Name: Utrzymanie w niewoli i ekstrakcja jadu Tityus serrulatus (brazylijskiego żółtego skorpiona) w celu produkcji antyjadu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T13:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Poznaj metody utrzymania i ekstrakcji jadu skorpiona Tityus serrulatus przy użyciu stymulacji elektrycznej. Protokół ten wspiera produkcję antyjadu dla brazylijskiego systemu ochrony zdrowia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Protokoły obejmujące zwierzęta bezkręgowe są zwolnione z zatwierdzenia przez Komitet ds. Wykorzystania i Opieki nad Zwierzętami Instituto Butantan. Niemniej jednak utrzymanie skorpionów opisane w niniejszym materiale jest zgodne z parametrami etycznymi, a dobrostan zwierząt jest przestrzegany zgodnie z potrzebami gatunkowymi.
1. Zakwaterowanie
<ol>
	<li>Skorpiony należy utrzymywać w zbiorczych pojemnikach z polipropylenu służących jako terraria (wysokość 35 cm, szerokość 35,5 cm, długość 72 cm), zawierających maksymalnie 350 osobników.</li>
	<li>W pomieszczeniu, w którym znajdują się terraria, należy utrzymać kontrolowaną temperaturę 24 °C (±0.5 °C) przy cyklu oświetlenia 10 h światła i 14 h ciemności.</li>
	<li>Dno każdego pojemnika należy wyłożyć papierem pakowym, mocując go taśmą maskującą na wszystkich krawędziach, aby zwierzęta nie mogły wejść pod papier (Rysunek 3A).</li>
	<li>W roli podłoży pionowych należy wykorzystać cztery tekturowe tace (tace na jaja), ułożone w stosie po jednej stronie pojemnika, z sztywną arkuszem tektury umieszczonym pomiędzy każdą tacą (Rysunek 3B,C).</li>
	<li>Po przeciwnej stronie terrarium należy umieścić płytką tacę z polipropylenu (tacę z wodą), zawierającą nasączoną watę jako źródło wody dla zwierząt (Rysunek 3B).</li>
	<li>Pojemniki należy trzymać bez przykrywek w celu zwiększenia przepływu powietrza. Na górnej części wewnętrznej powierzchni terrarium oraz w górnych narożnikach należy nakleić pasek samoprzylepnej taśmy plastikowej o szerokości około 10 cm, aby ściany były wystarczająco gładkie, co zapobiegnie ucieczce zwierząt z pojemnika (Rysunek 3A).</li>
</ol>
<img alt="Układ do hodowli owadów: wytłaczanki do jaj w pojemniku, schemat procesu tworzenia schronienia krok po kroku." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65737/65737fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Przygotowanie klatki i pomieszczenia. (A) Strzałki wskazują papier kraft na dnie, przymocowany taśmą maskującą na krawędziach. Linie przerywane wskazują samoprzylepną taśmę plastikową umieszczoną na górnej części wewnętrznej powierzchni klatki. (B) Podłoże pionowe (wytłaczanki do jaj ułożone jedna na drugiej po jednej stronie pojemnika) oraz płytka taca z polipropylenu (taca z wodą) umieszczona po przeciwnej stronie. (C) Szczegóły podłoża pionowego: wytłaczanki do jaj ułożone z sztywnym arkuszem tektury pomiędzy dwiema tackami. (D) Arkusze tektury i wytłaczanki do jaj ułożone warstwowo, symulujące naturalne, ciemne i wilgotne siedlisko T. serrulatus. (E) Zwierzęta zakwaterowane w podłożu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65737/65737fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
2. Rutyna higieniczna
UWAGA: Rutyna higieniczna jest podzielona na dwie procedury konserwacyjne: konserwację pełną oraz częściową. Pierwsza z nich jest przeprowadzana 2 dni po karmieniu zwierząt lub gdy klatka zostanie wybrana do ekstrakcji jadu. Konserwację częściową wykonuje się w czasie, gdy zwierzęta nie są karmione.
<ol>
	<li>Konserwacja całkowita
	<ol>
		<li>Przygotować czyste terrarium z nowym podłożem (tacki po jajkach, tektura i papier pakowy) oraz czystą tacką z wodą, zgodnie z opisem w sekcji 1.</li>
		<li>Używając długiej pęsety, wyjąć tackę z wodą z terrarium. Jeśli na tackce znajdują się skorpiony, przenieść je do czystego terrarium.</li>
		<li>Powtórzyć procedurę opisaną w punkcie 2.1.2 dla wszystkich tacek po jajkach i arkuszy tektury, przenosząc wszystkie skorpiony do czystego terrarium.</li>
		<li>Po wyjęciu tacek zebrać wszystkie skorpiony pozostałe na dnie terrarium i przenieść je do czystego terrarium. Należy uwzględnić wszelkie martwe osobniki i odpowiednio je zutylizować. Zebrać i usunąć z terrarium wszystkie pozostałe żywe ofiary (owady).</li>
		<li>Usunąć z terrarium wszystkie jednorazowe podłoża (tacki po jajkach, arkusze tektury i papier pakowy) i poddać je utylizacji. Elementy wielorazowego użytku (tackę z wodą i pojemnik z polipropylenu) przekazać do dezynfekcji. 
		UWAGA: Dezynfekcja elementów wielorazowych jest przeprowadzana przy użyciu 0,5% podchlorynu w połączeniu z neutralnym detergentem. Obowiązkowe jest dokładne i obfite płukanie materiałów bieżącą wodą po zastosowaniu każdego produktu lub roztworu dezynfekującego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konserwacja częściowa 
	UWAGA: Konserwacja częściowa polega na przeglądzie wszystkich podłoży (tacek po jajkach i papieru pakowego) w celu usunięcia martwych skorpionów i innych niepożądanych zanieczyszczeń, bez usuwania podłoży ani zmiany terrarium.
	<ol>
		<li>Przeprowadzić przegląd, używając długiej pęsety do delikatnego podnoszenia każdej tacki po jajkach i usuwania odpadów.</li>
		<li>W razie potrzeby zastąpić jedną lub więcej tacek po jajkach nowymi, czystymi tackami.</li>
		<li>Całkowicie wymienić tackę z wodą na czystą, używając długiej pęsety. Przenieść skorpiony znajdujące się na tackce z wodą na tackę po jajkach w innej części terrarium.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Karmienie
<ol>
	<li>Karm zwierzęta co 15 dni zgodnie z harmonogramem pozyskiwania jadu. Zwierzęta, z których jad będzie pozyskiwany, karm na 7 dni przed i 7 dni po ekstrakcji.</li>
	<li>W ramach karmienia podawaj naprzemiennie karaczany (Phoetalia pallida) i świerszcze (Gryllus sp.).</li>
	<li>Oblicz ilość pokarmu w zależności od zapotrzebowania energetycznego zwierząt; oferuj jedną ofiarę na każde 3 lub 5 skorpionów w terrarium.</li>
	<li>Odlicz obliczoną liczbę ofiar i umieść je żywe wewnątrz terrarium na 2 dni przed pełną konserwacją (sekcja 2.1).</li>
	<li>Podając karaczany, zastosuj roztwór węglanu wapnia z alkoholem wokół górnej krawędzi terrariów. Roztwór sprawia, że karaczany ślizgają się i nie są w stanie wspiąć się po ściankach bocznych terrarium, co zapobiega ucieczce owadów.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja jadu
UWAGA: Zwierzęta wykorzystane w procedurze ekstrakcji jadu to osobniki dorosłe lub przeddorosłe. Ze względu na trudności w określeniu pełnej dojrzałości płciowej brazylijskiego żółtego skorpiona (faza dorosła), ustalono, że do procedury kwalifikują się zwierzęta o całkowitej długości ciała od 5 do 7 cm.
<ol>
	<li>Poddoj każdego zwierzęcia co 2-3 miesiące.</li>
	<li>W dniu ekstrakcji jadu należy policzyć wszystkie żywe zwierzęta w terrarium i przenieść je do szklanego pojemnika, używając długich pincetów (Rysunek 4).</li>
	<li>Przygotować i ułożyć wszystkie materiały oraz sprzęt na blacie szafy laminicznej. Podłączyć kabel zasilający elektrostymulatora do gniazdka, a następnie włączyć elektrostymulator i szafę laminiczną (Rysunek 2B).
	<ol>
		<li>Zastosować następujące ustawienia parametrów elektrostymulatora: potencjał (różnica potencjałów między elektrodami): 540 mV, stres (czas trwania impulsu elektrycznego): 2 ms, działanie (przerywanie w celu umiarkowania stosowanej mocy, co zapobiega przegrzaniu tkanki organicznej telsonu): 70%, cykl (regulacja powtarzalności cyklicznej): 1 s oraz natężenie (prąd elektryczny przepływający przez mięśnie zwierzęcia): 0.75 mA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ręcznie unieruchomić każde zwierzę w taki sposób, aby telson pozostał w bezruchu, wykonując następujące czynności:
	<ol>
		<li>Chwycić metasomę zwierzęcia prostym pincetem (Rysunek 5A).</li>
		<li>Unieruchomić telson zakrzywionym pincetem (Rysunek 5B).</li>
		<li>Przytrzymać telson dłonią (Rysunek 5C,D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po unieruchomieniu należy umieścić telson w bezpośrednim kontakcie z przewodnikiem elektrostymulatora, bez konieczności stosowania roztworu przewodzącego. Wstrząs elektryczny powoduje mimowolny skurcz mięśnia gruczołu jadowego i w konsekwencji wyrzut jadu.</li>
	<li>Krople jadu należy zbierać bezpośrednio do plastikowej mikroprobówki umieszczonej blisko przewodnika elektrostymulatora (Rysunek 6).</li>
	<li>Następnie należy wypuścić zwierzę z powrotem do szklanego pojemnika, wykonując następujące czynności:
	<ol>
		<li>Przenieść telson zwierzęcia z dłoni do zakrzywionego pinceta.</li>
		<li>Delikatnie położyć zwierzę na dnie szklanego pojemnika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórzyć kroki 4.4-4.7 dla każdego zwierzęcia znajdującego się w szklanym pojemniku.</li>
	<li>Po poddojeniu wszystkich zwierząt z szklanego pojemnika należy umieścić je z powrotem w terrarium.</li>
	<li>Zebrany jad należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu procesu liofilizacji.</li>
</ol>
<img alt="Układ badania skorpionów z szklaną szalką i pęsetą, wykorzystywany do badania i analizy okazów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65737/65737fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Skorpiony w szklanym pojemniku. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65737/65737fig04large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Metoda unieruchamiania skorpiona przy użyciu pęsety i dłoni; procedura przedstawiona na schemacie w czterech krokach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65737/65737fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Procedura unieruchamiania do ekstrakcji jadu. (A) Metasoma unieruchomiona prostą pęsetą (czarna strzałka). (B) Telson unieruchomiony pęsetą zakrzywioną (czarna strzałka). (C) Przeniesienie unieruchomionego telsonu z pęsety do dłoni. (D) Telson unieruchomiony dłonią. Zaleca się obchodzenie się ze zwierzętami gołymi rękami, ponieważ przy użyciu rękawiczek skorpiony mogą chwytać materiał szczypcami, co utrudnia ich puszczenie po zakończeniu procedury i znacznie zwiększa ryzyko wypadków. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65737/65737fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Ekstrakcja jadu owada za pomocą pipety, zbieranie kropli, konfiguracja eksperymentu entomologicznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65737/65737fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Ekstrakcja jadu. Plastikowa mikroprobówka (biała strzałka) umieszczona blisko elektrostymulatora (żółta strzałka). Krople jadu są zbierane bezpośrednio do probówki utrzymywanej w temperaturze pokojowej podczas procedury. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65737/65737fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Rearing of Brazilian Yellow Scorpion for Venom Extraction

<ol><li>Polis, G. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPolis%2C+GA+%22The+biology+of+scorpions%22">The biology of scorpions</a>. , Stanford University Press. (1990).</li>
<li>Lacerda, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scorpion+envenomation+in+the+state+of+S%C3%A3o+Paulo%2C+Brazil%3A+Spatiotemporal+analysis+of+a+growing+public+health+concern%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Scorpion envenomation in the state of São Paulo, Brazil: Spatiotemporal analysis of a growing public health concern.</a> PLoS One. 17 (4), 0266138(2022).</li>
<li>Reckziegel, G. C., Pinto, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scorpionism+in+Brazil+in+the+years+2000+to+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Venomous+Animals+and+Toxins+Including+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Scorpionism in Brazil in the years 2000 to 2012.</a> Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 20, 46(2014).</li>
<li>Guerra-Duarte, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scorpion+envenomation+in+Brazil%3A+Current+scenario+and+perspectives+for+containing+an+increasing+health+problem%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Scorpion envenomation in Brazil: Current scenario and perspectives for containing an increasing health problem.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 17 (2), 0011069(2023).</li>
<li>Pimenta, R. J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+to+survive+and+kill%3A+Tityus+serrulatus%2C+the+Brazilian+yellow+scorpion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Selected to survive and kill: Tityus serrulatus, the Brazilian yellow scorpion.</a> PLoS One. 14 (4), e0214075(2019).</li>
<li>Lacerda, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+areas+vulnerable+to+scorpionism+and+its+association+with+environmental+factors+in+S%C3%A3o+Paulo%2C+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Detection of areas vulnerable to scorpionism and its association with environmental factors in São Paulo, Brazil.</a> Acta Tropica. 230, 106390(2022).</li>
<li>Torrez, P. P. Q., Dourado, F. S., Bertani, R., Cupo, P., França, F. O. deS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scorpionism+in+Brazil%3A+exponential+growth+of+accidents+and+deaths+from+scorpion+stings%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Brazilian+Society+of+Tropical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Scorpionism in Brazil: exponential growth of accidents and deaths from scorpion stings.</a> Journal of the Brazilian Society of Tropical Medicine. 52, 20180350(2019).</li>
<li>Amado, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vulnerable+areas+to+accidents+with+scorpions+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Medicine+%26+International+Health%22%5BJournal%5D)">Vulnerable areas to accidents with scorpions in Brazil.</a> Tropical Medicine & International Health. 26 (5), 13561(2021).</li>
<li>Brasil, Ministérioda da Saúde, Fundação Nacional de Saúde. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Manual+de+diagn%C3%B3stico+e+tratamento+de+acidentes+por+animais+pe%C3%A7onhentos%22">Manual de diagnóstico e tratamento de acidentes por animais peçonhentos</a>. , Ministérioda da Saúde, Fundação Nacional de Saúde. Brasília. (2001).</li>
<li>Candido, D. M., Lucas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+scorpions+of+the+genus+Tityus+Koch+%28Scorpiones%2C+Buthidae%29+for+venom+obtention+at+Instituto+Butantan%2C+S%C3%A3o+Paulo%2C+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Venomous+Animals+and+Toxins+including+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Maintenance of scorpions of the genus Tityus Koch (Scorpiones, Buthidae) for venom obtention at Instituto Butantan, São Paulo, Brazil.</a> Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases. 10 (1), 000100007(2004).</li>
<li>Lucas, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laborat%C3%B3rio+de+Artr%C3%B3podes+do+Instituto+Butantan+e+os+aracn%C3%ADdeos+pe%C3%A7onhentos%5BTitle%5D)+AND+%22Hist%C3%B3ria+Ci%C3%AAncias+Sa%C3%BAde+Manguinhos%22%5BJournal%5D)">Laboratório de Artrópodes do Instituto Butantan e os aracnídeos peçonhentos.</a> História Ciências Saúde Manguinhos. 10 (3), 000300011(2003).</li>
<li>Braga-Pereira, G. F., Santos, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asexual+reproduction+in+a+sexual+population+of+the+Brazilian+yellow+scorpion+%28Tityus+serrulatus%2C+Buthidae%29+as+evidence+of+facultative+parthenogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Arachnology%22%5BJournal%5D)">Asexual reproduction in a sexual population of the Brazilian yellow scorpion (Tityus serrulatus, Buthidae) as evidence of facultative parthenogenesis.</a> The Journal of Arachnology. 49 (2), (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Zastosowanie opisanych metod pozwala nam na utrzymanie dużej liczby osobników T. serrulatus i daje nam stałą przewidywalność liczby skorpionów potrzebnych do rocznej produkcji jadu. W ten sposób jesteśmy w stanie z wyprzedzeniem dostarczyć wystarczającą ilość partii jadu, aby zasilić proces produkcji antyjadu. Jednocześnie opracowanie wcześniej ustalonych harmonogramów konserwacji, karmienia i ekstrakcji jadu jest istotną częścią działań i pomaga w przestrzeganiu opisanych protokołów. Dlatego ustanowienie rutyny...

Skorpiony są stawonogami należącymi do klasy Arachnida, rzędu Scorpiones, który obejmuje około 2 621 gatunków1,2. Zwierzęta te mają szeroki zasięg geograficzny i występują na wszystkich kontynentach z wyjątkiem Antarktydy1. Ukąszenia przez skorpiony prowadzą każdego roku do zachorowań lub śmierci tysięcy ludzi na całym świecie3. W 2019 roku oszacowano, że zwierzęta te spowodowały ponad 1,2 miliona wypadków i 3 500 zgonów rocznie. W Brazylii liczba przypadków wzrasta wykładniczo, osiągając od 2017 roku ponad 100 000 przypadków rocznie4,5,6. Niekontrolowana urbanizacja obserwowana w Brazylii w ciągu ostatnich dziesięcioleci, brak odpowiedniego oczyszczania ścieków oraz regularnego zbierania i utylizacji odpadów, w połączeniu z degradacją środowiska i zmianami klimatycznymi, stworzyły warunki do proliferacji inwazyjnych skorpionów, takich jak T. serrulatus, co zwiększyło kontakt z ludźmi i w konsekwencji doprowadziło do szkodliwych wypadków4,7,8. W Brazylii występuje około 178 gatunków skorpionów, jednak ukąszenia o znaczeniu medycznym są powodowane przez rodzaj Tityus, z czego cztery gatunki (T. serrulatus, T. bahiensis, T. stigmurus i T. obscurus) budzą niepokój medyczny, przy czym Tityus serrulatus odpowiada za najcięższe przypadki i zgony7,9.
Instituto Butantan to główne laboratorium produkujące antytoksyny w Brazylii, dostarczające około 70 000 fiolek antytoksyny przeciwko jadowi skorpionów do brazylijskiego systemu zdrowia. W skrócie, etapy produkcji antytoksyny obejmują inokulację koni antygenami pochodzącymi z jadu, a następnie pobieranie i oczyszczanie osocza bogatego w przeciwciała, co skutkuje uzyskaniem fiolek o pojemności 5 mL antytoksyny przeciwko jadowi skorpionów. Każda fiolka jest w stanie zneutralizować co najmniej 1 mg jadu skorpiona na 1 mL antytoksyny. Bioterium Bezkręgowców jest integralną częścią centrum przemysłowego, odpowiedzialną za dostarczanie materiału źródłowego do produkcji antytoksyny przeciwko jadowi skorpionów.
Bioterium Stawonogów w Instituto Butantan pierwotnie nazywało się Laboratorium Stawonogów i zostało założone w 1967 roku. Dopiero w 1995 roku Laboratorium przeniosło się do wyłącznego obiektu przeznaczonego do hodowli jadowitych stawonogów10,11. W tamtym czasie skorpiony były trzymane w pomieszczeniu o powierzchni 12 m2 bez kontroli temperatury, rozmieszczone w około 13 terrariach, z których każde mieściło maksymalnie 300 zwierząt10. W związku z rosnącym zapotrzebowaniem na jad na przestrzeni lat i wynikającą z tego koniecznością zwiększenia liczby zwierząt, a także usprawnieniami w procesie ekstrakcji jadu, w 2016 roku nastąpiła istotna zmiana. Laboratorium zostało włączone do centrum przemysłowego Instituto Butantan i przemianowane na Bioterium Stawonogów. Dodatkowo w 2016 roku Bioterium przeniosło się do nowego, celu zbudowanego obiektu. Nowe pomieszczenie dla skorpionów obejmuje powierzchnię 24 m2 i zawiera około 48 polipropylenowych terrariów, z których każde mieści do 300 zwierząt, jak pokazano na Rysunku 1. W rezultacie w kontrolowanych warunkach niewoli utrzymywanych jest od 10 000 do 20 000 osobników, z wahaniami w ciągu roku. Skorpiony są starannie zarządzane zgodnie ze ścisłymi protokołami hodowlanymi, aby zapewnić im dobrostan, przy jednoczesnym spełnieniu wysokich wymagań produkcyjnych oraz przestrzeganiu dobrych praktyk i standardów etycznych opieki nad zwierzętami. Do ekstrakcji jadu zaprojektowano i zbudowano specjalne pomieszczenie, w którym znajdują się dwie komory z przepływem powietrza, jak pokazano na Rysunku 2A. Komory te służą jako środki bezpieczeństwa, aby zapobiec wdychaniu cząsteczek jadu przez techników podczas procedury ekstrakcji. Środki ochrony indywidualnej (ŚOI) są obowiązkowe dla techników, w tym fartuchy syntetyczne i maski FFP2, aby uniknąć jakiegokolwiek zanieczyszczenia i zapewnić im bezpieczeństwo.
<img alt="Laboratoryjny system przechowywania z pojemnikami, zorganizowany układ półek do zarządzania próbkami badawczymi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65737/65737fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Widok ogólny pomieszczenia dla skorpionów w Bioterium Stawonogów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65737/65737fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Konfiguracja dygestorium laboratoryjnego z kontrolą przepływu powietrza w celu zapewnienia bezpieczeństwa chemicznego i przygotowania próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65737/65737fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Obszar roboczy. (A) Widok ogólny pomieszczenia do ekstrakcji jadu w Bioterium Przegubowców. (B) Powierzchnia robocza szafy z wymuszonym przepływem powietrza. Wszystkie materiały i sprzęt są przygotowane i rozmieszczone na blacie szafy z wymuszonym przepływem powietrza. Czarna strzałka wskazuje elektrostymulator, a czerwona strzałka wskazuje pęsetę. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65737/65737fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Około 90% skorpionów T. serrulatus w Bioterium Bezkręgowców pochodzi z różnych lokalizacji, gdzie zostały zebrane przez miejskich agentów zdrowia w ramach programu nadzoru i kontroli tych zwierząt. Skorpiony są chwytane na obszarach miejskich, a następnie przesyłane do Instituto Butantan w ramach programu współpracy. Skorpiony T. serrulatus są partenogenetyczne, co oznacza, że narodziny następują w wyniku rozwoju potomstwa z niezapłodnionych jaj, bez udziału osobnika przeciwnej płci12. Ze względu na ten typ rozmnażania, niektóre zwierzęta rodzą się w niewoli w naszej placówce i są utrzymywane aż do osiągnięcia fazy dorosłości, zgodnie z podobnym protokołem hodowlanym, opisanym poniżej. Po osiągnięciu stadium dorosłego są one włączane do rutyny ekstrakcji jadu. Po przybyciu skorpiony przechodzą wstępny przegląd, a osobniki w dobrym stanie zdrowia są utrzymywane w zbiorowych wygrodzeniach mieszczących maksymalnie 350 osobników, podzielonych według miejsca pochodzenia. Dla każdego wygrodzenia codziennie wypełniany jest formularz kontrolny, zawierający dane o dacie karmienia i rodzaju oferowanej zdobyczy (świerszcz lub karaluch), dostawie wody, procedurach czyszczenia, liczbie martwych zwierząt oraz liczbie pozostałych żywych osobników w wygrodzeniu.
Zgodnie z ustalonym harmonogramem zwierzęta są poddawane stymulacji elektrycznej, a uzyskany jad od setek osobników jest następnie liofilizowany, co pozwala na przygotowanie partii jadru liofilizowanego. Standaryzowany jad otrzymany w tym procesie jest przeznaczony do immunizacji koni w ramach procesu produkcji, a także służy jako materiał referencyjny do kontroli jakości substancji czynnej oraz produktu końcowego.
Na świecie istnieje bardzo niewiele placówek zdolnych do utrzymania tak licznej populacji skorpionów i przeprowadzania ekstrakcji jadu w takiej ilości, zgodnie z zasadami dobrej praktyki produkcyjnej oraz etycznego wykorzystania zwierząt, jak ma to miejsce w Arthropods Bioterium w Instituto Butantan. Dlatego naszym celem jest opisanie protokołów utrzymania skorpionów oraz procedur ekstrakcji jadu stosowanych w hodowli T. serrulatus, które pozwalają na uzyskanie niezbędnej ilości jadu do produkcji antytoksyny przeciwskorpionowej.

<table><tbody><tr><td>Arkusz tektury</td><td>NA</td><td>NA Tacka</td><td></td></tr><tr><td>na jajka</td><td>Tektura NA</td><td>NA 36</td><td>miejsc tacki na jajka</td></tr><tr><td>Elektrostymulator</td><td>Instituto Butantan</td><td>ART-FV-01</td><td>Wewnętrznie zaprojektowany do ekstrakcji jadu&nbsp;</td></tr><tr><td>Papier pakowy</td><td>NA</td><td>NA</td><td>zwykły papier pakowy</td></tr><tr><td>Taśma do robienia</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Biała taśma maskująca (24 mm x 50 m)</td></tr><tr><td>Pojemnik polipropylenowy</td><td>NA</td><td>NA</td><td>70 L Pudełko polipropylenowe (wys. &ndash; 35 cm, szer. &ndash; 35,5 cm, L - 72 cm)</td></tr><tr><td>Tacka polipropylenowa</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Taca polipropylenowa (H &ndash; 3,0 cm, W &ndash; 18,5 cm, L - 30 cm)</td></tr><tr><td>Tworzywo samoprzylepne</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

utrzymanie w niewoli i ekstrakcja jadu tityus serrulatus (brazylijskiego żółtego skorpiona) w celu produkcji antyjadu

Captive Maintenance and Venom Extraction of Tityus serrulatus (Brazilian Yellow Scorpion) for Antivenom Production

Jad skorpiona jest problemem zdrowia publicznego w kilku krajach tropikalnych i subtropikalnych. Tityus serrulatus (Tityus serrulatus) Lutz i Mello, 1922 (brazylijski żółty skorpion) są odpowiedzialni za około 150 000 przypadków zatrucia rocznie w Brazylii, z których 10% wymaga leczenia przeciwjadowego w celu odwrócenia zagrażających życiu skutków jadu. W związku z tym tysiące osobników T. serrulatus jest utrzymywanych w kontrolowanych warunkach niewoli w celu ekstrakcji jadu, a następnie wykorzystywanego do produkcji krajowych zapasów jadu skorpiona. Instituto Butantan jest głównym laboratorium produkującym leki przeciwjadowe w Brazylii, dostarczającym około 70 000 fiolek z jadem przeciwjadowym dla brazylijskiego systemu opieki zdrowotnej. W związku z tym protokoły hodowlane i metodologie ekstrakcji jadu są kluczowymi punktami sukcesu standaryzowanej produkcji jadu na dużą skalę. Celem niniejszego artykułu jest opisanie protokołów hodowli T. serrulatus w niewoli, obejmujących rutynę hodowlaną i procedury ekstrakcji jadu, przestrzeganie dobrych praktyk produkcyjnych i zapewnienie dobrostanu zwierząt. Praktyki te pozwalają na utrzymanie do 20 000 zwierząt w niewoli, przy rutynowym dojeniu od 3 000 do 5 000 skorpionów miesięcznie zgodnie z zapotrzebowaniem na produkcję antyjadu, osiągając średnio 90% pozytywnej ekstrakcji.

Dla każdej procedury opracowano trzydzieści standardowych procedur operacyjnych (SOP), aby zapewnić powtarzalność działań między technikami oraz zgodność z parametrami jakościowymi. Średnia śmiertelność po procedurze ekstrakcji wynosi około 12%, co można uznać za wartość niską, biorąc pod uwagę rutynę elektrostymulacji oraz warunki niewoli, w których czynniki stresogenne są skutecznie redukowane dzięki zastosowaniu opisanych procedur.
Aby zapewnić zwierzętom dobre warunki zdrowotne, na jednym ...

Tutaj prezentujemy skuteczne protokoły konserwacji i ekstrakcji jadu dla hodowli Tityus serrulatus Lutz i Mello, 1922 (brazylijski żółty skorpion) na dużą skalę, w celu dostarczenia jadu do późniejszej produkcji jadu skorpiona, aby sprostać wymaganiom brazylijskiego systemu opieki zdrowotnej.

Utrzymanie w niewoli i ekstrakcja jadu Tityus serrulatus (brazylijskiego żółtego skorpiona) w celu produkcji antyjadu

Scorpion envenomation is a public health problem in several tropical and subtropical countries. Tityus serrulatus Lutz and Mello, 1922 (Brazilian yellow ...

Protokół ten opisuje metodę utrzymywania skorpionów w celu ekstrakcji dużych ilości jadu, który jest stosowany do produkcji neutralizujących immunoglobulin pochodnych koni lub antyjadów. W krajach tropikalnych istnieje duże zapotrzebowanie na środki przeciw jadowi skorpionów, które są podstawą leczenia przypadków ludzi i jadu. Zabiegi pielęgnacyjne odtwarzają optymalne warunki naturalne, utrzymując skorpiony w niewoli.W związku z tym bierzemy pod uwagę dobrostan zwierząt i dobrą praktykę laboratoryjną. Równolegle ekstrakcja jadu opiera się na stymulacji elektrycznej ogonów skorpionów, przy minimalnym szkodliwym wpływie na zwierzęta. Protokół ten umożliwił nam wykładnicze zwiększenie liczby zwierząt trzymanych w niewoli, z 4 000 do 20 000 osobników w ciągu 10 lat.W tym samym czasie jad został wyekstrahowany w wystarczającym stopniu, aby uodpornić konie. Aby uzyskać osocze ze specyficznymi przeciwciałami, które są materiałem wyjściowym w procesie produkcyjnym, w wyniku którego powstaje około stu tysięcy fiolek antyjadu rocznie. Procedura dojenia jadu różni się od innych opisanych w literaturze, w której usuwa się telson, co ogranicza liczbę ekstrakcji na zwierzę.Zgromadzone doświadczenie techników naszej placówki pozwala nam na ekstrakcję jadu od 200 do 300 zwierząt w ciągu około jednej do półtorej godziny bez znieczulania zwierząt lub wykonywania innych inwazyjnych zabiegów. Zacznij od przygotowania pomieszczeń do trzymania skorpionów. Aby wygładzić ścianki pojemnika polipropylenowego pełniącego funkcję obudowy, należy umieścić 10 centymetrów samoprzylepnej taśmy plastikowej na jego wewnętrznej powierzchni, a także w górnych rogach pojemnika.Następnie wyłóż podłogę pojemnika polipropylenowego papierem rzemieślniczym, przymocowanym taśmą maskującą na krawędziach ze wszystkich stron. Ułóż cztery tace kartonowe jako pionowe podłoża po jednej stronie pojemnika, z sztywnym arkuszem tektury między każdą tacą. Umieść płytką tacę polipropylenową zawierającą nasączoną bawełnę jako źródło wody po przeciwnej stronie obudowy.Umieść skorpiony w przygotowanych wybiegach, a pojemniki umieść w pomieszczeniu utrzymywanym w temperaturze 24 stopni Celsjusza. Aby zapewnić pełną konserwację, najpierw wyjmij skorpiony z tacki na wodę. Następnie za pomocą długich kleszczy wyjmij tackę na wodę z obudowy.Umieść skorpiony w czystej obudowie. Usuń wszystkie skorpiony pozostawione na podłodze obudowy i umieść je w czystej obudowie. Następnie usuń pozostałą żywą zdobycz z pomieszczenia.Usuń wszystkie jednorazowe podłoża z obudowy i odpowiednio je wyrzuć przed odkażeniem przedmiotów wielokrotnego użytku, takich jak tacki na wodę i pojemniki, 0,5% roztworem podchlorynu. Na początek umieść skorpiony we wspólnych pojemnikach polipropylenowych jako obudowach. Oblicz ilość paszy w zależności od spożycia energii przez skorpiony.Następnie policz liczbę karaluchów jako zdobycz. Następnie nałóż węglan wapnia z alkoholem wokół górnej części obudowy, aby zapobiec wydostawaniu się karaluchów z obudowy. Umieść karaluchy w zagrodzie na dwa dni.W dniu ekstrakcji jadu policz żywe skorpiony w pomieszczeniu i za pomocą długich kleszczy przenieś je do szklanego pojemnika. Następnie należy rozmieścić cały niezbędny sprzęt potrzebny do ekstrakcji jadu na powierzchni komory przepływu powietrza. Podłącz przewód zasilający elektrostymulatora do gniazdka.Następnie włącz szafkę nawiewu i elektrostymulator. Ustaw wyświetlane parametry na elektrostymulatorze do ekstrakcji jadu. Za pomocą kleszczy przytrzymaj metasomę skorpiona, a następnie unieruchamij telson zakrzywionymi kleszczami, a następnie przytrzymuj go ręką.Po unieruchomieniu umieść telson w bezpośrednim kontakcie z przewodnikiem elektrostymulatora i zbierz krople jadu do plastikowej mikrorurki. Przenieś telson z dłoni na zakrzywione kleszcze i delikatnie umieść skorpiona na dnie szklanego pojemnika. Po wydojeniu wszystkich skorpionów umieść je z powrotem w zagrodzie.Przechowuj jad w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do liofilizacji. Produkcja jadu Tityus serrulatus przekracza 80 gramów płynnego jadu rocznie, co odpowiada ponad 13 gramom jadu liofilizowanego. Wskaźniki produkcji, takie jak średni jad wydojony na zwierzę, jad wyekstrahowany miesięcznie i skorpiony ekstrahowane miesięcznie, wykazały pozytywną linię trendu wskazującą na solidną produkcję.

captive-maintenance-venom-extraction-tityus-serrulatus-brazilian

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protokół ilościowego, wysokoprzepustowego badania ekspresji i analitycznego oczyszczania białek fuzyjnych z małych kultur Escherichia coli jest opisany i zastosowany do ekspresji bogatych w dwusiarczki białek jadu zwierzęcego.

Wysokoprzepustowe ilościowe badania przesiewowe i oczyszczanie stosowane do rekombinowanych, bogatych w dwusiarczki białek jadowych wytwarzanych w E. coli

Ten artykuł zawiera protokół ekstrakcji jadu z pająków za pomocą stymulacji elektrycznej w celu: 1) przeprowadzenia charakterystyki proteomicznej, 2) stymulowania ekspresji genów gruczołów jadowych oraz 3) przeprowadzenia badań funkcjonalnych jadów. Następnie opisano mikrodysekcje gruczołów jadowych do badań ekspresji genów.

Ekstrakcja jadu i mikrodysekcji gruczołów jadowych od pająków do analiz proteomicznych i transkryptomicznych

Chociaż wiele owadów z podrzędu Heteroptera (Insecta: Hemiptera) jest jadowitych, ich skład jadu i funkcje toksyn jadowych są w większości nieznane. Protokół ten opisuje metody zbierania jadów heteropterów w celu dalszej charakterystyki, przy użyciu elektrostymulacji, nękania i sekcji gruczołów.

Zbieranie toksyn jadowych z robaków zabójców i innych owadów heteroptera

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania surowego ekstraktu z jadu z ukwiału morskiego i wykrywania jego aktywności hemolitycznej i fosfolipazy.

Identyfikacja aktywności hemolitycznej i fosfolipazy w surowych ekstraktach z ukwiałów morskich za pomocą prostych testów biologicznych

Tutaj prezentujemy protokół ekstrakcji jadu z Trichogramma dendrolimi za pomocą sztucznego gospodarza stworzonego z folii polietylenowej i roztworu aminokwasów.

Ekstrakcja jadu z pasożytniczej osy Trichogramma dendrolimi przy użyciu sztucznego żywiciela

Niniejszy protokół demonstruje sposób hodowli zdrowych, niezróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (ES).

Hodowla i utrzymanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

W niniejszym filmie zaprezentowano protokół ekstrakcji DNA z materiału utrwalonego w formalinie i zatopionego w parafinie. Jest to procedura wielodniowa, w ramach której skrawki tkanek są deparafinowane ksylenem, rehydratowane etanolem i traktowane proteinazą K w celu oczyszczenia i wyizolowania DNA do późniejszej analizy genowo-specyficznej lub całego genomu.

Ekstrakcja DNA z materiału zatopionego w parafinie do analiz genetycznych i epigenetycznych

Niniejszy protokół opisuje regularną konserwację i pielęgnację w celu utrzymania optymalnych warunków chowu danio pręgowanych. Film przedstawia procedurę konserwacji systemu, bieżącego utrzymania, karmienia, rozrodu oraz hodowli larw danio pręgowanych.

Regularna pielęgnacja i konserwacja laboratorium rybek danio (Danio rerio): wprowadzenie

Opisano prosty protokół przygotowania ekstraktów z ludzkich tkanek, które służą jako źródło antygenów w funkcjonalnych testach limfocytów T. Metoda ta pozwala na pomiar odpowiedzi limfocytów T na antygeny pochodzące z tkanek in vitro.

Ekstrakcja antygenów tkankowych do analiz funkcjonalnych

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), oparte na wzroście pojedynczych komórek bez typu kolonijnego (NCM) zdysocjowanych pojedynczych komórek. Ta nowa metoda, wykorzystująca inhibitory kinaz związane z Rho lub izoformę lamininy 521 (LN-521), jest odpowiednia do wytwarzania dużych ilości jednorodnych hPSC, manipulacji genetycznych i odkrywania leków.

Alternatywne hodowle do produkcji, utrzymania i analizy genetycznej ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metody utrzymania i ekstrakcji jadu skorpiona Tityus serrulatus przy użyciu stymulacji elektrycznej. Protokół ten wspiera produkcję antyjadu dla brazylijskiego systemu ochrony zdrowia.

Utrzymanie w niewoli i ekstrakcja jadu Tityus serrulatus (brazylijskiego żółtego skorpiona) w celu produkcji antyjadu

Przeglądaj więcej filmów