Name: Ocena zapalenia ośrodkowego układu nerwowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Poznaj metodę oceny zapalenia, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w modelu EAE u myszy. Protokół obejmuje analizę histologiczną oraz pomiar neurofilamentów we krwi jako biomarkerów uszkodzenia OUN.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Raymondowi Sobelowi (Uniwersytet Stanforda) za pokazanie nam swojej metody na utwardzanie i naprawianie odcinków mózgu i rdzenia kręgowego. Dziękujemy Kyle'owi Robertonowi i Milanowi Ganguly'emu z Toronto Centre for Phenogenomics za poznanie metody osadzania i za wycięcie tak wielu odcinków naszego mózgu i rdzenia kręgowego. Dziękujemy dr Matthew Cussickowi i dr Robertowi Fujinami (University of Utah) za podzielenie się swoimi protokołami oceny zapalenia podoponowego i okołonaczyniowego w rdzeniu kręgowym. Dziękujemy Shalinie Ousman za podzielenie się klonem przeciwciała CD45. Dziękujemy firmie Xiofang Lu za szkolenie w zakresie procesora tkanek i stacji do osadzania tkanek oraz konserwację tego sprzętu w Centrum Badawczym Badań Biomedycznych Keenan w Szpitalu św. Michała. Prace te były wspierane przez grant biomedyczny z MS Canada (dla SED). Carmen Ucciferri jest stypendystką rządu Kanady. Nuria Alvarez-Sanchez jest wspierana przez stypendium podoktorskie Keenan.

Histological Staining of Spinal Cord for Assessing EAE Disease Severity

<ol><li>Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+as+a+model+for+multiple+sclerosis+%28MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS).</a> Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).</li>
<li>Rasouli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GM-CSF+in+T+is+increased+in+multiple+sclerosis+and+suppressed+by+IFN-beta+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expression of GM-CSF in T is increased in multiple sclerosis and suppressed by IFN-beta therapy.</a> J Immunol. 194 (11), 5085-5093 (2015).</li>
<li>Zrzavy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+%27homeostatic%27+microglia+and+patterns+of+their+activation+in+active+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Loss of 'homeostatic' microglia and patterns of their activation in active multiple sclerosis.</a> Brain. 140 (7), 1900-1913 (2017).</li>
<li>Kutzelnigg, A., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+multiple+sclerosis+and+related+inflammatory+demyelinating+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Handb+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pathology of multiple sclerosis and related inflammatory demyelinating diseases.</a> Handb Clin Neurol. 122, 15-58 (2014).</li>
<li>Glatigny, S., Bettelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+as+animal+models+of+multiple+sclerosis+%28MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as animal models of multiple sclerosis (MS).</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (11), (2018).</li>
<li>Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+animal+models%3A+A+clinical+and+histopathological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis animal models: A clinical and histopathological perspective.</a> Brain Pathol. 27 (2), 123-137 (2017).</li>
<li>Nikic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).</li>
<li>Croxford, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytokine+GM-CSF+the+inflammatory+signature+of+CCR2%2B+monocytes+and+licenses+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The cytokine GM-CSF the inflammatory signature of CCR2+ monocytes and licenses autoimmunity.</a> Immunity. 43 (3), 502-514 (2015).</li>
<li>Jones, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+pathological+outcomes+in+MOG+35-55+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Neuroimmunol. 199 (1-2), 83-93 (2008).</li>
<li>Zuo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+gray+matter+demyelination+is+associated+with+leptomeningeal+neutrophil+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Age-dependent gray matter demyelination is associated with leptomeningeal neutrophil accumulation.</a> JCI Insight. 7 (12), 158144(2022).</li>
<li>Bannerman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+pathology+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%3A+Studies+in+thy1-yfp+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Motor neuron pathology in experimental autoimmune encephalomyelitis: Studies in thy1-yfp transgenic mice.</a> Brain. 128, 1877-1886 (2005).</li>
<li>Cahill, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aged+hind-limb+clasping+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+models+aspects+of+the+neurodegenerative+process+seen+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aged hind-limb clasping experimental autoimmune encephalomyelitis models aspects of the neurodegenerative process seen in multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (45), 22710-22720 (2019).</li>
<li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1810-1819 (2006).</li>
<li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1952-1960 (2006).</li>
<li>Drohomyrecky, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-delta+acts+within+peripheral+myeloid+cells+to+limit+the+expansion+of+myelin-reactive+T+cells+during+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-delta acts within peripheral myeloid cells to limit the expansion of myelin-reactive T cells during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).</a> J. Immunol. 10, 2588-2601 (2019).</li>
<li>Osorio-Querejeta, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+innovative+animal+monitoring+device+for+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28%26%2334%3BI+am+D+EAE%26%2334%3B%29%3A+A+more+detailed+evaluation+for+improved+results%5BTitle%5D)+AND+%22Mult+Scler+Relat+Disord%22%5BJournal%5D)">The innovative animal monitoring device for experimental autoimmune encephalomyelitis (&#34;I am D EAE&#34;): A more detailed evaluation for improved results.</a> Mult Scler Relat Disord. 63, 103836(2022).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+diverse+assessment+indicators+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Vis Exp. (187), e63866(2022).</li>
<li>Shahi, S. K., Freedman, S. N., Dahl, R. A., Karandikar, N. J., Mangalam, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+disease+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis+using+a+novel+infrared-based+automated+activity-monitoring+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Scoring disease in an animal model of multiple sclerosis using a novel infrared-based automated activity-monitoring system.</a> Sci Rep. 9, 19194(2019).</li>
<li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 12 (4), 400-403 (1953).</li>
<li>Disanto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+neurofilament+light%3A+A+biomarker+of+neuronal+damage+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Serum neurofilament light: A biomarker of neuronal damage in multiple sclerosis.</a> Ann Neurol. 81 (6), 857-870 (2017).</li>
<li>Novakova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+disease+activity+in+multiple+sclerosis+using+serum+neurofilament+light+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Monitoring disease activity in multiple sclerosis using serum neurofilament light protein.</a> Neurology. 89 (22), 2230-2237 (2017).</li>
<li>Pouzol, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Act-1004-1239%2C+a+first-in-class+CXCR7+antagonist+with+both+immunomodulatory+and+promyelinating+effects+for+the+treatment+of+inflammatory+demyelinating+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Act-1004-1239, a first-in-class CXCR7 antagonist with both immunomodulatory and promyelinating effects for the treatment of inflammatory demyelinating diseases.</a> FASEB J. 35 (3), 21431(2021).</li>
<li>Breakell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obinutuzumab-induced+B-cell+depletion+reduces+spinal+cord+pathology+in+a+CD20+double+transgenic+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Obinutuzumab-induced B-cell depletion reduces spinal cord pathology in a CD20 double transgenic mouse model of multiple sclerosis.</a> Int J Mol Sci. 21 (18), 6864(2020).</li>
<li>Aharoni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effect+of+glatiramer+acetate+on+neurofilament+light+chain+leakage+and+glutamate+excess+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effect of glatiramer acetate on neurofilament light chain leakage and glutamate excess in an animal model of multiple sclerosis.</a> Int J Mol Sci. 22 (24), 13419(2021).</li>
<li>Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+distinguish+phosphorylated+and+nonphosphorylated+forms+of+neurofilaments+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (19), 6126-6130 (1983).</li>
<li>Mouse spinal brain map. , Available from: 
 <a target="_blank" href="Https://Mousespinal.Brain-Map.Org/Imageseries/Showref.Html">Https://Mousespinal.Brain-Map.Org/Imageseries/Showref.Html</a> (2023).</li>
<li>Kuhle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+neurofilament+is+associated+with+progression+of+brain+atrophy+and+disability+in+early+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Serum neurofilament is associated with progression of brain atrophy and disability in early MS.</a> Neurology. 88 (9), 826-831 (2017).</li>
<li>Benkert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+neurofilament+light+chain+for+individual+prognostication+of+disease+activity+in+people+with+multiple+sclerosis%3A+A+retrospective+modelling+and+validation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Serum neurofilament light chain for individual prognostication of disease activity in people with multiple sclerosis: A retrospective modelling and validation study.</a> Lancet Neurol. 21 (3), 246-257 (2022).</li>
<li>D'Souza, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OGR1%2FGPR68+modulates+the+severity+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+regulates+nitric+oxide+production+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">OGR1/GPR68 modulates the severity of experimental autoimmune encephalomyelitis and regulates nitric oxide production by macrophages.</a> PLoS One. 11 (2), 0148439(2016).</li>
<li>Imagej. , Available from: 
 <a target="_blank" href="Https://www.imagej.nih.gov/lj/download.html">Https://www.imagej.nih.gov/lj/download.html</a> (2023).</li>
<li>Openmicroscopy. , Available from: 
 <a target="_blank" href="Https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads">Https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads</a> (2023).</li>
<li>Doroshenko, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-delta+deficiency+in+microglia+results+in+exacerbated+axonal+injury+and+tissue+loss+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-delta deficiency in microglia results in exacerbated axonal injury and tissue loss in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Front Immunol. 12, 570425(2021).</li>
<li>Soulika, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+and+progression+of+axonopathy+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Initiation and progression of axonopathy in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Neurosci. 29 (47), 14965-14979 (2009).</li>
<li>Trapp, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transection+in+the+lesions+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 338 (5), 278-285 (1998).</li>
<li>Lassmann, H., Bradl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+Experimental+models+and+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: Experimental models and reality.</a> Acta Neuropathol. 133 (2), 223-244 (2017).</li>
</ol>

Shannon Dunn konsultuje się z FSD Lucid Psycheceuticals.

Barwienie histologiczne rdzenia kręgowego jest ważnym narzędziem w ocenie ciężkości choroby EAE, szczególnie w przypadkach, gdy występują różnice między grupami leczonymi w zakresie powrotu do zdrowia w fazie ostrej choroby. Barwienie pod kątem infiltracji komórek odpornościowych (CD45), mieliny (LFB) i uszkodzenia aksonów (SMI-32) pomaga scharakteryzować podstawową przyczynę zmienionych wyników klinicznych u myszy. Opisany tutaj protokół barwienia histologicznego zapewnia perspektywę stanu zapalnego, a także zakresu uszkodzenia mieliny i aksonów. Co więcej, przedstawione wyniki potwierdzają, że pomiar sNF-L jest metodą oceny zakresu ogólnego uszkodzenia neuronów w EAE.
Krytycznymi parametrami tej analizy jest zapewnienie, że badacze są ślepi na tożsamość odcinków i że na każdym poziomie rdzenia kręgowego u różnych myszy pobierane jest równoważne próbkowanie. Dzieje się tak, ponieważ nasilenie stanu zapalnego może być większe na niższych poziomach rdzenia. Kolejnym krytycznym parametrem jest wielkość grup eksperymentalnych. Rdzenie kręgowe i mózgi są zwykle pobierane od 6-8 myszy na grupę w punkcie końcowym, aby zobaczyć znaczące różnice między grupami z leczeniem lub genotypami o umiarkowanych rozmiarach efektu. Ważne jest również, aby upewnić się, że wybrane myszy, po uśrednieniu, mają reprezentatywne średnie wyniki całej grupy. Jeśli chodzi o rozwiązywanie problemów, częstym problemem napotykanym przez osoby, które nie mają doświadczenia z protokołem, jest to, że rdzeń kręgowy jest zamocowany na niezbyt długi czas i nie jest łatwo wytłoczony z kręgosłupa. W takim przypadku rdzeń kręgowy można ręcznie wyciąć z kolumny, przycinając wzdłuż wyrostków kolczystych za pomocą cienkich nożyczek i otwierając kolumnę, aby odsłonić rdzeń kręgowy. Alternatywnie, tkanki można utrwalić przez kilka dodatkowych dni bez ingerencji w powodzenie barwienia przeciwciałami. Opisane tutaj klony przeciwciał działają w tkance utrwalonej do 2 tygodni w formalinie.
Osadzanie fragmentów rdzenia kręgowego wymaga umiejętności i praktyki. Zaleca się noszenie lup ocznych i skierowanie lampy na stację osadzania, aby lepiej zobaczyć, czy sekcje spadają w przekroju, czy w przekroju wzdłużnym. Utrzymywanie długości kawałków rdzenia kręgowego na poziomie mniejszym niż 2 mm podczas wbijania brutto pomoże im spaść w przekroju. Innym częstym problemem napotykanym przez mniej doświadczonych użytkowników jest to, że LFB odparowuje podczas nocnej inkubacji, pozostawiając połowę szkiełka poplamioną, a połowę niezabarwioną. Aby uniknąć parowania, szklane naczynie do barwienia należy uszczelnić folią termoplastyczną, a następnie folią. Jeśli dojdzie do parowania, a sekcje są nierównomiernie zabarwione, zaleca się całkowite odniebieszczenie szkiełek węglanem litu i ponowne zabarwienie ich w LFB przez noc. Innym częstym problemem jest to, że użytkownicy nie usuwają w pełni niebieskiej istoty szarej po LFB. Bardzo ważne jest, aby zbadać poszczególne sekcje pod mikroskopem, aby upewnić się, że osiągnięto wystarczającą ilość odniebieszczenia przed przystąpieniem do innych kroków w protokole. Ponadto, mimo że barwienia IHC CD45 i SMI-32 działają solidnie, nadal ważne jest, aby rozwiązywać problemy ze stężeniami przeciwciał we wstępnych eksperymentach dla każdej otrzymanej nowej partii przeciwciał. Można to zrobić, testując różne stężenia przeciwciała na odcinku kontroli pozytywnej (rdzeń kręgowy EAE). Barwienie po raz pierwszy powinno również obejmować kontrolę ujemną, która składa się z samego przeciwciała drugorzędowego bez dodatku przeciwciała pierwszorzędowego. Wreszcie, w analizie obrazu bardzo ważne jest, aby określić progi poszczególnych obrazów, ponieważ barwienie może być nierówne na slajdach lub sekcjach.
Protokół ten korzysta z ogólnodostępnego oprogramowania. Jeśli ktoś nie ma dostępu do procesora, urządzenia do osadzania lub mikrotomu, kroki te można wykonać w szpitalnym rdzeniu patologicznym, który oferuje te usługi. Ponadto, jeśli nie masz dostępu do skanera slajdów, możesz użyć mikroskopu świetlnego, który jest wyposażony w kamerę wideo, aby zapisać obrazy TIFF rdzenia kręgowego lub obszarów mózgu. W przypadku przepływu pracy opartego na mikroskopie uchwyć skrawki LFB lub LFB/H&E przy małej mocy (40-krotne powiększenie), a w przypadku barwienia CD45 i SMI-32 zobrazuj co najmniej cztery okna, które są wyśrodkowane w brzusznej, grzbietowej i bocznej części rdzenia kręgowego (powiększenie 200x dla CD45 i powiększenie 400x dla SMI-32). Na tych obrazach można przeprowadzić analizę obrazu w celu ilościowego określenia barwienia w podobny sposób, jak opisano.
Decyzja o tym, jakie podejście histologiczne należy zastosować w celu uzyskania oceny EAE, zależy od tego, jak bardzo wyniki kliniczne różnią się między grupami. Na przykład, jeśli istnieją drastyczne różnice w wyniku klinicznym EAE (jedna grupa otrzymała EAE, a druga nie), zwykle odnosi się to do różnic w zapaleniu o podłożu obwodowym. W takim przypadku ocena pod kątem obecności zmian demielinizacyjnych na skrawkach wybarwionych LFB/H&E jest wystarczająca i ujawni różnice między grupami. Jeśli grupy są bardziej podobne pod względem wyniku klinicznego na początku, a zamiast tego występują różnice w zakresie wyzdrowienia klinicznego (np. eksperyment na rycinie 5A), najlepiej jest zastosować pełny histologiczny przepływ pracy, który jest tutaj opisany, w tym ocenę stanu zapalnego mózgu w pniu mózgu i móżdżku, aby rozróżnić, czy różnice w przewlekłości choroby odnoszą się do różnic w stanie zapalnym lub uszkodzeniu tkanek. Jeśli różnice w stanie zapalnym zostaną znalezione zgodnie z oceną zliczając CD45, można przeprowadzić dalsze badania IHC w celu barwienia limfocytów T (anty-CD3), naciekających monocytów/makrofagów (Mac3) i mikrogleju (Iba-1/TMEM119) (zalecane klony przeciwciał znajdują się w Tabeli Uzupełniającej 3). Aktywacja mikrogleju znajduje odzwierciedlenie we wzroście intensywności barwienia Iba-1 na podwójnie znakowanym mikrogleju Iba-1 + TMEM-19 + i zwiększonej retrakcji procesów mikrogleju, które można ocenić za pomocą analizy Sholla na sekcjach32. Co więcej, techniki takie jak cytometria przepływowa lub sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek mogą być stosowane do przeprowadzenia głębszej charakterystyki częstotliwości i fenotypu populacji immunologicznych w mózgu i rdzeniu kręgowym.
Liczenie aksonów SMI-32+ jest czułą metodą wykrywania uszkodzeń aksonów w EAE32,33 i MS34. SMI-32, który wykrywa nieufosforylowaną formę ciężkiego lub średniego neurofilamentu gromadzącego się w cebulkach końcowych przeciętych neuronów. Alternatywą dla wykrywania uszkodzonych aksonów jest barwienie białkiem prekursorowym amyloidu (APP), które może gromadzić się w aksonach w wyniku zakłóconego transportu aksonów33. Wzór barwienia dla SMI-32 i APP, chociaż oba odzwierciedlają uszkodzenie aksonów, zazwyczaj nie nakładają się na siebie, co wskazuje, że wykrywają różne patologie33. Można również uzupełnić histologiczne pomiary uszkodzenia aksonów, mierząc sNF-L, który jest szybką i czułą miarą trwającego uszkodzenia aksonów zarówno w rdzeniu kręgowym, jak i w mózgu. Ma to tę zaletę, że można to zrobić w pół dnia u żywych myszy. Wadą tej metody jest to, że zestawy są drogie, a maszyna jest wysoce wyspecjalizowana. Firma sprzedająca zestaw sNF-L oferuje opłatę za serwis dla tych, którzy nie mają dostępu do maszyny SIMOA. Alternatywą dla oceny uszkodzenia aksonów jest ocena utraty aksonów poprzez zliczenie aksonów w zabarwionych na niebiesko toluidynie odcinkach rdzenia kręgowego12 lub zliczenie wiązek neurofilamentów wykrytych przez SMI-31 w obszarach istoty białej rdzenia kręgowego32. Oba te podejścia są bardziej pracochłonne niż pomiar SMI-32 lub sNF-L.
Jeśli wyniki kliniczne EAE różnią się między grupami, ale ocena stanu zapalnego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów nie ujawnia różnic między grupami, przydatne może być barwienie w celu aktywacji astrocytów za pomocą GFAP (patrz Tabela uzupełniająca 3 dla zalecanego klonu przeciwciała). Aktywacja astrocytów wiąże się ze wzrostem barwienia GFAP i wykazano, że koreluje to z progresją EAE w niektórych modelach EAE, w tym przewlekłym EAE u szczura DA35.
Podsumowując, protokół ten opisuje metody i zapewnia przepływ pracy analizy w celu przeprowadzenia oceny histologicznej EAE.

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) jest najczęstszym mysim modelem ludzkiej choroby demielinizacyjnej, stwardnienia rozsianego (MS)1. Klasyczna patologia zapalna SM, w tym naciekanie IFN-γ (gamma) i limfocytów pomocniczych T wytwarzających IL-172, naciek zapalnych monocytów3, powstawanie okołonaczyniowych i podoponowych zapalnych zmian demielinizacyjnych4, oraz występowanie uszkodzenia aksonów4 w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), obserwuje się również w EAE5,6,7,8,9. Podobieństwo w mechanizmach immunologicznych między EAE i SM sprawiło, że EAE jest odpowiednim modelem przedklinicznym do testowania skuteczności i mechanizmów działania wielu zatwierdzonych terapii immunologicznych SM, w tym natalizumabu, fingolimodu, fumaranu dimetylu i octanu glatirameru (recenzja w1,5). Niektóre schematy EAE modelują inne aspekty postępującej patologii stwardnienia rozsianego poza uszkodzeniem aksonów, w tym rozwój zapalenia podoponowego w mózgu, przewlekłą demielinizację, zanik rdzenia kręgowego, synapsę i utratę neuronów6,10,11,12. W związku z tym EAE ma zastosowanie do badań przesiewowych skuteczności terapii neuroprotekcyjnych w SM.
EAE jest indukowane u gryzoni na wiele sposobów. Aktywna immunizacja jest najpowszechniejszą metodą indukcji i polega na immunizacji gryzoni antygenami mielinowymi (całymi białkami lub peptydami) zemulgowanymi w CFA uzupełnionymi zabitymi termicznie Mycobacterium tuberculosis13. W zależności od szczepu myszy, toksyna krztuścowa (PTX) jest również podawana w 0 i 2 dniu szczepienia w celu zwiększenia penetracji choroby13. EAE może być również indukowany przez adoptywny transfer limfocytów T specyficznych dla mieliny uzyskanych od myszy z rdzeniem mielinowym/CFA do zdrowych myszy14 lub może rozwijać się spontanicznie u myszy z nadekspresją receptorów limfocytów T specyficznych dla głównych antygenów mielinowych5.
nasilenie i postęp choroby EAE są zwykle oceniane za pomocą dyskretnej 5-punktowej skali klinicznej: 1 – wiotkość ogona, 2 – osłabienie kończyn tylnych lub stóp, 3 – całkowity paraliż jednej lub obu kończyn tylnych, 4 – osłabienie kończyn przednich, 5 – konające lub martwe13. Ten kliniczny system punktacji jest solidny w dokumentowaniu postępu paraliżu wstępującego, który występuje na początku choroby, ale jest mniej czuły w uchwyceniu zakresu powrotu do zdrowia po atakach zapalnych OUN. Na przykład zarówno myszy, które poruszają się z trudnościami, jak i myszy, które poruszają się łatwo, ale wykazują słabość chwytania stóp, otrzymują wynik 2 w skali EAE. Wyniki mogą pozostać wysokie w fazie poostrej EAE ze względu na obecność trwałego uszkodzenia lub utraty aksonów, nawet pomimo ustąpienia odpowiedzi zapalnej9. Podjęto wiele prób opracowania bardziej wyrafinowanych systemów punktacji, testów behawioralnych, pomiarów siły kończyn tylnych i siły chwytu oraz systemów monitorowania w podczerwieni, aby lepiej uchwycić różnice w deficytach klinicznych w EAE9,16,17,18; Jednak te bardziej skomplikowane pomiary punktacji nie rozróżniają udziału stanu zapalnego i uszkodzenia tkanek w leżących u podstaw deficytów neurologicznych. W związku z tym złotym standardem podejścia do oceny nasilenia EAE jest przeprowadzenie zarówno oceny klinicznej, jak i histologicznej.
Tutaj opisany jest protokół dotyczący preparowania i osadzania próbek rdzenia kręgowego i mózgu myszy w parafinie w sposób, który oddaje stochastyczny proces powstawania zmian, który występuje w EAE. Przedstawiono również protokół barwienia skrawków za pomocą Luxol fast blue (LFB), pierwotnie stworzonego przez Kluvera i Barrera19, który wykrywa mielinę w OUN. Skrawki są albo barwione samym LFB (do analizy demielinizacji), albo są barwione przeciwwagowo hematoksyliną i eozyną (H&E), aby pomóc w wizualizacji i ocenie zmian zapalnych. Dostarczono również protokoły do ilościowego określenia obecności całkowitej liczby leukocytów (CD45), utraty mieliny i liczby uszkodzonych aksonów (SMI-32) w rdzeniu kręgowym przy użyciu komercyjnie dostępnych przeciwciał, technik immunohistochemicznych (IHC) i publicznie dostępnego oprogramowania. Protokół stosowany do ilościowego oznaczania leukocytów w rdzeniu kręgowym może być również stosowany do ilościowego oznaczania leukocytów w mózgu.
Ocena histologiczna utraty i uszkodzenia aksonów w mózgu jest stosunkowo trudniejsza niż w rdzeniu kręgowym, ponieważ drogi istoty białej mózgu nie biegną równolegle do siebie. Pomiar światła neurofilamentów w surowicy (sNF-L) okazał się obiecującym biomarkerem uszkodzenia neuronów w MS20,21. Ostatnie badania rozszerzyły tę technologię na EAE22,23,24. W tym miejscu przedstawiono metodę pomiaru światła neurofilamentów w surowicy (sNF-L) u żywych myszy za pomocą testu drobnocząsteczkowego (SIMOA). Ta metoda wymaga tylko niewielkiej ilości surowicy i można ją wykonać na żywych myszach w ciągu zaledwie pół dnia, zapewniając szybką informację zwrotną na temat tego, jak testowana terapia wpływa na ogólne uszkodzenie OUN. Wszystkie opisane tutaj metody można zastosować do myszy dowolnej płci lub szczepu.

<table><tbody><tr><td>10% neutralna buforowana formalina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>Służy do mocowania rdzenia kręgowego i próbek mózgu</td></tr><tr><td>1000 ml Szklana zlewka</td><td>Pyrex</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Falcon Tube</td><td>Starstedt</td><td>62.554.100</td><td>Mocowanie i przechowywanie rdzenia kręgowego i mózgu</td></tr><tr><td>250 mL Kolba Erlenmeyera</td><td>Pyrex</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>500 ml Szklana zlewka</td><td>Pyrex</td><td>1003</td><td></td></tr><tr><td>92 mm x 16 mm Szalki Petriego</td><td>Starstedt</td><td>82-1473-001</td><td>Stosowany w procedurze udrażniania tkanek</td></tr><tr><td>95% alkohol etylowy</td><td>Alkohole komercyjne</td><td>P016EA95</td><td>Etapy odwodnienia i nawodnienia</td></tr><tr><td>Zestaw ABC Elite Vector</td><td>Labratories</td><td>PK6100</td><td>Używany do znakowania immunohistochemicznego</td></tr><tr><td>Aqua Hold 2 PAP Pen</td><td>Cole Parmer</td><td>UZ-75955-53</td><td>Służy do rysowania wokół skrawków tkanek w barwieniu immunohistochemicznym</td></tr><tr><td>Zestaw blokujący awidin / biotynę</td><td>Vector Labratories</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>Szafka bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>biotynylowana królicza anty-szczurza IgG</td><td>Wektor Labratory</td><td>BA-4000</td><td>Używany do barwienia CD45</td></tr><tr><td>C57BL6 / J Myszy</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Stock # 664</td><td>Te myszy były używane w eksperymentach pokazane na papierze.</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Sorvall ST Plus</td><td></td></tr><tr><td>CitriSolv</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-121</td><td>Służy do usuwania wosku. Jest alternatywą dla ksylenu</td></tr><tr><td>DAB Kit</td><td>Vector Labratories</td><td>SK-4100</td><td>Służy do rozwoju w immunohistochemii</td></tr><tr><td>ddH2O</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Jednorazowy skalpel</td><td>Magna</td><td>M92-10</td><td>Używany do obrzydliwego rdzenia kręgowego i mózgu</td></tr><tr><td>DWK Life Sciences (Wheaton) szklane naczynie do barwienia</td> Cole <td>Parmer</td><td>UZ-48585-60</td><td>Służy do barwienia histochemicznego i płukania</td></tr><tr><td>Stojak do barwienia szkła DWK Life Sciences (Wheaton)</td><td>Cole Parmer</td><td>10061392</td><td>Używany do immunohistochemii i histochemii</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Bioshop</td><td>173772-87-1</td><td>Plamy cytoplazma</td></tr><tr><td>Pióra Mikrotomy Ostrza</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-634-1C</td><td>Służy do cięcia parafiny</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Whatman</td><td>1001110</td><td>Służy do filtrowania formaliny (podczas obrzydliwości) i luxol fast blue</td></tr><tr><td>Drobne nożyczki chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>14160-10</td><td>Służy do wycinania mózgu i czaszki</td></tr><tr><td>Dymion</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14190944</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>BioShop</td><td>ACE333.4</td><td>Stosowany w procedurze szybkiego barwienia luxol</td></tr><tr><td>Blue Pojemniki histologiczne Histoplex</td><td>Starplex Naukowy</td><td>565-060-26</td><td>Mocowanie rdzenia kręgowego i mózgu</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Fisher Chemicals</td><td>H325-500</td><td>Służy do usuwania endogennej peroksydazy w tkance</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Kimtech Science</td><td>Kimberly Clark Professional</td><td>34155</td><td>Używany do immunohistochemii</td></tr><tr><td>Papier do soczewek</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td>Służy do wychwytywania gatunków rdzenia kręgowego w kasecie podczas przetwarzania Mikroskop</td></tr><tr><td>świetlny</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>węglanów litu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>554-13-3</td><td>Odniebieczanie po szybkim barwieniu luxolem</td></tr><tr><td>Luxol niebieski</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1328-51-4</td><td>Plamy CNS mielina</td></tr><tr><td>MOM Zestaw do immunodetekcji</td><td>Wektorowe labustory</td><td>BMK-2202</td><td>Używany do Plama SMI-32</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A454.2</td><td>Używany do utrwalania</td></tr><tr><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>Hematoksyliny Mayera</td><td>Nauki 26381-02</td><td>Plamy jądra</td></tr><tr><td>Kleszcze Micro-Adson z zębami</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td>Służy do odbijania czaszki podczas sekcji</td></tr><tr><td>Mikrowirówka&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5417R</td><td></td></tr><tr><td>Rurki kapilarne Microvette CB 300 Z</td><td>Starstedt</td><td>16.440.100</td><td>Używany do pobierania krwi</td></tr><tr><td>Szkło osłonowe Micrscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545A</td><td>Używany do szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>Mini Shaker</td><td>VWR</td><td>12620-938</td><td>Używany do produkcji</td></tr><tr><td>NF Light Kit</td><td>Quanterix</td><td>103186</td><td>Ten zestaw może być używany do wykrywania rozpuszczalnego neurofilamentu u myszy lub człowieka w surowicy</td></tr><tr><td>Rękawice nitrylowe</td><td>VWR</td><td>76307-462</td><td>Bezpieczeństwo</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Vector Labratories</td><td>S-1000</td><td>Odczynnik blokujący</td></tr><tr><td>Normalna surowica królika</td><td>Vector Labratories</td><td>S-5000</td><td>Odczynnik blokujący</td></tr><tr><td>Kasety tkankowe OmniSette</td><td>Fisher Scientific</td><td>M4935FS</td><td>Służy do osadzania rdzenia kręgowego i mózgu</td></tr><tr><td>Pipeta i końcówki p1000 różne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipety i końcówki p200</td><td>różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>stacje zatapiania parafiny</td><td>Leica Biosystems</td><td>Model EG1160</td><td></td></tr><tr><td>Medium do infiltracji/osadzania tkanek Paraplast</td><td>Leica Biosystems</td><td>39601006</td><td>Służy do osadzania rdzenia kręgowego i mózgu</td></tr><tr><td>Montaż Permount Medium</td><td>Fisher Chemicals</td><td>SP15-100</td><td>Służy do montażu szkiełek nakrywkowych na szkiełkach</td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Fisher Scientific</td><td>13636AB315B</td><td>Służy do pHing</td></tr><tr><td>Plastikowe pipety transferowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td>Służy do pHing</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>BioShop</td><td>7447-40-7</td><td>Służy do produkcji PBS</td></tr><tr><td>Fosforan potasu Monobasic</td><td>BioShop</td><td>7778-77-0</td><td>Używany do produkcji</td></tr><tr><td>szybkowaru</td> PBS <td>Nordic Ware</td><td>Tender Cooker</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczone szczury anty-mysie CD45</td><td>Vector Labratory</td><td>553076</td><td>Wykrywa leukocyty</td></tr><tr><td>Odczynnik alkoholowy 100%</td> <td>VWR</td><td>89370-084</td><td>Etapy odwadniania i nawadniania</td></tr><tr><td>Odczynnik alkoholowy 70%</td> <td>VWR</td><td>64-17-5</td><td>Odwodnienie i Etapy nawadniania</td></tr><tr><td>Mikrotom obrotowy</td><td>Leica Biosystems</td><td>Model RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna Simoa</td> Skaner slajdów <td>Quanterix</td><td>HD-X</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>AxioScan.Z1</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało IgG1 SMI-32</td><td>Biolegend</td><td>801701</td><td>Wykrywa uszkodzone aksony</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>BioShop</td><td>7647-14-5</td><td>Służy do produkcji PBS</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy&nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>7558-79-4</td><td>Służy do produkcji PBS</td></tr><tr><td>Standardowe kleszcze Adson</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>11150-10</td><td>Używany do etapów preparacji</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Służy do pobierania skrawków</td></tr><tr><td>Chirurgiczne twarde cięcia</td><td>Fine Science Tools</td><td>14110-15</td><td>Służy do przecinania kręgosłupa, ściany ciała i skóry</td></tr><tr><td>Procesor tkanek</td><td>Leica Biosystems</td><td>Model TP1020</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian trójsoldowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-04-6132</td><td>Używany do pobierania antygenu</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioBasic</td><td>9005-64-5</td><td>Używany do mycia sekcji</td></tr><tr><td>Uszczelka płytowa X-P Pierce XP-100</td><td>Excel Scientific</td><td>12-140</td><td>Używany do testu sNF-L</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Chemicals</td><td>1330-20-7</td><td>Służy do usuwania wosku i oczyszczania sekcji</td></tr><tr><td>Lejek</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-63100-64</td><td>Służy do filtrowania formaliny przed zabrudzeniem tkanki</td></tr><tr><td>Mieszaj płytkę</td><td>Dowolna</td><td></td><td>Służy do sporządzania roztworów</td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>Dowolna</td><td></td><td>Służy do wypalania skrawków tkanek po cięciu</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>13-374-10</td><td>Służy do uszczelniania naczynia barwiącego LFB</td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td>Dowolna</td><td></td><td>Czas może się różnić w zależności od modelu mikrofalowego</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Służy do wytwarzania buforu blokującego</td></tr><tr><td>1,5 ml Probówki do mikrowirówek</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408--129</td><td>Służy do przechowywania próbek surowicy myszy</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Dowolny</td><td></td><td>Służy do przygotowania próbek do testu sNF-L</td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Dowolna</td><td></td><td>Służy do podgrzewania substratu enzymatycznego do oznaczania sNF-L</td></tr></tbody></table>

ocena zapalenia ośrodkowego układu nerwowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia

Scoring Central Nervous System Inflammation, Demyelination, and Axon Injury in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) jest powszechnym modelem immunologicznym stwardnienia rozsianego (MS). Choroba ta może być wywołana u gryzoni przez aktywne uodparnianie składnikami białkowymi osłonki mielinowej i kompletnego adiuwanta Freunda (CFA) lub przez transfer komórek efektorowych T specyficznych dla mieliny od gryzoni zaszczepionych białkiem mieliny/CFA do gryzoni wcześniej nieleczonych. Nasilenie EAE jest zwykle oceniane na 5-punktowej skali klinicznej, która mierzy stopień paraliżu wstępującego, ale skala ta nie jest optymalna do oceny stopnia wyzdrowienia z EAE. Na przykład wyniki kliniczne pozostają wysokie w niektórych modelach EAE (np. model EAE indukowany peptydem glikoproteiny oligodendrocytów mieliny [MOG]) pomimo ustąpienia stanu zapalnego. Dlatego ważne jest, aby uzupełnić ocenę kliniczną o ocenę histologiczną EAE, która zapewnia również środki do badania mechanizmów leżących u podstaw uszkodzenia komórek w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN).
Tutaj przedstawiono prosty protokół do przygotowania i barwienia rdzenia kręgowego i odcinków mózgu myszy oraz do oceny stanu zapalnego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w rdzeniu kręgowym. Metoda oceny nacieku leukocytów w rdzeniu kręgowym może być również stosowana do oceny stanu zapalnego mózgu w EAE. Opisano również protokół pomiaru rozpuszczalnego światła neurofilamentu (sNF-L) w surowicy myszy za pomocą testu drobnocząsteczkowego (SIMOA), który dostarcza informacji zwrotnych na temat zakresu ogólnego uszkodzenia OUN u żywych myszy.

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) służy jako zwierzęcy model stwardnienia rozsianego. W tym artykule opisano podejście do oceny zapalenia rdzenia kręgowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w EAE. Dodatkowo przedstawiono metodę ilościowego określania poziomu rozpuszczalnego światła neurofilamentów w surowicy myszy, ułatwiającą ocenę uszkodzenia aksonów u żywych myszy.

Ocena zapalenia ośrodkowego układu nerwowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a common immune-based model of multiple sclerosis (MS). This disease can be induced in rodents by ...

Jesteśmy zainteresowani zrozumieniem, jak zaczyna się autoimmunizacja i stwardnienie rozsiane (SM). W badaniu tym wykorzystano różne podejścia do zbadania, w jaki sposób czynniki ryzyka związane ze stwardnieniem rozsianym prowadzą do rozwoju autoimmunizacji. Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) to mysi model stwardnienia rozsianego, który można wykorzystać do zbadania wpływu różnych czynników ryzyka na autoimmunizację.Niedawno odkryliśmy biologiczną ścieżkę, w jaki sposób jeden z czynników ryzyka stwardnienia rozsianego, otyłość, prowadzi do zwiększonego stanu zapalnego autoimmunologicznego u myszy. Badania nad modelem EAE miały kluczowe znaczenie dla rozwikłania tych mechanizmów. Nasilenie choroby EAE jest często oceniane w pięciopunktowej skali klinicznej, jednak skala ta ma ograniczoną czułość i nie jest w stanie odróżnić, czy deficyty kliniczne są spowodowane stanem zapalnym, czy uszkodzeniem tkanek.Histologia rdzenia kręgowego i mózgu jest złotą metodą oceny stanu zapalnego i uszkodzenia tkanek w EAE. Protokół ten zapewnia prostą metodę pomiaru stanu zapalnego i uszkodzenia tkanek w rdzeniu kręgowym i mózgu podczas EAE, nasz protokół może być stosowany wraz ze skalą kliniczną, aby lepiej scharakteryzować nasilenie EAE, Nasz protokół mierzy kluczowe cechy histologiczne EAE, w tym infiltrację immunologiczną, demielinizację, uszkodzenie aksonów w rdzeniu kręgowym i zapalenie mózgu. Obejmuje również pomiar światła neurofilamentów w surowicy myszy, co wskazuje na zakres uszkodzenia OUN.Ten kompleksowy protokół zapewnia bardziej szczegółową charakterystykę EAE niż użycie tylko jednego markera. Na początek użyj kleszczy, aby chwycić skórę na czubku głowy myszy poddanej eutanazji, a następnie wykonaj 2,5-centymetrowe nacięcie za pomocą nożyczek chirurgicznych. Użyj palców, aby popchnąć skórę na głowie na boki, aby uwidocznić leżącą pod spodem czaszkę.Następnie, za pomocą standardowych kleszczyków Adson, chwyć za oczodoły, aby ustabilizować głowę. Za pomocą cienkich nożyczek wykonaj małe nacięcia w czaszce wzdłuż linii środkowej od kręgosłupa szyjnego do opuszki węchowej. Użyj kleszczy Adson z zębami, aby odbić otwartą czaszkę, aby odsłonić leżący pod nią mózg.Przytrzymaj mózg za pomocą ręki niedominującej. Z zamkniętymi nożyczkami w dominującej ręce zgarnij rdzeń kręgowy z kręgosłupa szyjnego i delikatnie wypchnij mózg z czaszki, przecinając nerwy czaszkowe. Umieść mózg w stożkowej probówce zawierającej 10 mililitrów 10% neutralnej buforowanej formaliny.Następnie naciąć futro wzdłuż linii środkowej wzdłuż linii środkowej tułowia myszy od szyi do ogona. Użyj palców, aby popchnąć skórę na boki, aby uwidocznić kręgosłup. Za pomocą nożyczek chirurgicznych przeciąć w dół kręgosłup w miejscu przyczepienia kości udowej do biodra, a następnie przeciąć ścianę ciała po każdej stronie kręgosłupa, od biodra do szyi.Umieść kręgosłup zawierający rdzeń kręgowy w tej samej rurce, w której znajduje się mózg i formalina. Na początek użyj nożyczek, aby wyciąć mały kawałek papieru do soczewek i umieść go na szalce Petriego. Następnie wlej formalinę zawierającą nieruchomy mózg i kręgosłup wyizolowany od myszy do lejka wyłożonego bibułą filtracyjną.Przenieś mózg i kręgosłup na pustą szalkę Petriego. Użyj skalpela, aby podzielić mózg na sześć koronalnych części. Za pomocą kleszczy przenieś próbki mózgu na jedną połowę papieru do soczewek na szalce Petriego.Przetnij rdzeń kręgowy na trzy części za pomocą skalpela, a następnie odetnij kawałek kręgosłupa krzyżowego na końcu ogonowym, aż rdzeń kręgowy stanie się widoczny. Podnieś kręgosłup piersiowy ręką niedominującą. Weź kleszcze Adson z zębami mocno zamkniętymi w dominującej dłoni i delikatnie wepchnij koniec w mniejszy otwór kręgosłupa delikatnym ruchem skręcającym.Następnie za pomocą kleszczy delikatnie wyciągnij wyłaniający się rdzeń kręgowy z kolumny. Umieść kawałek przewodu na szalce Petriego zawierającej papier do soczewek. Za pomocą skalpela podziel trzy kawałki rdzenia kręgowego na mniejsze kawałki o przekroju poprzecznym.Ułóż te kawałki na tej samej połowie papieru do soczewek, na którym znajdują się kawałki mózgu. Złóż papier do soczewek, aby ułożyć na nim kawałki chusteczek i umieść go w oznaczonej kasecie. Przenieś kasetę do słoika na próbkę zawierającego formalinę.Po inkubacji przenieś kasetę z pojemnika na próbkę do pierwszej kąpieli formalinowej w automatycznym procesorze tkanek i uruchom procesor na noc. Następnego dnia wyjmij kasety z procesora tkanek i przenieś je do ciepłej komory przetrzymywania stacji zatapiania parafiny. Wlej wosk parafinowy, aby pokryć dno formy.Za pomocą cienkich kleszczy umieść kawałki przekroju poprzecznego mózgu i rdzenia kręgowego w parafinie na dnie formy. Przenieś formę na powierzchnię chłodzącą na kilka sekund, aby utrwalić mózg i próbki na miejscu. Przenieś formę z powrotem na rozgrzaną powierzchnię i napełnij ją do góry gorącą parafiną.Umieść pokrywę kasety oznaczoną identyfikatorem próbki na formie. Wlej parafinę na pokrywę kasety. Przenieś formę do stacji chłodzącej, aby wosk stwardniał.Gdy bloki całkowicie ostygną, zabezpiecz je na obrotowym mikrotomie. Przyciąć bloki i wyciąć pięciomikrometrowe odcinki każdego bloku parafiny. Przenieś wstęgę parafinową do łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza.Zebrać wycinek z łaźni wodnej na oznakowane szkiełko. Umieść szkiełka w plastikowym ruszcie do szkiełków i piecz kawałki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w suchym piekarniku. Po zeskanowaniu otwórz obraz J, a następnie przeciągnij i upuść obraz TIFF sekcji do analizy.Obserwuj przekrój rdzenia kręgowego w czterech kwadrantach i oceniaj obecność zmian demielinizacyjnych w każdym kwadrancie. Ta sekcja ma wynik cztery, ponieważ zmiany chorobowe występują we wszystkich czterech kwadrantach. Ta sekcja zdobywa jeden, ponieważ zmiany znajdują się tylko w jednym kwadrancie.Barwienie CD45 wskazuje na obecność leukocytów w zmianach chorobowych. Nowe zmiany zawierają wiele komórek CD45 w porównaniu ze starszymi. Natomiast nowe zmiany mogą zawierać mniej aksonów SMI-32 dodatnich w porównaniu ze starszymi zmianami.Myszy w grupie typu dzikiego rozwinęły ciężkie EAE z całkowitym paraliżem, podczas gdy grupa OGR1 Knockout rozwinęła łagodną chorobę. Ta różnica w wyniku klinicznym odpowiadała zmianom w zmianach demielinizacyjnych podoponowych, w procentowym obszarze mieliny wybarwionym w rdzeniu kręgowym. Co więcej, procentowa frakcja mieliny również różniła się znacznie między OGR1 a myszami typu dzikiego i korelowała ze skumulowanym wynikiem EAE.W EAE stan zapalny w mózgu jest zlokalizowany głównie w móżdżku i pniu mózgu. Dodatkowe obszary zapalne mogą być widoczne w mózgu, w tym w oponach mózgowych, w pobliżu komór oraz w innych drogach istoty białej, takich jak nerw wzrokowy i ciało modzelowate. Światło neurofilamentu w surowicy, mierzone za pomocą testu z małą matrycą molekularną, wykryło wyższe poziomy światła neurofilamentu w surowicy u myszy z EAE w porównaniu ze zdrowymi myszami, a te podwyższone poziomy korelowały z gęstością SMI-32 dodatniego w rdzeniu kręgowym.

scoring-central-nervous-system-inflammation-demyelination-axon-injury

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie zaprezentowano indukcję oraz ocenę kliniczną modelu zwierzęcego stwardnienia rozsianego: przewlekłego nawracającego eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u szczurów linii DA. Choroba, wywołana immunizacją szczurów emulsją zawierającą cały rdzeń kręgowy szczura i pełny adiuwant Freunda, wykazuje objawy kliniczne przypominające przebieg choroby u ludzi.

Indukcja i ocena kliniczna przewlekłej postaci nawrotowej eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia

Ten film demonstruje metodę wywoływania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) poprzez wstrzykiwanie peptydów pochodzących z mieliny z adiuwantem w celu aktywacji autoreaktywnych limfocytów T, które migrują do mózgu. Toksyna krztuścowa jest podawana w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając tym limfocytom T i innym komórkom odpornościowym przedostanie się do mózgu. Te komórki odpornościowe powodują demielinizację, co prowadzi do...

Generowanie eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

W tym filmie mysi model stwardnienia rozsianego jest tworzony za pomocą eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). Myszowi wstrzykuje się emulsję zawierającą peptyd neuronalny i adiuwant, wywołując odpowiedź immunologiczną, która aktywuje autoreaktywne limfocyty T. Następnie podaje się wstrzyknięcie toksyny krztuścowej (PTX) w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając autoreaktywnym limfocytom T infiltrację mózgu. Ten naciek inicjuje kaskadę...

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) jest uznanym zwierzęcym modelem stwardnienia rozsianego. Myszy C57BL/6 są immunizowane peptydem 35-55 (MOG) glikoproteiny oligodendrocytów mieliny (MOG) (MOG35-55), co powoduje narastający porażenie wiotkie spowodowane przez autoreaktywne komórki odpornościowe w ośrodkowym układzie nerwowym. Omówione zostaną protokoły indukcji i monitorowania choroby.

Glikoproteina oligodendrocytów mielinowych (MOG35-55) indukowana eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) u myszy C57BL / 6

Ten manuskrypt opisuje metody indukcji i oceny eksperymentalnego modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), wraz z oceną rozmieszczenia komórek odpornościowych i poziomów cytokin mRNA w węzłach chłonnych, śledzionie, krwi i rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej i ilościowego PCR, odpowiednio, w różnych fazach choroby.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego u myszy i ocena zależnej od choroby dystrybucji komórek odpornościowych w różnych tkankach

Tutaj prezentujemy protokoły do badania upośledzenia jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia in vivo. W szczególności zajmujemy się tym, jak określić przepuszczalność bariery krew-mózg i aktywność żelatynazy zaangażowaną w migrację leukocytów przez limity gleju.

Wizualizacja upośledzenia barier śródbłonkowych i glejowych jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia mięśniowego in vivo

Ten manuskrypt przedstawia protokół indukcji aktywnego eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) u myszy. Przedstawiono również metodę izolacji i charakterystyki naciekających limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), aby pokazać, w jaki sposób limfocyty są zaangażowane w rozwój choroby autoimmunologicznej OUN.

Analiza cytometryczna przepływowa nacieku limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Niniejszy protokół opisuje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia w modelu mysim przy użyciu glikoproteiny oligodendrocytów mieliny i monitorowanie procesu chorobowego za pomocą systemu punktacji klinicznej. Eksperymentalne objawy związane z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego są analizowane za pomocą analizy mikrotomografii komputerowej kości udowej myszy i testu terenowego w celu kompleksowej oceny procesu chorobowego.

Indukcja i zróżnicowane wskaźniki oceny eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Do tej pory, protokoły jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od tej samej myszy są niezaspokojonym wymaganiem. Protokół przedstawia procedurę mającą zastosowanie u myszy z nieleczonym i eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia w celu zbadania złożonych sieci komórkowych podczas zapalenia nerwów i jednoczesnego zmniejszenia wymaganej liczby myszy.

Jednoczesna izolacja głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od dorosłych myszy z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) to zwierzęcy model stwardnienia rozsianego (MS), który dzieli z ludzką chorobą silną humoralną odpowiedź autoimmunologiczną. W tym miejscu przedstawiamy prosty i elastyczny protokół ELISA do ilościowego oznaczania autoprzeciwciał w surowicy myszy uodpornionych na EAE.

Kwantyfikacja przeciwciał autoreaktywnych u myszy po eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia kręgowego

Poznaj metodę oceny zapalenia, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w modelu EAE u myszy. Protokół obejmuje analizę histologiczną oraz pomiar neurofilamentów we krwi jako biomarkerów uszkodzenia OUN.

Ocena zapalenia ośrodkowego układu nerwowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia (Wideo) | JoVE Journal

Ocena zapalenia ośrodkowego układu nerwowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia

Przeglądaj więcej filmów