Ocena zapalenia ośrodkowego układu nerwowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia

Jesteśmy zainteresowani zrozumieniem, jak zaczyna się autoimmunizacja i stwardnienie rozsiane (SM). W badaniu tym wykorzystano różne podejścia do zbadania, w jaki sposób czynniki ryzyka związane ze stwardnieniem rozsianym prowadzą do rozwoju autoimmunizacji. Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) to mysi model stwardnienia rozsianego, który można wykorzystać do zbadania wpływu różnych czynników ryzyka na autoimmunizację.

Niedawno odkryliśmy biologiczną ścieżkę, w jaki sposób jeden z czynników ryzyka stwardnienia rozsianego, otyłość, prowadzi do zwiększonego stanu zapalnego autoimmunologicznego u myszy. Badania nad modelem EAE miały kluczowe znaczenie dla rozwikłania tych mechanizmów. Nasilenie choroby EAE jest często oceniane w pięciopunktowej skali klinicznej, jednak skala ta ma ograniczoną czułość i nie jest w stanie odróżnić, czy deficyty kliniczne są spowodowane stanem zapalnym, czy uszkodzeniem tkanek.

Histologia rdzenia kręgowego i mózgu jest złotą metodą oceny stanu zapalnego i uszkodzenia tkanek w EAE. Protokół ten zapewnia prostą metodę pomiaru stanu zapalnego i uszkodzenia tkanek w rdzeniu kręgowym i mózgu podczas EAE, nasz protokół może być stosowany wraz ze skalą kliniczną, aby lepiej scharakteryzować nasilenie EAE, Nasz protokół mierzy kluczowe cechy histologiczne EAE, w tym infiltrację immunologiczną, demielinizację, uszkodzenie aksonów w rdzeniu kręgowym i zapalenie mózgu. Obejmuje również pomiar światła neurofilamentów w surowicy myszy, co wskazuje na zakres uszkodzenia OUN.

Ten kompleksowy protokół zapewnia bardziej szczegółową charakterystykę EAE niż użycie tylko jednego markera. Na początek użyj kleszczy, aby chwycić skórę na czubku głowy myszy poddanej eutanazji, a następnie wykonaj 2,5-centymetrowe nacięcie za pomocą nożyczek chirurgicznych. Użyj palców, aby popchnąć skórę na głowie na boki, aby uwidocznić leżącą pod spodem czaszkę.

Następnie, za pomocą standardowych kleszczyków Adson, chwyć za oczodoły, aby ustabilizować głowę. Za pomocą cienkich nożyczek wykonaj małe nacięcia w czaszce wzdłuż linii środkowej od kręgosłupa szyjnego do opuszki węchowej. Użyj kleszczy Adson z zębami, aby odbić otwartą czaszkę, aby odsłonić leżący pod nią mózg.

Przytrzymaj mózg za pomocą ręki niedominującej. Z zamkniętymi nożyczkami w dominującej ręce zgarnij rdzeń kręgowy z kręgosłupa szyjnego i delikatnie wypchnij mózg z czaszki, przecinając nerwy czaszkowe. Umieść mózg w stożkowej probówce zawierającej 10 mililitrów 10% neutralnej buforowanej formaliny.

Następnie naciąć futro wzdłuż linii środkowej wzdłuż linii środkowej tułowia myszy od szyi do ogona. Użyj palców, aby popchnąć skórę na boki, aby uwidocznić kręgosłup. Za pomocą nożyczek chirurgicznych przeciąć w dół kręgosłup w miejscu przyczepienia kości udowej do biodra, a następnie przeciąć ścianę ciała po każdej stronie kręgosłupa, od biodra do szyi.

Umieść kręgosłup zawierający rdzeń kręgowy w tej samej rurce, w której znajduje się mózg i formalina. Na początek użyj nożyczek, aby wyciąć mały kawałek papieru do soczewek i umieść go na szalce Petriego. Następnie wlej formalinę zawierającą nieruchomy mózg i kręgosłup wyizolowany od myszy do lejka wyłożonego bibułą filtracyjną.

Przenieś mózg i kręgosłup na pustą szalkę Petriego. Użyj skalpela, aby podzielić mózg na sześć koronalnych części. Za pomocą kleszczy przenieś próbki mózgu na jedną połowę papieru do soczewek na szalce Petriego.

Przetnij rdzeń kręgowy na trzy części za pomocą skalpela, a następnie odetnij kawałek kręgosłupa krzyżowego na końcu ogonowym, aż rdzeń kręgowy stanie się widoczny. Podnieś kręgosłup piersiowy ręką niedominującą. Weź kleszcze Adson z zębami mocno zamkniętymi w dominującej dłoni i delikatnie wepchnij koniec w mniejszy otwór kręgosłupa delikatnym ruchem skręcającym.

Następnie za pomocą kleszczy delikatnie wyciągnij wyłaniający się rdzeń kręgowy z kolumny. Umieść kawałek przewodu na szalce Petriego zawierającej papier do soczewek. Za pomocą skalpela podziel trzy kawałki rdzenia kręgowego na mniejsze kawałki o przekroju poprzecznym.

Ułóż te kawałki na tej samej połowie papieru do soczewek, na którym znajdują się kawałki mózgu. Złóż papier do soczewek, aby ułożyć na nim kawałki chusteczek i umieść go w oznaczonej kasecie. Przenieś kasetę do słoika na próbkę zawierającego formalinę.

Po inkubacji przenieś kasetę z pojemnika na próbkę do pierwszej kąpieli formalinowej w automatycznym procesorze tkanek i uruchom procesor na noc. Następnego dnia wyjmij kasety z procesora tkanek i przenieś je do ciepłej komory przetrzymywania stacji zatapiania parafiny. Wlej wosk parafinowy, aby pokryć dno formy.

Za pomocą cienkich kleszczy umieść kawałki przekroju poprzecznego mózgu i rdzenia kręgowego w parafinie na dnie formy. Przenieś formę na powierzchnię chłodzącą na kilka sekund, aby utrwalić mózg i próbki na miejscu. Przenieś formę z powrotem na rozgrzaną powierzchnię i napełnij ją do góry gorącą parafiną.

Umieść pokrywę kasety oznaczoną identyfikatorem próbki na formie. Wlej parafinę na pokrywę kasety. Przenieś formę do stacji chłodzącej, aby wosk stwardniał.

Gdy bloki całkowicie ostygną, zabezpiecz je na obrotowym mikrotomie. Przyciąć bloki i wyciąć pięciomikrometrowe odcinki każdego bloku parafiny. Przenieś wstęgę parafinową do łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza.

Zebrać wycinek z łaźni wodnej na oznakowane szkiełko. Umieść szkiełka w plastikowym ruszcie do szkiełków i piecz kawałki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w suchym piekarniku. Po zeskanowaniu otwórz obraz J, a następnie przeciągnij i upuść obraz TIFF sekcji do analizy.

Obserwuj przekrój rdzenia kręgowego w czterech kwadrantach i oceniaj obecność zmian demielinizacyjnych w każdym kwadrancie. Ta sekcja ma wynik cztery, ponieważ zmiany chorobowe występują we wszystkich czterech kwadrantach. Ta sekcja zdobywa jeden, ponieważ zmiany znajdują się tylko w jednym kwadrancie.

Barwienie CD45 wskazuje na obecność leukocytów w zmianach chorobowych. Nowe zmiany zawierają wiele komórek CD45 w porównaniu ze starszymi. Natomiast nowe zmiany mogą zawierać mniej aksonów SMI-32 dodatnich w porównaniu ze starszymi zmianami.

Myszy w grupie typu dzikiego rozwinęły ciężkie EAE z całkowitym paraliżem, podczas gdy grupa OGR1 Knockout rozwinęła łagodną chorobę. Ta różnica w wyniku klinicznym odpowiadała zmianom w zmianach demielinizacyjnych podoponowych, w procentowym obszarze mieliny wybarwionym w rdzeniu kręgowym. Co więcej, procentowa frakcja mieliny również różniła się znacznie między OGR1 a myszami typu dzikiego i korelowała ze skumulowanym wynikiem EAE.

W EAE stan zapalny w mózgu jest zlokalizowany głównie w móżdżku i pniu mózgu. Dodatkowe obszary zapalne mogą być widoczne w mózgu, w tym w oponach mózgowych, w pobliżu komór oraz w innych drogach istoty białej, takich jak nerw wzrokowy i ciało modzelowate. Światło neurofilamentu w surowicy, mierzone za pomocą testu z małą matrycą molekularną, wykryło wyższe poziomy światła neurofilamentu w surowicy u myszy z EAE w porównaniu ze zdrowymi myszami, a te podwyższone poziomy korelowały z gęstością SMI-32 dodatniego w rdzeniu kręgowym.