Wydajna i powtarzalna metoda wytwarzania roślin złożonych metodą transformacji owłosionych korzeni na bazie Agrobacterium rhizogenes
30 czerwca 2023
Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół jednoetapowej metody transformacji, w której pośredniczy Agrobacterium tumefaciens, w celu produkcji roślin kompozytowych.
Nasz zespół koncentruje się na transformacji owłosionych korzeni na bazie Agrobacterium rhizogenes. Transformacja owłosionych korzeni ma kluczowe znaczenie w badaniu funkcji genów roślin, inżynierii metabolicznej i interakcji między nimi a mikroorganizmami ryzosferowymi. W tym artykule przedstawiono jednoetapową metodę transformacji, w której pośredniczy Agrobacterium rhizogenes.
Transformacja korzeni owłosionych występuje w różnych roślinach dwuliściennych i jednoliściennych i jest prawie niezależna od genotypu. Jednoetapowa metoda, w której pośredniczy Agrobacterium rhizogenes w celu indukowania owłosionych korzeni, jest prosta i bardziej wydajna w tworzeniu roślin kompozytowych w porównaniu z metodą iniekcji hipokotylowej. Metoda iniekcji hipokotylu jest nieskuteczna i może spowodować śmierć młodych, uzyskujących się roślin hipokotylowych.
Jednoetapowa metoda za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes jest bardzo skuteczna i wymaga mniej czasu na wytworzenie owłosionych korzeni. Co więcej, nie ma potrzeby przesadzania po utworzeniu owłosionych korzeni. Geny regulacyjne enzozymu i geny syntezy beta wykorzystano jako markery przesiewowe wirusa w agrobacterium rhizogenes, w którym pośredniczy transformacja korzeni owłosionych.
Zacznij od zebrania nasion dzikiej soi, S.americanum i lokalnej odmiany dyni. Zasiej nasiona w wermikulicie na głębokości jednego centymetra i dokładnie je podlej. Uprawiaj je w komorze wzrostowej o wilgotności względnej około 70%.
Wyjmij szczep A.Rhyzogenes K599 z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i aktywuj go na stałym podłożu LB w temperaturze 28 stopni Celsjusza na 48 godzin. Następnie wybierz pojedynczy klon szczepu K599 i hoduj go w jednym mililitrze płynnej pożywki LB zawierającej antybiotyk przez 12 godzin. Rozprowadzić 500 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej równomiernie na stałym podłożu LB zawierającym antybiotyk i inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 24 godziny.
Po siedmiu dniach, gdy liścienie sadzonek zostaną rozłożone, użyj wysterylizowanego ostrego skalpela, aby przeciąć około 0,5 do jednego centymetra hipokotylu. Wyrzuć pierwotny korzeń i część hipokotylu. Pokryj nacięcie hipokotylu bakteriami K599.
Posadź sadzonki w wilgotnym wermikulicie i zainfekuj 30 roślin każdego gatunku za pomocą transformacji owłosionych korzeni za pośrednictwem A.Rhyzogenes. Następnie podlej rośliny pięcioma mililitrami zawieszonej zawiesiny bakteryjnej K599 w pożywce podstawowej Gamborg B-5 o mocy ćwiartkowej. Przykryj doniczki przezroczystą plastikową torbą i umieść je w komorze wzrostowej.
Uprawiaj rośliny przez około 12 dni po inokulacji. W tym czasie w miejscu nacięcia powinny powstać nowe owłosione korzenie, zwykle osiągające długość od dwóch do pięciu centymetrów. Korzystając z systemu obrazowania chemiluminescencyjnego z zielonym światłem wzbudzenia o długości 540 nanometrów i emisją o długości 600 nanometrów, wykryj ekspresję genu reporterowego DsRed2.
Uwidoczniono korzenie roślin złożonych dzikiej soi, S.americanum i dyni w naturalnym i zielonym świetle wzbudzenia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na jednoczesnej metodzie transformacji za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes, mającej na celu indukcję korzeni włochatych u różnych gatunków roślin. Ta wydajna technika upraszcza tworzenie roślin kompozytowych, umożliwiając pogłębione badania nad funkcją genów roślinnych oraz ich oddziaływaniami z mikroorganizmami.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Genetyczna transformacja roślin
- Kultura korzeni włochatych
- Techniki z użyciem Agrobacterium
Wstęp
- Znaczenie zrozumienia funkcji genów roślin
- Rola korzeni włochatych w inżynierii metabolicznej
- Porównawcza nieefektywność tradycyjnych metod iniekcji w podsiewkę
Zastosowane metody
- Jednoetapowa metoda transformacji
- Agrobacterium rhizogenes szczep K599
- Nacięcia kotyledonów i podkotyledonów w celu indukcji korzeni
Główne wyniki
- Efektywna produkcja korzeni włochatych u kilku gatunków roślin
- Korzenie zazwyczaj osiągają długość 2-5 cm po inokulacji
- Skuteczna detekcja genu reporterowego przy użyciu technik obrazowania
Wnioski
- Niniejsze badanie demonstruje wydajną technikę transformacji roślin.
- Metoda ta ma znaczenie dla rozwoju badań w dziedzinie genetyki i inżynierii roślin.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywne generowanie roślin kompozytowych z korzeniami transgenicznymi poprzez transformację włochatych korzeni za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes umożliwia szybką analizę funkcjonalną genów i szlaków specyficznych dla korzeni. Ta usprawniona metoda, niezależna od genotypu, przyspiesza wczesne odkrycia i walidację celów w portfelach biotechnologii roślin. Jej powtarzalność i skalowalność wspierają rzetelne testowanie hipotez oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego dla zespołów badawczo-rozwojowych koncentrujących się na oddziaływaniach roślina-mikrob i inżynierii metabolicznej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia szybką analizę funkcjonalną genów wykazujących ekspresję w korzeniach u różnych gatunków roślin.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolację fenotypów i odpowiedzi specyficznych dla korzeni.
- Ułatwia wyjaśnianie szlaków metabolicznych na potrzeby inżynierii metabolicznej i badań nad funkcją genów.
- Zapewnia pewność prognostyczną niezbędną do wdrażania ukierunkowanych na korzenie interwencji genetycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Dostarcza zwalidowane złożone systemy roślinne do dalszych etapów analizy przesiewowej.
- Poprawia powtarzalność testów poprzez standaryzację etapów transformacji i indukcji korzeni.
- Generuje wyniki ilościowe poprzez ekspresję genów reporterowych i obrazowanie.
- Umożliwia skalowalne przygotowanie korzeni transgenicznych do przesiewania związków lub genów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgodne z procesem odkrywania biomarkerów translacyjnych w badaniach nad interakcjami korzeń-mikrob.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania funkcji genów do walidacji przedklinicznej w systemach roślinnych.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne poprzez zapewnienie solidnych, powtarzalnych modeli transformacji korzeni.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta jednostopniowa metoda transformacji korzeni włochatych integruje wczesne etapy odkrywania i walidacji celów, wspierając procesy badawcze od testowania hipotez po opracowywanie modeli przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Przyspiesza testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w biologii korzenia.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, gotowe do analizy rośliny kompozytowe do przesiewania funkcjonalnego.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar ekspresji genu reporterowego do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z badaniami przedklinicznymi w studiach nad interakcjami roślin-mikroby oraz badaniach metabolicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje zestandaryzowaną, wielokrotnego użytku platformę transformacji dla wielu gatunków roślin.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach ukierunkowanych na korzenie.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i wydajność procesów transformacji.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne kosztowo postępy w obszarze B+R.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów genetycznych i systemów modelowych z uwzględnieniem poziomu ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z tkankami roślinnymi oraz w technice sterylnej.
- Wymaga dostępu do szczepów Agrobacterium rhizogenes oraz aparatury obrazującej.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji protokołów transformacji i przesiewania.
- Metoda możliwa do zaadaptowania dla szerokiej gamy gatunków dwuliściennych i niektórych jednoliściennych przy minimalnych ograniczeniach genotypowych.
- Zależna od zastosowania wydajnych systemów genów reporterowych do analiz ilościowych.
