Pobieranie próbek płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi z żyły ogonowej bocznej u szczurów podczas zapisów EEG

W naszych badaniach dążymy do znalezienia przypuszczalnych biomarkerów diagnostycznych i prognostycznych padaczki. Aby zwalidować je w płynach biologicznych, porównujemy poziomy określonych substancji w płynie mózgowo-rdzeniowym i osoczu z występowaniem napadów samoistnych u szczurów. Do tej pory niektóre małe niekodujące kwasy rybonukleinowe, takie jak miRNA lub fragmenty tRNA, zostały zidentyfikowane jako krążący biomarker padaczki, ale ich przydatność jako skutecznego i wiarygodnego narzędzia diagnostycznego lub prognostycznego w padaczce musi zostać potwierdzona.

Badamy różne krążące markery padaczki. Rutynowo pobieramy osocze i płyn mózgowo-rdzeniowy szczurów z padaczką podczas wykonywania zapisu EEG w celu identyfikacji napadów samoistnych. Powtarzając pobieranie próbek przez wiele dni, możemy skorelować poziomy markerów z pojedynczym wystąpieniem napadu lub ich skumulowanym efektem.

Obecnym wyzwaniem jest uzyskanie wystarczającej ilości próbek wysokiej jakości do następujących procedur analitycznych bez wywoływania u zwierząt napadów produktów stresu spowodowanych ich manipulacją, które mogą wpływać na poziomy badanych cząsteczek. Istnieje pilna, niezaspokojona potrzeba medyczna, aby odkryć biomarkery dla osób z padaczką, zwłaszcza te prognostyczne i ryzykowne. Pobieranie próbek osocza i płynu mózgowo-rdzeniowego równolegle z monitorowaniem napadów EEG pozwala na znalezienie odpowiedniego markera.

Nasza technika pobierania z zablokowaną żyłą ogonową wytwarza wysokiej jakości próbki osocza wolne od hemolizy, ponieważ nie wymaga próżni ani dojenia ogona. Nakłucie Cisterna magna, którego używamy do pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego, ma lepszą sterylność i mniejsze ryzyko utraty implantu głowy w porównaniu z systemem kaniulowanym. Na początek umieść zwierzę w czystej klatce w pomieszczeniu nagraniowym, aby umożliwić przyzwyczajenie się do nowego środowiska.

Umieść klatkę w klatce Faradaya, aby uniknąć zakłóceń pola elektromagnetycznego otoczenia w sygnale EEG. Podłącz jeden koniec nagrywającego do urządzenia nagrywającego. Użyj woltomierza do pomiaru potencjału elektrycznego i rozróżnienia elektrod masowych i referencyjnych.

Następnie przytrzymaj cementową osłonę na głowie zwierzęcia i włóż drugi koniec nagrywającego do złącza elektrody zamocowanego na głowie szczura. Użyj komutatora, aby zrównoważyć ciężar nagrywającego i umożliwić swobodny ruch zwierzęcia bez skręcania. Przed rozpoczęciem rejestracji należy sprawdzić wszystkie ustawienia używane do pozyskiwania i przetwarzania danych z EEG.

Upewnij się, że zastosowano odpowiednie filtrowanie i częstotliwość próbkowania, aby uniknąć artefaktów i szumów w sygnałach EEG. Rozpocznij nagrywanie wideo i zapisy EEG na monitorze. Sprawdź moc w określonych pasmach częstotliwości w czasie, aby upewnić się, że ścieżki pasują do oczekiwanego sygnału EEG.

Okresowo sprawdzaj ślady EEG. Sprawdź też zwierzęta. Jeśli nagrywający odczepi się od złącza elektrody, podłącz go ponownie i sprawdź, czy sygnał EEG jest czysty.

Przeanalizuj sygnał EEG, przeprowadzając badanie przesiewowe za pomocą zapisu EEG i identyfikuj czynności podobne do napadów. Potwierdź potencjalne napady konwulsyjne, sprawdzając zsynchronizowany zapis wideo zebrany jednocześnie z EEG. Na początek pokryj igłę motylkową i jej rurkę 1% roztworem potasu EDTA.

Przeciąć rurkę tuż za igłą, aby zebrać krew kroplami. Umieść znieczulonego szczura na ramie stereotaktycznej, utrzymując znieczulenie przez maskę na twarz. Umieść poduszkę grzewczą pod zwierzęciem, utrzymując część jego ogona w bezpośrednim kontakcie z podkładką.

Przesuń grzbiet zwierzęcia tak, aby był skierowany na boki, a boczna żyła ogonowa była widoczna u góry. Zanurz ogon w ciepłej wodzie, aby rozszerzyć żyłę boczną. Następnie przetrzyj ogon 70% etanolem.

Umieść ciepłe światło na ogonie za pomocą zwykłej żarówki. Włóż igłę motylkową 21G do bocznej żyły ogonowej pod kątem 20 stopni na głębokość pięciu milimetrów. Następnie zbierz krew w probówce próżniowej o pojemności 500 mikrolitrów zawierającej pięć miligramów potasu EDTA jako antykoagulantu.

Wyjąć igłę i zatrzymać przepływ krwi, wywierając nacisk na miejsce nakłucia. Przywróć szczura do jego domowej klatki. Następnie delikatnie odwróć probówkę 10 razy, aby wymieszać antykoagulant z krwią.

Zrób w lodzie otwory o głębokości 1,5 cala i umieść w nich rurki pionowo. W ciągu godziny od pobrania odwirować próbkę krwi w wirówce z chłodzeniem w celu oddzielenia osocza. Następnie odessać około 200 mikrolitrów osocza, omijając warstwę czerwonych i białych krwinek.

Umieść pobrane osocze w sterylnej mikroprobówce o pojemności 0,2 mililitra. Odłóż na bok pięć mikrolitrów próbki do kontroli jakości, a pozostałą próbkę przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy. Krew pobrano od szczurów w pięciu punktach czasowych przy użyciu różnych metod, takich jak technika próżniowa w 52 dniu, dojenie ogona w 55 dniu i techniki upuszczania w dniach od 58 do 64.

Jakość próbek osocza ocenianych za pomocą spektrofotometrii UV wykazała, że osocze było zabarwione na różowo ze średnią wartością absorbancji 0,647 przy zastosowaniu techniki próżniowej. Podobnie, technika dojenia ogona dała różowy kolor plazmy o średniej absorbancji 0,620. W przeciwieństwie do tego, w przypadku grawitacyjnego systemu pobierania kropli, uzyskano przezroczyste próbki osocza ze znacznie obniżonymi średnimi wartościami absorbancji osocza, co sugeruje, że procedura ta jest optymalna dla uzyskania wysokiej jakości próbek do analiz.

Na początek przygotuj igłę motylkową 203G, przecinając jej plastikową osłonę rękawa tak, aby koniec gołej igły był odsłonięty na siedem milimetrów. Następnie połącz igłę motylkową z rurką polimerową do jednomililitrowej strzykawki. Umieść znieczulonego szczura na stereotaktycznej ramie i utrzymuj znieczulenie przez maskę na twarz.

Następnie usuń futro z tylnej głowy i szyi szczura. Przymocuj głowę szczura za pomocą prętów do uszu. Przesuń pasek na nos ramy stereotaktycznej, aby opuścić głowę zwierzęcia o około 45 stopni w pionie.

Znajdź lekko wklęsłą powierzchnię na tylnej głowie z aspektem rombu między wypukłością potyliczną a grzbietem atlasu. Przetrzyj powierzchnię 70% etanolem. W przypadku pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego włóż igłę motylkową pionowo do środka wklęsłej powierzchni w kształcie rombu do cisterna magna, aż ruch zostanie zablokowany przez plastikową osłonę tulei igły.

Delikatnie pociągnąć tłok strzykawki, aby płyn mózgowo-rdzeniowy powoli przepływał przez igłę. Zbierz około 100 mikrolitrów płynu mózgowo-rdzeniowego do rurki polimerowej. Ściśnij rurkę polimerową bardzo blisko igły motylkowej i odetnij rurkę w tym miejscu.

Pobrać przezroczystą próbkę do strzykawki. Wyrzuć próbkę do sterylnej mikroprobówki o pojemności 0,2 mililitra i przechowuj na lodzie do jednej godziny. Zdezynfekować miejsce pobrania płynu mózgowo-rdzeniowego na głowie zwierzęcia.

Wyjmij szczura z klatki stereotaktycznej i umieść go z powrotem w klatce. Odłóż dwa mikrolitry próbki do kontroli jakości, a resztę przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy. Wielokrotne wycofywanie płynu mózgowo-rdzeniowego przeprowadzono w ciągu pięciu dni w trzech eksperymentalnych grupach szczurów i wyrażono jako procent udanych wycofań, które zakończyły się czystym płynem mózgowo-rdzeniowym.

U szczurów wyposażonych w podwójny implant głowy, którym wykonano kaniulę w celu pobrania płynu mózgowo-rdzeniowego, wskaźnik sukcesu wyniósł 71,1%, co wskazuje, że kaniula na głowie zwierzęcia może przeszkadzać w wielokrotnym pobieraniu próbek płynu mózgowo-rdzeniowego. W przeciwieństwie do tego, gdy pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego przeprowadzono za pomocą nakłucia cisterna magna tylko u zwierząt z elektrodami na uwięzi lub telemetrycznymi, wskaźnik sukcesu wynosił 86,7% i 88,9%Wyniki te sugerują, że technika nakłuwania jest bardziej odpowiednia do wielokrotnego wycofywania płynu mózgowo-rdzeniowego u zwierząt z implantami elektrodowymi.