Badanie działania farmakologicznego i mechanizmu molekularnego salidrozydu w hamowaniu proliferacji i migracji komórek MCF-7

Skupiamy się na badaniu związków aktywnych pochodzących z produktów naturalnych i ich potencjału w leczeniu raka piersi. W szczególności naszym celem jest nawiązanie do farmakologicznych skutków strony komórkowej i jej mechanizmów molekularnych w walce z rakiem piersi. Obecnie brakuje wiarygodnych technik eksperymentalnych, które pozwoliłyby potwierdzić cele molekularne salidrozydu w leczeniu raka piersi.

Jednym z istotnych odkryć w tej dziedzinie jest potencjalna proliferacja i migracja komórek MCF-7 poprzez regulację segmentacji PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1. Przyszłe badania laboratorium mają na celu zbadanie mechanizmów patologicznych leżących u podstaw powstania, rozwoju, rokowania i wyników raka piersi. Dodatkowo przeprowadzamy badania przesiewowe pod kątem rzeczywistych małych naturalnych leków pochodzących ze źródeł naturalnych, które mogą przyczynić się do zapobiegania i leczenia raka piersi.

Na początek inkubuj dwa mililitry hodowanych komórek MCF-7 na sześciodołkowej płytce do 90% konfluacji. W monowarstwie wyhodowanych komórek utwórz liniowe zadrapanie nawinięte na środku za pomocą sterylnej końcówki pipety. Następnie uchwyć obrazy za pomocą mikroskopu optycznego w różnych odstępach czasu.

W teście transwellowym zawiesić komórki MCF-7 w podłożu wolnym od surowicy. Następnie wysiewaj komórki w górnej komorze transwell, wstępnie pokryte lub niepokryte matrigelem. Dodaj kompletną pożywkę DMEM na dnie komory transwell, aby działała jako induktor chemiczny.

Po 24 godzinach usuń komórki z górnej komory i utrwal pozostałe komórki inwazyjne i migrujące za pomocą metanolu. Wybarwić ogniwa MCF-7 roztworem fioletu krystalicznego. Następnie zobrazuj wybarwione komórki za pomocą mikroskopu optycznego.

Zaobserwowano zależny od dawki hamujący wpływ strony salidrozydu na proliferację komórek, z 50% spadkiem żywotności komórek przy 40 mikromolach. Co więcej, salidrozyd może z czasem hamować witalność komórek MCF-7, powodując 50% spadek żywotności komórek MCF-7 po 24 godzinach wspólnej inkubacji. Test zadrapań ran wykazał działanie hamujące leczenie salidrozydami na komórkach MCF-7.

Co więcej, leczenie salidrozydem znacznie zmniejszyło niepożądaną migrację i inwazję komórek MCF-7. Za pomocą zestawu kwasu bicinchoninowego zmierz stężenie białka w lizowanych komórkach MCF-7 zgodnie z instrukcjami producenta. Dodaj próbki zlizowanych komórek do odpowiednich grup na 96-dołkowej płytce.

Następnie dodaj roztwór roboczy i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Na koniec zmierz wartości gęstości optycznej przy 636 nanometrach w funkcjonalnym czytniku mikropłytek. Salidrozyd ograniczał witalność enzymów ATPaz sodowo-potasowych i ATPA wapnia, co wskazuje na jego potencjalną rolę w promowaniu dysfunkcji mitochondriów.

Aby rozpocząć, zbierz trypsynizowane komórki MCF-7. Następnie wybarwić zawieszone komórki PBS za pomocą XN5 FITC i jodku propidyny przez 20 minut. Następnie określ liczbę komórek apoptotycznych za pomocą cytometru przepływowego.

W celu analizy cyklu komórkowego wymieszaj zawieszone komórki z roztworem jodku propidyny w świeżej probówce i inkubuj mieszaninę przez 30 minut. Następnie wykryj próbkę za pomocą cytometru przepływowego. Salidrozyd zwiększał liczbę komórek MCF-7 we wczesnych i późnych stadiach epizodycznych.

Tymczasem, w porównaniu z grupą kontrolną, leczenie salidrozydem również znacznie zwiększyło liczbę komórek w fazie G0 G1, jednocześnie zmniejszając odsetek komórek fazy S. Dodaj 10 mikromoli sondy fluorescencyjnej DCFH-DA do komórek MCF-7 i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Po inkubacji usunąć nadmiar DCFH-DA, przemłukując komórki trzykrotnie PBS.

Następnie przetestuj intensywność fluorescencji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i długości fali wzbudzenia 488 nanometrów oraz długości fali emisji 525 nanometrów. Inkubować komórki MCF-7 z pięciomikromolowym roztworem sondy fluorescencyjnej Fluo-4 AM przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po trzykrotnym umyciu komórek PBS należy określić intensywność fluorescencji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego ze wzbudzeniem na 488 nanometrach i emisją na 516 nanometrach.

Salidrozyd znacznie wzmacniał sygnały fluorescencyjne ROS wykazywane przez barwienie immunofluorescencyjne DCFH-DA. Konsekwentnie, interwencja salidrozydów również wyraźnie zwiększyła produkcję wapnia, o czym świadczy barwienie immunofluorescencyjne Fluo-4 AM. Zacznij od dodania dwóch mililitrów komórek MCF-7 zawierających różne leki do studzienek sześciodołkowej płytki.

Inkubuj kultury komórkowe przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Zbierz komórki przez odwirowanie w temperaturze 560 G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umyj komórki dwukrotnie wstępnie schłodzonym PBS, odwirowując przy 560G przez trzy minuty między praniami.

Dodać 50 mikrolitrów buforu do lizy do umytych komórek i umieścić próbkę w łaźni lodowej na 15 minut. Następnie odwirować próbkę w temperaturze 8,550 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać próbkę białka sklarowanego nad osadem. Połączyć próbkę białka z buforem ładującym w stosunku cztery do jednego.

Następnie denaturuj mieszaninę w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 minut w metalowej kąpieli. Następnie ostudzić mieszaninę w temperaturze pokojowej. Oddzielić próbkę białka za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym 10%SDS.

Przenieś białka na membranę PVDF o grubości 0,22 mikrometra. Po zablokowaniu błony 5% BSA, inkubuj ją z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia inkubuj błonę z kozim przeciwciałem drugorzędowym anty-króliczym IgG w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Następnie wywołaj błony za pomocą roztworu chemoluminescencji ECL i uchwyć obrazy za pomocą bezkontaktowego systemu ilościowego obrazowania western blot. Western blot wykazał, że leczenie salidrozydem promowało ekspresję białek czynników proapoptotycznych CC9, CC7, CC3, Bim i Bax, jednocześnie hamując ekspresję białek antyapoptotycznych BCL2. Salidrosdie wyraźnie ograniczył proporcje PPI3K do PI3K i PAKT do AKT.

Tymczasem ekspresja białek mTOR, HIF-1-alfa i Fox01 została również znacznie stłumiona. Zbierz komórki MCF-7C przez wirowanie w temperaturze 560G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj 500 mikrolitrów buforowanego RL1 do pięć razy 10 z sześciu komórek i dokładnie wymieszaj, aż nie będą widoczne żadne masy komórek.

Następnie przenieś homogenaty komórek do kolumny czyszczącej DNA osadzonej w probówce zbiorczej. Odwirować próbki w temperaturze 8,550 G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu wyjąć kolumnę czyszczącą DNA, zatrzymując supernatant w probówce zbiorczej.

Dodać 800 mikrolitrów buforu RL2 i 500 mikrolitrów supernatantu i delikatnie wymieszać. Następnie przenieś 700 mikrolitrów mieszaniny do kolumny zawierającej tylko RNA osadzonej w probówce zbiorczej. Odwirować probówkę o temperaturze 8,550 G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie wyrzuć przepływ z probówki zbiorczej. Przemyć kolumnę tylko RNA najpierw 500 mililitrami buforu RW1, a następnie 700 mililitrami buforu RW2, wirując przez jedną minutę w temperaturze 8, 550 G i czterech stopniach Celsjusza przy każdym płukaniu. Po usunięciu pozostałej probówki RW przez ponowne odwirowanie, przenieść kolumnę z samym RNA do nowej probówki zbiorczej.

Dodaj 100 mikrolitrów bezRNAzowej wody dejonizowanej podgrzanej do 65 stopni Celsjusza do środka membrany w kolumnie zawierającej tylko RNA i odczekaj dwie minuty. Następnie odwirować w temperaturze 8,550G przez jedną minutę w czterech stopniach Celsjusza, aby zebrać roztwór RNA. Ustaw mieszaninę reakcyjną do PCR, a następnie ustaw warunki reakcji PCR systemu.

Wykonaj procedurę qRT-PCR. QRT-PCR wykazał, że leczenie salidrozydem promowało ekspresję genów czynników proapoptotycznych CC9, CC7, CC3, Bim i Bax, jednocześnie hamując ekspresję genów antyapoptotycznych BCL2. Ponadto podawanie salidrozydu zmniejszało poziomy ekspresji genów PI3K, AKT, mTOR, HIF-1-alpha i Fox01.