Technika wizualizacji 3D do przebudowy kości w mysim modelu rozszerzania szwów

Zainteresowanie szwami twarzoczaszki wynika z potrzeb klinicznych, aby zrozumieć mechanizm leczenia ortodontycznego i ortopedycznego. Zakres naszych badań polega na ustaleniu standaryzowanego modelu myszy z rozszerzaniem szwów oraz metody wizualizacji 3D w celu zbadania zmian kodu mechanobiologicznego szwów i przebudowy kości po ekspansji. Technika oczyszczania tkanek opracowana w ramach projektu PEGASOS została połączona z metodami znakowania wirusów w celu uzyskania wszechstronnych informacji na temat szwów i przebudowy kości w perspektywie kosmicznej.

Ten model jest odpowiedni dla różnych sił myszy transgenicznych w różnym wieku. Wygodna jest regulacja wielkości naprężenia rozciągającego i siły wycofania w dowolnym momencie. Dzięki technice PEGASOS możemy obserwować trójwymiarowy przestrzenny rozkład czasowy komórek macierzystych ze szwu czaszkowego podczas przebudowy kości.

Dzięki technice PEGASOS będziemy dalej badać związek między takimi komórkami macierzystymi a stresem mechanicznym, a także jego specyficzne mechanizmy. Zacznij od przygotowania dwóch uchwytów retencyjnych. Użyj szczypiec do drutu lekkiego i australijskiego drutu 0,014 cala, aby zrobić spiralną pętlę.

Następnie przygotuj niestandardowe sprężyny ze stali nierdzewnej i przytnij sprężynę na odpowiednią długość. Przygotuj również jeden prosty drut australijski lub prosty drut stalowy o długości siedmiu milimetrów i wytnij dwa kawałki papieru o średnicy dwóch milimetrów, aby użyć ich jako barier. Następnie umieść znieczuloną mysz na stole operacyjnym i ostrożnie usuń sierść na czubku głowy za pomocą kremu do depilacji lub golarki.

Następnie zdezynfekuj skórę głowy myszy za pomocą naprzemiennych rund jodoforu i 75% alkoholu. Ustaw mysz z głową na górze i użyj taśm chirurgicznych, aby przymocować kończyny na stole operacyjnym. Teraz użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać łukowaty płat wzdłuż skóry głowy w pobliżu szyi myszy, całkowicie odsłaniając szew strzałkowy i otaczającą czaszkę.

Następnie przymocuj płat skóry głowy za pomocą szwu 6-0 na stole operacyjnym. Osusz czaszkę i wytrawiaj ją 37% kwasem fosforowym przez 20 sekund. Następnie użyj zwykłej soli fizjologicznej, aby usunąć wytrawianie kwasem.

Umieść dwa uchwyty po obu stronach kości ciemieniowych, trzy milimetry od szwów strzałkowych i przyklej je światłoutwardzalnym klejem. Następnie odłóż płat skóry głowy, oznacz położenie uchwytów i wytnij dwa małe otwory w skórze głowy w odpowiednich pozycjach. Zresetuj opadającą skórę głowy, jednocześnie przepuszczając małe pętle przez otwory, aby odsłonić powierzchnię skóry.

Aby zainstalować sprężynę i drut doprowadzający, przyciąć sprężynę o jeden milimetr dłużej niż odległość między dwoma uchwytami. Ściśnij sprężynę dociskową i umieść ją między małymi zwojami po obu stronach. Przełóż drut ze stali nierdzewnej przez małe cewki i sprężynę, a następnie zwolnij sprężynę, aby uzyskać początkowy ciąg około 30G.

Następnie umieść dwa skrawki papieru między sprężyną a uchwytami i połącz je światłoutwardzalnym klejem, aby ustawić bariery na obu końcach sprężyny. Po rozprężeniu zastosowano Micro CT do wizualizacji zmian w szwie czaszkowym. W porównaniu z grupą kontrolną, szew czaszkowy stopniowo i znacznie rozszerzał się po przyłożeniu siły przez jeden dzień, a puszyste wypukłości kostne pojawiły się na krawędzi kości po piątym dniu.

Również wizualizacja mineralizacji przy użyciu metody podwójnego znakowania wykazała, że obciążenie siłowe istotnie aktywowało osteogenezę. Nowo zmineralizowaną kość zaobserwowano po siedmiu dniach, co wskazuje na proces przebudowy kości po rozszerzeniu szwów. Na początek przymocuj kończyny znieczulonej myszy taśmą klejącą, przytrzymaj skórę brzucha do góry i ostrożnie przetnij wzdłuż obwodu klatki piersiowej, aby całkowicie ją odsłonić.

Wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku nożyczkami okulistycznymi i natychmiast włóż igłę perfuzyjną 22 na wierzchołku lewej komory. Następnie przepchnij przez strzykawkę od 30 do 50 mililitrów płynu perfuzyjnego serca. Po tym, jak płyn odpływający z prawego przedsionka stanie się całkowicie przezroczysty, wlej równą objętość 4% roztworu PFA.

Wypreparuj tkanki i narządy i utrwal je przez noc za pomocą 4% PFA w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby wywołać odwapnienie tkanek, umieść utrwaloną twardą tkankę w 10 mililitrach roztworu EDTA na stole do wytrząsania w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Inkubuj przez około dwa dni i codziennie zmieniaj płyn.

Umieść nieruchome kości nazębne w 20 mililitrach roztworu 25% Quadral w celu odbarwienia tkanek. Inkubować na stole do wytrząsania w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden dzień i raz zmienić płyn. Następnie umieść tkankę sekwencyjnie w 30% trzeciorzędowym roztworze butanolu lub gruźlicy, następnie w roztworze 50% TB, a następnie w roztworze 70% TB, aby przeprowadzić odtłuszczanie gradientowe.

Następnie odwadniaj próbki i roztwór TB PEG przez sześć godzin na stole do wytrząsania w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na koniec umieść całkowicie odwodnioną tkankę w roztworze BB PEG na stole do wytrząsania w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po dwóch do czterech godzinach inkubacji tkanka stanie się przezroczysta.

Metoda oczyszczania tkanek PEGASOS doprowadziła do uzyskania przezroczystej tkanki. Oczyszczona tkanka z barwieniem całego mocowania EDU wykazała, że etykietowanie było wydajne i dobrze zachowane. W grupie kontrolnej kilka komórek EDU-dodatnich było rozproszonych w szwach.

Po jednym dniu rozszerzania szwu zaobserwowano proliferujące komórki w środku i na krawędziach szwu. Wraz z poszerzaniem się szwu liczba proliferujących komórek zmniejszała się z czasem. Komórki oznaczone na zielono były małymi okrągłymi komórkami w szpiku kostnym, które różniły się od komórek szwowych EDU-dodatnich.