Name: Łagodzenie nefropatii IgA za pośrednictwem dioscyny poprzez hamowanie aktywacji komórek B in vivo i zmniejszanie produkcji IgA1 z niedoborem galaktozy in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T14:40:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: Odkryj mechanizm działania dioscyny w leczeniu nefropatii IgA przy użyciu modeli mysich i komórek DAKIKI. Badanie pokazuje potencjał fitoterapii w hamowaniu aktywacji komórek B i redukcji patologicznej IgA1.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81973675).

Komisja bioetyki szpitala Guanganmen zatwierdziła ten eksperyment (numer zatwierdzenia etycznego eksperymentu na zwierzętach: IACUC-GAMH-2023-003).
1. Przygotowanie myszy do procedury eksperymentalnej
<ol>
	<li>Wyhoduj 22 samce myszy Balb/c klasy SPF (6-7 tygodni, masa ciała 20-25 g) w obiekcie dla zwierząt w szpitalu/centrum badawczym. Podziel zwierzęta na grupy kontrolne (n = 8) i modelowe (n = 14) przy użyciu metody tabeli liczb losowych.</li>
	<li>Po 1 tygodniu adaptacyjnego chowu w klatce laboratoryjnej karmić grupę modelową (grupę IgAN) 0,1% bydlęcym roztworem gamma globuliny (BGG) w zakwaszonej wodzie zawierającej 6 mmol/L HCl przez 9 tygodni zgodnie z protokołem modelowania Zou et al.18.</li>
	<li>Wstrzyknij 0,1 ml 0,1% roztworu BGG w soli fizjologicznej do żyły ogonowej przez 3 kolejne dni, kontynuując picie roztworu BGG, aby przygotować eksperymentalny model myszy IgAN18.</li>
	<li>Pozwól grupie kontrolnej swobodnie pić 6 mmol/l zakwaszonej wody HCl bez BGG przez 9 tygodni. Wstrzykiwać odpowiednią objętość soli fizjologicznej do żyły ogonowej przez kolejne 3 dni. 
	UWAGA: Grupy kontrolne i modelowe były karmione taką samą jakością jak normalna pasza.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu żyły ogonowej wybierz losowo 2 myszy w grupie kontrolnej i 2 myszy w grupie modelowej i zbadaj je za pomocą białkomoczu, mikroskopii świetlnej i immunofluorescencji, aby ustalić, czy modelowanie się powiodło. 
	UWAGA: Zwierzętom nie podaje się jedzenia, ale nie zabrania się im wody; Rejestruj wydalanie moczu.</li>
	<li>Zbierać mocz przez 24 godziny w klatkach metabolicznych i odwirowywać go przy 400 x g przez 5 minut; usunąć osad moczu. Po 10-krotnym rozcieńczeniu supernatantu zmierzyć stężenie białkomoczu za pomocą zestawu do oznaczania białka moczu, a następnie pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia i objętość moczu, aby uzyskać 24 godziny całkowitego białka w moczu. 
	UWAGA: Metody mikroskopowe i immunofluorescencyjne przedstawiono odpowiednio w sekcjach 3 i 4.</li>
	<li>Po pomyślnym przygotowaniu modelu podziel 12 myszy w grupie modelowej na 6 myszy, każda w grupie modelowej (grupa IgAN) i grupie zgłębników DIO (grupa DIO), zgodnie z metodą tabeli liczb losowych.</li>
	<li>Niech grupa kontrolna nadal pije 6 mmol/l zakwaszonej HCl wody bez BGG, a grupa modelowa 0,1% roztwór BGG złożony z zakwaszonej wody zawierającej 6 mmol/L HCl. Oblicz dawkę podawania przez zgłębnik grupy DIO zgodnie ze wzorem konwersji dawki farmakologicznej metodologii eksperymentalnej (przeliczoną według masy ciała ludzkiego 70 kg)19. Zgłębnik DIO tabletki 0,06 g/kg raz dziennie przez 8 tygodni.</li>
	<li>Po 8 tygodniach zgłębnika znieczulić myszy dootrzewnowo 0,4% pentobarbitalem sodu (60 mg/kg), a po potwierdzeniu prawidłowego znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi, wyizolować nerki i plaster Peyera do późniejszych mikroskopii świetlnej i analiz immunohistochemicznych. 
	UWAGA: Schemat dla modelu in vivo znajduje się w Uzupełnieniu <silna klasa="xfig">Rysunek 1.</li>
</ol>
2. Analiza histologiczna
<ol>
	<li>Wycinki parafinowe na nerki i plaster Peyera
	<ol>
		<li>Utrwal tkanki nerkowe o grubości 3 mm lub 1 plaster Peyera z 4% paraformaldehydem przez 24 godziny, odwodnić gradientowym etanolem i ksylenem. Zanurz w wosku na 2 godziny, zamknij i zamroź.</li>
		<li>Wytnij odcinki nerki o grubości 2 μm i plastry Peyera o grubości 4 μm i rozprowadź je w ciepłej wodzie. Rozłożone plastry nabierać za pomocą czystego szkiełka i piec je w piekarniku o stałej temperaturze 40 °C przez 1 godzinę. Barwienie należy rozpocząć po wstępnej obróbce próbki. 
		UWAGA: Weź powierzchnię czołową części wnękowej nerki o grubości bloku tkankowego 3 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwoskować i wybarwić skrawki parafiny w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut roztworem kwasu okresowego, unikając światła. Spłucz wodą destylowaną i wytrzyj na sucho poplamiony roztworem barwiącym Schiffa przez 20-30 minut, unikając światła. Spłucz wodą destylowaną, aż skrawki staną się czerwone pod mikroskopem.</li>
	<li>Skrawki umieścić w roztworze barwiącym hematoksylinę, wybarwić jądra przez 3 minuty (jądra zabarwione zbyt głęboko mogą być podzielone chlorowodorkiem etanolu) i spłukać bieżącą wodą, aż szkiełka staną się bezbarwne.</li>
	<li>Wykonaj rutynowe odwodnienie za pomocą gradientowych stężeń etanolu i ksylenu, uszczelnij skrawki neutralną gumą i obserwuj pod mikroskopem. PAS-dodatni jest czerwony, a jądro jest niebieskie.</li>
</ol>
3. Analiza immunohistochemiczna łaty Peyera
<ol>
	<li>Przygotuj skrawki parafiny plastra Peyera zgodnie z opisem w kroku 2.1. 
	UWAGA: Grubość przekrojów do immunohistochemicznej i późniejszej immunofluorescencji wynosi 4 μm.</li>
	<li>Odparafinować sekcje parafinowe:
	<ol>
		<li>Umieść skrawki w ksylenie I na 5 min, ksylenie II na 5 min i ksylenie III na 5 min.</li>
		<li>Następnie płukać szkiełka w bezwodnym etanolu I przez 5 minut, bezwodnym etanolu II przez 5 minut, 85% alkoholu przez 5 minut, 75% alkoholu przez 5 minut. Następnie opłucz szkiełka w wodzie destylowanej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie antygenu
	<ol>
		<li>Przygotować 50x roztwór podstawowy cytrynianu sodu i rozcieńczyć wodą destylowaną do 1x do użycia. Podgrzej go w autoklawie przez 2 minuty, a następnie umieść plastry w autoklawie, upewniając się, że poziom płynu przekracza poziom plastrów.</li>
		<li>Podgrzewaj w wysokiej temperaturze przez 5 minut, a następnie pozwól szkiełkom naturalnie ostygnąć. Umyj plastry trzy razy roztworem PBS przez 5 minut każda.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blokowanie endogennej peroksydazy: Zaznacz granice tkanki w okręgu za pomocą pisaka immunohistochemicznego. Inkubować skrawki w 3% roztworze nadtlenku wodoru przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem, i przemywać skrawki trzykrotnie roztworem PBS przez 5 minut za każdym razem.</li>
	<li>Blokowanie surowicy: Zablokuj skrawki, upuszczając 10% koziej surowicy na skrawki tkanek oznaczone na 30 minut w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że skrawki są równomiernie pokryte plamą.</li>
	<li>Inkubacja przeciwciał pierwotnych: Delikatnie strząśnij roztwór blokujący i dodaj część przygotowanego przeciwciała pierwszorzędowego (CD20 [1:800]; CXCR5 [1:800]) do sekcji. Umieścić sekcję płasko w wilgotnym pudełku i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Dodaj niewielką ilość wody do mokrego pudełka, aby zapobiec parowaniu przeciwciała.</li>
	<li>Wtórna inkubacja przeciwciał: Za każdym razem przemywać skrawki trzykrotnie roztworem PBS przez 5 minut. Usunąć PBS przez wytrząśnięcie skrawków do sucha, przykryć tkankę kroplą przeciwciała drugorzędowego (znakowanie HRP) pokrewnych gatunków przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować w temperaturze RT przez 50 minut.</li>
	<li>Homogenizacja 3,3'-diaminobenzydyny (DAB): Przemyć skrawki roztworem PBS trzykrotnie przez 5 minut każda. Po wytrząśnięciu sekcji do sucha upuść na nie świeżo przygotowany roztwór chromogeniczny DAB. Obserwuj czas rozwoju koloru pod mikroskopem; Pozytyw jest brązowo-żółty. Spłucz wodą z kranu, aby zakończyć rozwój koloru.</li>
	<li>Barwienie jąder: Ponownie zabarwić hematoksyliną przez około 1 minutę, umyć wodą z kranu, a następnie spłukać przez 10 minut wodą z kranu, aby powrócić do koloru niebieskiego.</li>
	<li>Odwodnienie i uszczelnienie:
	<ol>
		<li>Umieść sekcje w 75% alkoholu na 5 minut i 85% alkoholu na 5 minut. Umieść sekcje w bezwodnym etanolu I na 5 minut, bezwodnym etanolu II na 5 minut i bezwodnym etanolu III na 5 minut.</li>
		<li>Umyj skrawki w ksylenie I przez 5 minut, wyjmij je do lekkiego wyschnięcia i uszczelnij skrawki neutralną gumą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja obrazu: Zbieraj obrazy za pomocą badania mikroskopowego i analizuj je za pomocą oprogramowania halo w celu analizy obrazu panoramicznego tkanki. 
	UWAGA: Jądra barwione hematoksyliną są niebieskie, a dodatnia ekspresja DAB jest obserwowana jako brązowo-żółta.</li>
</ol>
4. Immunofluorescencja nerkowej IgA
<ol>
	<li>Przygotować skrawki parafinowe dla nerek zgodnie z opisem w kroku 2.1.</li>
	<li>Odwoskuj sekcje parafinowe:
	<ol>
		<li>Umieść skrawki w ksylenie I na 5 minut, ksylenie II na 5 minut i ksylenie III na 5 minut. Potraktuj skrawki bezwodnym etanolem I, bezwodnym etanolem II, 95% etanolem, 90% etanolem, 80% etanolem, 70% etanolem i 50% etanolem, każdy przez 5 minut i przemyj wodą destylowaną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie proteinazy K: Wstrząśnij skrawkami do sucha i narysuj okrąg wokół odcinka tkanki za pomocą pisaka histochemicznego. Roztwór roboczy proteinazy K (roztwór podstawowy i PBS w stosunku 1:9) dodawać kroplami, aby pokryć tkankę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Umyj sekcje trzy razy PBS przez 5 minut każda.</li>
	<li>Przenikanie przez błonę komórkową: Lekko wytrząśnij skrawki do sucha, a następnie przykryj je 0,1% Tritonem. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej i przemywać sekcje trzykrotnie PBS przez 5 minut każda.</li>
	<li>Blokowanie: Dodaj kroplami 10% surowicy koziej, aby równomiernie pokryć tkankę w celu zablokowania w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Inkubacja przeciwciał pierwotnych: Dodać kroplami odpowiednią ilość koziego przeciwciała IgA przeciwko mysim koniugatowi AF488 (1:500), aby równomiernie pokryć tkankę i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Barwienie jąder: Umyj plastry trzykrotnie PBS przez 5 minut każdy. Po usunięciu PBS dodać kroplami barwnik 4′,6-diamidyn-2-fenyloindolowy (DAPI) na skrawki i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Umyj i uszczelnij sekcje: Umyj sekcje trzykrotnie PBS przez 5 minut, a następnie uszczelnij je środkiem montażowym zapobiegającym blaknięciu.</li>
	<li>Mikroskopia i fotografia: Obserwuj skrawki pod mikroskopem fluorescencyjnym i rób zdjęcia. 
	UWAGA: W przypadku DAPI wzbudzenie ultrafioletowe ma długość fali 330-380 nm, a długość fali emisji wynosi 420 nm, światło niebieskie. Długość fali wzbudzenia izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) wynosi 465-495 nm, a długość fali emisji wynosi 515-555 nm, światło zielone.</li>
</ol>
5. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Uzyskaj ludzką linię limfocytów B DAKIKI z ATCC, USA. Hodowla komórek DAKIKI w pożywce RPMI-1640 uzupełniona 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny.</li>
	<li>Hodować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i podkulturować je co 2-3 dni. Używaj komórek w logarytmicznej fazie wzrostu we wszystkich eksperymentach.</li>
	<li>Przy zbiegu 70%-80% zebrać komórki sterylną pipetą i odwirować komórki przy 140 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić pożywką bez surowicy, a po 24 godzinach pozostawić wszystkie komórki w okresie spoczynku do późniejszej obróbki.</li>
</ol>
6. Testy cytotoksyczności LDH do badania bezpiecznych stężeń DIO na normalnych komórkach DAKIKI
<ol>
	<li>Umieść komórki DAKIKI w 96-dołkowych płytkach o gęstości 4x105 komórek / dołek i ustaw niską grupę kontrolną, wysoką grupę kontrolną i różne stężenia DIO (0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0 μg / ml). Inkubować w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez 24 godziny po odpowiednim poddaniu działaniu substancji zgodnie z metodą grupowania.</li>
	<li>Zgodnie z instrukcją zestawu do wykrywania cytotoksyczności, dodać 5 μl lizatu na studzienkę w grupie kontrolnej o wysokim poziomie kontroli, a następnie umieścić płytkę w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C na 15 minut.</li>
	<li>Wyjąć płytkę, dodać 100 μl mieszaniny reakcyjnej do każdego dołka, inkubować w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodać 50 μl roztworu zatrzymującego reakcję. Zmierz wartość OD przy 490 nm na czytniku mikropłytek tak szybko, jak to możliwe.</li>
	<li>Obliczyć szybkość uwalniania LDH o różnych stężeniach DIO i ≤10% jako maksymalną dawkę podawaną według wzoru: szybkość uwalniania LDH = (studnia doświadczalna LDH - LDH o niskiej kontroli) / (LDH o niskiej kontroli LDH) x 100%.</li>
</ol>
7. Test CCK-8 do wykrywania wpływu DIO na proliferację komórek DAKIKI
<ol>
	<li>Opierając się na wynikach naszych poprzednich eksperymentów20, ustal model IgAN przy użyciu LPS 40 μg/mL do indukcji komórek DAKIKI.</li>
	<li>Następnie wysiewaj 4x105 komórek/studzienka na 96-dołkowych płytkach i podziel na grupy kontrolne, modelowe i DIO o niskim, średnim i wysokim stężeniu (0,25 μg/ml, 0,5 μg/ml i 1,0 μg/ml). Inkubować płytki w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Następnie dodać 20 μl odczynnika CCK-8 do każdej studzienki i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze (5% CO2, 37 °C) na 2 godziny. Po inkubacji należy jak najszybciej wykryć OD o długości fali 450 nm na czytniku mikropłytek.</li>
</ol>
8. ELISA do wykrywania wpływu DIO na wydzielanie IgA i Gd-IgA1 przez komórki DAKIKI
<ol>
	<li>Wysiewać komórki DAKIKI na płytkach 6-dołkowych o gęstości 6x106 komórek/dołek, a następnie pogrupować i traktować komórki zgodnie z krokiem 7.2. Hodować komórki przez 24 godziny, a następnie odwirowywać przy 850 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania supernatantu.</li>
	<li>Wykryj stężenia IgA i Gd-IgA1 zgodnie z instrukcją zestawu.</li>
</ol>
9.qRT-PCR do wykrywania wpływu DIO na poziomy mRNA C1GALT1 i Cosmc w komórkach DAKIKI
<ol>
	<li>Wysiewać komórki DAKIKI o gęstości 6x106 komórek/dołek na 6-dołkowej płytce, grupować i traktować komórki jako CCK8 wymienione w kroku 7.2 i inkubować przez 24 godziny. Ekstrahować całkowite RNA z komórek DAKIKI zgodnie z instrukcjami zestawu do ekstrakcji całkowitego RNA.</li>
	<li>Po pobraniu 1 μl wyekstrahowanego RNA z każdej grupy próbek i zmierzeniu jego stężenia, należy odwrotnie przepisać 1 μg całkowitego RNA z każdej próbki na cDNA zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu.</li>
	<li>Następnie wykonaj amplifikację RT-PCR, aby wykryć ekspresję każdego genu (95 °C przez 15 min, 95 °C przez 10 s i 60 °C przez 30 s). Obliczyć poziom ekspresji każdego genu przy użyciu metody 2-ΔΔCT z β-aktyną jako wewnętrznym odniesieniem. 
	UWAGA: Sekwencje starterów były następujące: 
	C1GALT1: 5'-AAGGTTGACACCCAGCCTAA-3', 5'-CTTTGACGTGTTTGGCCTTT-3'; 
	Cosmc: 5'-GCTCCTTTTTGAAGGGTGTG-3', 5'-TACTGCAGCCCAAAGACTCA-3'; 
	β-aktyna: 5'-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3', 5'-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3'.</li>
</ol>
10. Western blot do badania wpływu DIO na ekspresję białek C1GALT1 i Cosmc w komórkach DAKIKI
<ol>
	<li>Wysiewaj komórki DAKIKI o gęstości 6x106 komórek/basenik na płytce 6-dołkowej. Pogrupuj je i potraktuj tak, jak wspomniano w kroku 7.2. Po 24 godzinach inkubacji zebrać każdą grupę komórek.</li>
	<li>Dodać odpowiednią ilość roztworu do lizy komórek (PMSF: inhibitor fosfatazy: roztwór do lizy RIPA = 1:1:100) i inkubować na lodzie przez 30 minut. Następnie odwirować przy 13 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant.</li>
	<li>Określ stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania stężenia białka BCA.</li>
	<li>Wymieszać próbki białek z 5-krotnym buforem ładującym SDS-PAGE w stosunku 4:1 przez wirowanie i podgrzewać zmieszane próbki w temperaturze 100 °C przez 5 minut, aby zdenaturować białko.</li>
	<li>Aby wykryć białka o różnej masie cząsteczkowej, dodaj marker białkowy (5 μl / dołek) i próbki (20 μg / dołek) do różnych torów 12% żelu SDS-PAGE, uruchom elektroforezę SDS-PAGE i przenieś żel do membran PVDF.</li>
	<li>Zablokuj błony 5% mlekiem beztłuszczowym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i inkubuj z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi (C1GALT1 [1:1000], Cosmc [1:2000]) przez 24 godziny. Użyj przeciwciała β-aktyny (1:100000) jako kontroli wewnętrznej.</li>
	<li>Przemyć membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) 1x solą fizjologiczną buforowaną trisem, 0,1% detergentem Tween 20 (TBST) trzy razy (10 minut / czas), a następnie inkubować z odpowiednim wtórnym kozim przeciwciałem anty-króliczym IgG (1: 10000) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
	<li>Ponownie umyj membranę TBST (trzy razy po 10 minut) i potraktuj ją odpowiednią ilością roztworu roboczego o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) (zgodnie z instrukcjami producenta) w celu wykrycia prążków białkowych.</li>
	<li>Uchwyć obrazy za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego i wykonaj półilościową analizę wartości szarości białek za pomocą systemu analizy obrazu Image J.</li>
</ol>
11. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Użyj odpowiedniej aplikacji do analizy danych. Wyraź wszystkie dane jako średnie ± SD (odchylenie standardowe) i oceń wiele próbek za pomocą jednoczynnikowego testu ANOVA w celu porównania między grupami. 
	UWAGA: Do analizy statystycznej wykorzystano oprogramowanie statystyczne SPSS w wersji 26.0. Metoda LSD została użyta do dwukierunkowych porównań między grupami, gdy wariancje były równe, a metoda Dunnetta T3 została użyta do dwukierunkowych porównań między grupami, gdy wariancje nie były równe. Uznano, że P<0,05 wskazuje na statystycznie istotną różnicę.</li>
</ol>

Treating Immunoglobulin A Nephropathy (IgAN) with Dioscin in a Murine Model

<ol><li>Knoppova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+activities+of+IgA1-containing+immune+complexes+in+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The origin and activities of IgA1-containing immune complexes in IgA nephropathy.</a> Frontiers in Immunology. 7, 117(2016).</li>
<li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology+of+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology of IgA nephropathy.</a> Journal of The American Society of Nephrology. 22 (10), 1795-1803 (2011).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+double-stranded+RNA+poly%28I%3AC%29+aggravates+IgA+nephropathy+by+triggering+IgA+class+switching+recombination+through+the+TLR3-BAFF+axis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Synthetic double-stranded RNA poly(I:C) aggravates IgA nephropathy by triggering IgA class switching recombination through the TLR3-BAFF axis.</a> American Journal of Nephrology. 42 (3), 185-197 (2015).</li>
<li>Zhao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+level+of+galactose-deficient+IgA1+in+the+sera+of+patients+with+IgA+nephropathy+is+associated+with+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The level of galactose-deficient IgA1 in the sera of patients with IgA nephropathy is associated with disease progression.</a> Kidney International. 82 (7), 790-796 (2012).</li>
<li>Xing, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1GALT1+expression+is+associated+with+galactosylation+of+IgA1+in+peripheral+B+lymphocyte+in+immunoglobulin+a+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Nephrology%22%5BJournal%5D)">C1GALT1 expression is associated with galactosylation of IgA1 in peripheral B lymphocyte in immunoglobulin a nephropathy.</a> BMC Nephrology. 21 (1), 18(2020).</li>
<li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+suppression+causes+the+low+expression+of+the+Cosmc+gene+in+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology+Dialysis+Transplantation%22%5BJournal%5D)">External suppression causes the low expression of the Cosmc gene in IgA nephropathy.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 23 (5), 1608-1614 (2008).</li>
<li>Sakai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactobacillus+gasseri+SBT2055+induces+TGF-%CE%B2+expression+in+dendritic+cells+and+activates+TLR2+signal+to+produce+IgA+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lactobacillus gasseri SBT2055 induces TGF-β expression in dendritic cells and activates TLR2 signal to produce IgA in the small intestine.</a> PLoS One. 9 (8), 105370(2014).</li>
<li>Gutzeit, C., Magri, G., Cerutti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+IgA+production+and+its+role+in+host-microbe+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Intestinal IgA production and its role in host-microbe interaction.</a> Immunological Reviews. 260 (1), 76-85 (2014).</li>
<li>Serino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+a+retrospective+international+study%2C+circulating+miR-148b+and+let-7b+were+found+to+be+serum+markers+for+detecting+primary+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy.</a> Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).</li>
<li>Lu, F., et al. Therapeutic effect of Rhizoma Dioscoreae Nipponicae on gouty arthritis based on the SDF-1/CXCR 4 and p38 MAPK pathway: an in vivo and in vitro study. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLu%2C+F+%22Phytotherapy+research%3A+PTR%22">Phytotherapy research: PTR</a>. 28 (2), 280-288 (2014).</li>
<li>Wang, W., Xu, L., Zhou, L., Wan, S., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Network+pharmacology+approach+to+reveal+the+underlying+mechanisms+of+Rhizoma+Dioscoreae+Nipponicae+in+the+treatment+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Evidence-Based+Complementary+and+Alternative+Medicine%3A+eCAM%22%5BJournal%5D)">A Network pharmacology approach to reveal the underlying mechanisms of Rhizoma Dioscoreae Nipponicae in the treatment of asthma.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2022, 4749613(2022).</li>
<li>Tian, W. W., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Professor+TONG+Xiaolin+used+the+experience+of+Dioscoreae+Nipponicae%5BTitle%5D)+AND+%22Jilin+Journal+of+Chinese+Medicine%22%5BJournal%5D)">Professor TONG Xiaolin used the experience of Dioscoreae Nipponicae.</a> Jilin Journal of Chinese Medicine. 40 (05), 589-592 (2020).</li>
<li>Rao, X. R., Bai, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Das+Xiwen%27s+experience+in+treating+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Beijing+Journal+of+Traditional+Chinese+Medicine%22%5BJournal%5D)">Das Xiwen's experience in treating IgA nephropathy.</a> Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine. 9, 691-693 (2008).</li>
<li>Si, Y., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+data+mining+study+on+the+pattern+of+medication+use+in+the+treatment+of+IgA+nephropathy+by+Professor+Zhang+Yu%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chinese+Physician%22%5BJournal%5D)">A data mining study on the pattern of medication use in the treatment of IgA nephropathy by Professor Zhang Yu.</a> Journal of Chinese Physician. 20 (01), 109-111 (2018).</li>
<li>Jiang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+enzymatic+extraction+technology+of+Diosgenin+from+Dioscorea+nipponica%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Traditional+Patent+Medicine%22%5BJournal%5D)">Optimization of the enzymatic extraction technology of Diosgenin from Dioscorea nipponica.</a> Chinese Traditional Patent Medicine. 39 (03), 621-624 (2017).</li>
<li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dioscin+alleviates+lipopolysaccharide-induced+inflammatory+kidney+injury+via+the+microRNA+let-7i%2FTLR4%2FMyD88+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Dioscin alleviates lipopolysaccharide-induced inflammatory kidney injury via the microRNA let-7i/TLR4/MyD88 signaling pathway.</a> Pharmacological Research. 111, 509-522 (2016).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+pharmacological+activities+of+Dioscin%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the pharmacological activities of Dioscin.</a> BioMed Research International. 2019, 5763602(2019).</li>
<li>Nal Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4+signaling+pathway+in+the+protective+effect+of+Pioglitazone+on+experimental+immunoglobulin+A+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4 signaling pathway in the protective effect of Pioglitazone on experimental immunoglobulin A nephropathy.</a> Chinese Medical Journal. 130 (8), 906-913 (2017).</li>
<li>Xu, S. Y., Bian, R. L., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+experiments+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Pharmacological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Pharmacological experiments methodology.</a> Chinese Pharmacological Bulletin. 1, 19(1992).</li>
<li>Shen, J. C., Ren, Y., Rao, X. R., You, Y., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+pharmacology%2C+molecular+docking%2C+and+in+vitro+experiments+to+explore+the+molecular+mechanism+of+Dioscorea+Nipponica+Makion+in+the+treatment+of+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Integrated+Traditional+and+Western+Medicine%22%5BJournal%5D)">Network pharmacology, molecular docking, and in vitro experiments to explore the molecular mechanism of Dioscorea Nipponica Makion in the treatment of IgA nephropathy.</a> World Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 16 (12), 2246-2254 (2021).</li>
<li>Mestecky, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgA+nephropathy%3A+molecular+mechanisms+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">IgA nephropathy: molecular mechanisms of the disease.</a> Annual Review of Pathology. 8, 217-240 (2013).</li>
<li>Novak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgA1-containing+immune+complexes+in+IgA+nephropathy+differentially+affect+proliferation+of+mesangial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">IgA1-containing immune complexes in IgA nephropathy differentially affect proliferation of mesangial cells.</a> Kidney International. 67 (2), 504-513 (2005).</li>
<li>Nihei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+IgA+autoantibodies+targeting+mesangial+cells+redefines+the+pathogenesis+of+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Identification of IgA autoantibodies targeting mesangial cells redefines the pathogenesis of IgA nephropathy.</a> Science Advances. 9 (12), (2023).</li>
<li>Raska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+CMP-NeuAc%3A+GalNAc-IgA1+alpha2%2C6-sialyltransferase+in+IgA1-producing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of CMP-NeuAc: GalNAc-IgA1 alpha2,6-sialyltransferase in IgA1-producing cells.</a> Journal of Molecular Biology. 369 (1), 69-78 (2007).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Charakterystyczną cechą patologiczną IgAN jest odkładanie się kompleksów immunologicznych zawierających IgA1 i GD-IgA1 w obszarze mezangialnym kłębuszka nerkowego21,22. Ograniczenie tworzenia kompleksów immunologicznych może zmniejszyć uszkodzenie nerek i złagodzić objawy kliniczne IgAN. W eksperymencie in vivo zbadaliśmy terapeutyczne działanie DIO na IgAN i stwierdziliśmy, że DIO może zmniejszać odkładanie się IgA w nerkach myszy modelowych IgAN. Wykazano, że nagromadzenie komórek wydzielających IgA w nerkach jest związane z patogenezą IgAN23. Jako ważne miejsce proliferacji i aktywacji limfocytów B, plaster Peyera jest ważnym źródłem komórek wydzielających IgA, dlatego zbadaliśmy ekspresję markerów limfocytów B (CD20, CXCR5) w plastrze Peyera i stwierdziliśmy, że DIO może hamować ekspresję limfocytów B w modelu myszy IgAN z plastrem Peyera. Te wyniki eksperymentalne mogą stanowić podstawę do zastosowania DIO w leczeniu IgAN.
Przeprowadziliśmy następujące eksperymenty In vitro w celu dalszego zbadania mechanizmu działania DIO na IgAN. Po pierwsze, wykazano wcześniej, że DAKIKI, unieśmiertelniona przez EBV linia komórek B, która wydziela IgA1, której częścią jest GD-IgA124, jest idealna do badań in vitro nad mechanizmem działania leku na IgAN. Wybraliśmy komórki DAKIKI do zbadania molekularnego mechanizmu DIO w leczeniu IgAN. Ponadto zapalna odpowiedź immunologiczna błony śluzowej odgrywa integralną rolę w patogenezie IgAN. Jak wspomniano powyżej, używamy LPS do stymulacji komórek DAKIKI, które mogą uwalniać czynniki prozapalne i pośredniczyć w odpowiedziach zapalnych, co może lepiej naśladować mechanizm odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej w IgAN. Model komórkowy in vitro może pomóc w zbadaniu możliwości i mechanizmu działania innych leków w leczeniu IgAN. Wyniki wykazały, że DIO hamował proliferację komórek DAKIKI stymulowanych przez LPS w sposób zależny od stężenia. DIO może hamować wydzielanie IgA i Gd-IgA1 w komórkach DAKIKI spowodowane stymulacją LPS i zwiększać ekspresję mRNA i białka C1GalT1 i jego chaperonu Cosmc w komórkach DAKIKI, co sugeruje, że DIO może zmniejszać wydzielanie Gd-IgA1 poprzez regulację w górę ekspresji C1GALT1/Cosmc, a tym samym hamować nadmierną aktywację komórek DAKIKI. 
Podczas procedur doświadczalnych należy zwrócić uwagę na kluczowe etapy. Stężenie Gd-IgA1 w supernatancie ogniwa DAKIKI nie mieści się w zakresie wykrywania zestawu ELISA (1,56 ~ 100 ng / ml), a zebrany supernatant należy odwirować za pomocą rurki ultrafiltracyjnej w celu uzyskania stężonego Gd-IgA1. Upewnij się również, że objętość supernatantu rozpoczynająca się od każdej grupy jest taka sama, a końcowa objętość koncentratu otrzymanego po ultrafiltracji jest taka sama.
W tym badaniu zastosowaliśmy jednocześnie metody in vitro i in vivo , które mogą wzajemnie wspierać się w efektach farmakologicznych i stanowić przykład do badania efektów i mechanizmów ich działania ziołolecznictwa. Niektóre rzeczy można poprawić w tym protokole. Po pierwsze, nie wykryliśmy stężeń we krwi w grupie zgłębników DIO myszy; w związku z tym stężenie DIO równoważne stężeniom we krwi nie jest stosowane w doświadczeniach in vitro . Po drugie, zbadano tylko monomer DIO, aktywny składnik DNR; wpływ innych składników DNR na IgAN nadal wymaga dalszych badań.
Podsumowując, badanie to stanowi eksperymentalną podstawę do leczenia IgAN DIO, aktywnym składnikiem DNR. W badaniu tym ustanowiono komórkowy patologiczny model IgAN, naśladując odpowiedź immunologiczną błony śluzowej IgAN zarówno in vitro , jak i in vivo. Daje to nowy pomysł na studiowanie tradycyjnej medycyny chińskiej w celu zapobiegania i leczenia IgAN.

Nefropatia IgA (IgAN) jest najczęstszym typem pierwotnego kłębuszkowego zapalenia nerek, dla którego nie ma specyficznego leczenia, i pozostaje istotną przyczyną schyłkowej niewydolności nerek1. Chociaż patogeneza IgAN nadal nie jest w pełni poznana, "hipoteza wielu trafień" jest ogólnie akceptowana i wspierana przez dużą liczbę dowodów klinicznych i eksperymentalnych badań2. Patogeneza IgAN polega na aktywacji limfocytów B i wytwarzaniu IgA1 z niedoborem galaktozy (Gd-IgA1)3. Wzrost krążących Gd-IgA1 spowodowany nadmierną proliferacją i aktywacją komórek wydzielających IgA podczas odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej jest krytycznym ogniwem w patogenezie IgAN4,5,6. Jako centralne miejsce proliferacji i aktywacji konwersji fenotypu limfocytów B do komórek wydzielających IgA, łatka Peyera jest głównym źródłem wydzielania IgA, ściśle związanym z występowaniem i rozwojem IgAN7,8. Ponadto proliferacja komórek wydzielających IgA1, a także ekspresja rdzenia 1β-1,3-galaktozylotransferazy (C1GalT1) i molekularnego białka opiekuńczego specyficznego dla C1GalT1 (Cosmc), były związane z nieprawidłową glikozylacją IgA1, która powoduje produkcję GD-IgA1 u pacjentów z IgAN6,9.
Badanie kliniczne nad leczeniem IgAN za pomocą ziołolecznictwa posunęło się naprzód w ostatnich latach. Formuła Yiqi Qingjie jest niezbędną formułą do leczenia IgAN przez Oddział Nefrologii Szpitala Guang'anmen. Poprzednie badanie naszej grupy wykazało, że Gd-IgA1 zmniejszył się w surowicy pacjentów z IgAN po leczeniu formułą Yiqi Qingjie. Jako jedno z najczęściej używanych ziół w formule Yiqi Qingjie, Dioscoreae Nipponicae Rhizoma (DNR) jest suszonym kłączem Dioscorea Nipponica Makino, które pełni różne funkcje, takie jak regulacja odporności, tłumienie stanów zapalnych, łagodzenie kaszlu i astmy10,11. Kilku uczonych leczyło IgAN za pomocą DNR i osiągnęło dobre wyniki12,13,14. Jako główny składnik aktywny DNR15, Dioscyna (DIO) obniża poziom kwasu moczowego, hamuje zwłóknienie, hamuje reakcję zapalną i stres antyoksydacyjny16,17. Dlatego DIO może mieć nowy mechanizm działania hamujący wydzielanie komórkowe nadmiernej ilości Gd-IgA1 i wywierający specyficzne działanie ochronne na nerki. Nadal jednak nie opisano żadnych badań dotyczących mechanizmu działania DIO w leczeniu IgAN.
Aby zbadać potencjalny mechanizm terapeutyczny DIO na IgAN i dostarczyć nową metodę leczenia IgAN, przeprowadziliśmy eksperymenty dotyczące terapeutycznego wpływu DIO na IgAN in vivo i in vitro.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało anty-CD20 / MS4A1</td><td>Boster Biotechnology Company</td><td>A03780-3</td><td></td></tr><tr><td>Medium do montażu zapobiegającego blaknięciu</td><td>Beyotime, Szanghaj, Chiny</td><td>P0128S</td><td></td></tr><tr><td>Myszy Balb / c</td><td>Pekin Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica blokująca</td> 110322220101424000 <td>Solarbio, Pekin, Chiny</td><td>SL038</td><td></td></tr><tr><td>Bydlęca gamma globulina</td><td>ShangHai YuanYe Biotechnology Company</td><td>S12031</td><td></td></tr><tr><td>C1GALT1 przeciwciało poliklonalne</td><td>Proteintech Group, Inc, USA</td><td>27569-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do odzyskiwania antygenu cytrynianowego (50 i razy)</td><td>Phygene Biotechnology Company</td><td>PH0422</td><td></td></tr><tr><td>COSMC przeciwciało poliklonalne</td><td>Proteintech Group, Inc, USA</td><td>19254-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania cytotoksyczności</td><td>Firma Roche 4744926001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System wykrywania Dako REAL EnVision, Peroksydaza/DAB+</td><td>Dako</td><td>K5007</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dioscyna</td><td>Narodowy Instytut Kontroli Żywności i Leków</td><td>111707-201703</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki DIO</td><td>Chengdu No 1 Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td></td><td></td>H51023866</tr><tr><td>Rozwiązanie robocze ECL</td><td>Merck Biotechnology, Inc</td><td>WBKLS0100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ulepszony zestaw do liczenia komórek-8</td><td>Beyotime, Szanghaj, Chiny</td><td>C0043</td><td></td></tr><tr><td>Jednoetapowe usuwanie jednoetapowego usuwania premiksu syntezy pierwszej nici genu cDNA</td><td>TIANGEN, Pekin, Chiny</td><td>KR118-02</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw barwników glikogenu i kwasu okresowego Schiffa (PAS)&nbsp;</td><td>Firma biotechnologiczna BaSO</td><td>BA4080A</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-mysia IgA-AF488</td><td>SouthernBiotech</td><td>1040-30</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L), HRP sprzężone</td><td>BeiJing Bioss Biotechnology Company</td><td>BS-0295G-HRP</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki zestaw ELISA Gd-IgA1</td><td>IBL</td><td>27600</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki zestaw ELISA</td><td>IgA MultiSciences (LiankeBio)</td><td>70-EK174-96</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór PMSF</td><td>Beyotime, Szanghaj, Chiny</td><td>Proteinaza ST507</td><td></td></tr><tr><td>K&nbsp;</td><td>Phygene Biotechnology Company</td><td>PH1521</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało poliklonalne anty-CXCR5&nbsp;</td><td>BeiJing Bioss Biotechnology Company</td><td>bs-23570R</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy RIPA</td><td>Beyotime, Szanghaj, Chiny</td><td>P0013B</td><td></td></tr><tr><td>Prosty zestaw do ekstrakcji RNAsimple TIANGEN</td><td>, Pekin, Chiny</td><td>DP419</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Solarbio, Pekin, Chiny</td><td>31800</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Super-Bradford</td><td>CWBIO, Pekin, Chiny</td><td>CW0013</td><td></td></tr><tr><td>Tryton&nbsp; X-100</td><td>Beyotime, Szanghaj, Chiny</td><td>ST795</td><td></td></tr><tr><td>&-Aktyna mAb królika</td><td>Abclonal, Wuhan, Chiny</td><td>AC026</td><td></td></tr></tbody></table>

Łagodzenie nefropatii iga za pośrednictwem dioscyny poprzez hamowanie aktywacji komórek b in vivo i zmniejszanie produkcji iga1 z niedoborem galaktozy in vitro

Dioscin Mediated IgA Nephropathy Alleviation by Inhibiting B Cell Activation In Vivo and Decreasing Galactose-Deficient IgA1 Production In Vitro

Wzrost krążącej IgA1 z niedoborem galaktozy (Gd-IgA1) jest spowodowany nadmierną aktywacją IgA-dodatnich komórek wydzielniczych w procesie odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej, co jest krytycznym ogniwem w patogenezie nefropatii IgA (IgAN). Plaster Peyera, widoczne miejsce, w którym limfocyty B są przekształcane w komórki plazmatyczne wydzielające IgA, jest głównym źródłem IgA. Ponadto niższa ekspresja rdzeniowej 1β-1,3-galaktozylotransferazy (C1GalT1) i jej molekularnego białka opiekuńczego, molekularnego chaperonu specyficznego dla C1GalT1 (Cosmc), jest związana z nieprawidłową glikozylacją IgA1 u pacjentów z IgAN. Nasze doświadczenie kliniczne pokazuje, że ziołolecznictwo Dioscoreae Nipponicae Rhizoma (DNR) może łagodzić białkomocz i krwiomocz oraz poprawiać czynność nerek u pacjentów z IgAN. Dioscyna (DIO) jest jednym z głównych składników aktywnych DNR, który ma różne działania farmakologiczne. Badanie to bada możliwy mechanizm DIO w leczeniu IgAN.Model myszy IgAN został ustalony przez indukcję immunologiczną błony śluzowej. Myszy podzielono na grupy kontrolne, modelowe i DIO. Odkładanie się kłębuszkowej IgA u myszy, zmiany patologiczne w nerkach oraz markery komórek B CD20 i ekspresja CXCR5 w plastrze Peyera wykryto za pomocą immunofluorescencji i immunohistochemii. Po stymulacji lipopolisacharydem (LPS) wpływ DIO na proliferację komórek DAKIKI, wydzielanie IgA i Gd-IgA1, ekspresję C1GalT1 i Cosmc badano za pomocą testu zliczania komórek-8 (CCK-8), testu immunoenzymatycznego (ELISA), ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (QRT-PCR) i western blottingu (WB). W badaniach in vivo odkładanie się IgA, któremu towarzyszy przerost kłębuszków nerkowych i zwiększona ekspresja CD20 i CXCR5 w plastrze Peyera u myszy modelowej IgAN, zostało złagodzone przez DIO. Badania in vitro wykazały, że od 0,25 μg/ml do 1,0 μg/ml DIO hamowało indukowaną przez LPS proliferację komórek DAKIKI, wydzielanie IgA i Gd-IgA1 oraz zwiększało ekspresję mRNA i białka C1GalT1 i Cosmc. Badanie to pokazuje, że DIO może zmniejszać produkcję Gd-IgA1 poprzez hamowanie nadmiernej aktywacji komórek wydzielających IgA i regulację w górę ekspresji C1GALT1 / Cosmc.

Wpływ DIO na tkankę nerek w modelu mysim IgAN
W porównaniu z grupą kontrolną, w mysim modelu IgAN indukowanym immunologicznie przez błonę śluzową (grupa modelowa) odnotowano istotny wzrost białkomoczu (Materiały uzupełniające Rycina 2), widoczne były złogi IgA w obszarze kłębka, a fluorescencja była rozmieszczona równomiernie w skupiskach w całym obszarze kłębka (Rysunek 1A), barwienie PAS tkanki nerkowej wykazało proliferację komórek kłębuszka oraz hiperplazję zrębu (Rycina 1B), co uległo zmniejszeniu w grupie DIO poddawanej podawaniu doustnemu (grupa DIO).
Wpływ DIO na limfocyty B w kępkach Peyera
Kępka Peyera jest głównym miejscem konwersji limfocytów B w komórki wydzielające IgA. Wybraliśmy kępkę Peyera jako obiekt badań, aby zaobserwować wpływ DIO na limfocyty B poprzez oznaczenie ekspresji markerów komórek B: CD20 oraz CXCR5. Wyniki immunohistochemiczne wykazały, że ekspresja CD20 i CXCR5 była znacznie wyższa w grupie modelowej w porównaniu z grupą kontrolną. DIO mógł hamować ekspresję powyższych markerów molekularnych (Rycina 2A,B).
Bezpieczny zakres stężeń DIO dla komórek DAKIKI
LDH jest markerem integralności błony plazmatycznej i wskaźnikiem śmierci komórkowej, przy czym wyższy poziom uwalniania LDH wskazuje na poważniejsze uszkodzenie komórek. Test uwalniania LDH został wykorzystany do określenia bezpiecznego zakresu stężeń DIO. Maksymalne bezpieczne stężenie DIO określono jako takie, przy którym poziom uwalniania LDH wynosił poniżej 10%. Wyniki (Rycina 3>) nie wykazały istotnej cytotoksyczności indukowanej przez DIO w stężeniach od 0,25 do 1,0 µg/mL. W związku z tym w dalszej części badania zastosowano dawki DIO o stężeniu 0,25, 0,5 oraz 1,0 µg/mL.
Wpływ DIO na proliferację komórek DAKIKI
Wyniki eksperymentalne (Rysunek 4) wykazały, że w porównaniu z grupą modelową (grupą stymulowaną LPS), DIO hamowało indukowaną przez LPS proliferację komórek DAKIKI w sposób zależny od stężenia. DIO w stężeniach 0,5 i 1,0 µg/mL znacząco hamowało indukowaną przez LPS proliferację komórek DAKIKI (P &lt; 0,01).
Wpływ DIO na funkcję wydzielniczą komórek DAKIKI
Poziomy Gd-IgA1 są ściśle powiązane z procesem patologicznym IgAN, a całkowite IgA jest badane równocześnie jako wskaźnik komórkowej funkcji wydzielniczej. Do oznaczenia zawartości IgA i Gd-IgA1 w supernatancie hodowli komórek DAKIKI wykorzystano test ELISA. Wyniki wykazały (Rysunek 5A,B), że komórki DAKIKI stymulowane LPS wydzielały więcej IgA w porównaniu z grupą kontrolną (P &lt; 0,01). Z kolei DIO znacząco hamowało wydzielanie IgA przez komórki DAKIKI (P &lt; 0,01) w sposób zależny od stężenia. W porównaniu z grupą kontrolną, komórki DAKIKI stymulowane LPS wydzielały więcej Gd-IgA1 z tendencją statystyczną (P &lt; 0,10), a DIO hamowało wydzielanie Gd-IgA1 z komórek DAKIKI stymulowanych LPS w sposób zależny od stężenia (P &lt; 0,05 oraz P &lt; 0,01), przy czym DIO w stężeniu 1,0 µg/mL znacząco hamowało wydzielanie Gd-IgA1 ze stopniem zahamowania wynoszącym 25%.
Mechanizm hamowania wydzielania Gd-IgA1 przez komórki DAKIKI przez DIO
Aby dalej zbadać możliwy mechanizm hamowania nadmiernej sekrecji Gd-IgA1 przez DIO w komórkach DAKIKI, poziomy mRNA glikozylotransferazy C1GALT1 oraz białka opiekuńczego Cosmc w komórkach DAKIKI oznaczono metodą qRT-PCR. Wyniki wykazały (Rysunek 6A,B), że względna ekspresja mRNA C1GALT1 oraz Cosmc była obniżona w komórkach DAKIKI w grupie modelowej w porównaniu z grupą kontrolną (P &lt; 0,01). DIO zwiększyło względną ekspresję mRNA C1GALT1 oraz Cosmc w różnym stopniu w porównaniu z grupą modelową, przy czym DIO 1,0 µg/mL znacząco zwiększyło względną ekspresję mRNA C1GALT1 oraz Cosmc (P &lt; 0,05).
Jednocześnie metodę WB wykorzystano do wykrycia wpływu DIO na ekspresję białek C1GALT1 i Cosmc w komórkach DAKIKI. W porównaniu z grupą kontrolną, ekspresja białek C1GALT1 i Cosmc w komórkach DAKIKI w grupie modelowej uległa wyraźnemu obniżeniu (P &lt; 0.05). W porównaniu z grupą modelową, ekspresja białek C1GALT1 i Cosmc po interwencji DIO została upregulowana. Ekspresja białek C1GALT1 i Cosmc została istotnie upregulowana przez DIO w stężeniu 1.0 µg/mL (P &lt; 0.05) (Rysunek 7A-C).
<img alt="" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65719/65719fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Histopatologia nerek. (A) Mikroskop fluorescencyjny. Przekroje nerek myszy z każdej grupy barwiono przeciwciałami anty-IgA (zielony) i DAPI (niebieski). Pasek skali na górnym zdjęciu = 200 μm. Pasek skali na dolnym zdjęciu = 50 μm. n = 6 na grupę. (B) Reprezentatywne zdjęcia barwienia PAS tkanki nerek myszy z grup kontrolnej, modelowej i DIO. Pasek skali = 30 μm. Strzałka skierowana w dół wskazuje komórki kłębuszka (mezzangialne), a strzałka skierowana w górę wskazuje zrąb. Pasek skali = 30 μm. n = 6 na grupę. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65719/65719fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie przekrojów histologicznych; kontrola, model, DIO; mikrografia; analiza struktury tkanki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65719/65719fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Wpływ DIO na markery limfocytów B. (A) Ekspresja CD20 w kępkach Peyera. Pasek skali = 200 μm. n = 6 na grupę. (B) Ekspresja CXCR5 w kępkach Peyera. Paski skali znajdują się w prawym dolnym rogu obrazu. Pasek skali = 200 μm. n = 6 na grupę. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65719/65719fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy tempa uwalniania LDH (%), pokazujący zależny od dawki efekt stężenia DIO od 0,25 do 8,0 µg/mL." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65719/65719fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Przesiewowe badanie bezpiecznego stężenia DIO dla komórek DAKIKI. Wartości statystyczne przedstawiono jako średnia ± SD z trzech niezależnych eksperymentów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65719/65719fig3large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający wartości OD przy 450 nm dla traktowania LPS+DIO, wskazujący istotne porównania danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65719/65719fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Różne stężenia DIO wpływają na proliferację komórek DAKIKI. Dane przedstawiono jako średnia ±SD. W porównaniu z grupą kontrolną, **P &lt; 0.01; w porównaniu z grupą modelową, #P &lt; 0.05‚ ##P &lt; 0.01; Wyniki wszystkich eksperymentów powtórzono trzykrotnie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65719/65719fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy porównujący stężenia IgA i GD-βA1 w supernatancie; analiza zależności dawka-odpowiedź dla LPS+DIO." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65719/65719fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. DIO hamuje sekrecję IgA i Gd-IgA1 przez komórki DAKIKI. (A) Metodą ELISA wykryto ekspresję IgA w każdej z grup. (B) Metodą ELISA wykryto ekspresję Gd-IgA1 w każdej z grup. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. W porównaniu z grupą kontrolną, **P &lt; 0.01; w porównaniu z grupą modelową, #P &lt; 0.05, ##P &lt; 0.01; wszystkie wyniki doświadczeń powtórzono trzykrotnie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65719/65719fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający ekspresję mRNA C1GALT1, Gosr2 po traktowaniu LPS i DIO; wyniki statystyczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65719/65719fig6.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Mechanizm, w którym DIO hamuje nadmierną sekrecję Gd-IgA1 przez komórki DAKIKI. (A) Wykrycie ekspresji mRNA C1GALT1 metodą qRT-PCR. (B) Wykrycie ekspresji mRNA Cosmc metodą qRT-PCR. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. W porównaniu z grupą kontrolną, **P&lt;0,01; w porównaniu z grupą modelową, #P &lt; 0,05, ##P &lt; 0,01; wszystkie wyniki eksperymentalne powtórzono trzykrotnie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65719/65719fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza ekspresji białek; Western blot i wykresy słupkowe; białka C1GALT1, Cosmc; ekspresja względna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65719/65719fig7.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7. DIO wpływa na ekspresję białek C1GALT1 i Cosmc w komórkach DAKIKI. (A) Metoda WB potwierdziła zwiększenie ekspresji białek C1GALT1 i Cosmc przez DIO. (B) Półilościową analizę ekspresji C1GALT1 przeprowadzono przy użyciu programu Image J. (C) Półilościowa analiza ekspresji Cosmc przy użyciu programu Image J. Dane przedstawiono jako średnia ±SD. W porównaniu z grupą kontrolną *P &lt; 0,05; w porównaniu z grupą modelową #P &lt; 0,05, ##P &lt; 0,01, wszystkie wyniki eksperymentów powtórzono trzykrotnie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65719/65719fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Materiały uzupełniające Rycina 1Schemat dla in vivo model <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65719/Supplementary_Figure_1.pdf" target="_blank">Aby pobrać tę rycinę, kliknij tutaj.</a>
Rysunek uzupełniający 2. Zmiany w białkomoczu. Dane przedstawiono jako średnia ± SD; n = 6 na grupę. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65719/Supplementary_Figure_2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.</a>

To badanie dostarcza danych eksperymentalnych do leczenia nefropatii immunoglobuliny A (IgAN) za pomocą Dioscyny (DIO), aktywnego składnika Dioscoreae Nipponicae Rhizoma (DNR), oraz paradygmatu do badania efektów ziołolecznictwa i podstawowych mechanizmów in vivo i in vitro.

Łagodzenie nefropatii IgA za pośrednictwem dioscyny poprzez hamowanie aktywacji komórek B in vivo i zmniejszanie produkcji IgA1 z niedoborem galaktozy in vitro

The increase of circulating galactose-deficient IgA1 (Gd-IgA1) is caused by excessive activation of IgA-positive secretory cells in the process of mucosal ...

Naszym głównym obszarem badawczym jest to, jak chińskie ziołolecznictwo działa w leczeniu przewlekłych chorób nerek, takich jak nefropatia IgA. W niniejszym badaniu, opierając się na naszym doświadczeniu klinicznym i leczeniu nefropatii IgA za pomocą Dioscoreae Nipponicae Rhizoma, skrót DNR, oraz na wynikach naszych badań nad główną substancją czynną DNR, staramy się potwierdzić potencjalną wartość dioscyny jako jednej z głównych substancji czynnych DNR oraz odkryć jej możliwy mechanizm działania w leczeniu nefropatii IgA poprzez eksperymenty in vivo i in vitro. Nieprawidłowa produkcja IgA1, czyli zwiększona ilość IgA1 z niedoborem laktozy, jest ważna w patogenezie nefropatii IgA i istnieją mocne dowody na to, że tkanka limfatyczna związana z jelitami odgrywa znaczącą rolę w produkcji IgA1 z niedoborem galaktozy.W eksperymentach in vitro stwierdziliśmy, że dioscyna ma bardzo wyraźny wpływ hamujący na proliferację komórek wydzielających IgA, linię komórkową DAKIKI, przy stosunkowo niskim stężeniu, a także hamujący wpływ na wydzielanie Gd-IgA1 przez komórki DAKIKI. Wyniki te wskazują, że dioscyna może mieć potencjalną wartość terapeutyczną w nefropatii IgA, a także w chorobie związanej z nadmierną aktywacją komórek B, takiej jak toczeń rumieniowaty układowy. Ze względu na złożoność chińskich składników ziołowych, badanie mechanizmu terapeutycznego chińskiej medycyny ziołowej napotyka znaczne trudności, zwłaszcza w eksperymentach komórkowych, w których dyskusja o mechanizmach takich jak nasza, użycie głównego składnika aktywnego leku nieziołowego jako substancji reprezentatywnej leku może być powszechnie przyjętą metodą badawczą i mamy nadzieję, że tego rodzaju prace mogą stanowić podstawę do odkrycia nowych leków dla medycyny naturalnej.Rozpocznij przygotowanie nefropatii immunoglobuliny A lub IgA i modeli kontrolnych po poddaniu myszy tygodniowemu adaptacyjnemu chowowi w klatce laboratoryjnej. Następnie przez dziewięć tygodni karmić myszy modelowe 0,1% bydlęcą gamma-globuliną lub roztworem BGG w 6-milimolowym wodnym kwasie solnym. Następnie wstrzyknij 0,1 mililitra 0,1% roztworu BGG w soli fizjologicznej do żyły ogonowej modelowego zwierzęcia przez trzy kolejne dni, kontynuując karmienie jak poprzednio.Po pomyślnym przygotowaniu modelu neuropatii IgA, w dziewiątym tygodniu rozpocznij interwencję dioscyny lub DIO połowie myszy z grupy modelowej wybranej jako grupa zgłębnika DIO. Podawaj grupom odpowiednie napoje, jak wykazano, przez osiem tygodni przed przystąpieniem do kolejnej analizy. Aby rozpocząć przygotowywanie skrawków parafiny nerki i plastra Peyera wyizolowanych z odpowiednio znieczulonej myszy modelowej neuropatii IgA, najpierw przymocuj jeden plaster Peyera lub tkanki nerkowe o grubości 3 milimetrów za pomocą 4% paraformaldehydu przez 24 godziny.Następnie odwodnij je, używając gradientu etanolu i ksylenu przed umyciem ich wodą. Zanurz tkanki w wosku na dwie godziny przed ich uszczelnieniem i zamrożeniem. Następnie odetnij kawałki plastra Peyera o grubości 4 mikronów lub odcinki nerki o grubości 2 mikronów i umieść je w ciepłej wodzie, aby się rozłożyły.Za pomocą czystego szkiełka delikatnie podnieś rozłożone plastry i inkubuj je w piekarniku o stałej temperaturze 40 stopni Celsjusza przez godzinę przed barwieniem. Po przygotowaniu skrawków parafiny nerki i plastra Peyera wyizolowanego z myszy modelowej neuropatii immunoglobuliny A lub IgA, przystąp do odparafinowania i barwienia żądanego skrawka parafiny roztworem kwasu okresowego o temperaturze pokojowej przez 10 minut, unikając ekspozycji na światło. Opłucz sekcję wodą destylowaną przed osuszeniem.Następnie zabarwić suchą część roztworem barwiącym Schiffa przez 20 do 30 minut, unikając ekspozycji na światło. Opłucz sekcję wodą destylowaną, aż stanie się czerwona pod mikroskopem. Zanurz wypłukany fragment w roztworze barwiącym hematoksylinę na trzy minuty, aby zabarwić jądra, a następnie spłucz go pod bieżącą wodą, aż skrawek stanie się bezbarwny.Po wykonaniu rutynowego odwodnienia za pomocą gradientów ksylenu i etanolu, uszczelnij odcinek neutralną gumą, aby zbadać go pod mikroskopem. W porównaniu z grupą kontrolną, model myszy z neuropatią IgA wywołaną przez układ odpornościowy błony śluzowej ma widoczne odkładanie się IgA w całym obszarze mezangialnym. Barwienie PAS tkanki nerkowej wykazało proliferację komórek mezangialnych i przerost zrębu w grupie modelowej, który uległ zmniejszeniu w grupie zgłębnika dioscyny.Aby rozpocząć odparafinowanie wcześniej przygotowanych skrawków parafiny plastra Peyera wyizolowanego z myszy modelowej neuropatii immunoglobuliny A lub IgA, zanurz każdą sekcję sekwencyjnie w gradientach ksylenu i etanolu na pięć minut. Następnie spłucz sekcję w wodzie destylowanej. W celu pobrania antygenu podgrzewaj roztwór cytrynianu sodu przez dwie minuty w autoklawie.Następnie umieść plasterek tkanki w roztworze i podgrzewaj go w wysokiej temperaturze przez pięć minut. Po schłodzeniu inkubować sekcję w 3% roztworze nadtlenku wodoru przez 15 minut, w temperaturze pokojowej, z dala od światła. Następnie nałóż równomiernie 10% kozią surowicę na wycinek tkanki i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby zablokować sekcjon.Po strząśnięciu roztworu blokującego nanieść odpowiednią ilość przygotowanego przeciwciała pierwszorzędowego na każdy odcinek. Inkubować skrawki ułożone płasko w mokrym pudełku przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnego dnia przykryj tkankę kroplą przeciwciała drugorzędowego znakowanego HRP i inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez 50 minut.Następnie nałóż świeżo przygotowany roztwór chromogeniczny DAB na każdą sekcję i poczekaj na rozwój koloru. Ponownie zabarwić skrawek hematoksyliną przez około minutę. Następnie płucz sekcje przez 10 minut wodą z kranu, aż powrócą do niebieskiego koloru.W celu odwodnienia umieść każdą sekcję sekwencyjnie w gradientach etanolu i ksylenu na pięć minut każdy. Gdy wszystkie sekcje lekko wyschną, uszczelnij każdą sekcję neutralną gumą. Wyniki immunohistochemiczne wykazały, że ekspresja markerów komórek B CD20 i CXCR5 była istotnie wyższa w grupie modelowej neuropatii IgA w porównaniu z grupą kontrolną.Jednak dioscyna może hamować ekspresję markerów molekularnych. Na początek wysiewaj komórki DAKIKI na 96 dołkach o gęstości 0,4 miliona komórek na dołek. Ustaw różne grupy eksperymentalne, a po odpowiednich zabiegach opartych na metodzie grupowania, inkubuj płytki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.W przypadku testu cytotoksyczności dehydrogenazy mleczanowej dodaj 5 mikrolitrów lizatu do każdego dołka w grupie kontrolnej o wysokim poziomie i inkubuj płytkę w temperaturze 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie dodaj 100 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej do każdej studzienki. Aby stłumić reakcję, dodaj 50 mikrolitrów roztworu do reakcji zatrzymania na dołek.W przypadku testu Cell Counting Kit-8 lub CCK-8, po początkowej 24-godzinnej inkubacji, dodaj 20 mikrolitrów odczynnika CCK-8 do każdej studzienki i włóż płytki do inkubatora w temperaturze 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Wyniki testu cytotoksyczności dehydrogenazy mleczanowej wykazały nieistotną cytotoksyczność indukowaną przez dioscynę w stężeniach od 0,25 do 1,0 mikrogramów na mililitr, które miały szybkość uwalniania dehydrogenazy mleczanowej poniżej 10% Test CCK-8 wykazał, że w porównaniu z grupą modelową, dioscyna hamowała proliferację komórek DAKIKI indukowaną przez LPS w sposób zależny od stężenia, przy stężeniach 0,5 i 1,0 mikrogramów na mililitr wykazujących istotne hamowanie. Na początek wysiewaj komórki DAKIKI na sześciodołkowej płytce o gęstości 6 milionów komórek na dołek.Ustaw różne grupy eksperymentalne, a po odpowiednim traktowaniu opartym na metodzie grupowania, inkubuj płytki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Ekstrahuj całkowite RNA z komórek DAKIKI, postępując zgodnie z instrukcjami zawartymi w zestawie do ekstrakcji całkowitego RNA. Weź jeden mikrolitr wyekstrahowanego RNA z każdej grupy próbek, aby zmierzyć jego stężenie.Odwrotna transkrypcja 1 mikrograma całkowitego RNA z każdej próbki na uzupełniające DNA zgodnie z instrukcjami zestawu. Wykonaj reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją lub amplifikację RT-PCR, aby wykryć ekspresję każdego genu. W przypadku western blott po początkowej 24-godzinnej inkubacji należy pobrać komórki z każdej grupy.Dodaj odpowiednią objętość roztworu do lizy komórek do pobranych komórek przed inkubacją na lodzie przez 30 minut. Odwirować próbki o stężeniu 13,500 G przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza i zebrać supernatant do dalszej analizy. Wirować próbki białek za pomocą buforu ładującego 5X SDS-PAGE w stosunku 4 do 1 i podgrzewać zmieszane próbki w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby zdenaturować białko przed elektroforezą.Po zakończeniu cyklu przenieś żel na membrany PVDF. Aby zablokować błonę, inkubuj ją w 5% beztłuszczowym mleku przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować błonę z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi przez 24 godziny, używając przeciwciała beta aktyny jako kontroli wewnętrznej.Następnie inkubować błony z odpowiednim wtórnym kozim przeciwciałem anty-króliczym IgG w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Na koniec potraktuj błony odpowiednią ilością roztworu roboczego o zwiększonej chemiluminescencji w celu wykrycia prążków białkowych. Ilościowe wyniki RT-PCR wykazały, że względna ekspresja mRNA C1GalT1 i Cosmc była obniżona w komórkach DAKIKI w grupie modelowej w porównaniu z grupą kontrolną.Dioscyna zwiększyła względną ekspresję mRNA obu w różnym stopniu w porównaniu z grupą modelową. Wyniki Western blot wykazały również, że w porównaniu z grupą kontrolną ekspresja białka C1GalT1 i Cosmc w komórkach DAKIKI w grupie modelowej zmniejszyła się. Ekspresja białek była regulowana w górę po interwencji dioscyny.

dioscin-mediated-iga-nephropathy-alleviation-inhibiting-b-cell

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Tutaj opisujemy prostą metodę obrazowania konfokalnego, aby zobrazować lokalizację in situ komórek wydzielających cytokinę Interferon gamma w mysich wtórnych narządach limfatycznych. Protokół ten można rozszerzyć o wizualizację innych cytokin w różnych tkankach.

Obrazowanie wytwarzania interferonu gamma in situ w śledzionie myszy po zakażeniu Listeria monocytogenes

Ten protokół wykorzystuje mieszane peptydy G6PI do konstruowania modeli reumatoidalnego zapalenia stawów, które są bliższe modelom ludzkiego reumatoidalnego zapalenia stawów w limfocytach T CD4+ i cytokinach. Niezmienne limfocyty T NK o wysokiej czystości (głównie iNKT2) o określonych fenotypach i funkcjach uzyskano przez indukcję in vivo i oczyszczanie in vitro do immunoterapii adoptywnej.

Immunoterapia adoptywna komórek iNKT u myszy RZS indukowanych izomerazą glukozo-6-fosforanową (G6PI)

Tutaj prezentujemy protokół do indukcji indukcji regulatorowych limfocytów T in vivo. W tym protokole komórki dendrytyczne są modyfikowane tak, aby lokalnie wytwarzały wysokie stężenia aktywnej witaminy D (1,25-dihydroksywitaminy D lub 1,25[OH]2D) i aktywnej witaminy A (kwas retinowy lub RA) de novo.

Augmentacja in vivo indukcji regulatorowych limfocytów T naprowadzających się na jelita

mikroRNA biorą udział w patogenezie nefropatii IgA. Opracowaliśmy niezawodną metodę wykrywania poziomów ekspresji mikroRNA w nerkach mysiego modelu nefropatii IgA (myszy HIGA). Ta nowa metoda ułatwi sprawdzenie udziału miRNA w nefropatii IgA.

Wykrywanie ekspresji mikroRNA w nerkach myszy nefropatycznych z immunoglobuliną A

Zapalenie powierzchni oka uszkadza tkanki powierzchni oka i zagraża funkcjom życiowym oka. Niniejszy protokół opisuje metodę wywoływania zapalenia oka i zbierania uszkodzonych tkanek w mysim modelu dysfunkcji gruczołów Meiboma (MGD).

Indukcja stanu zapalnego powierzchni oka i gromadzenie zajętych tkanek

W niniejszej pracy proponujemy proste metody testowania i oceny obecności reaktywnych form tlenu w komórkach.

Produkcja i detekcja reaktywnych form tlenu (ROS) w nowotworach

Opisujemy ogólny protokół śledzenia komórek in vivo za pomocą MRI w modelu mysim z komórkami oznaczonymi ex vivo. Dołączony jest typowy protokół do znakowania komórek, przetwarzania akwizycji obrazu i kwantyfikacji.

Rezonans magnetyczny in vivo 19F do śledzenia komórek

Jelito cienkie jest często narażone na działanie toksyn, które mogą wpływać na przepływ krwi i negatywnie wpływać na wchłanianie składników odżywczych. Za pomocą multimiografu i izolatów tętnic i żył krezkowych można badać pod kątem wazoaktywności związki lub toksyny.

Izolowanie i wykorzystanie odcinków tętnicy i żyły krezkowej bydła jako testu biologicznego do badania wazoaktywności w jelicie cienkim

Ten manuskrypt zawiera protokół wszczepiania telemetrów myszom w celu pomiaru ciśnienia wewnątrzmacicznego podczas ciąży.

Telemetria wewnątrzmaciczna do pomiaru ciśnienia skurczowego myszy in vivo

Aktywacja mikrogleju i mikroglejoza są kluczowymi odpowiedziami na przewlekłą neurodegenerację. W tym miejscu przedstawiamy metody długoterminowej wizualizacji in vivo komórek mikrogleju CX3CR1-GFP+ siatkówki za pomocą oftalmoskopii konfokalnej oraz analiz progowych i morfometrycznych w celu identyfikacji i ilościowego określenia ich aktywacji. Monitorujemy zmiany mikrogleju we wczesnych stadiach jaskry związanej z wiekiem.

In vivo (in vivo)Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy

Odkryj mechanizm działania dioscyny w leczeniu nefropatii IgA przy użyciu modeli mysich i komórek DAKIKI. Badanie pokazuje potencjał fitoterapii w hamowaniu aktywacji komórek B i redukcji patologicznej IgA1.

Łagodzenie nefropatii IgA za pośrednictwem dioscyny poprzez hamowanie aktywacji komórek B in vivo i zmniejszanie produkcji IgA1 z niedoborem galaktozy in vitro (Wideo) | JoVE Journal

Łagodzenie nefropatii IgA za pośrednictwem dioscyny poprzez hamowanie aktywacji komórek B in vivo i zmniejszanie produkcji IgA1 z niedoborem galaktozy in vitro

Przeglądaj więcej filmów