Multipleksowa analiza immunohistochemiczna przestrzennego krajobrazu komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza
18 sierpnia 2023
Ten protokół opisuje szczegółowo, jak przeprowadzana jest charakterystyka komórek odpornościowych mikrośrodowiska guza za pomocą multipleksowej immunohistochemii.
Naszym celem jest określenie ilości, rodzaju i lokalizacji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza. W dziedzinie immunohistochemii w ostatnich latach nastąpił znaczny postęp technologiczny Postęp w technologii immunohistochemii multipleksowej pozwala na wiarygodne badanie większej liczby markerów. Obecne wyzwania eksperymentalne polegają na wizualizacji określonych typów komórek odpornościowych w próbkach guza, które zostały przezwyciężone dzięki zastosowaniu multipleksowych metod immunohistochemicznych
.Jednak dokładna automatyczna analiza tych obrazów jest nadal wyzwaniem, nad którym pracujemy. Różnice między krajobrazem komórek odpornościowych, między guzami pierwotnymi i przerzutowymi rodzą pytania takie jak: Jakie wewnętrzne właściwości guza napędzają te różnice i co te różnice oznaczają dla terapii ukierunkowanych na układ odpornościowy? Oprócz naszych prac eksploracyjnych skupimy się również na istotnych klinicznie pytaniach, takich jak: W jaki sposób różne rodzaje terapii przeciwnowotworowych wpływają na krajobraz komórek odpornościowych guza oraz czy krajobraz komórek odpornościowych może przewidywać wynik terapii.
Po wykonaniu immunohistochemii na tkankach FFPE należy zobrazować skrawki za pomocą Digital Pathology Imager. Uruchom oprogramowanie, aby wykonać spektralne rozmieszanie obrazów z adnotacjami. Wybierz pozycję Plik.
Następnie kliknij Otwórz obraz i wybierz pliki QuP TIFF, aby przesłać obrazy do oprogramowania. Zezwól na przesyłanie do projektu pieczęci oznaczonych jako projekty świadome. Załaduj pliki QuP TIFF przygotowane do kompensacji autofluorescencji.
Wybierz narzędzie Autofluorescencja na obrazie, aby narysować linię na obrazie od niezabarwionego slajdu, przez struktury autofluorescencyjne, takie jak erytrocyty i kolagen, aby skompensować autofluorescencję. Następnie przejdź do sekcji Edytuj znaczniki i kolor. Przypisz nazwy znaczników, które pasują do opalowego fluoroforu i dostosuj ustawienia kolorów do preferowanej opcji.
Wybierz opcję Przygotuj wszystko znajdującą się w lewym dolnym rogu interfejsu, aby rozpocząć rozmieszanie fluorforów. Sprawdź wszystkie obrazy, aby sprawdzić widoczność wszystkich sygnałów i pomyślne zakończenie procesu rozłączania. Wybierz ikonę gałki ocznej, aby wyłączyć i włączyć wszystkie znaczniki jeden po drugim, aby sprawdzić jakość.
Teraz przejdź do zakładki eksportu i utwórz nowy pusty katalog eksportu, klikając przycisk Przeglądaj znajdujący się pod katalogiem eksportu. Wybierz opcję Composite Image and Component Images (Obrazy kompozytowe i składowe) w formacie TIFF z wieloma obrazami na karcie obrazów do wyeksportowania. Przejdź do karty Analiza wsadowa znajdującej się pionowo po lewej stronie, aby uzyskać informacje o przetwarzaniu wsadowym slajdów, i wybierz opcję utwórz osobne katalogi dla każdego elementu w opcjach eksportu.
Aby dodać slajdy do analizy, wybierz pliki QuP TIFF pod przyciskiem dodawania slajdów i załaduj je do analizy wsadowej. Wybierz opcję Uruchom, aby rozpocząć przetwarzanie wsadowe slajdów. Utwórz nowy folder zawierający tylko pliki składowe z Spectral Unmixing, upewniając się, że hierarchiczna struktura folderów pozostaje nienaruszona.
Uruchom całe oprogramowanie SlideViewer. Kliknij Utwórz projekt po lewej stronie i utwórz lub wybierz nowy pusty folder o odpowiedniej nazwie. Następnie kliknij Automatyzuj i wybierz pokaż Edytor skryptów.
Skopiuj i wklej istniejący skrypt, a następnie zmodyfikuj lokalizację, aby skierować go do folderu zawierającego wszystkie pliki składników slajdów. Wybierz pozycję Uruchom, aby rozpocząć proces zszywania slajdów wsadowo, a następnie poczekaj na jego zakończenie. Teraz przenieś ostatnio wygenerowane pliki OME-TIFF do projektu QuPath i zapisz je jako nowy projekt.
Gdy pojawi się nowe okno, wybierz Ustaw typ obrazu jako Fluorescencja, a następnie kliknij przycisk Importuj. Przejdź do menu po lewej stronie, wybierz próbkę z listy i kliknij dwukrotnie, aby otworzyć wybraną próbkę. Dostosuj intensywność kanałów, klikając ikonę kontrastu, aby poprawić widoczność.
Wybierz wszystkie kanały i zdecyduj się na zresetowanie. Upewnij się, że autofluorescencja jest wyłączona. Aby narysować obszar zainteresowania lub ROI dla guza, ponownie kliknij ikonę Kontrast, a następnie wybierz opcję Pokaż skalę szarości.
Następnie wybierz kanał markera nowotworowego i dostosuj intensywność, aby uzyskać optymalną widoczność. Kliknij narzędzie pędzla, aby narysować ROI wokół guza. Kliknij narzędzie różdżki i dostosuj ROI, naciskając Alt, aby wygładzić ROI od zewnątrz.
Po zakończeniu połącz wszystkie oddzielone części guza w ten sam ROI. Kliknij prawym przyciskiem myszy adnotację ROI na liście po lewej stronie, wybierz Ustaw właściwości i podaj odpowiednią nazwę, na przykład Guz. Rozwiń ROI dla inwazyjnego marginesu z obszaru guza, wybierając Obiekty, następnie Adnotacje, a następnie Rozwiń adnotacje.
Wybierz żądany rozmiar promienia rozszerzenia. Wybierz opcję Usuń wnętrze i ogranicz do elementu nadrzędnego. Kliknij ikonę kontrastu.
Wybierz kanał autofluorescencji i dostosuj intensywność, aby uzyskać optymalną widoczność. Kliknij różdżkę i dostosuj ROI, naciskając alt, aby wygładzić ROI z zewnątrz i usunąć wszelkie tło, które nie powinno być częścią tego ROI. Kliknij prawym przyciskiem myszy adnotację na liście po lewej stronie, a następnie wybierz opcję Ustaw właściwości, aby przypisać odpowiednią nazwę, taką jak: Inwazyjny margines lub IM do ROI.
W razie potrzeby zmień jego kolor. Aby wyeksportować adnotacje, przejdź do opcji pliku. Kliknij pozycję Dane obiektu, Eksportuj jako GO JSON i wybierz opcję Eksportuj wszystkie obiekty.
Kontynuuj wybór domyślny podczas eksportowania jako zbioru elementów i zapisz go w preferowanej lokalizacji.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje charakterystykę komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza z wykorzystaniem multipleksowej immunohistochemii. Przedstawia on postępy technologiczne, które umożliwiają wiarygodne badanie wielu markerów jednocześnie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Onkologia
- Histologia
Wstęp
- Identyfikacja typów i lokalizacji komórek odpornościowych w obrębie guzów jest kluczowa dla zrozumienia biologii nowotworów.
- Multipleksowa immunohistochemia umożliwia jednoczesną wizualizację wielu markerów odpornościowych.
- Wyzwania wciąż pozostają w zakresie automatycznej analizy złożonych obrazów.
- Różnice w krajobrazie immunologicznym między guzami pierwotnymi a przerzutami stawiają istotne pytania terapeutyczne.
Cel badania
- Zbadanie, w jaki sposób krajobrazy komórek odpornościowych są kształtowane przez terapie przeciwnowotworowe.
- Określenie, czy rozkład komórek odpornościowych może służyć do przewidywania wyników terapii.
- Udoskonalenie metod wizualizacji i analizy komórek odpornościowych w próbkach nowotworowych.
Zastosowane Metody
- Immunohistochemia na tkankach FFPE.
- Obrazowanie cyfrowe i demultipleksowanie spektralne adnotowanych obrazów.
- Przetwarzanie wsadowe preparatów w celu przeprowadzenia kompleksowej analizy.
- Tworzenie obszarów zainteresowania (ROI) do szczegółowego badania guza oraz marginesów naciekania.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja typów komórek odpornościowych w próbkach nowotworowych.
- Opracowanie metod analizy krajobrazu immunologicznego.
- Wnioski dotyczące wpływu różnych terapii na rozkład komórek odpornościowych.
- Opracowanie ustrukturyzowanego podejścia do analizy obrazów i eksportu danych.
Wnioski
- Multipleksowa immunohistochemia jest potężnym narzędziem do badania mikrośrodowiska nowotworowego.
- Zrozumienie dynamiki komórek odpornościowych może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
- Ciągłe udoskonalanie metod analizy jest niezbędne dla dokładnej interpretacji wyników.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Multipleksowa analiza immunohistochemiczna mikrośrodowiska guza umożliwia wysokorozdzielcze mapowanie populacji komórek odpornościowych, wspierając odkrywanie biomarkerów prognostycznych i predykcyjnych. Niniejszy schemat postępowania rozwija możliwości profilowania przestrzennego, dostarczając danych dla badań translacyjnych i decyzji portfelowych w obszarze immunoonkologii. Integracja zautomatyzowanego obrazowania i analizy opartej na uczeniu maszynowym zwiększa powtarzalność i skalowalność w ramach korporacyjnych rurociągów B+R.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia analizę rozmieszczenia i typów komórek odpornościowych w tkankach nowotworowych z rozdzielczością przestrzenną.
- Wspiera minimalizację ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie kontekstu immunologicznego istotnego dla hipotez terapeutycznych.
- Ułatwia identyfikację celów i szlaków związanych z odpornością w celu ich walidacji funkcjonalnej.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowaną, multipleksową analizę tkanek w celu rzetelnego opracowania testów.
- Dostarcza ilościowe i powtarzalne wskaźniki komórek odpornościowych dla późniejszych etapów procesów przesiewowych.
- Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy dla różnych typów nowotworów poprzez dostosowanie paneli markerów i parametrów analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki profilowania immunologicznego ze strategiami translacyjnymi w zakresie biomarkerów dla stratyfikacji pacjentów.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, umożliwiając porównawczą analizę krajobrazu immunologicznego.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o przestrzenny kontekst immunologiczny oraz przewidywaną odpowiedź na terapię.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten wielopleksowy schemat postępowania łączy wczesną fazę odkryć, opracowywanie testów oraz badania translacyjne, zapewniając ilościowe profilowanie immunologiczne z rozdzielczością przestrzenną z przekrojów guzów utrwalonych w FFPE.
- Biologia odkrywcza: usprawnia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez przestrzenne mapowanie komórek odpornościowych.
- Przesiewanie: dostarcza powtarzalnych, ilościowych danych dotyczących komórek odpornościowych w celu standaryzacji testów i przygotowania do badań przesiewowych.
- Analityka: integruje analizę obrazu opartą na uczeniu maszynowym w celu zapewnienia solidnej, wysokoprzepustowej ekstrakcji i porównywania danych.
- Badania translacyjne: umożliwiają dopasowanie biomarkerów i zapewniają ciągłość między fazami badań przedklinicznych i klinicznych.
- Zastosowania przedsiębiorstwa: możliwość adaptacji do różnych typów nowotworów i markerów odpornościowych, co wspiera szerokie zastosowania w ramach portfolio.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów związanych z układem odpornościowym oraz w odkrywaniu biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Automatyzuje i standaryzuje multipleksową analizę tkanek w celu uzyskania skalowalnych i powtarzalnych wyników.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go i redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach programów immuno-onkologicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację aktywów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie wglądów w przestrzenną charakterystykę układu odpornościowego.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu immunohistochemii, patologii cyfrowej oraz analizy obrazów opartej na uczeniu maszynowym.
- Wymaga dostępu do zautomatyzowanych platform barwienia, obrazowania wielospektralnego oraz infrastruktury obliczeniowej.
- Konieczna jest standaryzacja paneli markerów, protokołów obrazowania i potoków analizy danych pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych typów nowotworów i tkanek poprzez modyfikację doboru markerów i parametrów analizy.
- Przepustowość i skalowalność zależą od poziomu automatyzacji oraz integracji procesów przetwarzania wsadowego.
