Name: Badanie działania farmakologicznego i mechanizmu molekularnego salidrozydu w hamowaniu proliferacji i migracji komórek MCF-7 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-09T12:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Poznaj działanie salidrozydy w hamowaniu proliferacji i migracji komórek MCF-7 poprzez regulację szlaku PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. Ta metoda pozwala badać mechanizmy molekularne raka piersi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Komisję Zdrowia Prowincji Syczuan (120025).

Ogniwa MCF-7 użyte w niniejszym badaniu zostały uzyskane z komercyjnego źródła (zobacz Tabelę Materiałów).
1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Hodować komórki MCF-7 w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C z DMEM zawierającym 10% FBS i 1% penicyliny (10 000 U/ml)/streptomycyny (10 000 μg/ml) (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Komórki pokrywające 90% dna naczynia wykorzystano do eksperymentu i przydzielono do następujących grup: grupa kontrolna, grupa chlorowodorku doksorubicyny (DXR, 5 μM) i grupa Sal (20 μM, 40 μM i 80 μM) lub grupa kontrolna, grupa LY294002 (10 μM, inhibitor PI3K), Grupa Sal (80 μM) i grupa LY294002 (10 μM) + grupa Sal (80 μM) (patrz tabela materiałów).</li>
</ol>
2. Test żywotności komórek
UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tej procedury, zapoznaj się z poprzednim raportem27.
<ol>
	<li>Wysiewaj komórki MCF-7 o gęstości 8 x 104 komórki/basenik na 96-dołkowych płytkach i inkubuj z Sal (10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM i 320 μM) przez 24 godziny lub Sal (20, 40, 80 μM) przez 12 godzin/24 godziny/36 godzin/48 godzin przez noc, aż komórki będą przylegać.</li>
	<li>Po poddaniu działaniu substancji należy inkubować komórki MCF-7 z 10 μl/studzienkę roztworu CCK-8 (patrz tabela materiałów) przez 2 godziny. Następnie zmierz gęstość optyczną przy 450 nm (OD450) za pomocą automatycznego czytnika mikropłytek.</li>
</ol>
3. Migracja i inwazja komórek
UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tej procedury, zapoznaj się z poprzednim raportem35.
<ol>
	<li>Inkubować 2 ml komórek 5 x 10po 6 komórek/ml wysianych na płytkach 6-dołkowych, aby pokryć 90% dna naczynia.</li>
	<li>Wykonaj liniowe zadrapanie nawinięte wzdłuż środka monowarstwy komórki za pomocą sterylnej końcówki pipety. Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu optycznego po 0 godzinach, 24 godzinach i 48 godzinach.</li>
	<li>Użyj oprogramowania Image J, aby zmierzyć szerokość ran po zadrapaniach.</li>
	<li>W przypadku testu transwell, zawiesić komórki MCF-7 bez pożywki surowicy i wysiew w górnej komorze transwell wstępnie pokryte Matrigelem lub bez niego (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Na dnie komory transwell użyj kompletnego medium DMEM jako induktora chemicznego. Po 24 godzinach usuń komórki z górnej komory i utrwal pozostałe komórki inwazyjne i migrujące w metanolu35.</li>
	<li>Wybarwić ogniwa MCF-7 roztworem fioletu krystalicznego (patrz Tabela materiałów). Uchwyć obrazy za pomocą mikroskopu optycznego.</li>
</ol>
4. Ocena aktywności Na+-K+-ATPazy i Ca2+-Mg2+-ATPazy
<ol>
	<li>Użyj zestawu kwasu bicinchoninowego (BCA) do pomiaru stężenia białka w lizowanych komórkach MCF-7, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Dodaj próbki zlizowanych komórek w odpowiadających im grupach do 96-dołkowych płytek. Następnie dodać roztwór roboczy, aby kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Na koniec zmierz wartości OD636 za pomocą wielofunkcyjnego czytnika mikropłytek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza apoptozy i cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej
UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tej procedury, zapoznaj się z poprzednim raportem31.
<ol>
	<li>Trawić komórki i zbierać w celu ponownego zawieszenia w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) na 20 minut barwienia aneksyną V-FITC i jodkiem propidyny (PI) (patrz Tabela materiałów), a następnie określić liczbę komórek apoptotycznych za pomocą cytometru przepływowego.</li>
	<li>Zmieszać zawieszony roztwór próbki z roztworem PI przez 30 minut inkubacji, a następnie wykryć za pomocą cytometru przepływowego.</li>
</ol>
6. Barwienie fluorescencyjne DCFH-DA i Fluo-4 AM
UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tej procedury, zapoznaj się z poprzednim raportem29.
<ol>
	<li>Inkubować komórki MCF-7 przez 20 minut za pomocą sondy fluorescencyjnej 10 μM DCFH-DA (patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C. Po dokładnym usunięciu nadmiaru DCFH-DA poprzez trzykrotne przemycie PBS, należy zbadać intensywność fluorescencji przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 488 nm i 525 nm za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
	<li>Inkubować komórki MCF-7 w roztworze sondy fluorescencyjnej Fluo-4 AM o wielkości 5 μM (patrz tabela materiałów) przez 45 minut w temperaturze 37 °C. Po trzykrotnym przemyciu PBS oznaczyć wartości intensywności fluorescencji przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 488 nm i 516 nm za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
7. Western blot
<ol>
	<li>Dodać 2 ml zawiesin komórkowych 5 x 106 komórek/ml zawierających różne leki do płytek 6-dołkowych i hodować w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny 
	UWAGA: Grupy do analizy western blot zostały ustalone w następujący sposób: grupa kontrolna, grupa LY294002 (10 μM), grupa Sal (80 μM) i grupa LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Zebrać komórki i supernatant i odwirować w temperaturze 560 × g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty. Odrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć wstępnie schłodzonym PBS. Po każdym myciu odwirować komórki w temperaturze 560 × g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty.</li>
	<li>Dodać 50 μl buforu do lizy do próbki komórki z kroku 7.2 na 15-minutową kąpiel lodową. Wirować w temperaturze 8550 × g w temperaturze 4 °C przez 10 minut w celu zebrania próbki białka sklarowanego nad osadem.</li>
	<li>Po wykryciu stężenia białka metodą BCA, wymieszać próbkę białka w kroku 7.3 z buforem ładującym w stosunku 4:1, denaturować w temperaturze 100 °C przez 10 minut w kąpieli metalowej i schłodzić do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Dodać 20 μg próbki białka z kroku 7.4, oddzielić białka o różnych masach cząsteczkowych35za pomocą 10% SDS-PAGE (patrz tabela materiałów), a następnie przenieść na membrany PVDF o grubości 0,22 μm. Po zablokowaniu 5% BSA, inkubować błony z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Rozcieńczone stężenie następujących przeciwciał pierwszorzędowych wynosi 1:1,000: rozszczepiona kaspaza-9/7/3 (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 i β-aktyna (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Następnego dnia inkubować błony z kozim przeciwciałem drugorzędowym anty-króliczym IgG przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Rozwinąć błony za pomocą roztworu chemiluminescencyjnego ECL i uchwycić obrazy za pomocą bezkontaktowego ilościowego systemu obrazowania western blot (patrz tabela materiałów).</li>
</ol>
8. qRT-PCR
<ol>
	<li>Przeprowadzić wirowanie w celu zebrania komórek MCF-7 w temperaturze 560 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty i dodać 500 μl buforu RL1 do 5 × 106 komórek. Przedmuchać i kilkakrotnie wymieszać pipetą, aż nie będą widoczne masy komórek. 
	UWAGA: Bufor RL1 jest jednym ze składników kompletnego zestawu do izolacji RNA (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Przenieść homogenaty komórkowe opisane w kroku 8.1 do kolumny czyszczącej DNA umieszczonej w probówce zbiorczej i odwirować przy 8,550 × g w temperaturze 4 °C przez 2 minuty. Wyjąć kolumnę czyszczącą DNA i utrzymać supernatant w probówce zbiorczej. 
	UWAGA: Kolumna czyszcząca DNA i probówka do pobierania to dwa składniki kompletnego zestawu do izolacji RNA (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Dodać 800 μl buforu RL2 do 500 μl supernatantu z kroku 8.2 i delikatnie wymieszać. 
	UWAGA: Bufor RL2 jest jednym ze składników kompletnego zestawu do izolacji RNA (patrz Tabela materiałów). Przed użyciem dodać 120 ml bezwodnego etanolu do 60 ml buforu RL2.</li>
	<li>Przenieść 700 μl mieszaniny z etapu 8.3 do kolumny zawierającej tylko RNA umieszczonej w probówce zbiorczej i odwirować przy 8 550 × g w temperaturze 4 °C przez 1 minutę. Wyrzucić odpady cieczy do probówki zbiorczej. 
	UWAGA: Kolumna zawierająca tylko RNA jest jednym ze składników kompletnego zestawu do izolacji RNA (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Powtórz krok 8.4, aby przetworzyć pozostałą mieszaninę z kroku 8.3.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu RW1 do kolumny zawierającej tylko RNA i odwirować przy 8 550 × g w temperaturze 4 °C przez 1 minutę. Wyrzucić odpady cieczy do probówki zbiorczej. 
	UWAGA: Bufor RW1 jest jednym ze składników kompletnego zestawu do izolacji RNA (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Dodać 700 μl buforu RW2 do kolumny zawierającej tylko RNA i odwirować przy 8 550 × g w temperaturze 4 ◦C przez 1 minutę. Wyrzucić odpady cieczy do probówki zbiorczej. Powtórz krok 8.7 raz. 
	UWAGA: Bufor RW2 jest jednym ze składników kompletnego zestawu do izolacji RNA (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Umieścić kolumnę zawierającą tylko RNA z powrotem w probówce zbiorczej i odwirować w temperaturze 8550 × g w temperaturze 4 °C przez 2 minuty w celu usunięcia pozostałego buforu RW2.</li>
	<li>Przenieść kolumnę zawierającą tylko RNA do nowej probówki zbiorczej i wlać 100 μl wolnego od RNaz ddH2O podgrzanego w temperaturze 65 °C do środka membrany dla kolumny zawierającej tylko RNA. Umieścić w temperaturze 25 °C na 2 minuty i zebrać roztwór RNA przez odwirowanie w temperaturze 8 550 × g w temperaturze 4 °C przez 1 minutę 
	UWAGA: DDH2O bez RNaz jest jednym ze składników kompletnego zestawu do izolacji RNA (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Dodać 4 μl 5x buforu reakcyjnego, 1 μl startera oligo (dT)18, 1 μl losowego startera heksameru, 1 μl startera specyficznego dla genu (patrz Tabela 1), 1 μl mieszaniny enzymów i 5 μg roztworu RNA z kroku 8.9 do 100 μl 8-probówkowego paska. Uzupełnij układ reakcyjny wodą wolną od RNaz do 20 μl.</li>
	<li>Ustawić warunki reakcji układu w następujący sposób: (1): 95 °C, 30 s, 1 cykl; (2): 95 °C, 5 s, 50 cykli, 60 °C, 34 s; (3): 95 °C, 5 s, 1 cykl, 65 °C, 60 s, 97 °C, 1 s; i (4): 42 °C, 30 s, 1 cykl. Wykonaj procedurę qRT-PCR. 
	UWAGA: Względne poziomy ekspresji docelowych genów analizowano ilościowo metodą 2−ΔΔCT 36,37. Informacje o starterach każdego genu użytego do analizy qRT-PCR są wymienione w Tabeli 1.</li>
</ol>
9. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Wyraź dane jako średnią ± odchylenie standardowe trzech niezależnych eksperymentów.</li>
	<li>Analizuj porównania między wieloma grupami za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów i analizy (patrz tabela materiałów) z jednokierunkową analizą wariancji (ANOVA), a następnie testem Tukeya. W niniejszej pracy P < 0,05 określono jako istotne statystycznie.</li>
</ol>

Salidroside's Mechanism in Suppressing MCF-7 Cell Migration and Proliferation

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rak piersi dotyka osoby w każdym wieku i powoduje nieobliczalne obciążenie fizyczne i psychiczne oraz dużą presję ekonomiczną1. Rak piersi, ze względu na rosnącą z roku na rok zachorowalność i śmiertelność, przyciągnął również uwagę całego świata w zakresie poszukiwania skutecznych terapii ziołowych poza konwencjonalnymi metodami leczenia 4,5. Obiecująco, duża liczba dowodów ujawniła przeciwnowotworowe działanie Sal 24,25,38.<sup class="xr...

Jako jeden z najczęściej diagnozowanych nowotworów i najczęściej diagnozowanych nowotworów, najnowsze statystyki wskazują, że do 2020 roku na całym świecie pojawiło się 2,3 miliona przypadków raka piersi, co stanowi 11,7% wszystkich przypadków raka1. Typowe objawy raka piersi to tkliwość i mrowienie piersi, guzki i ból piersi, upławy z brodawek, nadżerka lub zapadnięta skóra oraz powiększone pachowe węzły chłonne1,2. Jeszcze bardziej niepokojące jest to, że liczba nowych przypadków i ogólna częstość występowania raka piersi nadal rosną w przytłaczającym tempie każdego roku, odpowiadając za 6,9% zgonów związanych z rakiem1. Obecnie interwencja w kierunku raka piersi nadal obejmuje głównie chemioterapię, chirurgię, radioterapię i kompleksowe leczenie. Chociaż leczenie może skutecznie zmniejszyć częstość nawrotów i śmiertelność pacjentów, długotrwałe stosowanie leczenia często powoduje oporność wielolekową, wypadanie włosów na dużych obszarach, nudności i wymioty oraz poważne obciążenie psychiczne i psychiczne2,3. Warto zauważyć, że potencjalne ryzyko przerzutów raka piersi do wielu narządów zmusza również ludzi do poszukiwania nowych ziołowych źródeł terapii lekowej4,5.
Sygnalizacja za pośrednictwem kinazy fosfoinozytolu 3 (PI3K) jest zaangażowana we wzrost, proliferację i przeżycie raka piersi poprzez splicing, który wpływa na ekspresję wielu genów6. Jako białko PI3K wykrywające sygnał, liczne dowody sugerują, że kinaza białkowa B (AKT) może łączyć się z celem ssaków białka rapamycyny (mTOR) w celu dalszego wzrostu raka piersi7,8,9. Co więcej, dezaktywacja sygnalizacji PI3K/AKT/mTOR została również uznana za kluczowy składnik leków hamujących złośliwą proliferację i stymulujących apoptozę w raku piersi10,11,12. Powszechnie wiadomo, że ekstremalne niedotlenienie w mikrośrodowisku guza wymusza ogromny wzrost indukowanego hipoksją czynnika 1 alfa (HIF-1α), co dodatkowo pogarsza postęp raka piersi13,14,15. Równolegle stymulacja AKT prowadzi również do nadmiernej akumulacji HIF-1α, ograniczając apoptozę w próbkach raka piersi16,17. Co ciekawe, potwierdzono, że aktywacja sygnalizacji PI3K-AKT-HIF-1α jest zaangażowana w patologiczną progresję i przerzuty w różnych nowotworach, w tym w raku płuc18, raku jelita grubego19, raku jajnika20 i raku prostaty21. Oprócz tego, że jest koordynowany przez HIF-1α, nadekspresja czynnika transkrypcyjnego 1 (FoxO1) rozwidlonej głowy jest również wywoływana przez stymulację sygnalizacji AKT, która sprzyja zatrzymaniu cyklu i zahamowaniu apoptozy w komórkach raka piersi22,23. Podsumowując, powyższe solidne dowody sugerują, że hamowanie kaskady sygnalizacji PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 może być potencjalnym nowym celem terapii lekowej w raku piersi.
Salidroside (Sal) ma szeroko udowodnione działanie przeciwnowotworowe24,25, anti-hypoxia26,27,28,29 oraz działania farmakologiczne wzmacniające odporność30. Jest to jasnobrązowy lub brązowy proszek, który jest łatwo rozpuszczalny w wodzie, jest rodzajem glikozydu fenyloetanoidowego i ma wzór struktury chemicznej C14H20O7 i masę cząsteczkową 300,3 31,32. Nowoczesne badania farmakologiczne wykazały, że Sal może promować apoptozę komórek raka żołądka poprzez hamowanie sygnalizacji PI3K-AKT-mTOR24. Dalsze dowody sugerują również, że tłumienie sygnalizacji PI3K-AKT-HIF-1α przez leczenie Sal może przyczyniać się do apoptozy komórek rakowych poprzez zwiększenie ich wrażliwości na środki chemioterapeutyczne25. Dowody sugerują również, że Sal ogranicza migrację i inwazję komórek oraz powoduje zatrzymanie cyklu poprzez promowanie apoptozy w ludzkich komórkach MCF-7 raka piersi33,34. Jednak dopiero okaże się, czy Sal może regulować sygnalizację PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 i hamować złośliwą proliferację komórek MCF-7. Dlatego protokół ten miał na celu zbadanie wpływu Sal na migrację komórek MCF-7, inwazję, cykl komórkowy i apoptozę za pośrednictwem szlaku PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. Zintegrowane strategie badawcze obejmujące konwencjonalne, tanie i niezależne eksperymenty, takie jak ocena migracji i inwazji komórek, apoptoza i wykrywanie cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej, reaktywne formy tlenu (ROS) i oznaczanie fluorescencji Ca2 + itp., mogą stanowić punkt odniesienia dla ogólnego projektu eksperymentów w badaniach przeciwnowotworowych z tradycyjną medycyną ziołową. Proces eksperymentalny tego badania jest pokazany na <silna klasa="xfig">Rysunek 1.

<table><tbody><tr><td>1% penicylina/streptomycyna</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało AKT</td><td>ImmunoWay Biotechnology Company</td><td>YT0185</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Aneksin V-FITC/PI</td><td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td><td>AP101</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny czytnik mikropłytek</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>SpectraMax iD5</td><td></td></tr><tr><td>Bax przeciwciało</td><td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>#5023</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw BCA</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>BL521A</td><td></td></tr><tr><td>Bcl-2</td><td>przeciwciało Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>#15071</td><td></td></tr><tr><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td> <td>przeciwciał Bim</td>, Inc.<td>#2933</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+– Zestaw do oznaczania ATPazy</td><td>Instytut Bioinżynierii Nanjing Jiancheng</td><td>A070-4-2</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do liczenia komórek-8</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>BS350B</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia cyklu komórkowego</td><td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td><td>CCS012</td><td></td></tr><tr><td>rozszczepiona kaspaza-3</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej, Inc.</td><td>#9661</td><td></td></tr><tr><td>rozszczepiona kaspaza-7</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej, Inc.</td><td>#8438</td><td></td></tr><tr><td>rozszczepiona kaspaza-9</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej, Inc.</td><td>#20750</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór fioletu krystalicznego</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C0121</td><td></td></tr><tr><td>DMEM pożywka do hodowli wysokiego poziomu glukozy</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td>G4510</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek doksorubicyny</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-15142</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chemiluminescencyjny ECL</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>BL520B</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Procell Nauki przyrodnicze i Technologia Co., Sp. z o.o.</td><td>164210</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD</td><td>FACSCanto <img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/65634/65634eq01.jpg" style="margin: auto; "></td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>S1060</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało FoxO1</td><td>ImmunoWay Biotechnology Company</td><td>YT1758</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG</td><td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td><td>70-GAR0072</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie GraphPad Prism</td><td>La Jolla</td><td>Wersja 6.0</td><td></td></tr><tr><td>HIF-1 i alfa</td><td>przeciwciało Powinowactwo Biosciences</td><td>BF8002</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka linia komórkowa raka piersi MCF-7</td><td>Procell Nauki przyrodnicze i Technologia Co., Sp. z o.o.</td><td>CL-0149</td><td></td></tr><tr><td>Bufor załadowczy</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>BL502B</td><td></td></tr><tr><td>LY294002</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10108</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Thermo </td><td></td><td></td>356234</tr><tr><td>przeciwciało mTOR</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>GB11405</tr><tr><td>Na+– K+– Zestaw do oznaczania ATPazy</td><td>Instytut Bioinżynierii Nanjing Jiancheng</td><td>A070-2-2</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop optyczny</td><td>Olympus</td><td>IX71PH</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało p-AKT</td><td>ImmunoWay Biotechnology Company</td><td>YP0006</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało PI3K</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>GB11525</tr><tr><td>przeciwciało p-PI3K</td><td>Affinity Biosciences</td><td>AF3241</td><td></td></tr><tr><td>Ilościowy system obrazowania western blot</td><td>Touch Image Pro</td><td>eBlot</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA z odwrotną transkrypcją</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>Zestaw testowy <td>G3330-100</td><td></td></tr><tr><td>ROS</td> Sonda fluorescencyjna <td>Beyotime Biotechnology</td><td>S0033S</td><td>DCFH-DA jest dołączona tutaj</td></tr><tr><td>Salidroside</td><td>Chengdu Herbpurify Co., Ltd.</td><td>Zestaw H-040</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td>G2003-50T</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji całkowitego RNA</td><td>Foregene</td><td>RE-03014</td><td></td></tr><tr><td>Hyklon trypsyny</td><td></td><td>SH30042.01</td><td></td></tr> <tr><td>i beta;-aktyny</td><td>Powinowactwo Biosciences</td><td>AF7018</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie działania farmakologicznego i mechanizmu molekularnego salidrozydu w hamowaniu proliferacji i migracji komórek mcf-7

Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration

Salidroside (Sal) zawiera przeciwnowotworowe, przeciw-hipoksyjne i przeciwzapalne działanie farmakologiczne. Jednak leżące u jego podstaw mechanizmy przeciw rakowi piersi zostały tylko nie w pełni wyjaśnione. W związku z tym protokół ten miał na celu rozszyfrowanie potencjału Sal w regulacji szlaku PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 w złośliwej proliferacji ludzkich komórek MCF-7 raka piersi. Po pierwsze, aktywność farmakologiczną Sal przeciwko MCF-7 oceniano za pomocą testów CCK-8 i zadrapań komórkowych. Ponadto oporność komórek MCF-7 mierzono za pomocą testów migracji i inwazji Matrigel. W przypadku apoptozy komórkowej i testów cyklicznych, komórki MCF-7 przetwarzano etapami za pomocą aneksyny V-FITC/PI i zestawów do wykrywania barwienia cyklu komórkowego do analiz cytometrii przepływowej. Poziomy reaktywnych form tlenu (ROS) i Ca2+ badano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego DCFH-DA i Fluo-4 AM. Aktywność Na+-K+-ATPazy iCa2+-ATPazy określono przy użyciu odpowiednich zestawów komercyjnych. Poziomy ekspresji białek i genów w apoptozie i szlaku PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 określono dalej za pomocą analiz western blot i qRT-PCR. Odkryliśmy, że leczenie Sal znacznie ograniczało proliferację, migrację i inwazję komórek MCF-7 z efektami zależnymi od dawki. Tymczasem podawanie Sal dramatycznie zmusiło komórki MCF-7 do poddania się apoptozie i zatrzymaniu cyklu komórkowego. Testy immunofluorescencyjne wykazały, że Sal obserwacyjnie stymulował produkcję ROS i Ca2+ w komórkach MCF-7. Dalsze dane potwierdziły, że Sal promował poziomy ekspresji białek proapoptotycznych, Bax, Bim, rozszczepionej kaspazy-9/7/3 i odpowiadających im genów. Konsekwentnie, interwencja Sal znacznie zmniejszyła ekspresję białek Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α i FoxO1 oraz odpowiadających im genów. Podsumowując, Sal może być stosowany jako potencjalny związek pochodzenia ziołowego w leczeniu raka piersi, ponieważ może zmniejszać złośliwą proliferację, migrację i inwazję komórek MCF-7 poprzez hamowanie szlaku PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.

Wpływ Sal na hamowanie nadmiernej proliferacji i opóźnianie gojenia ran w komórkach MCF-7 
Aby zbadać potencjał Sal w walce z rakiem piersi, najpierw przetestowano jego właściwości przeciwnowotworowe, wykorzystując testy toksyczności proliferacyjnej oraz testy zarysowania (scratch assays) na ludzkiej linii komórkowej raka piersi MCF-7. Komórki te inkubowano wspólnie z serią stężeń Sal (5-320 µM) przez 24 h, a proliferację komórek oceniono za pomocą testu CCK-8. Zaobserwowano zależny od dawki efekt ham...

Obecny protokół opisuje kompleksową strategię oceny działania farmakologicznego i mechanizmu salidrozydu w hamowaniu proliferacji i migracji komórek MCF-7.

Badanie działania farmakologicznego i mechanizmu molekularnego salidrozydu w hamowaniu proliferacji i migracji komórek MCF-7

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer ...

Skupiamy się na badaniu związków aktywnych pochodzących z produktów naturalnych i ich potencjału w leczeniu raka piersi. W szczególności naszym celem jest nawiązanie do farmakologicznych skutków strony komórkowej i jej mechanizmów molekularnych w walce z rakiem piersi. Obecnie brakuje wiarygodnych technik eksperymentalnych, które pozwoliłyby potwierdzić cele molekularne salidrozydu w leczeniu raka piersi.Jednym z istotnych odkryć w tej dziedzinie jest potencjalna proliferacja i migracja komórek MCF-7 poprzez regulację segmentacji PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1. Przyszłe badania laboratorium mają na celu zbadanie mechanizmów patologicznych leżących u podstaw powstania, rozwoju, rokowania i wyników raka piersi. Dodatkowo przeprowadzamy badania przesiewowe pod kątem rzeczywistych małych naturalnych leków pochodzących ze źródeł naturalnych, które mogą przyczynić się do zapobiegania i leczenia raka piersi.Na początek inkubuj dwa mililitry hodowanych komórek MCF-7 na sześciodołkowej płytce do 90% konfluacji. W monowarstwie wyhodowanych komórek utwórz liniowe zadrapanie nawinięte na środku za pomocą sterylnej końcówki pipety. Następnie uchwyć obrazy za pomocą mikroskopu optycznego w różnych odstępach czasu.W teście transwellowym zawiesić komórki MCF-7 w podłożu wolnym od surowicy. Następnie wysiewaj komórki w górnej komorze transwell, wstępnie pokryte lub niepokryte matrigelem. Dodaj kompletną pożywkę DMEM na dnie komory transwell, aby działała jako induktor chemiczny.Po 24 godzinach usuń komórki z górnej komory i utrwal pozostałe komórki inwazyjne i migrujące za pomocą metanolu. Wybarwić ogniwa MCF-7 roztworem fioletu krystalicznego. Następnie zobrazuj wybarwione komórki za pomocą mikroskopu optycznego.Zaobserwowano zależny od dawki hamujący wpływ strony salidrozydu na proliferację komórek, z 50% spadkiem żywotności komórek przy 40 mikromolach. Co więcej, salidrozyd może z czasem hamować witalność komórek MCF-7, powodując 50% spadek żywotności komórek MCF-7 po 24 godzinach wspólnej inkubacji. Test zadrapań ran wykazał działanie hamujące leczenie salidrozydami na komórkach MCF-7.Co więcej, leczenie salidrozydem znacznie zmniejszyło niepożądaną migrację i inwazję komórek MCF-7. Za pomocą zestawu kwasu bicinchoninowego zmierz stężenie białka w lizowanych komórkach MCF-7 zgodnie z instrukcjami producenta. Dodaj próbki zlizowanych komórek do odpowiednich grup na 96-dołkowej płytce.Następnie dodaj roztwór roboczy i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Na koniec zmierz wartości gęstości optycznej przy 636 nanometrach w funkcjonalnym czytniku mikropłytek. Salidrozyd ograniczał witalność enzymów ATPaz sodowo-potasowych i ATPA wapnia, co wskazuje na jego potencjalną rolę w promowaniu dysfunkcji mitochondriów.Aby rozpocząć, zbierz trypsynizowane komórki MCF-7. Następnie wybarwić zawieszone komórki PBS za pomocą XN5 FITC i jodku propidyny przez 20 minut. Następnie określ liczbę komórek apoptotycznych za pomocą cytometru przepływowego.W celu analizy cyklu komórkowego wymieszaj zawieszone komórki z roztworem jodku propidyny w świeżej probówce i inkubuj mieszaninę przez 30 minut. Następnie wykryj próbkę za pomocą cytometru przepływowego. Salidrozyd zwiększał liczbę komórek MCF-7 we wczesnych i późnych stadiach epizodycznych.Tymczasem, w porównaniu z grupą kontrolną, leczenie salidrozydem również znacznie zwiększyło liczbę komórek w fazie G0 G1, jednocześnie zmniejszając odsetek komórek fazy S. Dodaj 10 mikromoli sondy fluorescencyjnej DCFH-DA do komórek MCF-7 i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Po inkubacji usunąć nadmiar DCFH-DA, przemłukując komórki trzykrotnie PBS.Następnie przetestuj intensywność fluorescencji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i długości fali wzbudzenia 488 nanometrów oraz długości fali emisji 525 nanometrów. Inkubować komórki MCF-7 z pięciomikromolowym roztworem sondy fluorescencyjnej Fluo-4 AM przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po trzykrotnym umyciu komórek PBS należy określić intensywność fluorescencji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego ze wzbudzeniem na 488 nanometrach i emisją na 516 nanometrach.Salidrozyd znacznie wzmacniał sygnały fluorescencyjne ROS wykazywane przez barwienie immunofluorescencyjne DCFH-DA. Konsekwentnie, interwencja salidrozydów również wyraźnie zwiększyła produkcję wapnia, o czym świadczy barwienie immunofluorescencyjne Fluo-4 AM. Zacznij od dodania dwóch mililitrów komórek MCF-7 zawierających różne leki do studzienek sześciodołkowej płytki.Inkubuj kultury komórkowe przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Zbierz komórki przez odwirowanie w temperaturze 560 G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umyj komórki dwukrotnie wstępnie schłodzonym PBS, odwirowując przy 560G przez trzy minuty między praniami.Dodać 50 mikrolitrów buforu do lizy do umytych komórek i umieścić próbkę w łaźni lodowej na 15 minut. Następnie odwirować próbkę w temperaturze 8,550 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać próbkę białka sklarowanego nad osadem. Połączyć próbkę białka z buforem ładującym w stosunku cztery do jednego.Następnie denaturuj mieszaninę w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 minut w metalowej kąpieli. Następnie ostudzić mieszaninę w temperaturze pokojowej. Oddzielić próbkę białka za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym 10%SDS.Przenieś białka na membranę PVDF o grubości 0,22 mikrometra. Po zablokowaniu błony 5% BSA, inkubuj ją z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia inkubuj błonę z kozim przeciwciałem drugorzędowym anty-króliczym IgG w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.Następnie wywołaj błony za pomocą roztworu chemoluminescencji ECL i uchwyć obrazy za pomocą bezkontaktowego systemu ilościowego obrazowania western blot. Western blot wykazał, że leczenie salidrozydem promowało ekspresję białek czynników proapoptotycznych CC9, CC7, CC3, Bim i Bax, jednocześnie hamując ekspresję białek antyapoptotycznych BCL2. Salidrosdie wyraźnie ograniczył proporcje PPI3K do PI3K i PAKT do AKT.Tymczasem ekspresja białek mTOR, HIF-1-alfa i Fox01 została również znacznie stłumiona. Zbierz komórki MCF-7C przez wirowanie w temperaturze 560G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj 500 mikrolitrów buforowanego RL1 do pięć razy 10 z sześciu komórek i dokładnie wymieszaj, aż nie będą widoczne żadne masy komórek.Następnie przenieś homogenaty komórek do kolumny czyszczącej DNA osadzonej w probówce zbiorczej. Odwirować próbki w temperaturze 8,550 G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu wyjąć kolumnę czyszczącą DNA, zatrzymując supernatant w probówce zbiorczej.Dodać 800 mikrolitrów buforu RL2 i 500 mikrolitrów supernatantu i delikatnie wymieszać. Następnie przenieś 700 mikrolitrów mieszaniny do kolumny zawierającej tylko RNA osadzonej w probówce zbiorczej. Odwirować probówkę o temperaturze 8,550 G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie wyrzuć przepływ z probówki zbiorczej. Przemyć kolumnę tylko RNA najpierw 500 mililitrami buforu RW1, a następnie 700 mililitrami buforu RW2, wirując przez jedną minutę w temperaturze 8, 550 G i czterech stopniach Celsjusza przy każdym płukaniu. Po usunięciu pozostałej probówki RW przez ponowne odwirowanie, przenieść kolumnę z samym RNA do nowej probówki zbiorczej.Dodaj 100 mikrolitrów bezRNAzowej wody dejonizowanej podgrzanej do 65 stopni Celsjusza do środka membrany w kolumnie zawierającej tylko RNA i odczekaj dwie minuty. Następnie odwirować w temperaturze 8,550G przez jedną minutę w czterech stopniach Celsjusza, aby zebrać roztwór RNA. Ustaw mieszaninę reakcyjną do PCR, a następnie ustaw warunki reakcji PCR systemu.Wykonaj procedurę qRT-PCR. QRT-PCR wykazał, że leczenie salidrozydem promowało ekspresję genów czynników proapoptotycznych CC9, CC7, CC3, Bim i Bax, jednocześnie hamując ekspresję genów antyapoptotycznych BCL2. Ponadto podawanie salidrozydu zmniejszało poziomy ekspresji genów PI3K, AKT, mTOR, HIF-1-alpha i Fox01.

exploring-pharmacological-action-molecular-mechanism-salidroside

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano metodę propagacji ludzkich guzów siatkówczaka u myszy. Komórki nowotworowe są wstrzykiwane bezpośrednio do oczu myszy z niedoborem odporności. Guzy wtórne zostały pomyślnie wywołane z wykorzystaniem zarówno komórek pobranych bezpośrednio z ludzkich guzów, jak i hodowanych tumorsfer.

Ustanowienie i propagacja guzów retinoblastomy ludzkiej u myszy z niedoborem odporności

Opisano przedzielone urządzenie mikrofluidyczne do badania migracji komórek macierzystych nowotworu. Ta nowatorska platforma tworzy żywotne mikrośrodowisko komórkowe i umożliwia mikroskopową wizualizację lokomocji żywych komórek. Wysoce ruchliwe komórki nowotworowe są izolowane w celu zbadania molekularnych mechanizmów agresywnej infiltracji, co w przyszłości może prowadzić do opracowania bardziej skutecznych terapii.

Ocena migracji komórek macierzystych nowotworu z wykorzystaniem kompartymentowych urządzeń mikroprzepływowych i obrazowania żywych komórek

Ustrukturyzowany protokół jest prezentowany dla testu komórkowego jako test funkcjonalny do przewidywania rokowania skoliozy idiopatycznej za pomocą komórkowej spektroskopii dielektrycznej (CDS). Test można wykonać na świeżych lub mrożonych komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), a procedura zostaje zakończona w ciągu 4 dni.

Protokół testu komórkowego do prognozowania skoliozy idiopatycznej za pomocą komórkowej spektroskopii dielektrycznej

Neowaskularyzacja (NV) rogówki może komplikować wiele patologii wzrokowych. Wykorzystując kontrolowany model uszkodzeń spowodowanych oparzeniami zasadowymi, można uzyskać wymierny poziom NV rogówki do mechanistycznego badania NV rogówki i oceny potencjalnych terapii zaburzeń neowaskularnych.

Model urazu neowaskularyzacji rogówki w oparzeniach zasadowych u myszy

Opracowaliśmy model in vitro uśpienia w szpiku kostnym dla wrażliwych na estrogeny komórek raka piersi. Celem tego protokołu jest zademonstrowanie wykorzystania modelu do badania biologii molekularnej i komórkowej stanu spoczynku oraz do generowania hipotez do późniejszych testów in vivo.

Model spoczynku in vitro wrażliwego na estrogeny raka piersi w szpiku kostnym: narzędzie do badań mechanizmów molekularnych i generowania hipotez

Opisujemy dwie uzupełniające się metody wykorzystujące wskaźnik cyklu komórkowego ubikwitynacji fluorescencji (FUCCI) oraz analizę obrazu lub cytometrię przepływową do identyfikacji i izolacji komórek w wewnętrznych obszarach zatrzymanych G1 i zewnętrznych proliferujących sferoidach 3D.

Oparta na obrazowaniu i cytometrii przepływowej analiza położenia komórki i cyklu komórkowego w sferoidach czerniaka 3D

Ten manuskrypt opisuje, w jaki sposób zmiany przypominające nacięcia wykonane na monowarstwach hodowanych komórek nabłonkowych wygodnie modelują gojenie się ran in vitro, umożliwiając obrazowanie za pomocą konfokalnej lub laserowej mikroskopii skaningowej, i które mogą dostarczyć wysokiej jakości danych ilościowych i jakościowych do badania zarówno zachowania komórek, jak i mechanizmów związanych z migracją.

Mikroskopowe metody oceny migracji komórek nabłonka podczas gojenia się ran in vitro

Tutaj prezentujemy protokół dla testu in vitro z użyciem pierwotnych fibroblastów oraz dla testu in vivo gojenia ran skóry na myszach. Oba testy są prostymi metodami oceny gojenia się ran in vitro i in vivo.

Test migracji zadrapań i komora grzbietowego fałdu skórnego do analizy gojenia się ran in vitro i in vivo

Unikanie eliminacji za pośrednictwem komórek NK przez komórki rakowe jest ważne dla inicjacji i progresji raka. Tutaj przedstawiamy dwa protokoły nieoparte na radioaktywności do oceny cytotoksyczności komórek NK w stosunku do komórek nowotworowych wątroby. Dodatkowo przedstawiono trzeci protokół do analizy migracji komórek NK.

Pomiar cytotoksyczności i migracji komórek NK w kontekście komórek nowotworowych wątroby

W tym badaniu prezentujemy metodę obrazowania w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii konfokalnej do obserwacji komórek poruszających się w kierunku uszkodzonej tkanki poprzez inkubację ex vivo z nabłonkiem ślimaka zawierającym narząd Cortiego.

Obrazowanie poklatkowe żywych komórek in vitro w celu zbadania migracji komórek w kierunku narządu Cortiego

Poznaj działanie salidrozydy w hamowaniu proliferacji i migracji komórek MCF-7 poprzez regulację szlaku PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. Ta metoda pozwala badać mechanizmy molekularne raka piersi.

Badanie działania farmakologicznego i mechanizmu molekularnego salidrozydu w hamowaniu proliferacji i migracji komórek MCF-7

Przeglądaj więcej filmów