczanu amonu. Inkubuj mieszaninę przez 12 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie wytrącić białko przez odwirowanie mieszaniny i przechowywać wytrącone białko w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zawiesić osad białkowy w 30 mililitrach buforu Tris-HCl i przechowywać ten surowy roztwór białka w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania. Przefiltrować surowe białka wyekstrahowane z jelita Sipunculus nudus przez membranę filtracyjną o średnicy 0,22 mikrometra. Przechowuj tę próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania.

Upakować kolumnę chromatografii powinowactwa do matrycy argininowo-agarozowej, ładując podłoże z matrycą argininowo-agarozową do pustej kolumny chromatograficznej o pojemności pięciu mililitrów. Podobnie, załadować kolumnę chromatografii powinowactwa do matrycy lizyny-agarozy, ładując pożywkę z matrycą lizyny-agarozy do pustej kolumny chromatograficznej. Zrównoważyć kolumny chromatografii powinowactwa z wodą podwójnie destylowaną, a następnie buforem Tris-HCl.

Załadować przefiltrowaną próbkę białka do kolumny o wstępnej równowadze. Przemyć kolumnę pięcioma objętościami 0,02-molowego buforu Tris-HCl przed wylucowaniem jej kolejno 0,15, 0,25, 0,35, 0,45, 0,55 i 0,65 molowych roztworów chlorku sodu. Gdy pik elucji pojawi się w 0,15 molowej elucji chlorku sodu, zbierz frakcje w pięciomililitrowych probówkach.

Zagęścić próbkę elucyjną za pomocą ultrafiltra odśrodkowego o sile 3 kDa i przechowywać tę próbkę w temperaturze 80 stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania. Kiedy roztwór białka został załadowany na kolumnę powinowactwa do macierzy argininy-agarozy, pik przepływu pojawił się od około 40 do 66 minut. Na etapie elucji gradientowej elucja 0,15 molowym chlorkiem sodu osiągnęła szczyt od około 94 do 110 minut.

Gdy roztwór białka załadowano do kolumny powinowactwa do macierzy lizynowo-agarozowej, pik przepływu pojawił się od około 38 do 60 minut. W fazie elucji gradientowej elucja 0,15 molowym chlorkiem sodu osiągnęła szczyt od 80 do 86 minut. Przygotowanie płytki fibrynowej należy rozpocząć od zmieszania 25 miligramów fibrynogenu z 1,25 mililitra soli fizjologicznej.

Następnie przygotuj roztwór trombiny, dokładnie mieszając 100 jednostek trombiny z 1,05 mililitra soli fizjologicznej. Następnie przygotuj roztwór agarozy, dodając 0,5 grama agarozy do 22,5 mililitra 0,02-molowego buforu kwasu Tris-Hcl. Podgrzej roztwór agarozy w temperaturze 100 stopni Celsjusza, aż całkowicie się rozpuści.

Schłodzić roztwór agarozy do około 50 stopni Celsjusza. Przed dodaniem do niego roztworu fibrynogenu. Natychmiast dodaj roztwór trombiny, szybko wymieszaj i wlej mieszaninę do 60-milimetrowego naczynia hodowlanego.

Aby załadować próbkę, wbij trzymilimetrowe studzienki w płytki fibrynowe za pomocą sterylnego świdra i wypełnij je 10 mikrolitrami próbek. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 godzin przed zmierzeniem wielkości ich stref degradacji i obliczeniem aktywności fibrynolitycznej. Ocena aktywności fibrynolitycznej wykazała 1,3-centymetrową strefę lizy w kontroli urokinazy.

Brak strefy lizy w buforze soli fizjologicznej, 2,1 centymetra strefy lizy w studzience białka surowego i 1,8 centymetra średnicy strefy lizy w studzience oczyszczonego enzymu fibrynolitycznego.