Name: Porównanie dwóch reprezentatywnych metod różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mezenchymalne komórki zrębu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Poznaj dwie metody różnicowania hiPSC w mezenchymalne komórki zrębu: monowarstwową i ciał zarodkowych. Porównaj ich skuteczność w osteogenicznej, adipogenicznej i chondrogenicznej różnicowaniu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy niezmiernie wdzięczni wszystkim członkom Laboratorium Mao i Hu, byłym i obecnym, za interesujące dyskusje i wielki wkład w projekt. Jesteśmy wdzięczni Narodowemu Centrum Badań Klinicznych nad Zdrowiem Dziecka za ogromne wsparcie. Badania te były wspierane finansowo przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (U20A20351 Jianhua Mao, 82200784 Lidana Hu), Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Zhejiang w Chinach (nr 1). LQ22C070004 do Lidana Hu).

1. Konserwacja hiPSC
<ol>
	<li>Rozmrażanie hiPSC
	<ol>
		<li>Wyjmij komórki z ciekłego azotu i szybko rozmroź komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przenieść rozmrażające się komórki do probówki o pojemności 15 ml przygotowanej z 3 ml pożywki konserwacyjnej iPSC (tabela materiałów). Delikatnie wymieszaj podłoże.</li>
		<li>Wirować przy 300 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i delikatnie ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki konserwacyjnej iPSC z 10 μM Y-27632 (pipetować komórki w górę i w dół 2-3 razy).</li>
		<li>Przenieś zawiesinę komórek na 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej pokrytą żelem macierzy zewnątrzkomórkowej o zredukowanym czynniku wzrostu (GFR) (1:100) i 2 ml pożywki podtrzymującej iPSC z 10 μM Y-27632 dodanymi wcześniej (około 4 x 104 komórek/cm2).</li>
		<li>Hoduj komórki przez 5-6 dni (80%-90% konfluencji) w temperaturze 37 °C, 5% CO2 z codzienną wymianą pożywek konserwacyjnych iPSC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przejście hiPSC
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę konserwacyjną iPSC z płytki 6-dołkowej. Umyj hiPSC raz za pomocą DPBS.</li>
		<li>Dodać 700-800 μl 0,48 mM roztworu EDTA i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT), a następnie usunąć roztwór wytrawiający. Kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut.</li>
		<li>Gdy komórki są trawione na arkusze (nie trawić komórek na pojedyncze komórki), dodaj 1 ml pożywki konserwującej iPSC z 10 μM Y-27632, aby zakończyć trawienie. Ostrożnie pipetuj komórki w górę i w dół 2-3 razy.</li>
		<li>Przenieś zawiesinę komórek na 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej pokrytą żelem macierzy zewnątrzkomórkowej o zredukowanym czynniku wzrostu (GFR) (1:100) i 2 ml pożywki podtrzymującej iPSC z wcześniej dodanymi 10 μM Y-27632. 
		UWAGA: Współczynnik pasażowania waha się od 1:6 do 1:20 (około 4 x 104 komórki/cm2), a średnia wielkość agregacji wynosi około 50-200 μm.</li>
		<li>Hodować komórki do 80%-90% konfluencji (5-6 dni) w temperaturze 37 °C, 5% CO2 z codzienną wymianą pożywek konserwacyjnych iPSC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Odróżnianie MSC od hiPSC poprzez tworzenie EB
UWAGA: Metoda wywodzi się z poprzedniej literatury21,22,23,24. Przegląd metody jest zilustrowany w Rysunek 1. Charakterystykę metody podsumowano w tabeli 1.
<ol>
	<li>Przygotowanie podłoża
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę różnicującą MSC, suplementując α-MEM 1% (v/v) GlutaMAX, 10% (v/v) FBS, 10 ng/ml FGF2 i 5 ng/ml TGFβ.</li>
		<li>Przygotować pożywkę podtrzymującą MSC, uzupełniając α-MEM 1% (v/v) GlutMAX, 10% (v/v) FBS i 1 ng/ml FGF2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komórek hiPSC
	<ol>
		<li>Linie hodowli hiPSC (przejście co najmniej 2-3 razy po rozmrożeniu) w pożywce podtrzymującej iPSC na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej pokrytej żelem macierzy zewnątrzkomórkowej o obniżonym czynniku wzrostu (GFR) (1:100) w temperaturze 37 °C, 5% CO2 aż do zbiegu 80%-90%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 0: Formacja EB
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę konserwacyjną iPSC z płytki 6-dołkowej. Umyj hiPSC raz za pomocą DPBS.</li>
		<li>Dodać 700-800 μl 0,48 mM roztworu EDTA i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć roztwór wytrawiający. Kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut.</li>
		<li>Gdy komórki są trawione na arkusze (nie trawić komórek na pojedyncze komórki), dodaj 2 ml pożywki podtrzymującej iPSC (zawierającej 10 μM inhibitora Rock i 1:100 GFR - żel macierzy zewnątrzkomórkowej), aby zakończyć trawienie.</li>
		<li>Przenieś komórki na 6-dołkową niską płytkę mocującą. Zasiać komórki w proporcji 2 dołki płytki do hodowli tkankowej na 1 dołek płytki o niskim przyłączeniu. Inkubować komórki w wytrząsarce (60 obr./min) w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny, aby uzyskać kuliste EB.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 1 – Dzień 7: Różnicowanie EB
	<ol>
		<li>Przenieść EBs do probówki wirówkowej za pomocą pipety Pasteura (bez niszczenia EBs) i pozostawić EBs do naturalnego osadzania się przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie usunąć supernatant.</li>
		<li>Przenieś EB na 6-dołkową płytkę o niskim stopniu mocowania z 2 ml pożywki różnicującej MSC. Hodować EB na wytrząsarce w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 7 dni, zmieniając pożywkę jeden raz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 8 – Dzień 17: Szczepienie EB
	<ol>
		<li>Przenieś EB do probówki wirówkowej za pomocą pipety Pasteura (bez niszczenia EBs) i pozwól EBs naturalnie osiadać przez 5-10 minut. Następnie usunąć supernatant.</li>
		<li>Przenieś EB na 6-dołkową płytkę pokrytą żelem z macierzą zewnątrzkomórkową GFR z 2 ml pożywki podtrzymującej MSC. Hodowla do 90% zbiegu (~10 dni) z regularną zmianą pożywki po adhezji komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 18 – Dzień 27: Dojrzewanie i ekspansja MSCs
	<ol>
		<li>Kulturę pochodzącą z EB należy traktować roztworem dysocjacyjnym w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut (czas trawienia różni się ze względu na obecność różnych typów komórek).</li>
		<li>Gdy część komórek zostanie strawiona na pojedyncze komórki, dodaj 2 ml pożywki podtrzymującej MSC, aby zakończyć trawienie i przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej. Pozostałe niestrawione komórki należy raz przepłukać DPBS i ponownie strawić. Powtórz kilka razy, aż wszystkie komórki zostaną strawione na pojedyncze komórki. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant.</li>
		<li>Wysiewaj komórki na płytce hodowlanej pokrytej żelatyną (około 2 x 105 komórek/cm2). Hodowla do 90% zbieżności w pożywce podtrzymującej MSC z regularną wymianą pożywki. Oznacz tę generację komórek jako przejście 0 (P0) w tym momencie.</li>
		<li>Aby MSC był czysty i dojrzały, kontynuuj dwukrotne przechodzenie komórek w stosunku 1:3 w ciągu około 6 dni. Większość komórek ma morfologię podobną do fibroblastów (wrzecionowata).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Odróżnienie MSC od hiPSC dzięki hodowli jednowarstwowej
UWAGA: Metoda wywodzi się z poprzedniej literatury25,26,27,28. Przegląd tej metody jest zilustrowany w Rysunek 1. Charakterystykę metody podsumowano w tabeli 1.
<ol>
	<li>Przygotowanie podłoża
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę konserwacyjną MSC, uzupełniając α-MEM 1% (v/v) GlutMAX, 10% (v/v) FBS i 1 ng/ml FGF2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komórek hiPSC
	<ol>
		<li>Linie hodowli hiPSC (pasaż co najmniej 2-3 razy po rozmrożeniu) w pożywce podtrzymującej iPSC na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej pokrytej żelem macierzy zewnątrzkomórkowej o obniżonym czynniku wzrostu (GFR) (1:100) w temperaturze 37 °C, 5% CO2 aż do 50%-60% konfluencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 0 – Dzień 13: Różnicowanie przez bezpośrednie kultury jednowarstwowe
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę konserwacyjną iPSC z płytki 6-dołkowej.</li>
		<li>Bezpośrednio dodać 2 ml pożywki konserwacyjnej MSC i hodować ją przez 14 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , zmieniając pożywkę codziennie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 14 – dzień 35: Dojrzewanie MSCs przez wielokrotne pasażowanie
	<ol>
		<li>Kultury jednowarstwowe należy traktować roztworem dysocjacyjnym w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut (czas trawienia różni się ze względu na obecność różnych typów komórek).</li>
		<li>Gdy komórki są trawione na pojedyncze komórki, dodaj 2 ml pożywki podtrzymującej MSC, aby zakończyć trawienie i przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej. Pozostałe niestrawione komórki należy raz przepłukać DPBS i ponownie strawić. Powtórz kilka razy, aż wszystkie komórki zostaną strawione na pojedyncze komórki. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant.</li>
		<li>Wysiewaj komórki na pokrytym żelatyną naczyniu hodowlanym (około 2 x 10,5 komórek/cm2). Hodowla do 90% zbieżności w pożywce podtrzymującej MSC z regularną wymianą pożywki. Oznacz tę generację komórek jako przejście 0 (P0) w tym momencie.</li>
		<li>Aby MSC był czysty i dojrzały, kontynuuj pasaż komórek 6 razy w stosunku 1:3 przez około 18 dni. Większość komórek ma morfologię podobną do fibroblastów (wrzecionowata).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza antygenów powierzchniowych MSC napędzających hiPSC za pomocą cytometrii przepływowej
UWAGA: Podobnie jak antygeny powierzchniowe MSC pochodzące ze szpiku kostnego, MSC napędzające hiPSC wyrażają CD105, CD73 i CD90, ale nie wyrażają CD45, CD3429. Ponadto hiPSC mogą być wykorzystywane jako komórki kontroli ujemnej. Analiza antygenów powierzchniowych MSC i hiPSC napędzających hiPSC za pomocą cytometrii przepływowej jest pokazana na Rysunek 2.
<ol>
	<li>Potraktować MSCs napędzające hiPSC roztworem dysocjacyjnym w temperaturze 37 °C przez 2-3 minuty. Potraktować hiPSC odczynnikiem dysocjacyjnym EDTA 0,48 mM i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć odczynnik dysocjacyjny. Kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut.</li>
	<li>Gdy komórki są trawione na pojedyncze komórki, dodaj pożywkę (pożywkę podtrzymującą MSC do MSC i pożywkę podtrzymującą iPSC do iPSC), aby zakończyć trawienie.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 350 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant.</li>
	<li>Umyj komórki raz zimnym DPBS, odwiruj przy 350 x g przez 5 minut, a następnie usuń supernatant.</li>
	<li>Policz i ponownie zawieś komórki w zimnym 10% roztworze FBS-DPBS (v/v) o stężeniu 10 x 106 komórek/ml i rozprowadź 100 μl/probówkę zawiesiny komórek (1 x 106 komórek/probówkę) do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 5 μl ludzkiego roztworu blokującego receptor Fc do 100 μl zawiesiny komórkowej. Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej, aby wykonać niespecyficzne blokowanie.</li>
	<li>Wirować przy 350 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Umyj komórki dwukrotnie zimnym 2% roztworem FBS-DPBS (v/v).</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w zimnym 100 μl 2% roztworu FBS-DPBS (v/v).</li>
	<li>Dodać 5 μl (1 test) anty-CD34-FITC i 5 μl (1 test) anty-CD45-APC do 100 μl komórki 
	Zawieszenie. Dodać 5 μl (1 test) anty-CD73-APC, 5 μl (1 test) anty-CD90-FITC i 5 μl (1 test) anty-CD105-PE do kolejnej probówki do zawieszania komórek o pojemności 100 μl. Dodać 5 μl ludzkiej kontrolnej izotypu IgG1 FITC, ludzkiej kontroli izotypu IgG1 PE i ludzkiej kontroli izotypu IgG1 APC do trzeciej probówki do zawieszania komórek o pojemności 100 μl. Inkubować przez 15-20 minut na lodzie w ciemności. W międzyczasie przygotuj pojedyncze koraliki barwiące.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie zimnym 2% roztworem FBS-DPBS (v/v).</li>
	<li>Dodaj 300 μl zimnego 2% roztworu FBS-DPBS (v/v) w celu ponownego zawieszenia komórek i przefiltruj przez filtr siatkowy o siatce 200.</li>
	<li>Analizować próbki za pomocą cytometrii przepływowej. Przeanalizować zawiesinę komórkową wybarwioną przeciwciałami kontrolnymi izotypu i ustawić bramkę. Następnie przeanalizuj zawiesinę komórkową wybarwioną docelowymi przeciwciałami.</li>
</ol>
5. Osteogenne różnicowanie MSC napędzających hiPSC
UWAGA: MSC napędzające hiPSC posiadają potencjał różnicowania osteogennego (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A, B). Protokół różnicowania osteogennego podano poniżej.
<ol>
	<li>Przygotować osteogenną pożywkę indukcyjną, uzupełniając α-MEM 10% FBS, 100 nM deksametazonu, 10 mM beta-glicerofosforanu i 100 μM kwasu askorbinowego.</li>
	<li>Wysiewaj 1 x 105 MSCs na pokrytą żelatyną 48-dołkową płytkę i hoduj, aż będzie zlewać się w 60%-70%.</li>
	<li>Usunąć pożywkę i dodać 0,3 ml osteogennej pożywki indukcyjnej. Hodować komórki w pożywce indukcyjnej osteogennej przez 14 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , zmieniając pożywkę co 3 dni.</li>
	<li>Usuń podłoże i raz umyj DPBS.</li>
	<li>Dodać 0,3 ml 4% PFA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Usuń PFA. Przepłucz komórki 0,3 ml DPBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej i powtórz 3 razy.</li>
	<li>Usunąć DPBS, dodać 0,2 ml roztworu do barwienia czerwienią alizaryny i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń roztwór barwiący, przepłucz komórki 0,3 ml DPBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej i powtórz 3 razy.</li>
	<li>Obserwuj barwienie osadzania się wapnia pod mikroskopem świetlnym.</li>
</ol>
6. Adipogenne różnicowanie MSC napędzających hiPSC
UWAGA: MSC napędzające hiPSC posiadają potencjał różnicowania adipogennego (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C, D). Protokół różnicowania adipogennego podano poniżej.
<ol>
	<li>Przygotować adipogenną pożywkę indukcyjną, uzupełniając α-MEM 10% FBS, 1 μM deksametazon, 1 μM IBMX, 10 μg/ml insuliny i 100 μM indometacyny. Przygotować adipogenną pożywkę podtrzymującą, suplementując α-MEM 10% FBS i 10 μg/ml insuliny.</li>
	<li>Wysiewać 1 x 105 MSCs na pokrytą żelatyną 48-dołkową płytkę i hodować, aż gęstość komórek osiągnie 90%.</li>
	<li>Usuń pożywkę i dodaj 0,3 ml adipogennej pożywki indukcyjnej. Kontynuować hodowlę komórek w pożywce do indukcji adipogennej przez 4 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Usuń pożywkę i dodaj 0,3 ml adipogennej pożywki podtrzymującej. Kontynuować hodowlę komórek w adipogennej pożywce podtrzymującej przez 3 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Powtórz kroki 6.3 i 6.4 2-3 razy, aż do różnicowania i dojrzewania adipocytów.</li>
	<li>Usuń podłoże i raz umyj DPBS.</li>
	<li>Dodać 0,3 ml 4% PFA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Usunąć PFA i spłukać 2 razy DPBS.</li>
	<li>Nałóż barwnik Oli Red O zgodnie z instrukcją producenta i obserwuj kropelki lipidów pod mikroskopem świetlnym.</li>
</ol>
7. Chondrogenne zróżnicowanie MSC napędzających hiPSC
UWAGA: MSC napędzające hiPSC posiadają potencjał różnicowania chondrogennego (<silna klasa="xfig">Rysunek 3E, F). Protokół różnicowania chondrogennego podano poniżej.
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę indukcyjną chondroblastu, uzupełniając α-MEM 10% FBS, 100 nM deksametazonu, 1% insuliny-transferyny-selenu (ITS), 10 μM kwasu askorbinowego, 1 mM pirogronianu sodu, 50 μg/ml proliny, 0,02 nM transformującego czynnika wzrostu β3 (TGFβ3) i 0,5 μg/ml białka morfogenetycznego kości 6 (BMP-6).</li>
	<li>Zebrać 2,5 x 105 MSC napędzających hiPSC i odwirować komórki przy 150 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant. Zawiesić komórki w 1 ml α-MEM, a następnie odwirować przy 150 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant i zawiesić komórki w 0,5 ml chondrogenicznej pożywki indukcyjnej. Odwirować komórki przy sile 150 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Bezpośrednio odkręcić pokrywkę i hodowlę przez 21 dni z chondrogenną wymianą pożywki indukcyjnej co 3 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Delikatnie potrząśnij probówką wirówkową, aby zawiesić granulki chondrogenne (bez niszczenia granulek chondrogennych) każdego dnia podczas różnicowania chondrogennego.</li>
	<li>Usunąć supernatant i dwukrotnie przemyć 0,5 ml PBS.</li>
	<li>Dodać 0,3 ml 4% PFA i utrwalać przez 24 godziny.</li>
	<li>Parafina zatapia chondrogenne granulki, a następnie je kroi (3 μm). Zabarwić skrawki na niebiesko toluidyną (1%) przez 30 minut.</li>
	<li>Obserwuj zewnątrzkomórkową macierz chondrocytów pod mikroskopem świetlnym.</li>
</ol>

Characterizing Surface Antigens and Proliferation Ability in hiPSC-Driving MSCs

<ol><li>Weng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem%2Fstromal+cell+senescence%3A+Hallmarks%2C+mechanisms%2C+and+combating+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies.</a> Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).</li>
<li>Soliman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stromal+cells%3A+One+name%2C+multiple+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Multipotent stromal cells: One name, multiple identities.</a> Cell Stem Cell. 28 (10), 1690-1707 (2021).</li>
<li>Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Gerasimov, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+osteogenic+stem+cells%3A+in+vitro+cultivation+and+transplantation+in+diffusion+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Kinetics%22%5BJournal%5D)">Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers.</a> Cell and Tissue Kinetics. 20 (3), 263-272 (1987).</li>
<li>Friedenstein, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precursors+for+fibroblasts+in+different+populations+of+hematopoietic+cells+as+detected+by+the+in+vitro+colony+assay+method%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method.</a> Experimental Hematology. 2 (2), 83-92 (1974).</li>
<li>Friedenstein, A. J., Gorskaja, J. F., Kulagina, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+precursors+in+normal+and+irradiated+mouse+hematopoietic+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs.</a> Experimental Hematology. 4 (5), 267-274 (1976).</li>
<li>El Agha, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+fibrotic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in fibrotic disease.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).</li>
<li>Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+cultivation%2C+and+characterization+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells.</a> Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).</li>
<li>Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cell+homing%3A+Mechanisms+and+strategies+for+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement.</a> iScience. 15, 421-438 (2019).</li>
<li>Regmi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+viability+and+function+of+mesenchymal+stromal+cell+spheroids+is+mediated+via+autophagy+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Enhanced viability and function of mesenchymal stromal cell spheroids is mediated via autophagy induction.</a> Autophagy. 17 (10), 2991-3010 (2021).</li>
<li>Hoang, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+therapy+for+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based therapy for human diseases.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 272(2022).</li>
<li>Jiang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+pluripotent+cells%2C+an+unlimited+and+quality-controllable+source+for+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: Mesenchymal stem cells derived from human pluripotent cells, an unlimited and quality-controllable source for therapeutic applications.</a> Stem Cells. 37 (5), 572-581 (2019).</li>
<li>Soontararak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+%28MSC%29+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSC%29+equivalent+to+adipose-derived+MSC+in+promoting+intestinal+healing+and+microbiome+normalization+in+mouse+inflammatory+bowel+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells (MSC) derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) equivalent to adipose-derived MSC in promoting intestinal healing and microbiome normalization in mouse inflammatory bowel disease model.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (6), 456-467 (2018).</li>
<li>Di Baldassarre, A., Cimetta, E., Bollini, S., Gaggi, G., Ghinassi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-induced+pluripotent+stem+cell+technology+and+cardiomyocyte+generation%3A+Progress+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Human-induced pluripotent stem cell technology and cardiomyocyte generation: Progress and clinical applications.</a> Cells. 7 (6), 48(2018).</li>
<li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology%3A+a+decade+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).</li>
<li>Levy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shattering+barriers+toward+clinically+meaningful+MSC+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies.</a> Science Advances. 6 (30), eaba6884(2020).</li>
<li>Zhao, C., Ikeya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+applications+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Generation and applications of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells International. 2018, 9601623(2018).</li>
<li>Path, G., Perakakis, N., Mantzoros, C. S., Seufert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+treatment+of+diabetes+mellitus+-+Focus+on+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the treatment of diabetes mellitus - Focus on mesenchymal stem cells.</a> Metabolism. 90, 1-15 (2019).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+derivation+of+functional+mesenchymal+stem+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells.</a> Bio-Protocol. 8 (22), e3080(2018).</li>
<li>Hua, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-intensity+pulsed+ultrasound+promotes+osteogenic+potential+of+iPSC-derived+MSCs+but+fails+to+simplify+the+iPSC-EB-MSC+differentiation+process%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778(2022).</li>
<li>Dupuis, V., Oltra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+produce+induced+pluripotent+stem+cell-derived+mesenchymal+stem+cells%3A+Mesenchymal+stem+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Methods to produce induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells: Mesenchymal stem cells from induced pluripotent stem cells.</a> World Journal of Stem Cells. 13 (8), 1094-1111 (2021).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+stem+cells.+A+Werner+syndrome+stem+cell+model+unveils+heterochromatin+alterations+as+a+driver+of+human+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging.</a> Science. 348 (6239), 1160-1163 (2015).</li>
<li>Liu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+Fanconi+anemia+pathogenesis+and+therapeutics+using+integration-free+patient-derived+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-derived iPSCs.</a> Nature Communications. 5, 4330(2014).</li>
<li>Kubben, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+the+antioxidant+NRF2+pathway+in+premature+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repression of the antioxidant NRF2 pathway in premature aging.</a> Cell. 165 (6), 1361-1374 (2016).</li>
<li>Duan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+deficiency+reprogrammes+human+neural+stem+cells+towards+a+glioblastoma+stem+cell-like+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype.</a> Nature Communications. 6, 10068(2015).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+released+from+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+MSCs+facilitate+cutaneous+wound+healing+by+promoting+collagen+synthesis+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis.</a> Journal of Translational Medicine. 13, 49(2015).</li>
<li>Hu, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+secreted+by+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+mesenchymal+stem+cells+attenuate+limb+ischemia+by+promoting+angiogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice.</a> Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 10(2015).</li>
<li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+retain+adequate+osteogenicity+and+chondrogenicity+but+less+adipogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity.</a> Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 144(2015).</li>
<li>Wang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+results+in+downregulation+of+c-Myc+and+DNA+replication+pathways+with+immunomodulation+toward+CD4+and+CD8+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells.</a> Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Kim, S., Kim, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mesenchymal+stem-like+cells+for+producing+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of mesenchymal stem-like cells for producing extracellular vesicles.</a> World Journal of Stem Cells. 11 (5), 270-280 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym protokole zbadano dwie reprezentatywne metody różnicowania hiPSC na MSC 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Obie metody pozwoliły na wyprowadzenie MSC z hiPSC. MSCs pochodzące z h...

Mezenchymalne komórki zrębowe (MSC) to dorosłe pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące z mezodermy1. MSCs są obecne w prawie wszystkich tkankach łącznych2. Odkąd MSCs zostały po raz pierwszy odkryte w latach siedemdziesiątych XX wieku i pomyślnie wyizolowane ze szpiku kostnego w 1987 roku przez Friedensteina i wsp.3,4,5, do izolowania MSCs wykorzystano różne ludzkie tkanki somatyczne (w tym płodowe i dorosłe), takie jak kości, chrząstki, ścięgna, mięśnie, tkanka tłuszczowa i zrąb podtrzymujący układ krwiotwórczy1,2,6,7. MSCs wykazują wysokie zdolności proliferacyjne i plastyczność, aby różnicować się w wiele linii komórek somatycznych i mogą migrować do uszkodzonych i zapalnych tkanek2,8,9. Te właściwości sprawiają, że MSCs są potencjalnym kandydatem na medycynę regeneracyjną10. Jednak MSC pochodzące z tkanek somatycznych (st-MSC) są ograniczone przez ograniczoną dawstwo, ograniczoną zdolność proliferacyjną komórek, różnice w jakości i obawy o bezpieczeństwo biologiczne w przypadku możliwego przenoszenia patogenów, jeśli takie występują, od dawców11,12.
Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) pochodzą z przeprogramowania dorosłych komórek za pomocą czynników transkrypcyjnych (Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc), które pełnią podobne funkcje jak embrionalne komórki macierzyste13,14. Mogą się one samoodnawiać i mają potencjał różnicowania się w dowolny typ komórek somatycznych, w tym MSC. W porównaniu z st-MSC, iPSC-MSCs mają tę zaletę, że mają nieograniczoną podaż, niższy koszt, wyższą czystość, wygodę w kontroli jakości, łatwość produkcji na dużą skalę i modyfikację genów15,16,17.
Ze względu na te zalety iPSC-MSC, zgłoszono różne metody wyprowadzania MSC z iPSC. Te metody różnicowania koncentrowały się wokół dwóch metodologii hodowli: (1) tworzenia ciał zarodkowych (EBs) oraz (2) stosowania kultur jednowarstwowych11,18,19,20. W niniejszej pracy scharakteryzowano reprezentatywne podejście dla każdej z dwóch metodologii. Ponadto uzyskano dostęp do porównań między dwoma reprezentatywnymi podejściami opartymi na czasie, kosztach, zdolności proliferacyjnej, ekspresji biomarkerów MSC i zdolności różnicowania in vitro.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do barwienia na czerwono Alizaryn</td><td>Beyotime&nbsp; Biotechnologia</td><td>C0148S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human-CD105 (PE)</td><td>Biolegend</td><td>323206</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human-CD34 (FITC)</td><td>Biolegend</td><td>343503</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human-CD45 (APC)</td><td>Biolegend</td><td>304011</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human-CD73( APC)</td><td>Biolegend</td><td>344006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human-CD90 (FITC)</td><td>Biolegend</td><td>328108</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Solarbio</td><td>A8100</td><td></td></tr><tr><td>BMP-6</td><td>Novoprotein</td><td>C012</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka poziomu dwutlenku węgla</td><td>Kryształ</td><td>CO-06UC6</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki kompensacyjne</td><td>BioLegend</td><td>424601</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Technologia STEMCELL</td><td>07959</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Beyotime&nbsp; Biotechnologia</td><td>ST1254</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp; medium</td><td>Servicebio</td><td>G4610</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>HAKATA</td><td>HS-FBS-500</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Stemcell</td><td>78003.1</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500-100G</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>kontrola izotypu ludzkiej IgG1 APC</td><td>BioLegend</td><td>403505</td><td></td></tr><tr><td>kontrola ludzkiego izotypu IgG1 FITC</td><td>BioLegend</td><td>403507</td><td></td></tr><tr><td>kontrola ludzkiego izotypu IgG1 PE</td><td>BioLegend</td><td>403503</td><td></td></tr><tr><td>Human TGF-&beta; 1</td><td>Stemcell</td><td>78067</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki TruStain FcX&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Beyotime&nbsp; Biotechnologia</td><td>ST1398</td><td></td></tr><tr><td>Indometacyna</td><td>Solarbio</td><td>SI9020</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Beyotime&nbsp; Biotechnologia</td><td>P3376</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka pielęgnacyjna iPSC</td><td>Technologia STEMCELL</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>ITS Suplement prasowy</td><td>Beyotime&nbsp; Biotechnology</td><td>C0341-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, obniżony czynnik wzrostu</td><td>BD Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia Oli Red O</td><td>Beyotime&nbsp; Biotechnologia</td><td>C0158S</td><td></td></tr><tr><td>Proline</td><td>Solarbio</td><td>P0011</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta; 3</td><td>Zestaw</td> do barwienia błękitem toluidyny Novoprotein <td>CJ44</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Solarbio</td><td>G2543</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme(1x)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Low Attachment 6-dołkowa płytka</td><td>Costar</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-66</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Stemcell</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Hyclon</td><td>SH30265</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosforan</td><td>Solarbio</td><td>G8100</td><td></td></tr></tbody></table>

porównanie dwóch reprezentatywnych metod różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mezenchymalne komórki zrębu

Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells

Mezenchymalne komórki zrębowe (MSC) to dorosłe pluripotencjalne komórki macierzyste, które są szeroko stosowane w medycynie regeneracyjnej. Ponieważ MSCs pochodzące z tkanek somatycznych są ograniczone przez ograniczoną dawstwo, różnice w jakości i bezpieczeństwo biologiczne, w ciągu ostatnich 10 lat nastąpił znaczny wzrost wysiłków na rzecz generowania MSCs z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Wcześniejsze i niedawne wysiłki zmierzające do różnicowania hiPSC w MSCs koncentrowały się na dwóch metodologiach hodowli: (1) tworzeniu ciał zarodkowych (EBs) oraz (2) zastosowaniu hodowli jednowarstwowej. Niniejszy protokół opisuje te dwie reprezentatywne metody wyprowadzania MSC z hiPSC. Każda metoda przedstawia swoje zalety i wady, w tym czas, koszt, zdolność do proliferacji komórek, ekspresję markerów MSC i ich zdolność do różnicowania in vitro. Protokół ten pokazuje, że obie metody mogą wyprowadzać dojrzałe i funkcjonalne MSC z hiPSC. Metoda monowarstwowa charakteryzuje się niższym kosztem, prostszą obsługą i łatwiejszym różnicowaniem osteogennym, natomiast metoda EB charakteryzuje się mniejszym czasochłonnością.

Zgodnie z protokołem (Rysunek 1A), hiPSC zróżnicowano do MSC za pomocą metod tworzenia ciał embrioidalnych (EB) oraz hodowli monowarstwowej. Podczas różnicowania komórki wykazywały reprezentatywne, zróżnicowane morfologie (Rysunek 1B,C).
Jak pokazano na Rysunku 1B, kolonie hiPSC przed różnicowaniem wykazują typową zwartą morfologię z wyraźną krawędzią złożoną z gęsto upakowanych komórek. ...

Ten protokół opisuje i porównuje dwie reprezentatywne metody różnicowania hiPSC na mezenchymalne komórki zrębu (MSC). Metoda jednowarstwowa charakteryzuje się niższym kosztem, prostszą obsługą i łatwiejszym różnicowaniem osteogennym. Metoda ciał zarodkowych (EBs) charakteryzuje się mniejszym zużyciem czasu.

Porównanie dwóch reprezentatywnych metod różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mezenchymalne komórki zrębu

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are ...

Przedmiotem naszego opracowania jest badanie mechanizmu i strategii terapeutycznej chorób genetycznych. Nasze badania opierają się na wielopoziomowych modelach chorób, takich jak sferoidy, iPSC, organoidy i myszy. Moduły iPSC mają wyraźną przewagę nad innymi modelami.Komórki iPS pochodzące od pacjentów, a także wszelkie uzyskane w ich wyniku komórki i organoidy, mają ten sam genom co pacjentzy, co stanowi bank komórek pacjentów i modeli dla wielu chorób. Ponadto, chociaż metody tworzenia iPSC od pacjentów są dość dojrzałe, nadal istnieje wiele wyzwań związanych z ukierunkowanym różnicowaniem iPSC w określone komórki i organoidy. Wraz z pogłębieniem zrozumienia mechanizmów rozwojowych w obecnym rozwoju nastąpi w tej dziedzinie.Na początek należy wyhodować hiPSC w pożywce podtrzymującej iPSC na sześciodołkowej płytce do hodowli tkankowej pokrytej żelem macierzy zewnątrzkomórkowej o obniżonym czynniku wzrostu. Gdy komórki osiągną zbieżność od 80 do 90%, usuń pożywkę z płytki i umyj komórki raz DPBS. Następnie dodaj 700 do 800 mikrolitrów 0,48 milimolowego EDTA i inkubuj przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.Usuń roztwór wytrawiający i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Cels

comparison-two-representative-methods-for-differentiation-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje metodę in vitro do generowania makrofagów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Wytwarzanie makrofagów z iPSC zachodzi w trzech etapach: (i) agregacja iPSC w zawiesinie w celu utworzenia trójwymiarowych ciał zarodkowych (EB), które różnicują się w komórki mezodermalne, (ii) tworzenie komórek prekursorowych makrofagów ze zróżnicowanych EB oraz (iii) różnicowanie komórek prekursorowych makrofagów w dojrzałe, funkcjonalne makrofagi.

Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych w makrofagi

Artykuł opisuje szczegółową metodologię skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty poprzez selektywne modulowanie szlaku Wnt, a następnie analizę markerów referencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny jednorodności i tożsamości populacji.

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

Z zamiarem scharakteryzowania zmian w miRNA na zróżnicowanych ludzkich nerwowych komórkach macierzystych (hNSC) opisujemy różnicowanie hNSC w systemie trójwymiarowym, ocenę zmian w ekspresji mikroRNA za pomocą macierzy miRNA PCR oraz analizę obliczeniową do przewidywania celu miRNA i jego walidacji za pomocą testu podwójnej lucyferazy.

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mają wrodzoną zdolność do różnicowania się i samoorganizacji w odrębne wzorce tkankowe; chociaż wymaga to prezentacji przestrzennych gradientów środowiskowych. Przedstawiamy mikrowzorce szablonowe jako prostą i solidną metodę generowania gradientów biochemicznych i mechanicznych w celu kontrolowania wzorców różnicowania hPSC.

Szablonowe mikrowzorce ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badania przestrzennej organizacji losów różnicowania

Tutaj prezentujemy protokół do sekcji próbki ludzkiej pępowiny (UC) i łożyska płodu na błonę śluzową pępowiny (CL), galaretkę Whartona (WJ), połączenie pępowina-łożysko (CPJ) i łożysko płodu (FP) w celu izolacji i charakterystyki mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) przy użyciu techniki hodowli eksplantatów.

Izolacja i charakterystyka mezenchymalnych komórek zrębu z ludzkiej pępowiny i łożyska płodu

Tutaj prezentujemy metodę efektywnego wykorzystania potencjału różnicowania serca młodych źródeł ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w celu generowania funkcjonalnych, kurczących się, kardiomiocytów komórek in vitro.

In vitro Różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki podobne do kardiomiocytów

Generowanie zróżnicowanych typów komórek z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) jest bardzo obiecujące terapeutycznie, ale nadal stanowi wyzwanie. PSC często wykazują wrodzoną niezdolność do różnicowania, nawet gdy są stymulowane odpowiednim zestawem sygnałów. Opisane tutaj jest proste narzędzie do zwiększania różnicowania wieloliniowego w różnych liniach PSC.

Przejściowe leczenie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych DMSO w celu promowania różnicowania

W tym protokole opisujemy stabilną, wysoce efektywną strategię różnicowania do generowania postganglionowych neuronów współczulnych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Model ten sprawi, że neurony będą dostępne do wykorzystania w badaniach nad wieloma zaburzeniami autonomicznymi.

Skuteczne różnicowanie zazwojowych neuronów współczulnych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli bez karmienia i zdefiniowanych chemicznie

To badanie przedstawia nowatorskie podejście do pomiaru wielu parametrów funkcjonalnych mitochondriów na podstawie cytometrii przepływowej i podwójnego barwienia dwoma fluorescencyjnymi reporterami lub przeciwciałami w celu wykrycia zmian w objętości mitochondriów, potencjale błony mitochondrialnej, poziomie reaktywnych form tlenu, składzie mitochondrialnego łańcucha oddechowego i mitochondrialnym DNA.

Analiza cytometryczna przepływowa wielu parametrów mitochondrialnych w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach macierzystych oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych

Protokół pozwala na generowanie czystej populacji adipocytów z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Kwas retinowy służy do różnicowania iPSC w mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), które są wykorzystywane do produkcji adipocytów. Następnie stosuje się podejście sortowania oparte na barwieniu czerwienią nilową w celu uzyskania czystych adipocytów.

Solidne różnicowanie ludzkich iPSC w czystą populację adipocytów w celu zbadania zaburzeń związanych z adipocytami

Ten protokół przedstawia różnicowanie ludzkich osteoklastów od indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i opisuje metody charakterystyki osteoklastów i prekursorów osteoklastów.

Różnicowanie i charakterystyka osteoklastów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj dwie metody różnicowania hiPSC w mezenchymalne komórki zrębu: monowarstwową i ciał zarodkowych. Porównaj ich skuteczność w osteogenicznej, adipogenicznej i chondrogenicznej różnicowaniu.

Porównanie dwóch reprezentatywnych metod różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mezenchymalne komórki zrębu (Wideo) | JoVE Journal

Porównanie dwóch reprezentatywnych metod różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mezenchymalne komórki zrębu

Przeglądaj więcej filmów