Name: Technika wizualizacji 3D do przebudowy kości w mysim modelu rozszerzania szwów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Poznaj technikę PEGASOS do wizualizacji 3D przebudowy kości w modelu rozszerzania szwów u myszy. Metoda ta umożliwia szczegółowe badanie dynamiki komórek macierzystych szwów czaszkowych pod wpływem naprężenia mechanicznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za platformę laboratoryjną i pomoc Ear Institute, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Prace te były wspierane przez Shanghai Pujiang Program (22PJ1409200); Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (nr 11932012); Fundacja Badań Podoktoranckich Dziewiątego Szpitala Ludowego w Szanghaju, Szkoła Medyczna Uniwersytetu Jiao Tong w Szanghaju; Finansowanie programu badań podstawowych przez Ninth People's Hospital afiliowany przy Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYZZ154).

Wszystkie opisane tutaj procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Dziewiątego Szpitala Ludowego w Szanghaju, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (SH9H-2023-A616-SB). W tym badaniu wykorzystano 4-tygodniowe samce myszy C57BL/6. Wszystkie użyte narzędzia zostały wysterylizowane przed zabiegiem.
1. Przygotowanie modelu rozszerzania szwów
<ol>
	<li>Przygotowanie dwóch uchwytów retencyjnych.
	<ol>
		<li>Użyj drutu australijskiego 0,014 cala lub drutu ze stali nierdzewnej (patrz tabela materiałów), aby wykonać spiralną pętlę za pomocą szczypiec do drutu lekkiego. Średnica pętli wynosi 2 mm, a 1 mm ogon jest zarezerwowany z dwóch stron (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Wysterylizuj druty i uchwyty do zabiegu w autoklawie, sterylizatorze plazmowym lub odpowiednim zimnym sterylizatorze (np. aldehydzie glutarowym).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie sprężyn.
	<ol>
		<li>Przygotuj niestandardowe sprężyny ze stali nierdzewnej. 
		UWAGA: W tym badaniu zastosowano sprężynę dociskową o średnicy drutu 0,2 mm, średnicy zewnętrznej 1,5 mm, odstępie 1 mm i długości 7 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Każde ściśnięcie sprężyny o 1 mm uzyskiwało ciąg około 30 g.</li>
		<li>Przytnij sprężynę na dostępną długość przed ustawieniem. Potwierdź siłę dla specjalistycznej sprężyny przed eksperymentem. 
		UWAGA: Rozmiary sprężyn są różne, o ile wielkość siły jest taka sama w równoległych eksperymentach. Siła jest mierzona za pomocą jednoosiowego przyrządu testowego lub małego elektronicznego dynamometru (patrz Tabela materiałów), jeśli warunek jest ograniczony. Zmiana długości jest obliczana do wielkości siły (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C-E). W szczególności konieczna jest zmiana wartości obciążenia sprężyny w zależności od wieku, stanu kości myszy i obiektów badawczych.</li>
		<li>Przygotuj jeden prosty drut australijski lub prosty drut stalowy o długości 7 mm i zrób dwa kawałki papieru o średnicy 2 mm, które będą używane jako bariery (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Operacja rozszerzenia szwu strzałkowego
<ol>
	<li>Znieczulenie: Znieczulenie myszy tiletaminą (25 mg/kg), zolazepamem (25 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg). W tym samym czasie nałóż sterylną maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. Oceń głębokość znieczulenia myszy za pomocą szczypania palca u nogi. 
	UWAGA: Następujące cechy wskazują na to, że mysz jest prawidłowo znieczulona: powolny i jednostajny oddech, osłabienie kończyn, rozluźnienie mięśni, zanik odruchu akupunktury skóry i odruchu powiek, a także słabszy odruch rogówkowy.</li>
	<li>Usuwanie i dezynfekcja sierści: Ostrożnie usuń sierść na czubku głowy za pomocą kremu do depilacji; unikaj dotykania oczu. Wkrótce potem użyj naprzemiennych rund jodoforu i 75% alkoholu, aby zdezynfekować miejsce operowane. Meloksykam (1 mg/kg) należy podawać myszom w postaci środka przeciwbólowego we wstrzyknięciu podskórnym.</li>
	<li>Fiksacja pozycji ciała: Połóż mysz leżąc z przodu i użyj taśm chirurgicznych, aby przymocować kończyny na stole operacyjnym.</li>
	<li>Otwórz płat skóry głowy: Użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać łukowaty płat wzdłuż skóry głowy w pobliżu szyi myszy, całkowicie odsłaniając szew strzałkowy i otaczającą czaszkę. Następnie przymocuj płat skóry głowy za pomocą szwu 6-0 na stole operacyjnym.</li>
	<li>Sklej uchwyty retencyjne po wytrawianiu kwasem.
	<ol>
		<li>Wysuszyć czaszkę i wytrawić ją 37% kwasem fosforowym przez 20 sekund, a następnie użyć zwykłej soli fizjologicznej, aby oczyścić kwasowe wytrawianie (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2A). Kredowy osad będzie widoczny po wysuszeniu czaszki gumową gruszką do pipet.</li>
		<li>Zacementuj dwa uchwyty (przygotowane w kroku 1.1) po obu stronach kości ciemieniowych w odległości 3 mm od szwów strzałkowych za pomocą światłoutwardzalnego kleju (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zresetuj płatek skóry głowy.
	<ol>
		<li>Ręcznie załóż płatek skóry głowy (Rysunek 2C). Oznacz pozycję uchwytów, wytnij dwa małe otwory w skórze głowy w odpowiedniej pozycji obustronnych uchwytów retencyjnych, a następnie zresetuj trzepoczącą skórę głowy.</li>
		<li>W tym samym czasie przełóż małe pętle przez otwory, aby odsłonić powierzchnię skóry. Zszyj zakrzywione nacięcie szwem 6-0 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D). Na regenerację skóry przeznacza się od jednego do trzech dni. Meloksykam (1 mg/kg) należy podawać myszom we wstrzyknięciu podskórnym co 24 godziny przez 1 do 3 dni. 
		UWAGA: Po zabiegu codziennie sprawdzaj aktywność skóry głowy myszy i czy uchwyty nie odpadają. Istnieją różne rodzaje skóry pod względem koloru i grubości; Zdrowa skóra głowy zachowa pierwotny kolor, a krawędzie skóry będą się stopniowo zrastać po zszyciu. Jeśli zostanie stwierdzona infekcja skóry głowy lub jeśli odpadło urządzenie chirurgiczne, należy usunąć mysz z badania i poddać ją eutanazji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamontuj sprężynę i przewód doprowadzający.
	<ol>
		<li>Przyciąć sprężynę o 1 mm dłuższą niż odległość między dwoma uchwytami.</li>
		<li>Ściśnij wybraną sprężynę dociskową i umieść ją między małymi zwojami po obu stronach.</li>
		<li>Przełóż drut ze stali nierdzewnej przez małe zwoje i sprężynę, a następnie zwolnij sprężynę, aby uzyskać początkowy ciąg około 30 g.</li>
		<li>Sprawdź, czy skóra głowy pod obszarem sprężyny myszy nie jest objęta żadną kompresją.</li>
		<li>Po upewnieniu się, że wiązanie jest mocne, bez żadnych luzów, przyklej dwa skrawki papieru między sprężyną a uchwytami za pomocą światłoutwardzalnego kleju, aby ustawić bariery na obu końcach sprężyny (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E,F).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Podwójne etykietowanie zmineralizowanych kości
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu podstawowego.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór rozcieńczający wodą destylowaną, który zawiera 0,9% NaCl i 2%NaHCO3.</li>
		<li>Za pomocą roztworu rozcieńczalnika przygotować 20 mg/ml dwuwodnego kompleksu alizaryny i 10 mg/ml kalceiny (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Ustaw pH na 7,4 za pomocą miernika pH. Przepłukuj sondę pH między pomiarami, aby zapewnić dokładne odczyty.</li>
		<li>Umieścić barwnik w sterylnym pojemniku i przechowywać go w lodówce w temperaturze 4 °C; folia służy do ochrony przed światłem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj roztwór roboczy. Przed wstrzyknięciem należy rozcieńczyć roztwór podstawowy do 1 mg/ml w przypadku wapnia i 2 mg/ml w przypadku dwuwodnego kompleksu alizaryny, używając roztworu do rozpuszczania.</li>
	<li>Dootrzewnowo wstrzyknąć 5 mg/kg zieleni kalceiny i 20 mg/kg czerwieni alizaryny w dwóch punktach czasowych, aby oznaczyć zmineralizowane kości i przeanalizować zmiany między dwoma czasami. Ogólnie rzecz biorąc, próbki należy pobierać 12-14 godzin po wstrzyknięciu. 
	UWAGA: Podgrzej barwniki przed wstrzyknięciem i upewnij się, że czas wstrzyknięcia nie jest krótszy niż 3 minuty. Interwał wtryskiwania zależy od czasu rozprężania. W tym badaniu czerwień alizaryny i zieleń kalceiny wstrzykiwano odpowiednio przez noc (O/N) przed ekspansją i O/N przed pobraniem.</li>
	<li>Pobrać całe kości nazębne przygotowane do zabiegu oczyszczania tkanek dzień po drugim wstrzyknięciu.</li>
</ol>
4. Barwienie EdU
<ol>
	<li>Wstrzyknięcie dootrzewnowe: Wstrzyknąć dootrzewnowo EdU na 2 godziny przed eutanazją myszy (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Dawka wynosi 1 mg/10 g masy ciała.</li>
	<li>Przygotowanie koktajlu do etykietowania: Wymieszaj sól fizjologiczną buforowaną trisem (100 mmol/l końcowy, pH 7,6), CuSO4 (4 mmol/l końcowy), azydek sulfocyjaniny 3 (2-5 μmol/l końcowy) i askorbinian sodu (100 mmol/l końcowy, świeży za każdym razem) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Barwienie EdU w całości: Po etapie odbarwiania tkanek w metodzie oczyszczania tkanek PEGASOS (krok 7), umieść próbki w koktajlu do etykietowania na 1 dzień w temperaturze pokojowej (RT).</li>
</ol>
5. Obrazowanie metodą mikrotomografii komputerowej
<ol>
	<li>Utrwalanie i przechowywanie tkanek: Utrwalić kości łydkowe w 4% paraformaldehydzie (PFA) w temperaturze 4 °C O/N i przechowywać je w 0,5% PFA przed skanowaniem.</li>
	<li>Skanowanie i analiza: Skanuj próbki za pomocą systemu obrazowania mikrotomografii komputerowej (μCT) o wysokiej rozdzielczości i wielkości woksela 7 μm.</li>
</ol>
6. Przygotowanie roztworu roboczego do oczyszczania tkanek PEGASOS
<ol>
	<li>4% poliformaldehydu (PFA): Rozpuścić 4 g proszku PFA w 1× PBS na 100 ml.</li>
	<li>Roztwór perfuzyjny serca: 0,02% Heparyna, czyli 20 mg heparyny w proszku rozpuszczona w 1× PBS do 100 ml; alternatywnie użyj 0,05 mol/L EDTA, to znaczy 0,05 mola kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (patrz tabela materiałów), rozpuszczonego w dejonizowanym roztworze wodnym do całkowitej objętości 1 l.</li>
	<li>Roztwór odwapniający: 0,5 mol/L EDTA, czyli 0,5 mola kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), rozpuszczony w dejonizowanym roztworze wodnym do całkowitej objętości 1 l.</li>
	<li>Roztwór odbarwiający: 25% Quadrol, czyli 250 ml Quadrol (N, N, N', N' - Tetrakis (2-Hydroksypropylo) etylenodiaminy) (patrz Tabela Materiałów) rozpuszczony w wodzie dejonizowanej do całkowitej objętości 1 L. 
	UWAGA: Ze względu na lepkość Quadrol można go podgrzać do 60 °C, aby zwiększyć jego płynność przed konfiguracją.</li>
	<li>Roztwór odtłuszczający: 30%, 50%, 70% tert-butanol (tB) (patrz tabela materiałów), przygotowany z wodą według frakcji objętościowej. 
	UWAGA: Biorąc pod uwagę, że czysta tB jest krystaliczna w temperaturze pokojowej, należy ją podgrzać do 60 °C, aż się rozpuści, zanim będzie można ją użyć. Następnie dodaje się od 3% do 5% (v/v) trietanoloaminy (TEA) w celu regulacji pH roztworu >9,5.</li>
	<li>Roztwór do odwadniania: roztwór TB-PEG, 70% tB + 27% PEG-MMA + 3% Quadrol (v/v), w którym PEG-MMA to metakrylan eteru metylowego poli(glikolu etylenowego) o średniej masie cząsteczkowej 500 (Poli(glikol etylenowy) Metakrylan 500, PEG-MMA 500) (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Przezroczysty roztwór: roztwór BB-PEG, 75% BB + 22% PEG-MMA + 3% Quadrol (v/v), w którym BB to benzoesan benzylu (BB).</li>
</ol>
7. Przezroczystość kości kalwarycznych metodą PEGASOS
<ol>
	<li>Znieczulij mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie środków znieczulających (krok 2.1) i oceń głębokość znieczulenia myszy poprzez reakcję szczypania, aby upewnić się, że nie ma reakcji oporu przed perfuzją serca.</li>
	<li>Wykonaj perfuzję i stabilizację serca.
	<ol>
		<li>Trzymaj brzuch myszy do góry, przymocuj kończyny taśmą klejącą i ostrożnie przetnij wzdłuż obwodu klatki piersiowej, aby całkowicie ją odsłonić.</li>
		<li>Natychmiast po wykonaniu małego nacięcia w prawym przedsionku nożyczkami okulistycznymi, wprowadź igłę perfuzyjną 22 G na wierzchołku lewej komory. 
		UWAGA: Wkładana jest tylko końcówka igły, aby uniknąć uszkodzenia zastawki serca w wyniku nadmiernego włożenia. W przeciwnym razie płyn perfuzyjny serca dostanie się do krążenia płucnego, wpływając na efekt perfuzji krążenia ogólnoustrojowego.</li>
		<li>Wepchnąć 30-50 ml płynu perfuzyjnego serca (krok 6.2) do strzykawki. Można zauważyć, że wątroba stopniowo blednie z jaskrawoczerwonej.</li>
		<li>Po tym, jak płyn odpływający z prawego przedsionka stanie się całkowicie przezroczysty, wlej 4% roztwór PFA w równej objętości. Operacja perfuzji PFA odbywa się w wentylowanym okapie.</li>
		<li>Wypreparować i oddzielić tkanki i narządy, a następnie utrwalić je przez noc za pomocą 4% PFA w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwapnienie tkanek: W przypadku próbek przetwarzanych przez barwienie EdU, utrwaloną twardą tkankę należy umieścić w roztworze EDTA (pH 7,0) o stężeniu 0,5 mol/l (pH 7,0) (10 ml) na stole do wytrząsania w temperaturze 37 °C na około 2 dni i codziennie zmieniać płyn. 
	UWAGA: Pomiń proces odwapniania w znormalizowanej metodzie PEGASOS dla kości znakowanych czynnikiem chelatującym wapń, aby w pełni zachować sygnalizację. Odwapnienie jest wymagane w leczeniu kości w celu wizualizacji endogennej fluorescencji lub sygnałów immunologicznych wybarwionych całością.</li>
	<li>Odbarwienie tkanek: Umieścić nieruchome kości łydkowe w 25% roztworze Quadrol (20 ml) w stole wstrząsającym w temperaturze 37 °C na 1 dzień i zmienić płyn raz. 
	UWAGA: Czas odbarwiania jest związany z zawartością hemu w tkance. Zwróć uwagę na kolor płynu zabiegowego, ponieważ głębia koloru oznacza konieczność kontynuowania kuracji wymiany płynu.</li>
	<li>Barwienie EdU: Płucz próbki w 1× PBS przez 5 minut (trzy razy), a następnie zanurz je w koktajlu do etykietowania na 1 dzień. Następnie przepłukać próbki w 1× PBS przez 1 godzinę (trzy razy).</li>
	<li>Odtłuszczanie i odwadnianie tkanek
	<ol>
		<li>Umieścić tkanki w kolejno roztworach o stężeniu 30%, 50% tB i 70% tB, aby wykonać zmniejszanie gradientu na stole do wytrząsania w temperaturze 37 °C. Umieścić w każdym stężeniu na około 2 godziny.</li>
		<li>Następnie odwadniać próbki w roztworze TB-PEG przez 6 godzin na stole do wytrząsania w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Powyższy czas przetwarzania może być wydłużony lub skrócony w zależności od liczby tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przezroczystość tkanki: Umieścić całkowicie odwodnioną tkankę w roztworze BB-PEG na stole do wytrząsania w temperaturze 37 °C (2-4 h), aż stanie się przezroczysta. Obecnie próbki można przechowywać do 1-2 lat. 
	UWAGA: Po prawie całkowitym oczyszczeniu otwórz pokrywę probówki, aby wystawić próbki i medium na działanie powietrza z potrząsaniem, co jeszcze bardziej poprawi przezroczystość. Ta metoda jest odpowiednia do poprawy przezroczystości poszczególnych tkanek i narządów, a także całej głowy i ciała młodych myszy. Jednak dla przezroczystości całego ciała dorosłych myszy powyższe kroki należy wykonać metodą perfuzji w pełnym cyklu.</li>
</ol>
8. Obrazowanie
UWAGA: Mikroskopia konfokalna została użyta do wizualizacji 3D przezroczystych tkanek w tym badaniu. Mikroskopia arkuszy świetlnych jest również odpowiednia dla tego protokołu. Kilka systemów operacyjnych zostało zweryfikowanych jako dostępne wcześniej. W tym przypadku jako przykład podano system operacyjny laserowego mikroskopu konfokalnego (patrz tabela materiałów).
<ol>
	<li>Zgodnie z instrukcją obsługi wykonaj odpowiednie czynności, aby otworzyć interfejs operacyjny lasera konfokalnego i LAS AF. Włącz wymagany laser w różnych kanałach strzelania i dostosuj moc. Ustaw ścieżkę optyczną i odpowiadającą jej długość fali, 561 nm dla czerwieni Alizaryny i 488 nm dla zieleni Calceiny, z których każda jest używana dla sygnału EdU zgodnie z koktajlem etykietowania.</li>
	<li>Umieść przezroczyste próbki na wklęsłej szklanej szalce Petriego, która może przenosić grube próbki, pudełka do zatapiania lub samodzielnie wykonane urządzenia do umieszczania, takie jak wodoodporny klej, aby zanurzyć przezroczyste próbki w przezroczystej cieczy.</li>
	<li>Wybierz soczewkę obiektywu o małej mocy, aby szybko zlokalizować próbkę. Zrób przegląd całej tkanki nazębnej dzięki funkcji szybkiego skanowania i znajdź obszar zainteresowania do obrazowania.</li>
	<li>Ustaw moc wyjściową, wybierz tryb skanowania i najpierw dostosuj współczynniki fotografowania (rozdzielczość, szybkość skanowania, współczynnik powiększenia, jakość obrazu, średni szum tła itp.). 
	UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, Smart Gain waha się od 500 do 800 (zarówno zmiana sygnału, jak i szumu); Inteligentne przesunięcie jest jak najbardziej zbliżone do 0, zapewniając jednocześnie jakość obrazu (w celu zmniejszenia szumów tła). Gdy wzmocnienie PMT jest większe niż 800, lub wzmocnienie HyD jest większe niż 100%, a jasność jest nadal niewystarczająca, intensywność lasera można odpowiednio zwiększyć, ale w zasadzie im niższe, tym lepiej.</li>
	<li>Ustaw odległość osiową zakresu Z i krok Z, który jest drążony w dół od najpłytszej strony przezroczystej organizacji, czyli ustaw najgłębsze i najpłytsze boki. 
	UWAGA: Potwierdź klasyfikację i odległość roboczą dla każdego obiektywu. Ostrożnie ustaw zakres Z i nie używaj odległości roboczej przekraczającej limit wybranego obiektywu. "z-Galvo" można wybrać, gdy potrzebna jest precyzyjna regulacja.</li>
	<li>Ponownie ustaw parametry fotografowania i rozpocznij fotografowanie. Po zakończeniu scal i przetwórz obrazy za pomocą modułu wielofunkcyjnego. Na koniec przechowuj i wyłącz instrument we wskazanej kolejności.</li>
</ol>

3D Visualization of Bone Remodeling Under Tensile Load in Suture Expansion Mice

<ol><li>Opperman, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+sutures+as+intramembranous+bone+growth+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Cranial sutures as intramembranous bone growth sites.</a> Developmental Dynamics. 219 (4), 472-485 (2000).</li>
<li>Thenier-Villa, J. L., Sanromán-Álvarez, P., Miranda-Lloret, P., Plaza Ramírez, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incomplete+reossification+after+craniosynostosis+surgery-incidence+and+analysis+of+risk+factors%3A+a+clinical-radiological+assessment+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neurosurgery-pediatrics%22%5BJournal%5D)">Incomplete reossification after craniosynostosis surgery-incidence and analysis of risk factors: a clinical-radiological assessment study.</a> Journal Of Neurosurgery-pediatrics. 22 (2), 120-127 (2018).</li>
<li>Markiewicz, M. R., Recker, M. J., Reynolds, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+sagittal+and+lambdoid+craniosynostosis%3A+open+cranial+vault+expansion+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+And+Maxillofacial+Surgery+Clinics+Of+North+America%22%5BJournal%5D)">Management of sagittal and lambdoid craniosynostosis: open cranial vault expansion and remodeling.</a> Oral And Maxillofacial Surgery Clinics Of North America. 34 (3), 395-419 (2022).</li>
<li>Mao, J. J., Wang, X., Kopher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanics+of+craniofacial+sutures%3A+orthopedic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Angle+Orthodontist%22%5BJournal%5D)">Biomechanics of craniofacial sutures: orthopedic implications.</a> Angle Orthodontist. 73 (2), 128-135 (2003).</li>
<li>Shayani, A., Sandoval Vidal, P., Garay Carrasco, I., Merino Gerlach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midpalatal+suture+maturation+method+for+the+assessment+of+maturation+before+maxillary+expansion%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Midpalatal suture maturation method for the assessment of maturation before maxillary expansion: a systematic review.</a> Diagnostics (Basel). 12 (11), 2774(2022).</li>
<li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniscrew-assisted+rapid+palatal+expander+%28MARPE%29%3A+the+quest+for+pure+orthopedic+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Dental+Press+Journal+Of+Orthodontics%22%5BJournal%5D)">Miniscrew-assisted rapid palatal expander (MARPE): the quest for pure orthopedic movement.</a> Dental Press Journal Of Orthodontics. 21 (4), 17-23 (2016).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+suture+regeneration+mitigates+skull+and+neurocognitive+defects+in+craniosynostosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis.</a> Cell. 184 (1), 243-256 (2021).</li>
<li>Roth, D. M., Souter, K., Graf, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Craniofacial+sutures%3A+Signaling+centres+integrating+mechanosensation%2C+cell+signaling%2C+and+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Craniofacial sutures: Signaling centres integrating mechanosensation, cell signaling, and cell differentiation.</a> European Journal of Cell Biology. 101 (3), 151258(2022).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+suture+provides+a+niche+for+mesenchymal+stem+cells+of+craniofacial+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 386-396 (2015).</li>
<li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Gli1%28%2B%29+suture+stem+cells+to+mechanical+force+upon+suture+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+And+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Response of Gli1(+) suture stem cells to mechanical force upon suture expansion.</a> Journal of Bone And Mineral Research. 37 (7), 1307-1320 (2022).</li>
<li>Xu, Y., Malladi, P., Chiou, M., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+posterofrontal%2Fsagittal+suture+mesenchymal+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of posterofrontal/sagittal suture mesenchymal cells in vitro.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 119 (3), 819-829 (2007).</li>
<li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+suture+mesenchymal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human suture mesenchymal stem cells in vitro.</a> International Journal of Stem Cells. 13 (3), 377-385 (2020).</li>
<li>Ikegame, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+stress+induces+bone+morphogenetic+protein+4+in+preosteoblastic+and+fibroblastic+cells%2C+which+later+differentiate+into+osteoblasts+leading+to+osteogenesis+in+the+mouse+calvariae+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+And+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Tensile stress induces bone morphogenetic protein 4 in preosteoblastic and fibroblastic cells, which later differentiate into osteoblasts leading to osteogenesis in the mouse calvariae in organ culture.</a> Journal of Bone And Mineral Research. 16 (1), 24-32 (2001).</li>
<li>Liu, S. S., Opperman, L. A., Buschang, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+protein-2+on+midsagittal+sutural+bone+formation+during+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Orthodontics+And+Dentofacialorthopedics%22%5BJournal%5D)">Effects of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on midsagittal sutural bone formation during expansion.</a> American Journal of Orthodontics And Dentofacialorthopedics. 136 (6), 768-769 (2009).</li>
<li>Liang, W., Ding, P., Li, G., Lu, E., Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyapatite+nanoparticles+facilitate+osteoblast+differentiation+and+bone+formation+within+sagittal+suture+during+expansion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Design+Development+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Hydroxyapatite nanoparticles facilitate osteoblast differentiation and bone formation within sagittal suture during expansion in rats.</a> Drug Design Development and Therapy. 15, 905-917 (2021).</li>
<li>Morinobu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteopontin+expression+in+osteoblasts+and+osteocytes+during+bone+formation+under+mechanical+stress+in+the+calvarial+suture+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+And+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Osteopontin expression in osteoblasts and osteocytes during bone formation under mechanical stress in the calvarial suture in vivo.</a> Journal of Bone And Mineral Research. 18 (9), 1706-1715 (2003).</li>
<li>Hwang, S., Chung, C. J., Choi, Y. J., Kim, T., Kim, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cetirizine%2C+a+histamine+1+receptor+antagonist%2C+on+bone+remodeling+after+calvarial+suture+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+Journal+of+Orthodontics%22%5BJournal%5D)">The effect of cetirizine, a histamine 1 receptor antagonist, on bone remodeling after calvarial suture expansion.</a> Korean Journal of Orthodontics. 50 (1), 42-51 (2020).</li>
<li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li>
<li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+application+to+bone+and+dental+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its application to bone and dental tissues.</a> Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).</li>
<li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+postnatal+craniofacial+bone+development+with+tissue+clearing-based+three-dimensional+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Development%22%5BJournal%5D)">Investigation of postnatal craniofacial bone development with tissue clearing-based three-dimensional imaging.</a> Stem Cells Development. 28 (19), 1310-1321 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zastosowaliśmy standardowy model myszy z rozszerzaniem szwów, aby obserwować regularne zmiany morfologiczne, które zachodzą co tydzień podczas całego miesięcznego cyklu przebudowy10. Model ten jest przydatny do badań nad przebudową i regeneracją kości kalwarycznej poprzez rozszerzanie szwów kalwarycznych, a także do badania różnych komórek szwów in vivo. Aby w pełni zaprezentować wyniki takich badań, potrzebna jest trójwymiarowa wizualizacja barwionych tkanek. Dlatego technologia PEGASOS,...

Szwy twarzoczaszki to włókniste tkanki, które łączą kości twarzoczaszki i odgrywają istotną rolę we wzroście i przebudowie kości twarzoczaszki. Struktura szwu przypomina rzekę, zapewniając przepływ zasobów komórkowych do odżywiania i budowy "brzegu rzeki", znanego jako fronty osteogenne, które przyczyniają się do tworzenia kości twarzoczaszki poprzez wewnątrzbłoniastą osteogenezę1.
Zainteresowanie szwami twarzoczaszkowymi wynika z potrzeb klinicznych, aby zrozumieć przedwczesne zamykanie szwów czaszkowych i dysfunkcję szwów twarzowych, co może prowadzić do deformacji twarzoczaszki, a nawet stanów zagrażających życiu u dzieci. Otwarta szycie jest rutynowo stosowane w leczeniu klinicznym, ale długotrwała obserwacja wykazała niepełny nawrót ponownego kostnienia u niektórych pacjentów2. Minimalnie inwazyjna kraniotomia wspomagana sprężynami rozprężnymi lub endoskopowa kraniektomia paskowa może zapewnić bezpieczniejsze podejście do zachowania potencjalnego szwu niż odrzucanie tkanek3. Podobnie, terapie ortopedyczne, takie jak maski na twarz i aparaty ekspansyjne, są szeroko stosowane w leczeniu strzałkowej lub poziomej hipoplazji szczęki, a niektóre badania rozszerzają ograniczenie wiekowe na leczenie dorosłych pacjentów za pomocą ekspanderów podniebiennych wspomaganych miniśrubami4,5,6. Dodatkowo, regeneracja szwów czaszkowych za pomocą mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w połączeniu z materiałami biodegradowalnymi jest potencjalną terapią w przyszłości, oferując nowy kierunek leczenia chorób pokrewnych7. Jednak proces funkcjonalny lub mechanizm regulacyjny szwów pozostaje nieuchwytny.
Przebudowa kości polega głównie na równowadze między tworzeniem kości prowadzonym przez osteoblasty a resorpcją kości prowadzoną przez osteoklasty, gdzie osteogenne różnicowanie komórek macierzystych stymulowane przez sygnały mechaniczne odgrywa ważną rolę. Po dziesięcioleciach badań stwierdzono, że szwy twarzoczaszki są wysoce plastycznymi niszami mezenchymalnych komórek macierzystych8. Komórki macierzyste do szwów (SuSCs) to niejednorodna grupa komórek macierzystych, należąca do mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) lub komórek macierzystych kości (SSC). SuSC są znakowane in vivo za pomocą czterech markerów, w tym Gli1, Axin2, Prrx1 i Ctsk. W szczególności SuSC Gli1+ ściśle zweryfikowały biologiczne cechy komórek macierzystych, nie tylko wykazując wysoką ekspresję typowych markerów MSC, ale także wykazując doskonały potencjał osteogenny i chondrogene9. Wcześniejsze badania wykazały, że Gli1+ SuSC aktywnie przyczyniają się do tworzenia nowych kości pod wpływem siły rozciągającej, identyfikując je jako źródło komórek macierzystych szwów wspomagających osteogenezę rozpraszającą10.
W przeszłości, obszerne właściwości mechaniczne komórek macierzystych były badane in vitro za pomocą Flexcell, czteropunktowego zginania, systemu ładowania mikromagnesami i innych. Chociaż mysie komórki mezenchymalne pochodzące ze szwów czaszkowych zostały zidentyfikowane in vitro11, a ostatnio wyizolowano również ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste wykonane szwem ludzkim 12, odpowiedź biomechaniczna komórek szwowych pozostaje niejasna w systemie in vitro. W celu dalszego zbadania procesu przebudowy kości, stworzono model rozszerzania szwów oparty na izolowanej hodowli narządów kalwarii, torując drogę do ustanowienia użytecznego modelu rozszerzania szwów in vivo1,13. Rabbits14 i rats15 były najczęściej wykorzystywanymi zwierzętami w badaniach podstawowych nad rozszerzaniem szwów. Jednak myszy są preferowanymi modelami zwierzęcymi do badania chorób ludzkich ze względu na ich wysoce homologiczny genom z ludźmi, liczne linie modyfikacji genów i silną zdolność hybrydyzacji reprodukcyjnej. Istniejące mysie modele rozszerzania szwów czaszkowych zazwyczaj opierają się na ortodontycznych drutach sprężynowych ze stali nierdzewnej, aby przyłożyć siłę rozciągającą do szwu strzałkowego16,17. W tych modelach po obu stronach kości ciemieniowych wykonuje się dwa otwory, aby zamocować urządzenie rozprężne, a przewody są osadzone pod skórą, co może wpływać na tryb aktywacji komórek.
Jeśli chodzi o metodę wizualizacji, dwuwymiarowa obserwacja przekrojów w kierunku strzałkowym jest powszechnie stosowana od dziesięcioleci. Biorąc jednak pod uwagę, że przebudowa kości jest złożonym trójwymiarowym procesem dynamicznym, uzyskanie kompletnych informacji trójwymiarowych stało się pilną potrzebą. Aby spełnić ten wymóg, powstała technika przezroczystości tkanek PEGASOS18,19. Oferuje unikalne korzyści w zakresie przezroczystości tkanek twardych i miękkich, umożliwiając odtworzenie całego procesu przebudowy kości w przestrzeni trójwymiarowej.
Aby uzyskać głębsze i bardziej kompleksowe zrozumienie zmian fizjologicznych w okresach przebudowy kości, stworzono standardowy model myszy z rozszerzaniem szwów strzałkowych z ustawieniem sprężyny między ręcznie robionymi uchwytami10. Dzięki znormalizowanej procedurze trawienia i klejenia kwasem, urządzenie do rozprężania może być mocno połączone z kością czaszki, generując siłę rozciągającą prostopadłą do szwu strzałkowego. Ponadto po dwukrotnym znakowaniu zmineralizowanej kości po rozprężeniu zastosowano metodę oczyszczania tkanek PEGASOS, aby w pełni uwidocznić zmiany modelowania kości po rozszerzeniu szwów.

<table><tbody><tr><td>37% Wytrawianie kwasem</td><td>Xihubiom</td><td>E10-02/1807011</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień alizarynowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3882</td><td></td></tr><tr><td>AUSTRALIJSKI DRUT</td><td>A.J.WILCOCK</td><td>0,014''</td><td></td></tr><tr><td>Benzoesan benzylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6630</td><td></td></tr><tr><td>Zieleń kalceinowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan miedzi(II), bezwodny</td>Dynamometr <td>A603008</td><td></td> <td>Sangon Biotech</td></tr><tr><td></td><td>Sanliang</td><td>SF-10N</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>EdU</td><td>Invitrogen</td><td>E104152</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607008</td><td></td></tr><tr><td>PEG-MMA 500</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>447943</tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pH-metry</td><td>Mettler Toledo</td><td>S220</td><td></td></tr><tr><td>Quadrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>122262</td><td></td></tr><tr><td>Askorbinian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500873</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610476</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Wiosna</td><td>TAOBAO</td><td>0,2 * 1,5 * 1 * 7</td><td></td></tr><tr><td>Azydowa sonda sulfo-cyjanininy3</td><td>Lumiprobe</td><td>A1330</td><td></td></tr><tr><td>tert-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>360538&nbsp;</td><td>Chronić przed światłem. Nie zamrażać.</td></tr><tr><td>Transbond MIP Niewrażliwy na wilgoć podkład</td><td>3M Unitek</td><td>712-025</td><td></td></tr><tr><td>Transbond XT Światłoutwardzalna pasta adhezyjna</td><td>3M Unitek</td><td>712-035</td><td></td></tr><tr><td>Trietanoloamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900257</td><td></td></tr><tr><td>sola fizjologiczna buforowana trisem</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500027</td><td></td></tr></tbody></table>

technika wizualizacji 3d do przebudowy kości w mysim modelu rozszerzania szwów

A 3-D Visualization Technique for Bone Remodeling in a Suture Expansion Mouse Model

Szwy twarzoczaszki odgrywają kluczową rolę poza tym, że są włóknistymi stawami łączącymi kości twarzoczaszki; służą również jako główna nisza dla wzrostu kości nazębnej i twarzowej, mieszcząc mezenchymalne komórki macierzyste i osteoprogenitory. Ponieważ większość kości twarzoczaszki rozwija się w wyniku kostnienia śródbłoniastego, obszary brzeżne szwów działają jako punkty inicjacji. Ze względu na to znaczenie, szwy te stały się intrygującymi celami w terapiach ortopedycznych, takich jak wspomagane sprężyną rozszerzanie sklepienia czaszki, szybkie rozszerzanie szczęki i wysuwanie szczęki. Pod wpływem ortopedycznej siły śledzącej komórki macierzyste szwu są szybko aktywowane, stając się dynamicznym źródłem przebudowy kości podczas ekspansji. Pomimo ich znaczenia, zmiany fizjologiczne zachodzące w okresach przebudowy kości pozostają słabo poznane. Tradycyjne metody cięcia, przede wszystkim w kierunku strzałkowym, nie pozwalają uchwycić kompleksowych zmian zachodzących w całym szycie. W tym badaniu ustanowiono standardowy model mysi do rozszerzania szwów strzałkowych. Aby w pełni uwidocznić zmiany w przebudowie kości po rozszerzeniu szwów, metodę oczyszczania tkanek PEGASOS połączono z barwieniem EdU w całości i podwójnym znakowaniem chelatującym wapń. Pozwoliło to na wizualizację wysoce proliferujących komórek i tworzenie się nowych kości w całych kościach kalwarii po ekspansji. Protokół ten oferuje ustandaryzowany model myszy z rozszerzaniem szwów i metodę wizualizacji 3D, rzucając światło na zmiany mechanobiologiczne w szwach i przebudowie kości pod wpływem obciążenia siłą rozciągającą.

Zastosowanie niniejszego protokołu pozwoliło na stworzenie modelu mysiego do badania rozszerzenia szwu strzałkowego (Rycina 1-2). W celu trójwymiarowej wizualizacji zmian w modelowaniu kości po rozszerzeniu szwu, zastosowano metodę klarowania tkanek PEGASOS w odniesieniu do całych kości sklepienia czaszki po zabiegu rozszerzenia. Po perfuzji oddzielono kości sklepienia czaszki (Rycina 3A), a następnie kontynuowano odpowiedni pro...

Ten protokół przedstawia ustandaryzowany model myszy do rozszerzania szwów oraz metodę wizualizacji 3D do badania mechanobiologicznych zmian szwu i przebudowy kości pod wpływem siły rozciągającej.

Technika wizualizacji 3D do przebudowy kości w mysim modelu rozszerzania szwów

Craniofacial sutures play a crucial role beyond being fibrous joints connecting craniofacial bones; they also serve as the primary niche for calvarial and ...

Zainteresowanie szwami twarzoczaszki wynika z potrzeb klinicznych, aby zrozumieć mechanizm leczenia ortodontycznego i ortopedycznego. Zakres naszych badań polega na ustaleniu standaryzowanego modelu myszy z rozszerzaniem szwów oraz metody wizualizacji 3D w celu zbadania zmian kodu mechanobiologicznego szwów i przebudowy kości po ekspansji. Technika oczyszczania tkanek opracowana w ramach projektu PEGASOS została połączona z metodami znakowania wirusów w celu uzyskania wszechstronnych informacji na temat szwów i przebudowy kości w perspektywie kosmicznej.Ten model jest odpowiedni dla różnych sił myszy transgenicznych w różnym wieku. Wygodna jest regulacja wielkości naprężenia rozciągającego i siły wycofania w dowolnym momencie. Dzięki technice PEGASOS możemy obserwować trójwymiarowy przestrzenny rozkład czasowy komórek macierzystych ze szwu czaszkowego podczas przebudowy kości.Dzięki technice PEGASOS będziemy dalej badać związek między takimi komórkami macierzystymi a stresem mechanicznym, a także jego specyficzne mechanizmy. Zacznij od przygotowania dwóch uchwytów retencyjnych. Użyj szczypiec do drutu lekkiego i australijskiego drutu 0,014 cala, aby zrobić spiralną pętlę.Następnie przygotuj niestandardowe sprężyny ze stali nierdzewnej i przytnij sprężynę na odpowiednią długość. Przygotuj również jeden prosty drut australijski lub prosty drut stalowy o długości siedmiu milimetrów i wytnij dwa kawałki papieru o średnicy dwóch milimetrów, aby użyć ich jako barier. Następnie umieść znieczuloną mysz na stole operacyjnym i ostrożnie usuń sierść na czubku głowy za pomocą kremu do depilacji lub golarki.Następnie zdezynfekuj skórę głowy myszy za pomocą naprzemiennych rund jodoforu i 75% alkoholu. Ustaw mysz z głową na górze i użyj taśm chirurgicznych, aby przymocować kończyny na stole operacyjnym. Teraz użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać łukowaty płat wzdłuż skóry głowy w pobliżu szyi myszy, całkowicie odsłaniając szew strzałkowy i otaczającą czaszkę.Następnie przymocuj płat skóry głowy za pomocą szwu 6-0 na stole operacyjnym. Osusz czaszkę i wytrawiaj ją 37% kwasem fosforowym przez 20 sekund. Następnie użyj zwykłej soli fizjologicznej, aby usunąć wytrawianie kwasem.Umieść dwa uchwyty po obu stronach kości ciemieniowych, trzy milimetry od szwów strzałkowych i przyklej je światłoutwardzalnym klejem. Następnie odłóż płat skóry głowy, oznacz położenie uchwytów i wytnij dwa małe otwory w skórze głowy w odpowiednich pozycjach. Zresetuj opadającą skórę głowy, jednocześnie przepuszczając małe pętle przez otwory, aby odsłonić powierzchnię skóry.Aby zainstalować sprężynę i drut doprowadzający, przyciąć sprężynę o jeden milimetr dłużej niż odległość między dwoma uchwytami. Ściśnij sprężynę dociskową i umieść ją między małymi zwojami po obu stronach. Przełóż drut ze stali nierdzewnej przez małe cewki i sprężynę, a następnie zwolnij sprężynę, aby uzyskać początkowy ciąg około 30G.Następnie umieść dwa skrawki papieru między sprężyną a uchwytami i połącz je światłoutwardzalnym klejem, aby ustawić bariery na obu końcach sprężyny. Po rozprężeniu zastosowano Micro CT do wizualizacji zmian w szwie czaszkowym. W porównaniu z grupą kontrolną, szew czaszkowy stopniowo i znacznie rozszerzał się po przyłożeniu siły przez jeden dzień, a puszyste wypukłości kostne pojawiły się na krawędzi kości po piątym dniu.Również wizualizacja mineralizacji przy użyciu metody podwójnego znakowania wykazała, że obciążenie siłowe istotnie aktywowało osteogenezę. Nowo zmineralizowaną kość zaobserwowano po siedmiu dniach, co wskazuje na proces przebudowy kości po rozszerzeniu szwów. Na początek przymocuj kończyny znieczulonej myszy taśmą klejącą, przytrzymaj skórę brzucha do góry i ostrożnie przetnij wzdłuż obwodu klatki piersiowej, aby całkowicie ją odsłonić.Wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku nożyczkami okulistycznymi i natychmiast włóż igłę perfuzyjną 22 na wierzchołku lewej komory. Następnie przepchnij przez strzykawkę od 30 do 50 mililitrów płynu perfuzyjnego serca. Po tym, jak płyn odpływający z prawego przedsionka stanie się całkowicie przezroczysty, wlej równą objętość 4% roztworu PFA.Wypreparuj tkanki i narządy i utrwal je przez noc za pomocą 4% PFA w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby wywołać odwapnienie tkanek, umieść utrwaloną twardą tkankę w 10 mililitrach roztworu EDTA na stole do wytrząsania w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Inkubuj przez około dwa dni i codziennie zmieniaj płyn.Umieść nieruchome kości nazębne w 20 mililitrach roztworu 25% Quadral w celu odbarwienia tkanek. Inkubować na stole do wytrząsania w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden dzień i raz zmienić płyn. Następnie umieść tkankę sekwencyjnie w 30% trzeciorzędowym roztworze butanolu lub gruźlicy, następnie w roztworze 50% TB, a następnie w roztworze 70% TB, aby przeprowadzić odtłuszczanie gradientowe.Następnie odwadniaj próbki i roztwór TB PEG przez sześć godzin na stole do wytrząsania w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na koniec umieść całkowicie odwodnioną tkankę w roztworze BB PEG na stole do wytrząsania w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po dwóch do czterech godzinach inkubacji tkanka stanie się przezroczysta.Metoda oczyszczania tkanek PEGASOS doprowadziła do uzyskania przezroczystej tkanki. Oczyszczona tkanka z barwieniem całego mocowania EDU wykazała, że etykietowanie było wydajne i dobrze zachowane. W grupie kontrolnej kilka komórek EDU-dodatnich było rozproszonych w szwach.Po jednym dniu rozszerzania szwu zaobserwowano proliferujące komórki w środku i na krawędziach szwu. Wraz z poszerzaniem się szwu liczba proliferujących komórek zmniejszała się z czasem. Komórki oznaczone na zielono były małymi okrągłymi komórkami w szpiku kostnym, które różniły się od komórek szwowych EDU-dodatnich.

a-3-d-visualization-technique-for-bone-remodeling-suture-expansion

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Połączone obrazowanie optyczne i μCT w mysim modelu infekcji implantu ortopedycznego, wykorzystujące bioluminescencyjny zmodyfikowany szczep Staphylococcus aureus, zapewniło możliwość nieinwazyjnego i podłużnego monitorowania dynamiki infekcji bakteryjnej, jak również odpowiadającej jej reakcji zapalnej i zmian anatomicznych w kości.

Połączone obrazowanie optyczne in vivo i μCT w celu monitorowania infekcji, stanu zapalnego i anatomii kości w zakażeniu implantu ortopedycznego u myszy

Ocena rozwoju tkanki w złamaniu modzeli podczas gojenia kości śródchrzęstnej jest niezbędna do monitorowania procesu gojenia. W tym miejscu informujemy o zastosowaniu zewnętrznego stabilizatora kompatybilnego z rezonansem magnetycznym (MRI) dla kości udowej myszy, aby umożliwić skany MRI podczas regeneracji kości u myszy.

In vivo (in vivo) Ocena rozwoju kalusa złamania podczas gojenia kości u myszy przy użyciu urządzenia do osteosyntezy kompatybilnego z MRI dla kości udowej myszy

Prezentujemy model osteogenezy rozproszenia kości piszczelowej myszy opracowany przy użyciu specjalnie wykonanego dystraktora. Wykorzystanie myszy jako celu analizy jest korzystne dla postępu badań.

Model osteogenezy rozpraszającej uwagę myszy

Model mysiego zamkniętego złamania kości udowej jest potężną platformą do badania gojenia złamań i nowatorskich strategii terapeutycznych przyspieszających regenerację kości. Celem tego protokołu chirurgicznego jest wygenerowanie jednostronnie zamkniętych złamań kości udowej u myszy za pomocą śródszpikowego pręta stalowego do stabilizacji kości udowej.

Generowanie zamkniętych złamań kości udowej u myszy: model do badania gojenia kości

Tutaj prezentujemy protokół amputacji terminalnego paliczka dorosłej myszy w celu zbadania powstawania blastema u ssaków i kostnienia wewnątrzbłoniastego, analizowany za pomocą immunohistochemii fluorescencyjnej i sekwencyjnej tomografii mikrokomputerowej in vivo.

Amputacja i regeneracja palców dorosłych myszy : prosty model do badania powstawania blastemy i kostnienia śródbłoniastego u ssaków

Tutaj opisujemy narzędzia i metody obliczeniowe, które umożliwiają wizualizację i analizę trzy- i czterowymiarowych danych obrazowych zarodków myszy w kontekście osiowego wydłużania i segmentacji, uzyskanych przez optyczną tomografię projekcyjną in toto oraz przez obrazowanie na żywo i barwienie immunofluorescencyjne w całości za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Trój- i czterowymiarowe podejścia do wizualizacji i analizy w celu badania wydłużenia osiowego i segmentacji kręgowców

Ten protokół opisuje procedurę chirurgiczną mającą na celu wykrycie złamania trzonu w kości udowej myszy, która jest stabilizowana drutem śródszpikowym, do badań nad gojeniem złamań.

Ustalenie modelu złamania kości udowej trzonu u myszy

Ten protokół przedstawia ekonomiczną i efektywną metodę ilościowej oceny mikroarchitektury kości w mysim modelu osteoporozy poprzez połączenie barwienia Hematoxylin-Eosin (HE) i technik mikrotomografii komputerowej (Micro-CT).

Ocena mikroarchitektury kości beleczkowej w mysim modelu osteoporozy

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę, która opiera się na mikrotomografii komputerowej, do segmentacji i pomiaru modeli 3D kości czaszkowo-szczękowo-twarzowych u myszy, dla lepszej oceny rozwoju kości czaszkowo-szczękowo-twarzowej u myszy niż jest to możliwe przy użyciu obecnych metod.

Analiza malformacji czaszkowo-szczękowo-twarzowych u myszy za pomocą trójwymiarowej mikrotomografii komputerowej

Model uszkodzenia szpiku kostnego u myszy jest użytecznym narzędziem do badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste. Ten uproszczony protokół chirurgiczny opisuje procedurę ablacji szpiku kostnego w celu dalszej oceny tworzenia się nowej kości i odpowiedzi komórkowych po urazie.

Ulepszona metodologia badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste w mysim modelu uszkodzenia szpiku kostnego

Przedstawiamy metodę analizy zdefiniowanego przez użytkownika obszaru zainteresowania (ROI) w podłużnym modelu defektu promieniowego szczura in vivo . Metoda ta umożliwia analizę porównawczą różnych rusztowań, które wcześniej były ograniczone przez różnice w polu widzenia skanowania metodą tomografii komputerowej (μCT), orientacji próbki i wyjściowej obecności rusztowania.

Podłużna analiza obrazu mikrotomografii komputerowej dla zdefiniowanego przez użytkownika obszaru zainteresowania w ubytkach kostnych o krytycznej wielkości

Poznaj technikę PEGASOS do wizualizacji 3D przebudowy kości w modelu rozszerzania szwów u myszy. Metoda ta umożliwia szczegółowe badanie dynamiki komórek macierzystych szwów czaszkowych pod wpływem naprężenia mechanicznego.

Technika wizualizacji 3D do przebudowy kości w mysim modelu rozszerzania szwów

Przeglądaj więcej filmów