Name: Wydajna i powtarzalna metoda wytwarzania roślin złożonych metodą transformacji owłosionych korzeni na bazie Agrobacterium rhizogenes (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 9 s
Description: Poznaj efektywną metodę transformacji owłosionych korzeni z wykorzystaniem Agrobacterium rhizogenes do tworzenia roślin złożonych. Technika ta umożliwia badanie funkcji genów roślinnych i inżynierię metaboliczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fundusz Badawczy Uniwersytetu Liaocheng (318012028) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Shandong (ZR2020MC034).

1. Warunki wzrostu roślin i kultura A. rhizogenes 
<ol>
	<li>Wysiew nasion 
	UWAGA: Nasiona dzikiej soi zebrano w hrabstwie Yanggu w Liaocheng w Chinach; nasiona S. americanum i lokalnej odmiany dyni Yinsu zakupiono na targu.
	<ol>
		<li>Zbierz nasiona dzikiej soi, S. americanum i lokalnej odmiany dyni, zasiej je w wermikulicie na głębokości 1 cm i dokładnie podlej. Posadź 20 nasion w plastikowych pudełkach o wymiarach 8 cm x 11 cm x 9 cm. Uprawiaj rośliny w komorze wzrostowej w temperaturze 24 ± 2 °C w cyklu 16 godzin światła/8 godzin ciemności przy wilgotności względnej około 70%. 
		UWAGA: Warstwy nasion dzikiej soi muszą być zerwane przed siewem. Jeśli pytanie badawcze koncentruje się na interakcjach między roślinami a mikroorganizmami, nasiona, wermikulit, plastikowe pudełka i woda muszą być sterylizowane przed użyciem.</li>
		<li>Aktywacja i hodowla A. rhizogenes K599 
		UWAGA: Szczep A. rhizogenes K599 miał jeden wektor binarny pRed13052 niosący gen reporterowy czerwonej fluorescencji DsRed2.
		<ol>
			<li>Wyjąć szczep A. rhizogenes K599 z zamrażarki o temperaturze -80 °C i aktywować bakterie na stałym podłożu LB (z 50 mg/l kanamycyny i 50 mg/l streptomycyny) w temperaturze 28 °C przez 48 godzin.</li>
			<li>Wybierz pojedynczy klon szczepu K599 i hoduj go w 1 ml płynnej pożywki LB zawierającej antybiotyk przez 12 godzin.</li>
			<li>Równomiernie rozprowadzić 500 μl zawiesiny bakteryjnej na stałym podłożu LB zawierającym antybiotyk, a następnie inkubować w temperaturze 28 °C przez 24 godziny.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Jednoetapowa metoda transformacji owłosionego korzenia za pośrednictwem ryzogenów
<ol>
	<li>Nacięcie hipokotylu
	<ol>
		<li>Po 7 dniach (zdefiniuj wysiew nasion jako dzień 0), sadzonki liścieni właśnie się rozwinęły (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A), użyj wysterylizowanego, ostrego skalpela, aby przeciąć około 0,5-1 cm hipokotylu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Wyrzuć pierwotny korzeń i część częściowego hipokotylu. 
		UWAGA: Używaj skalpela ostrożnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inokulacja K599
	<ol>
		<li>Pokryj nacięcie hipokotylu bakteriami K599 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
		<li>Posadź sadzonki w wilgotnym wermikulicie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
		<li>Zainfekuj 30 roślin każdego gatunku poprzez transformację owłosionych korzeni za pośrednictwem A. rhizogenes. Podlej każdą roślinę 5 ml zawieszonej zawiesiny bakteryjnej K599 (OD600 = 0,5-0,6) w ćwiartce mocy (0,25x) pożywki podstawowej Gamborg B-5 (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1E).</li>
		<li>Przykryj doniczki wysoce przezroczystą plastikową torbą (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1F) i umieść je w komorze wzrostowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Produkcja owłosionych korzeni
<ol>
	<li>Uprawiaj rośliny przez ~ 12 dni po inokulacji, nowe owłosione korzenie zostaną wywołane i wygenerowane w miejscu nacięcia. Po 15 dniach owłosiona długość korzenia zwykle osiąga 2-5 cm (<silna klasa="xfig">Ryc. 2).</li>
	<li>Aby ustalić, czy wytworzone owłosione korzenie są transgeniczne, zbadaj ekspresję genów reporterowych zależnych od przekształconego wektora w K599.
	<ol>
		<li>Wykryj ekspresję genu reporterowego DsRed2 za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego z zielonym światłem wzbudzenia przy 540 nm i emisją przy 600 nm (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B, <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2D i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2F).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

One-Step Hairy Root Transformation Method for Advancing Root-Related Biology

<ol><li>Chilton, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes+inserts+T-DNA+into+the+genome+of+the+host+plant+root+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genome of the host plant root cells.</a> Nature. 295, 432-434 (1982).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+simple%2C+high+efficient+and+one-step+generation+of+composite+cucumber+plants+with+transgenic+roots+by+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%2C+Tissue+and+Organ+Culture+%28PCTOC%29%22%5BJournal%5D)">A fast, simple, high efficient and one-step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation.</a> Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 141, 207-216 (2020).</li>
<li>Du, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+mutagenesis+in+soybean+by+TALENs+and+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted mutagenesis in soybean by TALENs and CRISPR/Cas9.</a> Journal of Biotechnology. 217, 90-97 (2016).</li>
<li>Nguyen, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+hairy+root+system+for+validation+of+plant+transformation+vector+and+CRISPR%2FCas+construct+activities+in+cucumber+%28Cucumis+sativus+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">An efficient hairy root system for validation of plant transformation vector and CRISPR/Cas construct activities in cucumber (Cucumis sativus L.).</a> Frontiers in Plant Science. 12, 770062(2022).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtGCS+promoter-driven+clustered+regularly+interspaced+short+palindromic+repeats%2FCas9+highly+efficiently+generates+homozygous%2Fbiallelic+mutations+in+the+transformed+roots+by+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">AtGCS promoter-driven clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 highly efficiently generates homozygous/biallelic mutations in the transformed roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation.</a> Frontiers in Plant Science. 13, 952428(2022).</li>
<li>Irigoyen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+hairy+roots+enable+high+throughput+identification+of+antimicrobials+against+Candidatus+Liberibacter+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Plant hairy roots enable high throughput identification of antimicrobials against Candidatus Liberibacter spp.</a> Nature Communications. 11 (1), 5802(2020).</li>
<li>Plasencia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eucalyptus+hairy+roots%2C+a+fast%2C+efficient+and+versatile+tool+to+explore+function+and+expression+of+genes+involved+in+wood+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation.</a> Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2016).</li>
<li>Gutierrez-Valdes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+cultures-a+versatile+tool+with+multiple+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 33(2020).</li>
<li>Stougaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes+as+a+vector+for+transforming+higher+plants.+Application+in+Lotus+corniculatus+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes as a vector for transforming higher plants. Application in Lotus corniculatus transformation.</a> Methods in Molecular Biology. 49, 49-61 (1995).</li>
<li>Kereszt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+soybean+to+study+root+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology.</a> Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).</li>
<li>Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+tomato+suitable+for+the+study+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Plant Methods. 14, 34(2018).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+phosphatidylserine+synthase+IbPSS1+affords+cellular+Na%2B+homeostasis+and+salt+tolerance+by+activating+plasma+membrane+Na%2B%2FH%2B+antiport+activity+in+sweet+potato+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulture+Research%22%5BJournal%5D)">Overexpression of phosphatidylserine synthase IbPSS1 affords cellular Na+ homeostasis and salt tolerance by activating plasma membrane Na+/H+ antiport activity in sweet potato roots.</a> Horticulture Research. 7, 131(2020).</li>
<li>Boisson-Dernier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Medicago+truncatula+for+the+study+of+nitrogen-fixing+and+endomycorrhizal+symbiotic+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%3A+MPMI%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 14 (6), 695-700 (2001).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+composite+soybean+plants+with+transgenic+roots+by+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">One-step generation of composite soybean plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation.</a> BMC Plant Biology. 20 (1), 208(2020).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthocyanin%2C+a+novel+and+user-friendly+reporter+for+convenient%2C+non-destructive%2C+low+cost%2C+directly+visual+selection+of+transgenic+hairy+roots+in+the+study+of+rhizobia-legume+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Anthocyanin, a novel and user-friendly reporter for convenient, non-destructive, low cost, directly visual selection of transgenic hairy roots in the study of rhizobia-legume symbiosis.</a> Plant Methods. 16, 94(2020).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+AtMYB75+as+a+reporter+gene+in+the+study+of+symbiosis+between+tomato+and+Funneliformis+mosseae%5BTitle%5D)+AND+%22Mycorrhiza%22%5BJournal%5D)">Application of AtMYB75 as a reporter gene in the study of symbiosis between tomato and Funneliformis mosseae.</a> Mycorrhiza. 33 (3), 181-185 (2023).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+set+of+novel+binary+expression+vectors+for+plant+gene+function+analysis+and+genetic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Development of a set of novel binary expression vectors for plant gene function analysis and genetic transformation.</a> Frontiers in Plant Science. 13, 1104905(2023).</li>
<li>Li, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytochrome+B+inhibits+darkness-induced+hypocotyl+adventitious+root+formation+by+stabilizing+IAA14+and+suppressing+ARF7+and+ARF19%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%3A+For+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Phytochrome B inhibits darkness-induced hypocotyl adventitious root formation by stabilizing IAA14 and suppressing ARF7 and ARF19.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 105 (6), 1689-1702 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Jednoetapowa metoda owłosionych korzeni za pośrednictwem A. rhizogenes jest prostszą i bardziej wydajną metodą wytwarzania roślin kompozytowych niż metoda iniekcji hipokotylowej. Jednoetapowa metoda ARM znacznie poprawia efektywność transformacji owłosionych korzeni, skraca czas wytwarzania owłosionych korzeni, zwiększa liczbę owłosionych cebulek, a także zmniejsza ilość związanego z tym nakładu pracy. Ulepszony protokół transformacji jest optymalny do badań nad symbiozami między roślinami strączkowymi a ryzobia...

Agrobacterium rhizogenes to Gram-ujemna bakteria glebowa z rodziny Rhizobiaceae. A. rhizogenes może zakażać prawie wszystkie rośliny dwuliścienne, kilka jednoliściennych i pojedyncze rośliny nagonasienne przez rany, wytwarzając owłosione korzenie u zakażonych roślin. Bakteria jest nosicielem plazmidu Ri (indukującego korzenie), a T-DNA plazmidu Ri przenosi gen syntezy opiny i geny rol (geny locus korzenia). Po tym, jak T-DNA plazmidu Ri dostanie się do komórki roślinnej i zostanie zintegrowane z chromosomem gospodarza, ekspresja genów rol indukuje produkcję owłosionych korzeni1. Roślinny wektor ekspresji binarnej przenoszący gen docelowy jest przekształcany w A. rhizogenes, a przekształcony A. rhizogenes jest używany do zakażenia rośliny. Korzenie transgeniczne mogą być indukowane w zainfekowanych roślinach, wytwarzając rośliny złożone zawierające transgeniczne korzenie oraz nietransgeniczne łodygi i pąki. Ogólnie rzecz biorąc, roślinę kompozytową można uzyskać w ciągu 14-20 dni. Transformacja owłosionych korzeni za pośrednictwem A. ryzogenów na ogół nie jest ograniczona genotypem u roślin dwuliściennych2. Owłosione korzenie wytwarzane przez rośliny porażone przez A. rhizogenes charakteryzują się szybkim tempem wzrostu, stabilnym dziedziczeniem i łatwą obsługą. Transformacja owłosionych korzeni, w której pośredniczy A. rhizogenes, jest obecnie szeroko stosowana do badania biologii związanej z korzeniami. Co więcej, transformacja owłosionych korzeni może być również wykorzystana do walidacji i optymalizacji wydajności edycji celów systemu CRISPR/Cas93,4,5 i lokalizacji subkomórkowej białek. Dlatego transformacja owłosionych korzeni jest ważnym narzędziem w badaniach nad funkcją genów roślin, inżynierią metaboliczną i interakcjami między korzeniami a mikroorganizmami ryzosfery6,7,8.
Rośliny kompozytowe zawierające transgeniczne korzenie uzyskane w wyniku transformacji owłosionych korzeni były powszechnie produkowane w roślinach dwuliściennych, zwłaszcza w roślinach strączkowych. Tradycyjna metoda wstrzykiwania hipokotylu z A. rhizogenes została wykorzystana do produkcji kompozytu Lotus corniculatus9, soybeans10, tomato11, słodkie ziemniaki12 i wiele innych roślin5,8. Metoda iniekcji hipokotylu jest nieskuteczna i może spowodować śmierć młodych lub maleńkich roślin hipokotylowych. W związku z tym metoda została ulepszona poprzez odcięcie korzeni zarodkowych, pokrycie nacięcia siewki A. rhizogenes, a następnie umieszczenie hipokotylu na sterylnym podłożu hodowlanym w celu ukorzenienia uprawy13. Jednak te kroki są wykonywane w sterylnym środowisku, a etapy operacji są stosunkowo uciążliwe. W szczególności powstałe rośliny kompozytowe należy przesadzić, co zwiększa ilość pracy. W poprzedniej pracy jednoetapowa transformacja owłosionych korzeni za pośrednictwem A. rhizogenes (ARM) została ustalona w ogórku, soi, Lotus japonicus, Medicago truncatula i pomidorach2,14,15,16,17. Pierwotny korzeń i częściowy hipokotyl zostały usunięte, miejsce nacięcia pozostałego hipokotylu pokryto przekształconym A. rhizogenes, a następnie sadzonkę posadzono w wilgotnym sterylnym wermikulicie. Po 12 dniach uprawy w miejscu nacięcia wytworzyły się owłosione korzenie. Jednoetapowa metoda ARM jest bardzo wydajna i wymaga mniej czasu na wytworzenie owłosionych korzeni. Przesadzanie po uformowaniu owłosionych korzeni również nie jest konieczne. Ponieważ zanieczyszczenia mikrobiologicznego można uniknąć bez przesadzania, jednoetapowa metoda ARM może być szczególnie przydatna podczas badania interakcji między roślinami a mikroorganizmami, takich jak symbiotyczne wiązanie azotu między roślinami strączkowymi a Rhizobia oraz symbiozy między roślinami a arbuskularnymi grzybami mikoryzowymi. W tym artykule przedstawiono szczegółowy, jednoetapowy protokół transformacji owłosionych korzeni za pośrednictwem A. rhizogenes wraz z przykładami roślin złożonych wytwarzanych w dzikiej soi, Solanum americanum i dyni. Dzięki temu protokołowi badacze mogą płynnie przeprowadzić jednoetapową transformację ARM.

<table><tbody><tr><td>kanamycin</td><td>Sangon Biotech (Szanghaj) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A506636</tr><tr><td>LB medium</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>B540113</tr><tr><td>plastikowe pudełko</td><td>LiaoSu</td><td></td><td>8 cm x 11 cm x 9 cm</td></tr><tr><td>dynia</td><td></td><td></td><td>lokalna odmiana Yinsu</td></tr><tr><td>streptomycyna</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>A610494&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tanon-5200Multi machine</td><td>Tanon Co., Ltd., Chiny</td><td>5200Multi</td><td>system obrazowania chemiluminescencyjnego</td></tr><tr><td>lokalna odmiana</td><td></td><td></td> pomidora <td>Dzika</td>soja</tr><tr><td></td><td></td><td></td> Zhongshu4 <td>zebrana w hrabstwie Yanggu, Liaocheng, Chiny</td></tr></tbody></table>

wydajna i powtarzalna metoda wytwarzania roślin złożonych metodą transformacji owłosionych korzeni na bazie agrobacterium rhizogenes

An Efficient and Reproducible Method for Producing Composite Plants by Agrobacterium rhizogenes-Based Hairy Root Transformation

Produkcja roślin kompozytowych z transgenicznymi korzeniami oraz nietransgenicznymi łodygami i pąkami za pomocą transformacji owłosionych korzeni za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes jest potężnym narzędziem do badania biologii związanej z korzeniami. Przemiana korzeni owłosionych występuje w szerokim zakresie roślin dwuliściennych oraz u kilku gatunków jednoliściennych i jest prawie niezależna od genotypu. Tradycyjna metoda wstrzykiwania hipokotylu z A. rhizogenes w celu uzyskania roślin kompozytowych jest nieefektywna, czasochłonna, pracochłonna i często powoduje śmierć delikatnych i maleńkich roślin hipokotylowych. Wcześniej ustalono wysoce wydajną, jednoetapową transformację owłosionych korzeni, w której pośredniczy A. rhizogenes, która eliminuje potrzebę przesadzania po wytworzeniu owłosionych korzeni. W tym badaniu usunięto częściowy hipokotyl i pierwotny korzeń, miejsce nacięcia hipokotylu pokryto A. rhizogenes, a następnie hipokotyle posadzono w sterylnym wermikulicie. Po 12 dniach uprawy nacięcie hipokotylu rozszerzyło się i wyindukowano nowe owłosione korzenie. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół jednoetapowej metody transformacji, w której pośredniczy A. rhizogenes, a jej skuteczność wykazano poprzez produkcję roślin złożonych z dzikiej soi, Solanum americanum i dyni.

Wysoko wydajna jednoetapowa *A. rhizogenes*transformacja korzeni włochatych indukowana przez 
Korpuskuły korzeni włóknistych (hairy roots) pojawiły się w miejscu nacięcia podsłonka 12 dni po inokulacji zmodyfikowanym szczepem K599. Transgeniczność korzeni włóknistych określono na podstawie ekspresji genu reporterowego zawartego w wektorze binarnym. Korzenie transgeniczne przekształcone genem reporterowym DsRed2 z kompozytowej soi dzikiej, S. americanumoraz dynia były obserwo...

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół jednoetapowej metody transformacji, w której pośredniczy Agrobacterium tumefaciens, w celu produkcji roślin kompozytowych.

Wydajna i powtarzalna metoda wytwarzania roślin złożonych metodą transformacji owłosionych korzeni na bazie Agrobacterium rhizogenes

Producing composite plants with transgenic roots and nontransgenic stems and buds using Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation is a ...

Nasz zespół koncentruje się na transformacji owłosionych korzeni na bazie Agrobacterium rhizogenes. Transformacja owłosionych korzeni ma kluczowe znaczenie w badaniu funkcji genów roślin, inżynierii metabolicznej i interakcji między nimi a mikroorganizmami ryzosferowymi. W tym artykule przedstawiono jednoetapową metodę transformacji, w której pośredniczy Agrobacterium rhizogenes.Transformacja korzeni owłosionych występuje w różnych roślinach dwuliściennych i jednoliściennych i jest prawie niezależna od genotypu. Jednoetapowa metoda, w której pośredniczy Agrobacterium rhizogenes w celu indukowania owłosionych korzeni, jest prosta i bardziej wydajna w tworzeniu roślin kompozytowych w porównaniu z metodą iniekcji hipokotylowej. Metoda iniekcji hipokotylu jest nieskuteczna i może spowodować śmierć młodych, uzyskujących się roślin hipokotylowych.Jednoetapowa metoda za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes jest bardzo skuteczna i wymaga mniej czasu na wytworzenie owłosionych korzeni. Co więcej, nie ma potrzeby przesadzania po utworzeniu owłosionych korzeni. Geny regulacyjne enzozymu i geny syntezy beta wykorzystano jako markery przesiewowe wirusa w agrobacterium rhizogenes, w którym pośredniczy transformacja korzeni owłosionych.Zacznij od zebrania nasion dzikiej soi, S.americanum i lokalnej odmiany dyni. Zasiej nasiona w wermikulicie na głębokości jednego centymetra i dokładnie je podlej. Uprawiaj je w komorze wzrostowej o wilgotności względnej około 70%.Wyjmij szczep A.Rhyzogenes K599 z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i aktywuj go na stałym podłożu LB w temperaturze 28 stopni Celsjusza na 48 godzin. Następnie wybierz pojedynczy klon szczepu K599 i hoduj go w jednym mililitrze płynnej pożywki LB zawierającej antybiotyk przez 12 godzin. Rozprowadzić 500 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej równomiernie na stałym podłożu LB zawierającym antybiotyk i inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 24 godziny.Po siedmiu dniach, gdy liścienie sadzonek zostaną rozłożone, użyj wysterylizowanego ostrego skalpela, aby przeciąć około 0,5 do jednego centymetra hipokotylu. Wyrzuć pierwotny korzeń i część hipokotylu. Pokryj nacięcie hipokotylu bakteriami K599.Posadź sadzonki w wilgotnym wermikulicie i zainfekuj 30 roślin każdego gatunku za pomocą transformacji owłosionych korzeni za pośrednictwem A.Rhyzogenes. Następnie podlej rośliny pięcioma mililitrami zawieszonej zawiesiny bakteryjnej K599 w pożywce podstawowej Gamborg B-5 o mocy ćwiartkowej. Przykryj doniczki przezroczystą plastikową torbą i umieść je w komorze wzrostowej.Uprawiaj rośliny przez około 12 dni po inokulacji. W tym czasie w miejscu nacięcia powinny powstać nowe owłosione korzenie, zwykle osiągające długość od dwóch do pięciu centymetrów. Korzystając z systemu obrazowania chemiluminescencyjnego z zielonym światłem wzbudzenia o długości 540 nanometrów i emisją o długości 600 nanometrów, wykryj ekspresję genu reporterowego DsRed2.Uwidoczniono korzenie roślin złożonych dzikiej soi, S.americanum i dyni w naturalnym i zielonym świetle wzbudzenia.

an-efficient-reproducible-method-for-producing-composite-plants

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy sposób wykorzystania kompozytowych roślin z korzeniami włochatymi do badania interakcji między roślinami a ryzobiami oraz procesu nodulacji u gatunku Medicago truncatula, który jest trudny do transformacji.

Generowanie roślin kompozytowych u Medicago truncatula wykorzystywanych w testach nodulacji

Korzystając z montażu DNA, wiele wektorów CRISPR może być konstruowanych równolegle w jednej reakcji klonowania, co sprawia, że budowa dużej liczby wektorów CRISPR jest prostym zadaniem. Owłosione korzenie pomidora są doskonałym systemem modelowym do walidacji wektorów CRISPR i generowania zmutowanych materiałów.

Wysokoprzepustowa konstrukcja wektora CRISPR i charakterystyka modyfikacji DNA przez generowanie owłosionych korzeni pomidora

Tutaj prezentujemy dwa protokoły przekształcania roślin ziemniaka. Transformacja Agrobacterium tumefaciens prowadzi do kompletnej rośliny transgenicznej, podczas gdy Agrobacterium rhizogenes wytwarza transgeniczne owłosione korzenie w pędach typu dzikiego, które mogą się samodzielnie rozmnażać. Następnie wykrywamy aktywność promotora poprzez barwienie GUS w przekształconych korzeniach.

Przemiana ziemniaka w ziemniaku za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes oraz aktywność promotorowa genu suberyny przez barwienie GUS

Opisujemy metodę wywoływania owłosionych korzeni przez przemianę za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes w gryce tartarskiej (Fagopyrum tataricum). Może to być wykorzystane do zbadania funkcji genów i produkcji metabolitów wtórnych w gryce tartarskiej, może być wykorzystane do dowolnej transformacji genetycznej lub wykorzystane do innych roślin leczniczych po ulepszeniu.

Wywoływanie owłosionych korzeni przez przemianę za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes w gryce winnej (Fagopyrum tataricum)

Tutaj prezentujemy protokół do wysokowydajnej produkcji transgenicznych korzeni owłosionych soi.

Transformacja owłosionych korzeni soi w celu analizy funkcji genów

Protokół opisuje indukcję owłosionych korzeni za pomocą łodyg kwiatostanu Arabidopsis i hipokotyli Brassica napus. Owłosione korzenie mogą być hodowane i wykorzystywane jako eksplantaty do regeneracji roślin transgenicznych.

Transformacja i regeneracja korzeni owłosionych u Arabidopsis thaliana i Brassica napus

Rośliny oferują nowatorski system do produkcji białek farmaceutycznych na skalę komercyjną, który jest bardziej skalowalny, opłacalny i bezpieczny niż obecne paradygmaty ekspresji. W tym badaniu przedstawiamy proste i wygodne, a jednocześnie skalowalne podejście do wprowadzenia genu docelowego zawierającego Agrobacterium tumefaciens do roślin w celu przejściowej ekspresji białka.

Efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie

Mięsak Kaposiego (KS) to nowotwór wywołany przez zakażenie wirusem onkogennym ludzkim herpeswirusem-8/herpeswirusem KS (HHV-8/KSHV). Opisany tutaj model hodowli komórek śródbłonka jest wyjątkowo odpowiedni do badania mechanizmów, za pomocą których KSHV przekształca komórki gospodarza.

Model in vitro do badania transformacji komórkowej przez opryszczkę mięsaka Kaposiego

Tutaj opisujemy szybki i elastyczny protokół tworzenia sferoid 3D komórek poprzez agregację komórek. Można go łatwo dostosować do wielu typów komórek i nadaje się do stosowania w różnych zastosowaniach, w tym w testach migracji komórek, inwazji lub anoikis, a także do obrazowania i ilościowego określania interakcji komórka-macierz.

Wydajna i elastyczna metoda agregacji komórek do produkcji sferoidów 3D

Ten protokół opisuje metodę osiągnięcia stabilnej integracji interesującego genu z ludzkim genomem przez regulowany transkrypcyjnie system Śpiącej Królewny. Opisano przygotowanie do integracji wadliwych wektorów lentiwirusowych, transdukcję in vitro komórek ludzkich oraz test molekularny na transdukowanych komórkach.

Skuteczna metoda transpozycji in vitro za pomocą regulowanego transkrypcyjnie systemu Śpiącej Królewny zapakowanego w wadliwy wektor lentiwirusowy z uszkodzoną integracją

Poznaj efektywną metodę transformacji owłosionych korzeni z wykorzystaniem Agrobacterium rhizogenes do tworzenia roślin złożonych. Technika ta umożliwia badanie funkcji genów roślinnych i inżynierię metaboliczną.

Wydajna i powtarzalna metoda wytwarzania roślin złożonych metodą transformacji owłosionych korzeni na bazie Agrobacterium rhizogenes (Wideo) | JoVE Journal

Wydajna i powtarzalna metoda wytwarzania roślin złożonych metodą transformacji owłosionych korzeni na bazie Agrobacterium rhizogenes

Przeglądaj więcej filmów