Name: Zoptymalizowana technika odwróconej politransfekcji oparta na embrionalnych komórkach macierzystych myszy do szybkiego badania proporcji kwasów nukleinowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę odwróconej politransfekcji mysich embrionalnych komórek macierzystych w mediach 2i i LIF. Technika ta zwiększa przeżywalność komórek i efektywność transfekcji, umożliwiając szybką optymalizację proporcji plazmidów w jednym kroku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować za wiele wkładów w tę dziedzinę, które nie zostały zacytowane w tej pracy ze względu na ograniczenia przestrzenne, a także agencje finansujące, które umożliwiły tę możliwość. Autorzy dziękują za finansowanie przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) oraz Canadian Institutes of Health Research (CIHR), , które wspierały te prace. K.M. jest laureatem stypendium CGS-M od NSERC oraz stypendium doktoranckiego Killam od University of British Columbia. N.S. jest laureatem nagrody Michael Smith Health Research BC Scholar Award.

1. Przygotowanie odczynników do hodowli mPSC
<ol>
	<li>Przygotuj suplement N2.
	<ol>
		<li>W warunkach niesterylnych przygotować następujące roztwory podstawowe (etap 1.1.1.1) w dygestorium bezpieczeństwa chemicznego. Dodaj stały proszek każdej substancji chemicznej do wstępnie zważonej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Po dodaniu proszku zważyć każdą probówkę i dodać odpowiednią ilość rozpuszczalnika, aby osiągnąć poniższe stężenia. Dla jednej partii podłoża należy przygotować minimalną ilość podaną na liście. 
		UWAGA: Następujące odczynniki są niebezpieczne i należy obchodzić się z nimi zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa chemicznego. Podczas obsługi należy zapewnić odpowiednie środki ochrony osobistej i pracować wyłącznie ze stałymi formami tych chemikaliów w postaci proszku w okapie oparów chemicznych, aby zapobiec wdychaniu .
		<ol>
			<li>Co najmniej 0,05 ml seleninu sodu w wodzie w stężeniu 0,518 mg/ml, 0,5 ml putrescyny w wodzie w stężeniu 160 mg/ml, 0,165 ml progesteronu w 100% etanolu w stężeniu 0,6 mg/ml (patrz tabela materiałów).</li>
			<li>Roztwory należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 2 lat.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) dodać następujące składniki do 58,035 ml DMEM-F12.
		<ol>
			<li>0,05 ml 0,518 mg/ml roztworu seleninu sodu, 0,5 ml roztworu putrescyny o stężeniu 160 mg/mL, 0,165 ml roztworu progesteronu o stężeniu 0,6 mg/ml.</li>
			<li>Filtr Wysterylizuj powyższą mieszaninę filtrem 0,22 μm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pozostając w BSC, przygotować roztwór apotransferyny o stężeniu 100 mg/ml.
		<ol>
			<li>Dodać 5 ml DMEM-F12 do 500 mg apotransferyny (patrz tabela materiałów). Powoli ponownie wymieszać i umyć pojemnik, unikając pęcherzyków.</li>
			<li>Po ponownym wymieszaniu i usunięciu jak największej ilości za pomocą 5 ml, dodać go do roztworu selenitu/putrescyny/progesteronu. Weź więcej poprzedniego roztworu i umyj butelkę z apotransferyną, wydobywając jej jak najwięcej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dodać 5 ml 7,5% BSA frakcji V (patrz Tabela Materiałów) do roztworu.</li>
		<li>Wymieszać i podatkować 6,875 ml na probówkę. Podwielokrotności należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku.</li>
		<li>Używając powyższych podwielokrotności N2 do przygotowania pożywki N2B27, rozmrozić żądaną podwielokrotność i dodać 3,125 ml roztworu insuliny o stężeniu 4 mg/ml (patrz Tabela materiałów) do 6,875 N2 na 10 ml 100x N2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować podłoże podstawowe N2B27.
	<ol>
		<li>Rozmrażaj suplementy N2 i B27 w lodówce o temperaturze 4 °C przez kilka godzin lub przez noc.</li>
		<li>W BSC wymieszaj 484,5 ml DMEM-F12 i 484,5 ml pożywki neuropodstawowej (patrz tabela materiałów) w sterylnej butelce o pojemności 1 l.</li>
		<li>Do pożywki dodać 10 ml witaminy B27 i 10 ml suplementu N2.</li>
		<li>Dodać 1 ml 55 mM beta-merkaptoetanolu (patrz tabela materiałów). Dodaj 10 ml 100x glutamax. Wymieszaj energicznie, obracając butelkę.</li>
		<li>Podwielokrotnić żądaną objętość na podwielokrotność (zwykle 100 ml) i przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku. Przechowywać w użyciu po rozmrożeniu w temperaturze 4 °C do 3 tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj pożywkę NBiL.
	<ol>
		<li>Rozmrozić 100 ml porcji podłoża podstawowego N2B27 w temperaturze -80 °C w lodówce o temperaturze 4 °C.</li>
		<li>W BSC dodać LIF (patrz tabela materiałów) do końcowego stężenia 10 μg/l.</li>
		<li>Dodać CHIR99021 (3 μM wersja ostateczna) i PD0325901 (1 μM wersja ostateczna) (patrz tabela materiałów). Dobrze wymieszać pipetą serologiczną o pojemności 50 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 0,2% roztwór żelatyny.
	<ol>
		<li>Przenieść 500 ml podwójnie destylowanegoH2Odo szklanej butelki o pojemności 1 l.</li>
		<li>Odmierz 1 g żelatyny (patrz Tabela Materiałów) i dodaj ją do wody. Mieszaj, potrząsając butelką, aż do całkowitego rozpuszczenia.</li>
		<li>Mieszaninę żelatyny i wody należy sterylizować w autoklawie pod ciśnieniem 15 psi, 121 °C przez 35 min. Po schłodzeniu filtr wysterylizuj go filtrem 0,22 μm w BSC. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj media myjące.
	<ol>
		<li>W BSC wymieszać 160 μl 7,5% BSA na 10 ml DMEM-F12.</li>
		<li>Skaluj powyższe i przygotuj w dużych ilościach, aby ułatwić użycie w przyszłości (np. 8 ml 7,5% BSA do 500 ml DMEM-F12). Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie odczynników do politransfekcji mPSC
UWAGA: Następujące wartości są podane dla pojedynczego dołka płytki 24-dołkowej. Wartości można odpowiednio skalować. Sekwencje wszystkich DNA/plazmidów są szczegółowo opisane w pliku uzupełniającym 1.
<ol>
	<li>Oblicz objętość roztworu DNA potrzebną na zabieg.
	<ol>
		<li>Przygotuj 500 ng DNA na studzienkę/warunek.
		<ol>
			<li>W przypadku transfekcji pojedynczego plazmidu roztworem DNA o stężeniu 100 ng/μl należy przygotować jedną probówkę z 5 μl DNA.</li>
			<li>W przypadku transfekcji dwóch plazmidów po 100 ng/μl każdy, należy przygotować dwie probówki po 2,5 μl w każdej, po jednej dla każdego plazmidu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W BSC wykonaj następujące czynności: Na każde 500 ng zabiegu transfekcji (patrz Tabela materiałów) należy podać 25 μl OptiMEM do probówki o pojemności 1,5 ml.
	<ol>
		<li>Przeskaluj to odpowiednio - dla powyższego przykładu przygotuj dwie probówki, każda z 250 ng DNA (2,5 μL) i 12,5 μL OptiMEM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać wymaganą objętość DNA do tego zabiegu do OptiMEM w probówce.</li>
	<li>Dla każdej probówki z 500 ng DNA i OptiMEM utwórz pasującą probówkę z kolejnymi 25 μl OptiMEM i 1 μl odczynnika do transfekcji na bazie kationowych lipidów.
	<ol>
		<li>Ponownie, te wartości muszą być odpowiednio przeskalowane. Do powyższego przykładu przygotuj dwie probówki, każda zawierająca 12,5 μl OptiMEM i 0,5 μl odczynnika do transfekcji. 
		UWAGA: Podczas skalowania wartości należy użyć masy dodanego DNA, a nie objętości wymaganej dla tej ilości DNA. Reakcje z odczynnikiem do transfekcji i DNA można skalować (np. jeśli 5 studzienek ma być transfekowanych tym samym DNA). Zachowaj takie same proporcje odczynników, ale odpowiednio je skaluj (np. 1000 ng DNA: 50 μL OptiMEM: 2 μl odczynnika do transfekcji: 50 μL OptiMEM).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie mPSC do transfekcji
UWAGA: Do transfekcji odwrotnej, przygotuj naczynie hodowlane i przeprowadź mPSC bezpośrednio przed dodaniem odczynników do transfekcji. W przypadku transfekcji do przodu, przejście i płytkowanie komórek 12-18 godzin przed transfekcją, aby komórki mogły przylgnąć do płytki.
<ol>
	<li>Przygotować 0,2% naczynie do hodowli komórkowych pokryte żelatyną.
	<ol>
		<li>Zaplanuj liczbę dołków potrzebnych do transfekcji (jeden dołek z 24-dołkowej płytki na zabieg/grupę).</li>
		<li>Dodaj 200 μl 0,2% roztworu żelatyny do każdego z pożądanych dołków na płytce 24-dołkowej.</li>
		<li>Delikatnie potrząśnij płytką, aby równomiernie rozprowadzić roztwór, upewniając się, że pokrywa całe dno studzienki.</li>
		<li>Pozostaw studzienki do pokrycia przez co najmniej 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Za pomocą aspiratora próżniowego ostrożnie usuń resztki żelatyny z dołków (przechyl płytkę, aby zapewnić usunięcie całego płynu bez zeskrobywania warstwy żelatyny).</li>
		<li>Dodać 0,5 ml pożywki NBiL (krok 1.3) do każdego dołka i pozostawić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych do wstępnego ogrzania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przejście mPSC.
	<ol>
		<li>Porcję 30 ml pożywki płuczącej (krok 1.5) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Odessać stare podłoża z naczynia do hodowli tkankowych mESC. 
		UWAGA: Dopuszczalnych jest kilka technik aspiracji. Niezależnie od wybranej techniki upewnij się, że komórki nie pozostają suche przez dłuższy czas (maksymalnie około 30 s).</li>
		<li>Dodać wymaganą ilość dostępnej w handlu pożywki do usuwania komórek (1,5 ml na 10-centymetrową szalkę, odpowiednio skalować, patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Odczekaj 3-5 minut przed pipetowaniem w górę i w dół 15-20 razy za pomocą pipety P1000, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Zobacz komórki pod mikroskopem, aby zapewnić zawiesinę pojedynczej komórki.</li>
		<li>Przenieść komórki z pożywki denatchacyjnej do probówki o pojemności 50 ml zawierającej pożywkę do przemywania (ang. wash agents).</li>
		<li>Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zassać płyn myjący, upewniając się, że w probówce nie pozostały żadne resztki płynu.</li>
		<li>Zawiesić granulat w małej objętości środka myjącego (~300 μL). Policz zawiesinę komórek za pomocą hemocytometru, aby uzyskać gęstość komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Odwrotna transfekcja mPSC
<ol>
	<li>Przygotować odczynniki do politransfekcji zgodnie z krokiem 2.</li>
	<li>Przygotować naczynie do hodowli komórkowej i pasażować mPSC zgodnie z krokiem 3.</li>
	<li>Porcję 200 μl pożywki NBiL do probówek o pojemności 1,5 ml, po jednej na każdy zabieg.</li>
	<li>Dodać 26 μl mieszaniny odczynnika OptiMEM:transfekcja do mieszaniny DNA:OptiMEM. Odczynniki należy szybko i energicznie wymieszać, pipetując około 10 razy. Pozostaw mieszaninę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>W zależności od gęstości komórek przenieś wymaganą objętość komórek z zawiesiny komórek o pojemności 300 μl do probówek NBiL o pojemności 200 μl, aby uzyskać 25 000 komórek na probówkę.</li>
	<li>Po 5 minutach inkubacji mieszaniny Lipofectamine 2000 (L2K, odczynnik do transfekcji) i DNA, dodać ją do probówki z komórkami o pojemności 1,5 ml i dobrze wymieszać pipetując. Pozostawić komórki do inkubacji z odczynnikiem przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odpipetować płyn, pozostawiając około 50 μl.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy za pomocą 100 μl pożywki NBiL. Przenieść komórki na płytkę i umieścić płytkę w inkubatorze. Wymień nośnik 24 godziny później na nowy nośnik NBiL.</li>
</ol>
5. Transfekcja do przodu mPSC
<ol>
	<li>12-18 godzin przed transfekcją przygotować naczynie do hodowli komórkowej i pasażować mPSC zgodnie z krokiem 3.</li>
	<li>W zależności od gęstości komórek przenieś wymaganą objętość komórek z mieszaniny komórek o objętości 300 μl do zasiewu 25 000 komórek na dołek. Umieścić płytkę w inkubatorze.</li>
	<li>1 godzinę przed transfekcją odessać pożywkę ze wszystkich studzienek i zastąpić ją 0,5 ml pożywki NBiL. Umieścić płytkę w inkubatorze.</li>
	<li>W czasie transfekcji przygotuj odczynniki do politransfekcji mPSC zgodnie z krokiem 2.</li>
	<li>Dodać 26 μl mieszaniny odczynnika OptiMEM:transfekcja do mieszaniny DNA:OptiMEM. Odczynniki należy szybko i energicznie wymieszać, pipetując około 10 razy. Pozostawić połączoną mieszaninę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Dodaj połączoną mieszaninę do studzienek kroplami. Umieścić płytkę w inkubatorze. Zmień nośnik 24 godziny później.</li>
</ol>
6. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Odessać pożywkę z transfekowanej płytki 24-dołkowej po 48 godzinach od transfekcji.</li>
	<li>Dodać 200 μl trypsyny do każdej studzienki, wirować i inkubować przez 30 s w temperaturze 37 °C. Postukać w boki płytki i dodać 200 μl lodowatego buforu FACS (2% FBS w PBS).</li>
	<li>Otwórz i oznacz 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V, zaczynając od punktu A1. Wymieszać zawartość każdej studzienki na transfekowanej płytce w celu usunięcia komórek i sporządzenia roztworów jednokomórkowych za pomocą pipety P200. Przenieść 200 μl z każdej studzienki do odpowiedniego dołka na 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Dodać 15 ml buforu FACS do zbiornika na odczynnik o pojemności 50 ml. Odwirować płytkę o masie 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzuć supernatant, odwracając 96-dołkową płytkę do zlewu szybkim i płynnym ruchem.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej zawiesić granulki na płytce 96-dołkowej w 150 μl buforu FACS ze zbiornika odczynnika. Powtórz kroki 6.4-6.5 dwukrotnie. Umieść 96-dołkową płytkę w pojemniku wypełnionym lodem, chronionym przed światłem.</li>
	<li>Przepuścić próbki przez cytometr przepływowy, aby uzyskać rozkład populacji reporterów fluorescencyjnych.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że cytometr jest odpowiedni pod względem kombinacji lasera i filtra do eksperymentu, który ma być przeprowadzony (np. nie używaj reportera w podczerwieni, jeśli nie jest możliwe wzbudzenie lub wykrycie w widmie dalekiej czerwieni).</li>
		<li>Dołącz dodatkowe próbki do koralików standaryzacyjnych, aby umożliwić konwersję danych MEFL podczas analizy. Upewnij się, że w próbce zebrano wystarczającą liczbę komórek do przeprowadzenia odpowiedniej analizy statystycznej9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konwertuj jednostki fluorescencyjne z surowych plików cytometru i analizuj dane za pomocą dowolnej z kilku metod, takich jak potoki oparte na Pythonie lub MATLAB lub dostępne na rynku oprogramowanie9,13.</li>
</ol>

Comparative Analysis of Forward and Reverse Transfection Methods on mPSCs

<ol><li>Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-aware+synthetic+biology+by+controller+design%3A+Engineering+the+mammalian+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell.</a> Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).</li>
<li>Fus-Kujawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+methods+and+tools+for+transfection+of+eukaryotic+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, (2021).</li>
<li>FAU, K. T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+protocols+for+mouse+embryonic+stem+cell+culturing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing.</a> PLoS One. 8 (12), 81156(2013).</li>
<li>Morgani, S., Nichols, J., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+pluripotency%3A+in+vitro+adaptations+of+a+continuum+of+in+vivo+states%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The many faces of pluripotency: in vitro adaptations of a continuum of in vivo states.</a> BMC Developmental Biology. 17 (1), (2017).</li>
<li>Mulas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+propagation+and+manipulation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for propagation and manipulation of mouse embryonic stem cells.</a> Development. 146 (6), Cambridge, England. 173146(2019).</li>
<li>Tamm, C., Kadekar, S., Pijuan-Galitó, S., Annerén, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+efficient+transfection+of+mouse+embryonic+stem+cells+using+non-viral+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast and efficient transfection of mouse embryonic stem cells using non-viral reagents.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 584-591 (2016).</li>
<li>Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+types%2C+methods+and+strategies%3A+A+technical+review%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Transfection types, methods and strategies: A technical review.</a> PeerJ. 9, 11165(2021).</li>
<li>Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bpoly-transfection%26%2334%3B+method+for+rapid%2C+one-pot+characterization+and+optimization+of+genetic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A &#34;poly-transfection&#34; method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems.</a> Nucleic Acids Research. 47 (18), 106(2019).</li>
<li>Jones, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endoribonuclease-based+feedforward+controller+for+decoupling+resource-limited+genetic+modules+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 5690(2020).</li>
<li>Wauford, N., Jones, R., Van De Mark, C., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+development+of+cell+state+identification+circuits+with+poly-transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid development of cell state identification circuits with poly-transfection.</a> Journal of Visualized Experiments. (192), e64793(2023).</li>
<li>Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+extract+based+optimization+of+biomolecular+circuits+with+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 17 (18), 3037-3042 (2017).</li>
<li>Teague, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoflow%3A+A+python+toolbox+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Cytoflow: A python toolbox for flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Qin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+constitutive+promoters+and+the+doxycycline-inducible+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter.</a> PLoS One. 5 (5), 0010611(2010).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Głównym powodem powszechnego stosowania protokołów transfekcji jest ich odtwarzalność i dostępność; Protokoły te wymagają jednak optymalizacji w kontekstach eksperymentalnych. Nie wspomniano powyżej, że standardowe testy są wymagane przy próbie transfekcji nowej linii komórkowej po raz pierwszy. Po pierwsze, wybór odczynnika do transfekcji jest kluczowy, ponieważ dostępne na rynku odczynniki nie są uniwersalne i będą się różnić pod względem skuteczności dostarczania NA w zależności od typu komórek. Dodatkowo znalezienie ...

Dostarczanie DNA i RNA do komórek ssaków służy jako główny filar badań biomedycznych1. Powszechną metodą wprowadzania egzogennych kwasów nukleinowych (NA) do komórek ssaków jest transfekcja przejściowa2,3. Technika ta polega na mieszaniu NA z dostępnymi na rynku odczynnikami do transfekcji, które są w stanie dostarczyć je do komórek biorcy. Zazwyczaj NA jest dostarczany przez transfekcję do przodu, w której komórki przylegające do dwuwymiarowej powierzchni otrzymują kompleks transfekcji. Podczas gdy transfekcja do przodu dla najpowszechniej ustalonych linii komórkowych jest solidna, a protokoły są dobrze opublikowane, bardziej niszowe typy komórek o morfologii niejednowarstwowej nie ulegają łatwej transfekcji, co ogranicza ilość NA, która może zostać dostarczona, i liczbę komórek, które ją odbierają.
Pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC) służą jako atrakcyjny model do zrozumienia rozwoju i jako narzędzie dla medycyny regeneracyjnej, biorąc pod uwagę ich zdolność do dzielenia się w nieskończoność i wytwarzania dowolnego typu komórek ciała. W przypadku mysich PSC (mPSC) rutynowe warunki hodowli in vitro z 2 inhibitorami i LIF (2i/LIF) utrzymują morfologię kolonii przypominającą kopułę, bezpośrednio ograniczając liczbę komórek wystawionych na transfekcję do przodu4,5,6. Aby temu zaradzić, można przeprowadzić odwrotną transfekcję: komórki są dodawane do naczynia zawierającego pożywkę i odczynnik do transfekcji, zamiast dodawać odczynnik do transfekcji do przylegających komórek7. Chociaż zwiększa to liczbę komórek wystawionych na działanie odczynnika, wymaga to również jednoczesnego pasażowania i transfekcji komórek.
Wychodząc poza proste transfekcje pojedynczego NA, badacze często dążą do dostarczenia kilku konstruktów NA do populacji komórek in vitro. Zazwyczaj osiąga się to poprzez kotransfekcję, w której NA są mieszane w określonym stosunku (1:1, 9:1 itd.), a następnie są łączone z wybranym odczynnikiem do transfekcji8. W ten sposób uzyskuje się mieszaninę NA i odczynnika, która zachowuje oryginalny stosunek NAs względem siebie - podczas gdy komórki w leczeniu mogą otrzymywać różne ilości tej mieszanki, wszystkie otrzymują ten sam stosunek9. Chociaż jest to korzystne, gdy znany jest pożądany stosunek części, określenie tego stosunku z wyprzedzeniem może być pracochłonne, a każdy stosunek stanowi inny warunek. Jedną z alternatyw jest wykonanie "politransfekcji", w której poszczególne NA są mieszane z odczynnikiem do transfekcji niezależnie od siebie9. Łącząc kompleksy transfekcyjne zawierające pojedyncze NA (zamiast łączyć NA przed utworzeniem kompleksów), naukowcy mogą badać szeroki wachlarz stechiometrii NA w jednym eksperymencie transfekcyjnym9. Jest to szczególnie cenne w przypadkach, w których oczekuje się, że produkty kilku agencji narodowych będą ze sobą współdziałać, na przykład z indukowalnymi systemami transkrypcji lub systemami z wbudowanym sprzężeniem zwrotnym1,10,11. Jednak, aby zrobić to skutecznie, potrzebna jest wysoka wydajność transfekcji. Rzeczywiście, wraz ze wzrostem liczby unikalnych transfekowanych NA, prawdopodobieństwo, że dana komórka otrzyma wszystkie pożądane NA, maleje wykładniczo9, 12.
Poniższy raport opisuje protokół odwrotnej transfekcji dla mPSC przy użyciu odczynnika do transfekcji na bazie kationowych lipidów, w którym komórki są wystawione na działanie mieszanki odczynnika i NA przez maksymalnie 5 minut, aby zmaksymalizować żywotność i zminimalizować czas poza typowymi warunkami hodowli. Porównanie tego protokołu ze standardową transfekcją do przodu tych komórek wykazuje wyższą skuteczność transfekcji i wzrost całkowitej liczby ocalałych transfekowanych komórek. Łącząc tę odwrotną transfekcję z trójplazmidową politransfekcją z wykorzystaniem prostych reporterów fluorescencyjnych, wykazano rozszerzony potencjał w zakresie badań przesiewowych współczynników NA przy wysokiej skuteczności transfekcji.

<table><tbody><tr><td>Akumulator&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Apotransferyna&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>T1147-500MG</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement&nbsp;</td><td>ThermoFisher Naukowy&nbsp;</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>Beta-merkaptoetanol</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>21985023</tr><tr><td>BSA frakcja V (7,5%)</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>SML1046-25MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>MilliporeSigma</td><td>D6421-24X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki standaryzacyjne cytometrii przepływowej</td><td>Spherotech</td><td>URCP-38-2K</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX suplement&nbsp;</td><td>ThermoFisher Naukowy&nbsp;</td><td></td><td></td>35050061</tr><tr><td>Insulina&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12585-0014</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>Neurobasel media</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>21103049</tr><tr><td>OptiMEM&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>PZ0162-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>MilliporeSigma</td><td>P8783</td><td>Zagrożenie chemiczne - zapoznaj się z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa, upewnij się, że noszone są odpowiednie środki ochrony osobistej i pracuj ze stałym proszkiem tylko w okapie oparów chemicznych</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>MilliporeSigma</td><td>P6780</td><td>Zagrożenie chemiczne - zapoznaj się z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa, upewnij się, że noszone są odpowiednie środki ochrony osobistej i pracuj ze stałym proszkiem tylko w okapie</td></tr> <tr><td>oparów chemicznychRekombinowany mLIF&nbsp;</td><td>BioTechne</td><td>8878-LF-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>Selenin sodu&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>S5261-25G</td><td>Zagrożenie chemiczne - zapoznaj się z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa, upewnij się, że nosisz odpowiednie środki ochrony osobistej i pracuj ze stałym proszkiem tylko w chemicznym dygestoriach</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>25200056</tr></tbody></table>

zoptymalizowana technika odwróconej politransfekcji oparta na embrionalnych komórkach macierzystych myszy do szybkiego badania proporcji kwasów nukleinowych

An Optimized Mouse Embryonic Stem Cell Based Reverse Poly-Transfection Technique for Rapid Exploration of Nucleic Acid Ratios

Ze względu na względną prostotę i łatwość użycia, przejściowa transfekcja linii komórkowych ssaków za pomocą kwasów nukleinowych stała się podstawą badań biomedycznych. Podczas gdy większość powszechnie stosowanych linii komórkowych ma solidne protokoły transfekcji w przylegającej dwuwymiarowej hodowli, protokoły te często nie przekładają się dobrze na mniej zbadane linie lub te o nietypowej, trudnej do transfekcji morfologii. Wykorzystując mysie pluripotencjalne komórki macierzyste hodowane w pożywce 2i/LIF, szeroko stosowanym modelu hodowli w medycynie regeneracyjnej, metoda ta przedstawia zoptymalizowany, szybki protokół odwrotnej transfekcji, który jest w stanie osiągnąć wyższą wydajność transfekcji. Wykorzystując ten protokół, przeprowadzana jest politransfekcja trójplazmidowa, wykorzystując wyższą niż normalna wydajność dostarczania plazmidu do badania rozszerzonego zakresu stechiometrii plazmidu. Ten protokół odwróconej politransfekcji pozwala na metodę eksperymentalną z jednym garnkiem, umożliwiając użytkownikom optymalizację proporcji plazmidu w jednym dołku, a nie w kilku kotransfekcjach. Ułatwiając szybkie badanie wpływu stechiometrii DNA na ogólną funkcję dostarczonych obwodów genetycznych, protokół ten minimalizuje czas i koszt transfekcji embrionalnych komórek macierzystych.

Zarówno transfekcja bezpośrednia, jak i odwrócona opierają się na oddziaływaniu pomiędzy błoną komórkową a wchodzącymi kompleksami odczynnika do transfekcji i DNA, co umożliwia dostarczenie kwasów nukleinowych do komórek biorczych. Różnica między tymi technikami polega na stanie komórek w momencie dostarczenia – podczas gdy w tradycyjnej transfekcji bezpośredniej DNA jest zazwyczaj dostarczane do adherentnych monowarstw komórek, transfekcja odwrócona polega na spotkaniu kompleksu odczynnik-DNA z komórkami w formie zawies...

Obecny protokół opisuje metodę odwrotnej politransfekcji embrionalnych komórek macierzystych myszy podczas hodowli za pomocą pożywki 2i i LIF. Metoda ta zapewnia wyższą żywotność i wydajność niż tradycyjne protokoły transfekcji do przodu, a jednocześnie umożliwia jednoetapową optymalizację proporcji plazmidów.

Zoptymalizowana technika odwróconej politransfekcji oparta na embrionalnych komórkach macierzystych myszy do szybkiego badania proporcji kwasów nukleinowych

Due to its relative simplicity and ease of use, transient transfection of mammalian cell lines with nucleic acids has become a mainstay in biomedical ...

Nasza praca skupia się głównie na wykorzystaniu syntetycznych urządzeń genetycznych do manipulowania wiarą i zachowaniem komórek macierzystych. Kontrolując stany komórkowe, dążymy do przyspieszenia rozwoju terapii komórkowych nowej generacji. Ostatnio udało się lepiej zrozumieć związek między dawką genu determinującego wiarę a linią komórkową.Było to możliwe dzięki opracowaniu kontrolerów genetycznych, które są w stanie precyzyjnie miareczkować dany gen. Klasyczne techniki biologii molekularnej, takie jak transfekcja lub transdukcja lentiwirusowa w celu uzyskania prostej ekspresji genów, zawsze będą podstawą. Jednak w naszej dziedzinie przyjęto ostatnio urządzenia syntetyczne, które zawierają liniowe i nieliniowe sprzężenie zwrotne w celu uzyskania bardziej złożonych wyników z dostarczonego DNA.Dawkowanie genów odgrywa kluczową rolę w określaniu wyniku ekspresji genów. W przypadku dostarczania wielu genów egzogennych kluczowym czynnikiem eksperymentalnym jest to, ile każdego genu da optymalny lub pożądany wynik. Nasz protokół pozwala naukowcom na szybkie skanowanie różnych dawek w jednym zabiegu, szukając pożądanego stosunku urządzeń DNA.Aby przygotować 24-dołkową płytkę pokrytą żelatyną, dodaj 200 mikrolitrów tych 0,2% roztworu żelatyny do każdej studzienki. Delikatnie potrząśnij płytką, aby równomiernie rozprowadzić roztwór i pozwól studzienkom pokryć się w temperaturze pokojowej. Po 15 minutach za pomocą aspiratora próżniowego ostrożnie usuń resztki żelatyny z dołków.Dodaj 0,5 mililitra świeżo przygotowanej pożywki NBIL do każdej studzienki i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w celu wstępnego ogrzania. Porcja 30 mililitrów środka myjącego do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Odessać pożywkę z naczynia do hodowli tkankowych MPSC i dodać wymaganą ilość pożywki do oddzielania komórek.Po trzech do pięciu minutach pipetuj w górę i w dół od 15 do 20 razy za pomocą pipety P1000. Obserwuj komórki pod mikroskopem, aby zapewnić zawieszenie pojedynczej komórki. Przenieść zawiesinę komórek do 50-mililitrowej probówki zawierającej pożywkę do mycia.Odwirować zawiesinę o sile 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i odessać pożywkę myjącą. Zawiesić granulat w około 300 mikrolitrach środka myjącego. Na początek podlej 200 mikrolitrów pożywki NBIL do 1,5 mililitrowych probówek.Dodać 26 mikrolitrów optymalnej mieszaniny odczynników do transfekcji do optymalnej mieszaniny DNA. Energicznie odpipetować odczynniki, około 10 razy. Przenieść wymaganą objętość zawiesiny MPSC do 200 mikrolitrów probówek NBIL.Następnie dodać lipofektaminę 2000 i mieszaninę DNA do probówek i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Po pięciu minutach odwirować mieszalnik o sile 300G przez pięć minut i usunąć supernatant, pozostawiając około 50 mikrolitrów w probówce. Zawiesić osad w 100 mikrolitrach pożywki NBIL.Przenieść zawiesinę komórek na 24-dołkową płytkę pokrytą żelatyną i umieścić ją w inkubatorze. Przenieść wymaganą objętość zawiesiny MPSC do nasion 25 000 komórek na dołek 24-dołkowej płytki pokrytej żelatyną i umieścić płytkę w inkubatorze. Na godzinę przed transfekcją zastąp pożywkę ze studzienek 0,5 mililitra pożywki NBIL.Po inkubacji kroplami dodaj lipofektaminę 2000 i mieszaninę DNA do studzienek. Umieść płytkę w inkubatorze na 48 godzin. Po transfekcji MPSC odessać pożywkę z płytki sześciodołkowej.Następnie dodaj 200 mikrolitrów trypsonu do każdej studzienki, wiruj i inkubuj przez 30 sekund w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Postukaj w bok płytki i dodaj 200 mikrolitrów lodowatego bufora faksu. Za pomocą pipety P200 wymieszaj zawartość każdej studzienki, aby usunąć komórki i uzyskać roztwory jednokomórkowe.Przenieś 200 mikrolitrów z każdej studzienki do odpowiedniego dołka na płytce 96-dołkowej. Odwirować płytkę o temperaturze 300G przez pięć minut. Po odwirowaniu ponownie zawiesić granulki w 150 mikrolitrach buforu faksowego przed uruchomieniem próbki na cytometrze przepływowym.W porównaniu z transfekcjami odwrotnymi, transfekcje do przodu wykazały znacznie niższy odsetek komórek dodatnich dla markera. Co ciekawe, transfekcje do przodu nie dostarczyły średnio istotnie mniejszej ilości DNA do populacji komórek. W przypadku odwrotnych transfekcji czas inkubacji istotnie wpłynął na odsetek komórek reporterowo-dodatnich.Jednak na średnią ekspresję reporterową w komórkach dodatnich nie miał wpływu czas inkubacji. Zarówno w przypadku politransfekcji, jak i kotransfekcji, transfekcja do przodu znacznie zmniejszyła liczbę komórek obecnych w wybranym punkcie końcowym w porównaniu z transfekcją odwrotną. W przypadku odwróconych politransfekcji zaobserwowano wyższą efektywność transfekcji oraz szerszy zakres dynamiczny dobrze reprezentowanych proporcji DNA.

an-optimized-mouse-embryonic-stem-cell-based-reverse-poly

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Opisujemy test z reporterem fluorescencyjnym służący do szybkiej identyfikacji i charakterystyki genów regulujących utrzymanie oraz samoodnawianie embrionalnych komórek macierzystych myszy.

Analiza reporterowa Oct4GiP w celu badania genów regulujących utrzymanie i samoodnawianie macierzystych komórek embrionalnych myszy

Kontrola ekspansji somatycznych komórek macierzystych jest głównym czynnikiem utrudniającym ich badanie oraz zastosowanie w terapii. W niniejszym opracowaniu opisujemy system czasowej kontroli ekspansji neuronalnych komórek macierzystych podczas rozwoju oraz w wieku dorosłym, który może zostać wykorzystany do zwiększenia liczby neuronów generowanych w mózgu myszy.

Ekspansja embrionalnych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego poprzez elektroporację in utero lub stereotaksycyjne wstrzyknięcie wirusowe

Reporterowe linie komórkowe oferują sposób na wizualizację, śledzenie i izolowanie interesujących komórek z heterogenicznych populacji. Jednak celowanie w geny za pomocą konwencjonalnej rekombinacji homologicznej w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych jest wyjątkowo nieefektywne. W tym miejscu opisujemy celowanie w locus czynnika transkrypcyjnego PITX3 specyficznego dla OUN za pomocą EGFP przy użyciu rekombinacji homologicznej wzmocnionej nukleazą palca cynkowego.

Ukierunkowanie genów na nukleazę palca cynkowego w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

Celem tego protokołu jest opisanie metody funkcji utraty i zysku, która ma zastosowanie do identyfikacji neogeniny jako specyficznego dla etapu receptora, który prowadzi do trofektodermy i różnicowania wewnętrznej masy komórkowej w preimplantacyjnych zarodkach myszy.

Podejście oparte na utracie i wzmocnieniu funkcji w celu zbadania determinantów wczesnego losu komórek w preimplantacyjnych zarodkach myszy

Białka często zawierają wiele domen, które mogą pełnić różne funkcje komórkowe. Nokauty genów (KO) nie uwzględniają tej różnorodności funkcjonalnej. W tym miejscu przedstawiamy podejście oparte na wymianie kasetowej za pośrednictwem rekombinacji (RMCE) oparte na strukturze i funkcji w embrionalnych komórkach macierzystych KO, które pozwala na molekularną sekcję różnych domen funkcjonalnych lub wariantów białka.

Badania strukturyczno-funkcjonalne w embrionalnych komórkach macierzystych myszy z wykorzystaniem wymiany kasetowej za pośrednictwem rekombinazy

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę kriokonserwacji jednokomórkowych zarodków, a także protokół, który łączy użycie zamrożonych i rozmrożonych embrionów z elektroporacją w celu efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy.

Wykorzystanie zamrożonych i rozmrożonych zarodków do wysokowydajnej produkcji genetycznie zmodyfikowanych myszy

Ten protokół opisuje metodę Capture Hi-C używaną do charakteryzowania organizacji 3D docelowych regionów genomowych o rozmiarach mega w wysokiej rozdzielczości, w tym granic topologicznie asojacujących domen (TADs) i interakcji chromatyny dalekiego zasięgu między regulatorowymi i innymi elementami sekwencji DNA.

Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C

Tutaj opisujemy prostą technikę przeznaczoną do efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy o nazwie CRISPR RNP Electroporation of Zygot (CRISPR-EZ). Metoda ta zapewnia edycję odczynników poprzez elektroporację do zarodków z wydajnością bliską 100%. Protokół ten jest skuteczny w przypadku mutacji punktowych, małych insercji genomowych i delecji w zarodkach ssaków.

Wydajna edycja genomu myszy za pomocą elektroporacji zygot CRISPR

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju genetycznie modyfikowanych modeli myszy przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych, szczególnie dla dużych DNA knock-in (KI). Protokół ten jest dostrojony przy użyciu edycji genomu CRISPR/Cas9, co skutkuje znacznie lepszą wydajnością KI w porównaniu z konwencjonalną metodą celowania w linearyzowane DNA za pośrednictwem rekombinacji homologicznej.

Wysoce skuteczne celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w embrionalnych komórkach macierzystych w celu opracowania modeli myszy zmanipulowanych genami

Skomplikowane obwody genetyczne są czasochłonne do projektowania, testowania i optymalizacji. Aby ułatwić ten proces, komórki ssaków są transfekowane w sposób, który umożliwia testowanie wielu stechiometrii elementów obwodu w jednym dołku. Protokół ten określa etapy planowania eksperymentu, transfekcji i analizy danych.

Szybki rozwój obwodów identyfikacji stanu komórki z politransfekcją

Poznaj zoptymalizowaną metodę odwróconej politransfekcji mysich embrionalnych komórek macierzystych w mediach 2i i LIF. Technika ta zwiększa przeżywalność komórek i efektywność transfekcji, umożliwiając szybką optymalizację proporcji plazmidów w jednym kroku.

Zoptymalizowana technika odwróconej politransfekcji oparta na embrionalnych komórkach macierzystych myszy do szybkiego badania proporcji kwasów nukleinowych (Wideo) | JoVE Journal

Zoptymalizowana technika odwróconej politransfekcji oparta na embrionalnych komórkach macierzystych myszy do szybkiego badania proporcji kwasów nukleinowych

Przeglądaj więcej filmów