Name: Badanie niezależnych efektów hormonu folikulotropowego in vivo w modelu mysim (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 32 s
Description: Poznaj niezależne działanie hormonu folikulotropowego na poziom cholesterolu w surowicy u myszy ovariectomizowanych. Metoda pozwala badać zmiany metaboliczne związane z menopauzą i ryzykiem chorób sercowo-naczyniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcemy podziękować laboratorium zwierzęcemu Szpitala Wojewódzkiego w Szantungu za wsparcie techniczne. Prace te były wspierane przez Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (NSFC 82101645), Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Shandong w Chinach (ZR2020QH088) oraz Plan Wsparcia Nauki i Technologii dla Innowacji Młodzieży Szkół Wyższych w prowincji Shandong (2021KJ051).

Poniższy protokół był zgodny ze wszystkimi instytucjonalnymi wytycznymi etycznymi dotyczącymi wykorzystania zwierząt badawczych i został zatwierdzony przez Komitet Etyki Zwierząt w Szpitalu Wojewódzkim w Shandong, Chiny. Wszystkie manipulacje chirurgiczne zostały wykonane w głębokiej narkozy, a zwierzęta nie odczuwały bólu na żadnym etapie zabiegu.
1. Przygotowanie do operacji
<ol>
	<li>Sterylizacja narzędzi
	<ol>
		<li>Przed zabiegiem wysterylizuj narzędzia chirurgiczne parą wodną w autoklawie (121°C przez 15 min). Przygotuj wystarczającą ilość jednorazowych szwów i igieł.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja platformy chirurgicznej
	<ol>
		<li>Zabieg należy wykonać w pomieszczeniu przeznaczonym do zabiegów chirurgicznych. Do operacji należy przeznaczyć powierzchnię stołu o wymiarach co najmniej 60 cm x 60 cm. Oczyść powierzchnię obszaru 75% alkoholem i przykryj jednorazowym ręcznikiem medycznym, a następnie zdezynfekuj ją promieniowaniem ultrafioletowym 30 minut wcześniej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zwierząt
	<ol>
		<li>Trzymaj wszystkie zwierzęta w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (20-25 °C) z 12-godzinnym cyklem światła i 12 godzin ciemności. Zaaklimatyzować 8-tygodniowe samice myszy C57BL/6 w obiekcie inwentarskim na 1 tydzień przed zabiegiem.</li>
		<li>Zważ myszy przed operacją. Wszystkim 9-tygodniowym samicom myszy należy podać znieczulenie ogólne przez dootrzewnowe wstrzyknięcie tribromoetanolu (280 mg/kg), aby uzyskać bezbolesność na każdym etapie zabiegu. Meloksykam (2 mg/kg) należy wstrzyknąć podskórnie, około 1 godzinę przed operacją w celu złagodzenia bólu.</li>
		<li>Zastosuj maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas zabiegu.</li>
		<li>Nałóż balsam do depilacji na plecy za pomocą czystego bawełnianego wacika. Pozostaw balsam na myszy na 3-5 minut, a następnie usuń włosy za pomocą gazy i wacików. Powtarzaj ten krok, aż wszystkie włosy zostaną usunięte z tyłu myszy.</li>
		<li>Użyj gazy i bawełnianych wacików, aby oczyścić skórę 75% alkoholem. Przymocuj mysz do platformy chirurgicznej za pomocą gumowego paska lub bawełnianej liny (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B) i nałóż roztwór jodoforu, aby wyczyścić plecy. 
		UWAGA: Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez uszczypnięcie palca u nogi przed owariektomią.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Jajnikomia
UWAGA: Tribromoetanol może być utrzymywany przez około 30 minut, zapewniając jak najwięcej czasu na zakończenie operacji.
<ol>
	<li>Wykonaj nacięcie grzbietowe o długości ~1,0 cm od podstawy uda w górę za pomocą jednorazowego skalpela, upewniając się, że nacięta jest tylko skóra i powięź podskórna i unikając w tym czasie nacinania tylnej otrzewnej.</li>
	<li>Pociągnij nacięcie w lewo, a zobaczysz białą poduszeczkę tłuszczową. Przeciąć ~0,5 cm wzdłuż białej poduszeczki tłuszczowej, aby odsłonić jamę śródotrzewnową za pomocą mikrokleszczy i nożyczek.</li>
	<li>Po przecięciu tylnej otrzewnej powoli i delikatnie usuń białą poduszeczkę tłuszczową z jamy śródotrzewnowej za pomocą mikrokleszczyków. Natychmiast zwilżyć białą tkankę tłuszczową 0,9% sterylnym roztworem soli fizjologicznej na zewnątrz nasączonej gazy. Odsłoniętą tkankę należy zawsze nawilżać, gdy znajduje się poza jamą brzuszną.</li>
	<li>Różowa ziarnista substancja, a mianowicie jajnik, jest przyczepiona do dolnej części białej poduszeczki tłuszczowej (<silna klasa="xfig">Ryc. 2A). Jajniki są połączone ze smukłym przewodem, a mianowicie macicą. Użyj szwów wchłanialnych 5-0, aby podwiązać jajnikowy koniec macicy i usunąć lewy jajnik (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B).</li>
	<li>Podczas usuwania jajnika należy w jak największym stopniu zachować otaczającą tkankę tłuszczową. Należy unikać bezpośredniego kontaktu narzędzi chirurgicznych z jajnikami i zapobiegać implantacji wewnątrzotrzewnowej tkanki jajnika.</li>
	<li>Ostrożnie umieść białą poduszeczkę tłuszczową z powrotem w jamie wewnątrzotrzewnowej. Wykonaj prosty szew przerywany na tylnej części otrzewnej za pomocą szwu wchłanialnego 5-0 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C). Po zakończeniu zakładania szwu oczyść wszelkie krwawienia sterylną gazą nasączoną solą fizjologiczną o stężeniu 0,9%.</li>
	<li>Pociągnij nacięcie skóry w prawo i usuń prawy jajnik tą samą metodą.</li>
	<li>Wykonaj przerywany szew z 4-0 niewchłanialnymi szwami i oczyść wszelkie krwawienia za pomocą 0,9% sterylnej gazy nasączonej solą fizjologiczną (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D).</li>
	<li>Oczyść ranę roztworem jodoforu po wykonaniu obu szwów. Dootrzewnowo wstrzyknąć antybiotyki o szerokim spektrum działania.</li>
</ol>
3. Obserwacja pooperacyjna
<ol>
	<li>Po operacji przenieś myszy do koca o stałej temperaturze 37 °C. Dopóki myszy nie będą mogły się swobodnie poruszać, trzymaj je w ich indywidualnej klatce. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą w mostku.</li>
	<li>Meloksykam (2 mg/kg) należy wstrzyknąć podskórnie 24 godziny po operacji w celu złagodzenia bólu.</li>
	<li>Codziennie monitoruj myszy, aby upewnić się, że rana pooperacyjna goi się prawidłowo, bez żadnych oznak powikłań (rozejścia się).</li>
</ol>
4. Suplementacja estradiolu
<ol>
	<li>Przygotuj paszę uzupełnioną walerianianem estradiolu. Stosować 2,6 mg beta-estradiolu 17-walerianianu suplementowanego na 1 kg paszy.</li>
	<li>Po 3 dniach od zakończenia zabiegu nakarm myszy walerianianem estradiolu.</li>
</ol>
5. Wstrzyknięcie FSH
<ol>
	<li>Przygotować rekombinowany ludzki roztwór FSH. Rekombinowany ludzki proszek FSH do wstrzykiwań rozpuścić w 0,9% sterylnym roztworze soli fizjologicznej do 100 j.m./ml.</li>
	<li>Myszy należy grupować zgodnie z planami eksperymentalnymi i podawać rozpuszczalnik lub różne dawki rekombinowanego FSH we wstrzyknięciu dootrzewnowym przez 2 tygodnie. Zgodnie z aktywnością biologiczną rekombinowanego FSH, należy stosować dawkę do wstrzykiwań FSH u myszy równoważną poziomowi FSH w surowicy u kobiet w okresie menopauzy. 
	UWAGA: Na podstawie różnych metod leczenia, myszy po owariektomii suplementowane estrogenem zostały losowo podzielone na trzy grupy: grupę rozpuszczalnikową (N.S.) otrzymującą 100 μl / dzień rozpuszczalnika, grupę o niskiej dawce FSH (L-FSH) otrzymującą 15 IU / kg masy ciała dziennie i grupę otrzymującą wysokie dawki FSH (H-FSH) otrzymującą 30 IU / kg masy ciała dziennie.</li>
</ol>

Developing an Ovariectomized Mouse Model with Elevated FSH Level

<ol><li>Harlow, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Executive+summary+of+the+Stages+of+Reproductive+Aging+Workshop+%2B+10%3A+addressing+the+unfinished+agenda+of+staging+reproductive+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Executive summary of the Stages of Reproductive Aging Workshop + 10: addressing the unfinished agenda of staging reproductive aging.</a> Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (4), 1159-1168 (2012).</li>
<li>Ulloa-Aguirre, A., Zariñán, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Follitropin+Receptor%3A+Matching+Structure+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The Follitropin Receptor: Matching Structure and Function.</a> Molecular Pharmacology. 90 (5), 596-608 (2016).</li>
<li>Franks, S., Stark, J., Hardy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicle+dynamics+and+anovulation+in+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome.</a> Human Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+FSH+inhibits+hepatic+cholesterol+biosynthesis+and+reduces+serum+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Blocking FSH inhibits hepatic cholesterol biosynthesis and reduces serum cholesterol.</a> Cell Research. 29 (2), 151-166 (2019).</li>
<li>Xiong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FSH+blockade+improves+cognition+in+mice+with+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">FSH blockade improves cognition in mice with Alzheimer's disease.</a> Nature. 603 (7901), 470-476 (2022).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FSH+Directly+Regulates+Bone+Mass%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FSH Directly Regulates Bone Mass.</a> Cell. 125 (2), 247-260 (2006).</li>
<li>Liu, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FSH+regulates+fat+accumulation+and+redistribution+in+aging+through+the+G%CE%B1i%2FCa%282%2B%29%2FCREB+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">FSH regulates fat accumulation and redistribution in aging through the Gαi/Ca(2+)/CREB pathway.</a> Aging Cell. 14 (3), 409-420 (2015).</li>
<li>Maclellan, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Follicle-Stimulating+Hormone+Receptor+in+Vascular+Anomalies%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Expression of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Vascular Anomalies.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 133 (3), 344e-351en (2014).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+FSH+induces+thermogenic+adipose+tissue+and+reduces+body+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Blocking FSH induces thermogenic adipose tissue and reduces body fat.</a> Nature. 546 (7656), 107-112 (2017).</li>
<li>Ji, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope-specific+monoclonal+antibodies+to+FSH%CE%B2+increase+bone+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Epitope-specific monoclonal antibodies to FSHβ increase bone mass.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2192-2197 (2018).</li>
<li>El Khoudary, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trajectories+of+estradiol+and+follicle-stimulating+hormone+over+the+menopause+transition+and+early+markers+of+atherosclerosis+after+menopause%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Preventive+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Trajectories of estradiol and follicle-stimulating hormone over the menopause transition and early markers of atherosclerosis after menopause.</a> European Journal of Preventive Cardiology. 23 (7), 694-703 (2016).</li>
<li>Radu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Follicle-Stimulating+Hormone+Receptor+in+Tumor+Blood+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Expression of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Tumor Blood Vessels.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (17), 1621-1630 (2010).</li>
<li>Sowers, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+hormones+and+bone+turnover+markers+in+pre-+and+perimenopausal+women%3A+SWAN%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporosis+International%22%5BJournal%5D)">Endogenous hormones and bone turnover markers in pre- and perimenopausal women: SWAN.</a> Osteoporosis International. 14 (3), 191-197 (2003).</li>
<li>Kristensen, V. N., Kure, E. H., Erikstein, B., Harada, N., Børresen-Dale, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+susceptibility+and+environmental+estrogen-like+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FFundamental+and+Molecular+Mechanisms+of+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Genetic susceptibility and environmental estrogen-like compounds.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 482 (1), 77-82 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podczas przejścia z fazy rozrodczej do nierozrodczej (menopauza) wiele kobiet doświadcza znaczących zmian fizjologicznych i patologicznych. Poziom FSH wzrasta w okresie menopauzy1. Nowe badania wykazały, że FSH w różnych tkankach i narządach pozagonadalnych ma kluczowe znaczenie w patogenezie wielu chorób, w tym dyslipidemii4, choroby Alzheimera5, osteoporozy 9,10, miażdżycy11, otyłości9 i raka12. Dlatego szczególnie ważne jest zbudowanie modelu zwierzęcego, który może pomóc w badaniu niezależnych efektów FSH in vivo. Mysi model OVF naśladuje wczesny etap przejścia menopauzy ze stosunkowo stabilnym poziomem estrogenu i rosnącym poziomem FSH i jest szczególnie odpowiedni do badań mających na celu zbadanie pozagonowego działania FSH.
W tej metodzie owariektomię wykonano za pomocą pojedynczego nacięcia grzbietowego grzbietu, około 1 cm od podstawy uda w górę (ryc. 1B). Skórę przecięto prawie razem z mięśniami grzbietowymi za pomocą ostrych nożyczek preparacyjnych i w ten sposób uzyskano dostęp do jamy otrzewnej. Po operacji nacięcie mięśnia nie wymagało szycia, a rana skóry została zamknięta obustronnie jednym szwem katgutowym (ryc. 2). Operacja jest technicznie łatwiejsza, mniej czasochłonna i mniej szkodliwa dla samic myszy w porównaniu z innymi stosowanymi metodami.
Kilka szczegółów, na które należy zwrócić uwagę podczas zabiegu chirurgicznego. Po pierwsze, wszystkie zabiegi chirurgiczne powinny być utrzymywane w czystości i jak najbardziej sterylne, aby zmniejszyć ryzyko infekcji pooperacyjnej. Po drugie, ponieważ tkanka jajnika jest bardzo delikatna, narzędzia chirurgiczne nie mogą kontaktować się z jajnikami bezpośrednio podczas jajników, aby uniknąć implantacji dootrzewnowej. Po trzecie, po operacji, myszy przeniesiono do koca o stałej temperaturze 37 °C podczas rekonwalescencji, aby zapobiec pooperacyjnej hipotermii prowadzącej do śmierci.
Poprzednie badanie dowiodło, że endogenny estrogen jest syntetyzowany w komórkach osłonki jajnika kobiet przed menopauzą lub w komórkach zrębu tłuszczowego piersi kobiet po menopauzie oraz w niewielkich ilościach w tkance obwodowej14. Estrogen w surowicy gwałtownie spadł u myszy po owariektomii, ale nie można go wyeliminować (ryc. 3B). Jednak endogenny estrogen syntetyzowany w tkance pozagonadalnej nie wpływa na stabilność poziomów estrogenów w modelu OVF (ryc. 4B).
W modelu OVF istnieją pewne ograniczenia. Gdy operacja chirurgiczna nie jest ostrożna i prowadzi do implantacji dootrzewnowej jajnika, może to prowadzić do niepowodzenia modelu. W tym przypadku estrogen w surowicy nie spada gwałtownie i waha się na różnych etapach cyklu rujowego. Po egzogennym podaniu estrogenu i FSH organizm potrzebuje około 1 tygodnia, aby osiągnąć równowagę. Tak więc zmiany patologiczne modelu OVF, które zachodzą w ciągu 1 tygodnia, nie mogą wskazywać na działanie FSH.
Podsumowując, model OVF ma tę zaletę, że jest stabilny, tani i łatwy w obsłudze. Ogólnoustrojowe skutki FSH na wysokim poziomie można zaobserwować po dootrzewnowym wstrzyknięciu FSH; oznacza to, że model OVF jest odpowiedni do badań, które badają pozagogodawcze działania FSH. Jednak wymagania dotyczące chirurgii modelowej i zabiegów iniekcji dootrzewnowych są dość wysokie. Jeśli finansowanie jest wystarczające, najlepszym wyborem są konkretne modele nokautów.

Poziom hormonu folikulotropowego (FSH) wzrasta podczas przejścia menopauzalnego (termin przejście menopauzalne zostało zdefiniowane w 2011 roku na etapach warsztatu starzenia reprodukcyjnego (STRAW) + 10 system)1. To właśnie podczas przejścia menopauzalnego, okresu charakteryzującego się rosnącym poziomem FSH i stosunkowo stabilnym estrogenem1, kobiety doświadczają zmian w cyklu menstruacyjnym i znaczących zmian fizjologicznych obejmujących różne komórki i tkanki. Zmiany te mogą poważnie wpłynąć na jakość życia i zdrowie kobiet. Badanie wpływu FSH może poprawić jakość życia i zdrowie kobiet.
FSH jest wydzielany z komórek gonadotropowych w przedniej przysadce mózgowej i ma kluczowe znaczenie w kontrolowaniu funkcji gonad i reprodukcji2. W funkcji FSH pośredniczy receptor FSH (FSHR), który należy do receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR)3. FSHR jest na ogół wyrażany w gonadach, a mianowicie w jajniku i jądrze. Udowodniono, że FSHR ulega powszechnej ekspresji w wielu komórkach i tkankach pozagonadalnych, w tym w wątrobie4, hippocampus5, osteoklastach6, adipocytes7 i endothelial cells8. Nowe badania ujawniły dodatkowe działanie gonad FSH i jego potencjalne znaczenie kliniczne w dyslipidemii4, Alzheimer's disease5, osteoporoza9,10, miażdżyca11, otyłość9 i cancer12. W związku z tym zbudowanie modelu zwierzęcego, który może pomóc w badaniu niezależnych efektów FSH in vivo, jest szczególnie ważne w badaniu działania samego FSH.
W protokole wprowadziliśmy procedurę tworzenia modelu myszy ze względnie stabilnym poziomem estrogenu i rosnącym poziomem FSH13. Model mysi naśladuje przejście menopauzy poprzez operację owariektomii, a następnie uzupełnienie walerianianem estradiolu i rekombinowanym FSH. Ponieważ myszy po owariektomii były suplementowane egzogennym estrogenem w celu utrzymania podobnego poziomu estrogenu jak myszy operowane pozorami, poziomy endogennego FSH były stabilne ze względu na sprzężenie zwrotne estrogenu w przysadce mózgowej. W tym stanie może kontrolować poziom FSH, podając egzogenne FSH bez zmiany poziomu estrogenów. W ten sposób mysi model OVF może wykluczyć wpływ estrogenu i obserwować pozagonadalne fizjologiczne i patologiczne skutki FSH. Uważamy, że szczegółowa i zobrazowana procedura jest przydatna dla naukowców w celu ustalenia mysiego modelu OVF w ich laboratorium i zastosowania go do badania zmian fizjologicznych i patologicznych podczas przejścia menopauzy w razie potrzeby.

<table><tbody><tr><td>beta-estradiol 17-walerianian</td><td>Macklin</td><td>E829824</td><td></td></tr><tr><td>Estradiol wrażliwy ELISA</td><td>Demeditec</td><td>DE4399</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do barwienia hematoksyliny</td><td>Beyotime</td><td>C0107</td><td></td></tr><tr><td>Meloksykam</td><td>Aladyn</td><td>M129228</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowany ludzki hormon folikulotropowy</td><td>Merck Serono</td><td>N19Z8803G</td><td></td></tr><tr><td>Tribromoetanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td>Nazwa alifatyczna: 2,2,2-Tribromoetanol</td></tr></tbody></table>

badanie niezależnych efektów hormonu folikulotropowego in vivo w modelu mysim

Exploring Independent Effects of Follicle-Stimulating Hormone In Vivo in a Mouse Model

Podczas przejścia z fazy rozrodczej do niereprodukcyjnej (menopauza), wiele kobiet doświadcza znaczących zmian fizjologicznych i patologicznych, w tym zmniejszenia masy kostnej, zwiększenia stężenia lipidów we krwi i zwiększenia otyłości trzewnej. Poziom hormonu folikulotropowego (FSH) wzrasta podczas przejścia menopauzalnego. Wiele badań wykazało, że FSH w różnych tkankach i narządach pozagonadalnych jest związany z patogenezą wielu chorób. Dlatego szczególnie ważne jest zbudowanie modelu zwierzęcego, który może pomóc w badaniu niezależnych efektów FSH in vivo. W tym badaniu samice myszy C57BL/6 poddano owariektomii i uzupełniono walerianianem estradiolu (OVX + E2) w celu wyeliminowania wpływu osi podwzgórze-przysadka-gonady. Myszy OVX + E2 otrzymały rozpuszczalnik (N.S.) lub różne dawki rekombinowanego FSH poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe, aby stworzyć model mysi (OVF) charakteryzujący się stosunkowo stabilnym estrogenem i rosnącym poziomem FSH. W ten sposób z powodzeniem wygenerowaliśmy eksperymentalny model myszy, który naśladował wczesny etap przejścia menopauzy, charakteryzujący się podwyższonym poziomem FSH w surowicy. Model OVF ma tę zaletę, że jest stabilny, tani i łatwy w obsłudze, co jest odpowiednie do badań mających na celu zbadanie pozagonadalnych działań FSH. W tym miejscu opisujemy szczegółowe protokoły dla mysiego modelu OVF.

Mysi model OVF naśladuje wczesny etap przejścia w menopauzę, charakteryzujący się stosunkowo stabilnym poziomem estrogenów i rosnącym poziomem FSH13. Po pierwsze, w celu przeprowadzenia operacji usunięcia jajników, samice myszy C57BL/6 w wieku 9 tygodni poddano znieczuleniu ogólnemu, a następnie operacji pozorowanej (Sham) lub obustronnej owariektomii (OVX). Ponieważ obrazy z rozmazów komórek barwionych metodą Papanicolaou pozwoliły na wyraźną identyfikację faz proestrus, estrus, metestrus i diestrus cyklu rujowego, stwierdzono, że u myszy OVX cykl rujowy zanikł (Rycina 3A), a metoda ELISA wykazała istotny spadek poziomu estradiolu (E2) w surowicy (Rycina 3B). Po drugie, myszy OVX otrzymywały beta-estradiolu 17-walerianian (OVX + E2), aby utrzymać poziom estrogenów w surowicy na poziomie analogicznym do grupy Sham. Po trzecie, myszy OVX + E2 otrzymywały rozpuszczalnik (N.S.) lub różne dawki rekombinowanego FSH w formie iniekcji dosytchniczych, aby stworzyć model mysi (OVF) charakteryzujący się stosunkowo stabilnym poziomem estrogenów i rosnącym poziomem FSH (Rycina 4).
<img alt="Układ eksperymentu chirurgicznego z narzędziami i preparatem myszy na niebieskiej powierzchni do badania anatomicznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65665/65665fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Środowisko chirurgiczne i pozycja myszy. (A) Obszar blatu o wymiarach co najmniej 60 cm x 60 cm do przeprowadzenia operacji. Powierzchnię obszaru należy oczyścić 75% alkoholem, przykryć jednorazowym ręcznikiem medycznym, a następnie zdezynfekować promieniowaniem ultrafioletowym na 30 min przed zabiegiem. (B) Unieruchomienie myszy na platformie chirurgicznej w pozycji grzbietowej za pomocą gumowej taśmy lub bawełnianego sznurka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65665/65665fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Procedura chirurgiczna u gryzonia, przedstawiająca kroki nacięcia i zamknięcia rany na schemacie sekwencyjnym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65665/65665fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Kluczowe etapy operacji chirurgicznej. (A) położenie jajnika, (B) owariektomia, (C) szycie otrzewnej oraz (D) szycie nacięcia skóry. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65665/65665fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie histologiczne tkanek grupy Sham i OVX. Wykres stężeń E2 w surowicy w pg/mL." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65665/65665fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Cytologia pochwy. Cytologia pochwy przedstawiająca stadia cyklu rujowego oraz poziom endogennego estrogenu u myszy po owariektomii (OVX) i myszy poddanych operacji pozorowanej (Sham; n = 12 dla grupy Sham; n = 10 dla grup OVX). (A) Cytologia pochwy przedstawia stadia cyklu rujowego w zależności od względnej obecności leukocytów, zrogowaciałych komórek nabłonkowych i jądrowych komórek nabłonkowych. Stadia ruji obejmują: proestrus – przewaga jądrowych komórek nabłonkowych; estrus – przewaga bezjądrowych komórek zrogowaciałych; metestrus – obecność leukocytów oraz zrogowaciałych i jądrowych komórek nabłonkowych; diestrus – przewaga leukocytów. Pasek skali = 100 µm. (B) Poziom endogennego estrogenu u myszy po owariektomii (OVX) i myszy poddanych operacji pozorowanej (Sham). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Do analizy statystycznej wykorzystano test t Studenta. ***p&lt; 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65665/65665fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat badania myszy C57BL/6; wykres poziomów E2 i FSH w surowicy w grupach: sham, OVX, L-FSH, H-FSH." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65665/65665fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Model OVF i poziomy hormonów w surowicy. (A) Schemat blokowy modelu OVF. (B) Analiza ELISA stężeń estrogenu (E2) i FSH w surowicy. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Do analizy statystycznej zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA). * p&lt; 0.05 oraz ** p&lt; 0.01. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie źródła4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65665/65665fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Hormon folikulotropowy (FSH) w różnych tkankach i organach pozagonadalnych jest związany z patogenezą wielu chorób. Mysi model owariektomii i leczony FSH (OVF) może być wykorzystany do zbadania pozagonowego działania FSH.

Badanie niezależnych efektów hormonu folikulotropowego in vivo w modelu mysim

During the transition from a reproductive to a nonreproductive phase (menopause), many women experience significant physiological and pathological ...

Nasze badania koncentrują się na zmianach fizjologicznych i patologicznych u kobiet w okresie okołomenopauzalnym. W tym badaniu staramy się ustalić, które zmiany patofizjologiczne są związane z FSH. Menopauza wiąże się z dyslipidemią i zwiększonym ryzykiem chorób naczyniowych układu krążenia i mózgu.Korzystając z tego mysiego modelu, odkryliśmy, że hormon stymulujący komórki foliowe niezależny od aspiryny zwiększa poziom cholesterolu w surowicy. Co więcej, blokowanie sygnalizacji FSH może skutecznie zapobiegać hipocholesterolemii. Ten mysi model naśladuje wczesny etap przejścia menopauzy, charakteryzujący się podwyższonym poziomem FSH w surowicy i stosunkowo stabilnym poziomem estrogenów.Model ma tę zaletę, że jest stabilny, tani i łatwy w obsłudze, co nadaje się do badań mających na celu zbadanie pozagonowego działania FSH. Aby rozpocząć, przygotuj platformę chirurgiczną ustawioną w pomieszczeniu o powierzchni ławki 60 centymetrów na 60 centymetrów do operacji. Oczyść powierzchnię 70% alkoholem i przykryj ją jednorazowym ręcznikiem medycznym.Następnie dezynfekuj obszar promieniowaniem ultrafioletowym przez 30 minut. Zaaklimatyzować ośmiotygodniową samicę C-57 czarnej myszy sześcioosobowej w ośrodku mieszkalnym na tydzień przed operacją. Za pomocą czystego bawełnianego wacika nałóż balsam do depilacji na tył znieczulonej myszy.Po trzech do pięciu minutach usuń włosy za pomocą gazy i bawełnianych wacików. Następnie oczyść skórę 70% etanolem. Zamocuj mysz na platformie operacyjnej tyłem do góry za pomocą gumowego paska lub bawełnianej liny i nałóż roztwór jodaforu, aby oczyścić plecy.W przypadku jajnikomii za pomocą jednorazowego skalpela należy wykonać jednocentymetrowe nacięcie grzbietowe wzdłużnie od podstawy uda w górę, upewniając się, że nacięta jest tylko skóra i powięź podskórna i unikając nacinania tylnej otrzewnej. Następnie pociągnij nacięcie w lewo, aby uwidocznić białą poduszeczkę tłuszczową. Za pomocą mikrokleszczyków i nożyczek przetnij 0,5 centymetra wzdłuż białej poduszeczki tłuszczowej, aby odsłonić jamę wewnątrzotrzewnową.Po przecięciu tylnej części otrzewnej za pomocą mikrokleszczy powoli i delikatnie usuń białą poduszeczkę tłuszczową z jamy dootrzewnowej. Bezpośrednio po usunięciu zwilż białą tkankę tłuszczową 0,9% sterylną gazą nasączoną solą fizjologiczną. W dolnej części białej poduszeczki tłuszczowej zidentyfikuj różowe ziarniste substancje jako jajniki i upewnij się, że są połączone z macicą.Używając szwów wchłanialnych 5/0, podwiąż jajnikowy koniec macicy. Następnie usuń lewy jajnik, unikając bezpośredniego kontaktu narzędzi chirurgicznych z jajnikami, zapobiegając dootrzewnowej implantacji tkanki jajnika. Po zabiegu ostrożnie umieść białą poduszeczkę tłuszczową z powrotem w jamie otrzewnej.Następnie za pomocą szwu wchłanialnego 5/0 wykonaj szew przerywany na tylnej otrzewnej. Oczyść wszelkie miejsca krwawienia gazą nasączoną 0,9% sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Następnie pociągnij nacięcie skóry w prawo i usuń prawy jajnik tą samą metodą.Wykonaj przerywany szycie za pomocą niewchłanialnych szwów 4/0 i oczyść krwawienie 0,9% sterylną gazą nasączoną solą fizjologiczną. Po wykonaniu obu szwów oczyść ranę roztworem jodaforu. Po 24 godzinach należy wstrzyknąć meloksykam podskórnie w celu złagodzenia bólu.Codziennie monitoruj mysz, aby potwierdzić prawidłowe gojenie się ran chirurgicznych bez żadnych oznak powikłań. Po trzech dniach nakarm mysz świeżo przygotowanym walerianianem estradiolu. Do wstrzykiwań FSH przygotuj roztwór FSH, rozpuszczając rekombinowany ludzki proszek FSH w 0,9% sterylnej soli fizjologicznej do 100 jednostek międzynarodowych na mililitr.W zależności od aktywności biologicznej rekombinowanego FSH należy podawać rozpuszczalnik lub różne dawki rekombinowanego FSH we wstrzyknięciu dootrzewnowym przez dwa tygodnie. Obrazy rozmazowe komórek barwiących Papanicolaou wyraźnie zidentyfikowały etapy rui, rui, metestrus i diestrus cyklu rui. W przeciwieństwie do tego, myszy po obustronnej wycięciu jajników straciły cykl rujowy.Metoda ELIZA wykazała znaczny spadek stężenia estradiolu w surowicy u myszy obustronnych jajników w porównaniu z myszami z grupy pozorowanej. Endogenny estrogen syntetyzowany w tkance pozagododanej nie wpływa na stabilność poziomu estrogenów w modelu mysim leczonym FSH.

exploring-independent-effects-follicle-stimulating-hormone-vivo-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten artykuł opisuje mikroiniekcję i elektroporację jąder myszy in vivo jako technikę transfekcji komórek jąder myszy w celu zbadania unikalnych procesów spermatogenezy. Prezentowany protokół obejmuje etapy przygotowania kapilar szklanych, mikroiniekcji przez przewód odprowadzający oraz transfekcji za pomocą elektroporacji.

In vivo (in vivo) Mikroiniekcja i elektroporacja jąder myszy

Ten protokół opisuje pierwotną hodowlę/kokulturę tkanki jajnikowej myszy, używając jajników od noworodków myszy i indywidualnych pęcherzyków jajnikowych od myszy przed okresem dojrzewania. Techniki hodowli wspomagają rozwój w wysoce fizjologiczny sposób, umożliwiając badanie wpływu czynników zewnętrznych na jajnik oraz interakcji między pęcherzykami jajnikowymi.

Hodowla i kokultura jajników myszy i pęcherzyków jajnikowych

Wysoce obiecującą techniką generowania konstruktów tkankowych bez użycia matrycy jest hodowla komórek w symulowanych warunkach mikrograwitacji. Korzystając z systemu hodowli rotacyjnej, zbadaliśmy wzrost pęcherzyków jajnikowych i dojrzewanie oocytów pod kątem przeżycia pęcherzyków, morfologii, wzrostu i funkcji oocytów w symulowanych warunkach mikrograwitacji.

In vitro Wzrost pęcherzyków przedantralnych myszy w symulowanej mikrograwitacji

Hodowle tkanek jajnikowych mogą być używane jako modele rozwoju pęcherzyków, owulacji i atrezji pęcherzyków oraz wskazują mechanizmy regulacyjne dynamicznych procesów jajnikowych.

Posiew tkanki jajnikowej w celu wizualizacji zjawisk w jajniku myszy

Opisujemy rozwój szczupłego modelu myszy podobnego do PCOS z granulką dihydrotestosteronu w celu zbadania patofizjologii PCOS i potomstwa z tych matek podobnych do PCOS.

Hiperandrogenny model myszy do badania zespołu policystycznych jajników

Tutaj opisujemy, porównujemy i kontrastujemy dwie różne techniki dokładnego liczenia pęcherzyków w stałych tkankach jajnika myszy.

Dokładne liczenie pęcherzyków w jajnikach dorosłych myszy

Badanie to wprowadza nowy model mysi zaprojektowany specjalnie do symulacji endometriozy, klinicznie istotnego podtypu endometriozy. Wykorzystując myszy C57BL/6J, model ma na celu wyjaśnienie patofizjologicznych mechanizmów leżących u podstaw niepłodności związanej z endometrioma, oferując wyrafinowane narzędzie do wypełnienia obecnej luki w wiedzy w medycynie reprodukcyjnej.

Stworzenie eksperymentalnego mysiego modelu endometrioma w celu zbadania związanej z nim niepłodności

Ten protokół opisuje metodologie tworzenia prostego i efektywnego modelu implantacji zarodków in vitro do oceny istotnych cząsteczek wpływających na proces implantacji zarodka.

Opracowanie modelu implantacji zarodka in vitro

Ortotopowe modele zwierzęce raka jajnika lepiej odwzorowują przebieg choroby u ludzi, a tym samym zwiększają naszą wiedzę na temat progresji nowotworu i odpowiedzi guza na terapię. W modelu mysim wykonuje się wstrzyknięcie do wnętrza woreczka otrzewnej komórek nowotworu jajnika wykazujących ekspresję lucyferazy. Leczenie podaje się poprzez zgłębnik żołądkowy. Wzrost guza monitoruje się za pomocą systemu obrazowania in vivo.

Obrazowanie in vivo i leczenie terapeutyczne w ortotopowym modelu raka jajnika u myszy

Aby zbadać związek między homeostazą białek, stresem i starzeniem się, monitorowaliśmy zmiany w fałdowaniu białek, śledząc dysfunkcję białek, lokalizację białek w komórce i stabilność białek na poziomie organizmu, komórkowym i białkowym, używając genetycznie wykonalnego metazoanu Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

Poznaj niezależne działanie hormonu folikulotropowego na poziom cholesterolu w surowicy u myszy ovariectomizowanych. Metoda pozwala badać zmiany metaboliczne związane z menopauzą i ryzykiem chorób sercowo-naczyniowych.

Badanie niezależnych efektów hormonu folikulotropowego in vivo w modelu mysim

Przeglądaj więcej filmów