Name: Identyfikacja rodzaju włókien ludzkich mięśni szkieletowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Poznaj technikę MyDoBID do izolacji pojedynczych włókien z liofilizowanej ludzkiej mięśni szkieletowej i klasyfikacji typów włókien na podstawie izoform MHC. Ta metoda umożliwia analizę różnic w ekspresji białek specyficznych dla typu włókna.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Przeciwciała przeciwko MHC I (A4.840) i MHCIIa (A4.74) użyte w tym badaniu zostały opracowane przez Dr. H. M. Blau, a przeciwciało przeciwko MHCIIx (6H1) zostało opracowane przez Dr. C. A. Lucasa i uzyskane z Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), dzięki auspicjom National Institute of Child Health and Human Development i utrzymywane przez University of Iowa, Wydział Nauk Biologicznych (Iowa City, IA). Dziękujemy Victorii L. Wyckelsmie za dostarczenie próbek mięśni ludzkich do tego badania. Większość obrazów na rysunku 1 pochodzi z BioRender.com.
Finansowanie: 
Badanie to nie otrzymało żadnego zewnętrznego finansowania.

MyDoBID- A Novel Technique for Identifying Muscle Fiber Types Efficiently

<ol><li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li>
<li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat%2C+mouse%2C+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), e35273(2012).</li>
<li>Wyckelsma, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+specific+differences+in+the+protein+abundances+of+GAPDH+and+Na%28%2B%29%2CK%28%2B%29-ATPase+in+skeletal+muscle+from+aged+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals.</a> Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).</li>
<li>Morales-Scholz, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+type-specific+autophagy+responses+following+an+overnight+fast+and+mixed+meal+ingestion+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber type-specific autophagy responses following an overnight fast and mixed meal ingestion in human skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 323 (3), e242-e253 (2022).</li>
<li>Tripp, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+fibre+type-dependent+nature+of+calcium-handling+protein+responses+to+sprint+interval+exercise+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Time course and fibre type-dependent nature of calcium-handling protein responses to sprint interval exercise in human skeletal muscle.</a> The Journal of Physiology. 600 (12), 2897-2917 (2022).</li>
<li>Frankenberg, N. T., Mason, S. A., Wadley, G. D., Murphy, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+cell-specific+differences+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle cell-specific differences in type 2 diabetes.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (5), 256(2022).</li>
<li>Murphy, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+skeletal+muscle+calpain-3+by+eccentric+exercise+in+humans+does+not+result+in+its+translocation+to+the+nucleus+or+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol.</a> Journal of Applied Physiology. 111 (5), 1448-1458 (2011).</li>
<li>Murphy, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+technique+to+measure+proteins+in+single+segments+of+human+skeletal+muscle+fibers%3A+fiber-type+dependence+of+AMPK-alpha1+and+-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Enhanced technique to measure proteins in single segments of human skeletal muscle fibers: fiber-type dependence of AMPK-alpha1 and -beta1.</a> Journal of Applied Physiology. 110 (3), 820-825 (2011).</li>
<li>Christiansen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+reliable+and+sample-sparing+method+to+identify+fibre+types+of+single+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6473(2019).</li>
<li>Skelly, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+fiber+type-specific+responses+to+sprint+interval+and+moderate-intensity+continuous+exercise%3A+acute+and+training-induced+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle fiber type-specific responses to sprint interval and moderate-intensity continuous exercise: acute and training-induced changes.</a> Journal of Applied Physiology. 130 (4), 1001-1014 (2021).</li>
<li>Bergstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+electrolytes+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Clinical+and+Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Muscle electrolytes in man.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. (SUPPL. 68), 1-110 (1962).</li>
<li>Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suction+applied+to+a+muscle+biopsy+maximizes+sample+size%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%26+Science+in+Sports+%26+Exercise%22%5BJournal%5D)">Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size.</a> Medicine & Science in Sports & Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).</li>
<li>Wyckelsma, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+skeletal+muscle+mitochondrial+content+in+older+adults%3A+relationship+between+mitochondria%2C+fibre+type+and+high-intensity+exercise+training%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training.</a> The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).</li>
<li>Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+type+populations+and+Ca2%2B-activation+properties+of+single+fibers+in+soleus+muscles+from+SHR+and+WKY+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).</li>
<li>Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+considerations+for+protein+analyses+using+antibody+based+techniques%3A+down-sizing+Western+blotting+up-sizes+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes.</a> The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).</li>
<li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).</li>
<li>MacInnis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+mitochondrial+adaptations+in+human+skeletal+muscle+after+interval+compared+to+continuous+single-leg+cycling+matched+for+total+work%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work.</a> The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Kolekcja włókien Opierając się na kilkuletnim doświadczeniu, większość badaczy może opanować tę technikę; Jednak praktyka prowadzi do szybszego i wydajniejszego zbierania włókien do dalszych analiz. Aby móc wyizolować 30 pojedynczych segmentów włókien o jakości przeznaczonej do łączenia, zaleca się pobranie 50 segmentów włókien na próbkę. Zaleca się dokładne przestudiowanie filmu z gromadzeniem włókien i po wykonaniu dwóch sesji treningowych (~50 włókien na sesję), aby osiągnąć rozsądny standard. Ws...

Mięsień szkieletowy to niejednorodna tkanka, z wyraźnymi komórkowymi właściwościami metabolicznymi i kurczliwymi, które zależą od tego, czy komórka (włókno) jest wolnokurczliwa (typ I) czy szybkokurczliwa (typ II). Typ włókna można zidentyfikować, badając izoformy ciężkiego łańcucha miozyny (MHC), które różnią się od siebie na kilka sposobów, w tym czasem skurczu, szybkością skracania i odpornością na zmęczenie1. Główne izoformy MHC obejmują typ I, typ IIa, typ IIb i typ IIx, a ich profile metaboliczne są albo oksydacyjne (typ I i IIa), albo glikolityczne (IIx, IIb)<klasa sup="xref">1. Proporcje tych rodzajów włókien różnią się w zależności od rodzaju mięśni i gatunków. Typ IIb jest powszechnie spotykany w mięśniach gryzoni. Mięśnie ludzkie nie zawierają żadnych włókien typu IIb i składają się głównie z izoform MHC typu I i IIa, z niewielką ilością włókien IIx2. Profile ekspresji białek różnią się w zależności od rodzaju włókien i mogą być zmieniane wraz z starzeniem się3, exercise4,5, oraz disease6.
Pomiar odpowiedzi komórkowych w różnych typach włókien mięśni szkieletowych jest często pomijany lub niemożliwy ze względu na badanie homogenatów mięśniowych (mieszanka wszystkich typów włókien). Pojedynczy błonnik western blot pozwala na badanie wielu białek w poszczególnych włóknach mięśniowych7. Metodologia ta była wcześniej wykorzystywana do tworzenia nowatorskich i pouczających cech pojedynczych włókien, które nie były możliwe do uzyskania przy użyciu preparatów homogenatycznych. Istnieją jednak pewne ograniczenia oryginalnej metodologii western blot z pojedynczym włóknem, w tym czasochłonny charakter, niemożność wygenerowania kontrprób próbek oraz stosowanie drogich, czułych odczynników do wzmocnionej chemiluminescencji (ECL). Jeśli używana jest świeża tkanka, metoda ta jest dodatkowo ograniczona ze względu na ograniczenia czasowe związane z koniecznością wyizolowania pojedynczych włókien w ograniczonym czasie (tj. 1-2 godziny). Na szczęście to ograniczenie jest złagodzone przez wyizolowanie pojedynczych segmentów włókien z liofilizowanej tkanki8. Jednak pobieranie włókien z próbek liofilizowanych jest ograniczone rozmiarem i jakością tkanki poddanej biopsji.
Identyfikacja typu światłowodu za pomocą metody dot blotting9 została znacznie rozbudowana i rozszerzona w tym kompleksowym protokole. Wcześniej wykazano, że zaledwie ~2-10 mg mokrej masy tkanki mięśniowej jest odpowiednie do liofilizacji i analizy białka izoformy MHC z pojedynczym włóknem9. Christensen et al.9 wykorzystali 30% segmentu włókna o grubości ~1 mm do wykrycia izoformy MHC za pomocą kleksu punktowego, co zostało potwierdzone przez western blotting. Praca ta wykazała, że dzięki zastąpieniu western blotting metodą dot blotting, całkowite koszty zostały zmniejszone o ~40-krotnie (dla 50 segmentów włókien). Włókna zostały następnie "połączone" w próbki typu I i typu II, co pozwoliło na replikację eksperymentalną9. Niemniej jednak ograniczeniem było to, że uzyskano tylko dwie próbki specyficzne dla typu włókna: typ I (MHCI dodatni) i typ II (MHCII dodatnie włókna), przy czym próbki typu II zawierały mieszaninę MHCIIa i MHCIIx6,10. Warto zauważyć, że obecny protokół pokazuje, w jaki sposób można zidentyfikować czyste włókna typu IIx i zapewnia bardzo szczegółowy przepływ pracy (podsumowany w Rysunek 1), w tym strategie rozwiązywania typowych problemów z protokołem.

<table><tbody><tr><td>1x Bufor denaturacyjny</td><td>Wykonaj zgodnie z recepturą</td><td>Składniki mogą pochodzić z Sigma-Aldrich lub innych firm zajmujących się dystrybucją chemikaliów</td><td>&nbsp; 1x bufor denaturujący jest wytwarzany przez rozcieńczenie 3x buforu denaturującego 1 na 3 v / v z 1X Tris-HCl (pH 6,8). Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>3x Bufor denaturacyjny</td><td>Zrób według receptury</td><td>Składniki mogą pochodzić z Sigma-Aldrich lub innych dystrybutorów chemicznych</td><td>3x bufor denaturujący zawiera: 0,125M Tris-HCI, 10% glicerol, 4% SDS, 4 M mocznik, 10% 2-merkaptoetanol i 0,001% błękit bromofenolowy, pH 6,8.&nbsp; Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>95% etanol</td><td>nie dotyczy</td><td>100% etanol może pochodzić z dowolnej firmy</td><td>Rozcieńczony do 95% ultra czystym H2O.</td></tr><tr><td>Aktynowe królicze przeciwciało poliklonalne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; A2066</td><td>Rozcieńczyć 1 do 1,000 buforem BSA.</td></tr><tr><td>Wagi analityczne</td><td>Mettler Toledo</td><td>Numer modelu: MSZ042101</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz przeciwciał</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>32110</td><td>Nazwa produktu to Miser Antibody Extender Solution NC.</td></tr><tr><td>Zlewka (100 mL)</td><td>Nie dotyczy</td><td>Wirówka</td><td></td></tr><tr><td>stołowa</td><td>Eppendorf</td><td>5452</td><td>Nazwa modelu: Mini Spin.</td></tr><tr><td>Bufor blokujący: 5% odtłuszczonego mleka w buforze do mycia.</td><td>Sklep z dyplomami</td><td>kupił</td><td></td></tr><tr><td>bufor BSA: 1 % BSA/PBST, 0,02 % NaN3</td><td>BSA: Sigma-Aldrich&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; PBS: Laboratoria Bio-Rad. NaN3 : Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>BSA: A6003-25G&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10x PBS: 1610780&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; NaN3: S2002</td><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA), sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) i azydek sodu (NaN3). Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Dźwignia otwierania kasety&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>4560000</td><td>Służy do otwierania prefabrykowanych kaset żelowych.</td></tr><tr><td>Chemidoc MP Imager&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>Numer modelu: Kaptur uniwersalny III</td><td>Dowolny system obrazowania z możliwością obrazowania żelowego bez plam.</td></tr><tr><td>Bibuła Criterion</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1704070</td><td>Zawiera worek z lodem, tackę transferową, rolkę, 2 uchwyty na kasety, bibułę filtracyjną, podkładki piankowe i pokrywę z.</td></tr><tr><td>Criterion Cell (Bio-Rad)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1656001</td><td></td></tr><tr><td>ECL (wzmocniona chemiluminescencja)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1705062</td><td>Nazwa produktu: Podłoże Clarity Max Western ECL.</td></tr><tr><td>Bufor do elektroforezy 1x Tris Glycine SDS (TGS)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610772</td><td>Rozcieńczyć 10x TGS 1 w 10 ultra czystym H2O.</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna, grubość 0,34 mm</td><td>Whatmann</td><td>3030917</td><td>Format zbiorczy 3 MM, opakowanie 100 arkuszy, 315 x 335 mm.</td></tr><tr><td>Kleszcze do preparowania tkanek</td><td>Dumont</td><td>F6521-1EA</td><td>Jubiler' Kleszcze S nr 5.</td></tr><tr><td>Płaska plastikowa taca/pokrywka&nbsp; &nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Wystarczająco duży, aby umieścić na nim membranę. Upewnij się, że powierzchnia jest całkowicie płaska.</td></tr><tr><td>System liofilizacji</td><td>Labconco</td><td>7750030</td><td>Freezone 4,5 L ze szklanym stolikiem na próbki.</td></tr><tr><td>Zamrażarka -80 <s>oC&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Dowolna zamrażarka o stałej temperaturze -80 & deg; C jest odpowiednie.</td></tr><tr><td>Uwalniacze żelu</td><td>1653320</td><td>Bio-Rad</td><td>Wsuń się pod membranę, aby zebrać lub przesunąć membranę.</td></tr><tr><td>Ołówek ołówek</td><td>szary N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Oprogramowanie do laboratorium obrazowego&nbsp;</td><td>Rysunki Bio-Rad Laboratories</td><td>N/A</td><td>odnoszą się do wersji oprogramowania 5.2.1, ale można korzystać z innych wersji.</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1660521</td><td>Dowolny inkubator, który można ustawić na 37 & deg; C by wystarczyło.</td></tr><tr><td>Lampa</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne z pchełką</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Membrana roller&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1651279</td><td>Można kupić w pakiecie Transfer. Jeśli jednak ten produkt nie jest dostępny, wystarczy dowolna cylindryczna rurka o gładkiej powierzchni, wystarczająco długa, aby przetoczyć się przez membranę.</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek&nbsp; (0,6 ml)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mysia IgG HRP wtórna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31430</td><td>Kozia anty-mysia IgG (H+L), RRID AB_228341. Rozcieńczyć w stężeniu 1 na 20 000 w buforze blokującym.</td></tr><tr><td>Mysz IgM HRP wtórny</td><td>Abcam</td><td>ab97230</td><td>Goat Anti-Mouse IgM mu łańcuch. Stosować w tym samym rozcieńczeniu, co mysie IgG.</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko miozynie o ciężkim łańcuchu I (MHCI)</td><td>DSHB</td><td>A4.840&nbsp;</td><td>Zakres rozcieńczenia: od 1 do 200 do 1 do 500 w buforze BSA.</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe miozyny o ciężkim łańcuchu IIa (MHCIIa)</td><td>DSHB</td><td>A4.74&nbsp;</td><td>Zakres rozcieńczenia: od 1 do 200 do 1 do 500 w buforze BSA.</td></tr><tr><td>Pierwszorzędowe przeciwciało miozyny o ciężkim łańcuchu IIx (MHCIIx)</td><td>DSHB</td><td>6H1</td><td>Zakres rozcieńczenia: 1 na 200 do 1 na 500 w buforze BSA.</td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa 0,45 i mikro; m&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1620115</td><td>Do Western blotting.</td></tr><tr><td>Pokrywka szalki Petriego</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta plastikowa</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Power Pack&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>164-5050</td><td>Nazwa produktu: Zasilacz podstawowy.</td></tr><tr><td>Drabinka białkowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 do 180 kDa.</td></tr><tr><td>Membrana PVDF 0,2 i mikro; m</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit HRP wtórny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31460</td><td>Kozia anty-królicza IgG (H+L), RRID AB_228341. Rozcieńczenie takie samo jak mysie przeciwciała drugorzędowe.</td></tr><tr><td>Rocker</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Linijka</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do zdejmowania</td> izolacji <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21059</td><td>Nazwa produktu: Przywróć bufor do usuwania Western Blot.</td></tr><tr><td>Chusteczka (niestrzępiąca się)</td><td>Kimberly-Clark professional</td><td>34120</td><td>Nazwa produktu: Kimwipe.</td></tr><tr><td>Bufor transferowy (1x Bufor Tris Glycine (TG), 20% Metanol)</td><td>TG: Bio-Rad Laboratories&nbsp; &nbsp; Metanol: Bufor TG firmy Merck</td><td>: 1610771&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Metanol: 1.06018</td><td>rozcieńczyć 10x bufor TG ultra czystym H2O do 1x. Dodaj 100% metanolu do końcowego stężenia 20% metanolu. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Taca transferowa</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1704089</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Prefabrykowany żel aktywowany promieniami UV</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>5678085</td><td>Rodzaj żelu: 4&ndash; 15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 dołków, 15 &mikro;L.</td></tr><tr><td>Bufor do</td> płukania <td>Vortex N</td><td>/A N/A</td><td></td></tr><tr><td>(1x TBST)</td><td>10x TBS: Astral Scientific&nbsp; Animacja 20: Sigma</td><td>&nbsp; BIOA0027-4L</td><td>1x Receptura TBST: 10x Tris-buforowana sól fizjologiczna (TBS) rozcieńcza się do 1x ultra czystym H2O, Tween 20 dodaje się do końcowego stężenia 0,1%. Przechowywać bufor w temperaturze 4 °C.</td></tr><tr><td>Pojemniki do mycia</td><td>Sistema</td><td>Sklep kupiony</td><td>Wystarczy dowolny pojemnik tupperware, który odpowiada przybliżonym wymiarom membrany.</td></tr></tbody></table>

identyfikacja rodzaju włókien ludzkich mięśni szkieletowych

Fiber Type Identification of Human Skeletal Muscle

Opisana tutaj technika może być użyta do identyfikacji specyficznych izoform ciężkiego łańcucha miozyny (MHC) w segmentach poszczególnych włókien mięśniowych za pomocą dot blotting, zwanego dalej Myosin heavy chain detection by Dot Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). Protokół ten opisuje proces liofilizacji ludzkich mięśni szkieletowych i izolowania segmentów pojedynczych włókien mięśniowych. Za pomocą MyDoBID włókna typu I i II są klasyfikowane odpowiednio z przeciwciałami specyficznymi dla MHCI i IIa. Sklasyfikowane włókna są następnie łączone w próbki specyficzne dla danego rodzaju włókien dla każdej biopsji.
Całkowita zawartość białka w każdej próbce jest określana za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) i technologii żelu aktywowanego promieniowaniem UV. Rodzaj włókien w próbkach jest weryfikowany za pomocą western blot. Opisano również znaczenie normalizacji obciążenia białkami w celu poprawy wykrywania białek docelowych w wielu western blot. Korzyści płynące z konsolidacji sklasyfikowanych włókien w próbkach specyficznych dla typu włókien w porównaniu z pojedynczymi włóknami zachodnimi obejmują wszechstronność próbek, zwiększoną przepustowość próbek, krótszą inwestycję czasową i środki oszczędnościowe, a wszystko to przy zachowaniu cennych informacji specyficznych dla typu włókna, które są często pomijane przy użyciu homogenizowanych próbek mięśni. Celem protokołu jest osiągnięcie dokładnej i efektywnej identyfikacji włókien typu I i typu II wyizolowanych z liofilizowanych próbek ludzkich mięśni szkieletowych.
Te pojedyncze włókna są następnie łączone w celu utworzenia próbek specyficznych dla typu włókna typu I i II. Ponadto protokół został rozszerzony o identyfikację włókien typu IIx, przy użyciu aktyny jako markera dla włókien, które były ujemne dla MHCI i MHCIIa, które są potwierdzone jako włókna IIx przez western blotting. Każda próbka specyficzna dla rodzaju włókna jest następnie wykorzystywana do ilościowego określenia ekspresji różnych białek docelowych przy użyciu technik western blotting.

Identyfikacja poszczególnych włókien mięśniowych MHCI, MHCIIa i MHCIIx za pomocą techniki dot blotting 
Cechą charakterystyczną metody MyDoBID jest kategoryzacja różnego poziomu intensywności sygnału MHC i aktyny w danym włóknie (Rycina 4A). Typ włókna określano na podstawie obecności lub braku izoform MHCI i IIa (Rycina 4B). W sześciu przypadkach nie wykryto MHC ani aktyny, co wskazywało na brak pobranego włókna. Wynikami tego konkretnego te...

Ten protokół demonstruje izolację pojedynczego włókna z liofilizowanych ludzkich mięśni szkieletowych i klasyfikację typów włókien według izoformy ciężkiego łańcucha miozyny (MHC) przy użyciu techniki kropkowania. Zidentyfikowane próbki włókien MHC I i II mogą być następnie dalej analizowane pod kątem specyficznych dla rodzaju błonnika różnic w ekspresji białek przy użyciu western blotting.

Identyfikacja rodzaju włókien ludzkich mięśni szkieletowych

The technique described here can be used to identify specific myosin heavy chain (MHC) isoforms in segments of individual muscle fibers using dot ...

Nasze badania koncentrują się na mięśniach szkieletowych, które składają się z komórek o charakterystycznych właściwościach metabolicznych i kurczliwych, charakteryzujących się włóknami wolnokurczliwymi lub szybkokurczliwymi. Zagłębiamy się w czynniki przyczyniające się do tych różnic i badamy ich implikacje w kontekście starzenia się, ćwiczeń i różnych chorób. Pomiar odpowiedzi komórek w różnych włóknach mięśni szkieletowych jest często pomijany lub niemożliwy ze względu na badanie jednorodności mięśni.Technika MyDoBID pozwala nam na wielokrotną analizę różnic w rodzajach białek błonnika, które wcześniej były niemożliwe do zmierzenia. Protokół ten dokładnie i skutecznie identyfikuje włókna mięśniowe typu pierwszego i drugiego z liofilizowanych próbek ludzkich mięśni szkieletowych. Ta nowo zrewidowana metoda zapewnia naukowcom proste podejście do badania różnic białkowych w mięśniach szkieletowych na poziomie komórkowym.Warto zauważyć, że ułatwia identyfikację włókien X typu drugiego, a te historycznie były trudne do odróżnienia. Technika ta pozwala naukowcom rzucić światło na wszystkie rodzaje włókien, w tym nieuchwytne włókno X typu dwa. Dzięki technice MyDoBID można teraz uzyska

fiber-type-identification-of-human-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie pokazujemy przygotowanie próbki ludzkiej tkanki mięśni szkieletowych i jej barwienie do transmisyjnej mikroskopii elektronowej w celu wizualizacji i ilościowego określenia subkomórkowego rozkładu glikogenu.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa w celu ilościowego określenia dystrybucji glikogenu w ludzkich mięśniach szkieletowych

Tutaj prezentujemy protokół do szybkich analiz włókien mięśniowych, który pozwala na poprawę jakości barwienia, a tym samym na automatyczne pozyskiwanie i kwantyfikację populacji włókien za pomocą swobodnie dostępnego oprogramowania ImageJ.

Szybki zautomatyzowany protokół analizy populacji włókien mięśniowych w przekrojach poprzecznych mięśni szczurów przy użyciu immunohistochemii łańcuchów ciężkich miozyny

Immunohistochemiczne barwienie izoform łańcucha ciężkiego miozyny stało się najnowocześniejszym dyskryminatorem włókien mięśni szkieletowych typu (tj. typu I, typu IIA, typu IIX, typu IIB). W tym miejscu przedstawiamy protokół barwienia wraz z nowatorskim półautomatycznym algorytmem, który ułatwia szybką ocenę rodzaju włókien i morfologii włókien.

Półautomatyczna analiza morfologii mięśni szkieletowych myszy i składu włókien

Ten raport techniczny opisuje odmianę zmodyfikowanej techniki Bergströma do biopsji mięśnia piszczelowego przedniego, która ogranicza uszkodzenia włókien.

Pobieranie biopsji mięśni szkieletowych z górnego przedziału mięśnia piszczelowego ludzkiego mięśnia piszczelowego przedniego w celu oceny mechanicznej

Zdolność do dokładnego wykrywania komponentów połączenia nerwowo-mięśniowego jest kluczowa w ocenie zmian w jego architekturze spowodowanych procesami patologicznymi lub rozwojowymi. Poniżej przedstawiamy pełny opis prostej metody uzyskiwania wysokiej jakości obrazów całych połączeń nerwowo-mięśniowych, które można wykorzystać do wykonywania pomiarów ilościowych.

Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości

Coraz więcej dowodów wskazuje, że nadmierna infiltracja lipidów wewnątrz mięśni szkieletowych prowadzi do lipotoksyczności i cukrzycy. Tutaj przedstawiamy kompletny protokół, w tym przetwarzanie tkanek, barwienie za pomocą Bodipy, akwizycję obrazu i analizę, w celu ilościowego określenia wielkości, gęstości i subkomórkowego rozkładu kropelek lipidów w sposób specyficzny dla rodzaju włókna.

Analiza zawartości kropelek lipidów w mięśniach szkieletowych pod kątem rodzaju włókien i subkomórek

Opisujemy protokół uzyskiwania enzymatycznie zdysocjowanych włókien o różnych długościach i typach z sześciu mięśni dorosłych myszy: trzy z nich już opisane (zginacz palca krótkiego, prostownik palca długiego, płaszczkowaty) i trzy z nich pomyślnie zdysocjowane po raz pierwszy (prostownik palucha długiego, mięsień długi długi, peroneus digiti quarti).

Nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis

Ten protokół opisuje izolację nienaruszonych pojedynczych włókien mięśniowych z utlenianego mięśnia podkolanowego oraz ustanowienie wysoce czystych kultur mioblastów pochodzących z tych włókien. Zoptymalizowana procedura niezawodnie przynosi około 300–500 nienaruszonych miofibryli na jednego mysza, umożliwiając dalszą molekularną i komórkową analizę.

Test izolacji pojedynczych włókien do oceny utleniania zachowania miofibrili

Przedstawiono protokół syntezy peptoidów o mieszanej funkcjonalności kationowej w tej samej sekwencji (monomery typu lizyny i argininy). Opisano również późniejsze testy tych związków przeciwko Leishmania mexicana, pasożytniczym pierwotniakom wywołującym leiszmaniozę skórną.

Skuteczna metoda syntezy peptoidów z monomerami typu mieszanego lizyny/argininy i oceny ich aktywności przeciwleiszmanicznej

Proponujemy protokół do identyfikacji kwasów tłuszczowych bez potrzeby ich oczyszczania. Łączy informacje o czasach retencji z widmami masowymi trzech rodzajów pochodnych kwasów tłuszczowych: estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME), pochodnych 4,4-dimetyloksazoliny (DMOX) i estrów 3-pirydylokarbinylu (pikolinylu).

Identyfikacja kwasów tłuszczowych w Bacillus cereus

Poznaj technikę MyDoBID do izolacji pojedynczych włókien z liofilizowanej ludzkiej mięśni szkieletowej i klasyfikacji typów włókien na podstawie izoform MHC. Ta metoda umożliwia analizę różnic w ekspresji białek specyficznych dla typu włókna.

Identyfikacja rodzaju włókien ludzkich mięśni szkieletowych

Przeglądaj więcej filmów