Name: Tworzenie modeli skóry do wielu zastosowań - od dwuwymiarowej (2D) monokultury do trójwymiarowej (3D) wielokulturowości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj metody tworzenia trójwymiarowych modeli skóry z wykorzystaniem keratynocytów, fibroblastów i melanocytów. Proste protokoły umożliwiają badania cytotoksyczności składników na realistycznej platformie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni za wsparcie finansowe udzielone przez Politechnikę Warszawską z programu 'Inicjatywa Doskonałości - Uczelnia Badawcza' w postaci dwóch grantów: POB BIB BIOTECHMED-2 start (nr 1820/2/ZO1/POB4/2021) oraz grantu Rektora dla Studenckich Kół Naukowych (SKIN-ART, nr 1820/116/Z16/2021). Ponadto Autorzy dziękują za wsparcie, jakie otrzymali prof. Joanna Cieśla oraz Katedra Biotechnologii Leków i Kosmetyków oraz Koła Naukowego Biotechnologii "Herbion" na Wydziale Chemicznym Politechniki Warszawskiej. Szczególne podziękowania kierujemy do dr Michała Stepulaka za udostępnienie związku Pluronic F-127.

Efficient 3D Skin Models for Flexible Research Application

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W artykule przedstawiono metodykę, którą można zastosować do przygotowania własnych, zaawansowanych modeli sztucznej skóry. Jest to dobre rozwiązanie wszędzie tam, gdzie planowane badania wymagają ściśle określonych modeli badawczych, które mogą okazać się niedostępne na rynku lub bardzo drogie. Jak wspomniano wcześniej, na rynku dostępnych jest kilka komercyjnych odpowiedników skóry (np. EpiSkin, EpiDerm FT). Jednak ich koszt (100-400 euro za sztukę) oraz czas realizacji (kilka dni-tygodni) mogą skłonić badacza do podjęcia próby przygotowania takiego modelu we własnym zakresie. Proponowane zabiegi są łatwe do wykonania nawet dla niedoświadczonych naukowców, a jednocześnie pozwalają na uzyskanie bardzo zaawansowanych modeli skóry. Warto podkreślić, że decyzja o składzie komórkowym danego modelu jest w pełni zależna od badacza. Oprócz stworzonego modelu może on być dalej rozwijany i udoskonalany, co otwiera zupełnie nowe perspektywy badawcze. W przypadku modeli komercyjnych konieczne jest dokupienie innego odpowiednika.
Chociaż hodowle komórkowe 3D mogą być zaawansowane z wieloma typami komórek, łatwe w obsłudze i dostępne, nadal są to tylko sztuczne modele, które nie są w stanie w pełni odtworzyć złożoności i funkcjonalności tkanki (np. funkcji immunologicznych, unaczynienia). Dlatego w większości badań wymaganych jest kilka modeli, aby potwierdzić uzyskane wyniki. W tabeli 9 zebrano niektóre zalety i wady tych modeli, a także ich ograniczenia. Z drugiej strony, modele komercyjne gwarantują wysokie standardy jakościowe przy odtwarzalności eksperymentów i porównywalności danych między laboratoriami. Aby wdrożyć zastosowanie nowego związku do badań, z pewnością konieczny będzie zakup odpowiedniego komercyjnego odpowiednika. Ale na etapie przygotowawczym taki samodzielnie wykonany model 3D skóry (sfera wielokomórkowa lub odpowiednik) może pomóc w zmniejszeniu liczby eksperymentów, które trzeba przeprowadzić na komercyjnym odpowiedniku. Celem tworzenia i wykorzystywania opisywanych modeli nie jest ominięcie konieczności stosowania certyfikowanych modeli badawczych, ale ułatwienie prowadzenia badań i ograniczenie wydatków z tym związanych.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Porównana para modeli</td>
			<td colspan="3">Zalety</td>
			<td colspan="3">Wady</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">Hodowla komórkowa a zwierzęta</td>
			<td colspan="3">Zminimalizowane cierpienie zwierząt</td>
			<td colspan="3">Ograniczone informacje na temat wpływu badanego czynnika na cały organizm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Wysoka standaryzacja eksperymentu - lepsza powtarzalność wyników</td>
			<td colspan="3">Pojedynczy model nie wystarczy, aby odzwierciedlić procesy zachodzące w organizmie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Brak skutków ubocznych dla całego organizmu</td>
			<td colspan="3">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Lepsza kontrola nad warunkami eksperymentu</td>
			<td colspan="3">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Możliwość automatyzacji (np. bioprinting)</td>
			<td colspan="3">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Niższe koszty</td>
			<td colspan="3">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Mały rozmiar potrzebnej próbki</td>
			<td colspan="3">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Ograniczona ilość wytwarzanych odpadów</td>
			<td colspan="3">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Kultury 3D i 2D</td>
			<td colspan="3">Lepiej odzwierciedlają cały organizm</td>
			<td colspan="3">Kultura czasochłonna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Możliwość stworzenia funkcjonalnej tkanki</td>
			<td colspan="3">Wyższe koszty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Możliwość stworzenia modelu dopasowanego do potrzeb prowadzonych badań</td>
			<td colspan="3">Spontaniczne tworzenie struktury 3D jest prawie niemożliwe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">-</td>
			<td colspan="3">Brak standaryzowanych testów do ilościowego określania wpływu różnych związków</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">-</td>
			<td colspan="3">Ograniczony dostęp do różnych kultur 3D dostępnych na rynku</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Linia komórkowa a komórki pierwotne</td>
			<td colspan="3">Certyfikowane i zatwierdzone modele</td>
			<td colspan="3">Dostępna jest tylko ograniczona liczba linii komórkowych</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Wysoka standaryzacja eksperymentu - lepsza powtarzalność wyników</td>
			<td colspan="3">Ograniczona możliwość pozyskania kilku typów komórek od tego samego dawcy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Dłuższa żywotność</td>
			<td colspan="3">Może mieć zmienione właściwości w stosunku do komórek natywnych</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Dość szybkie tempo rozprzestrzeniania się</td>
			<td colspan="3">Często zaburzona funkcjonalność komórek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Mniej wrażliwy na kilka czynności (np. zamrażanie, wirowanie)</td>
			<td colspan="3">-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 9: Porównanie wykorzystania różnych modeli w badaniach – zalety i wady
W kilku artykułach opisano, jak przygotować modele 3D skóry (poza artykułami przeglądowymi podsumowującymi dostępne na rynku modele 14,43,44, zwykle koncentrują się one na jednej metodologii uzyskiwania sfer 45 lub odpowiedników46).
W artykule opisano dwie metodologie tworzenia kuli z komórkami skóry. Metoda wiszącego kropli jest szeroko stosowana, ale jej powtarzalność i stabilność może być w niektórych przypadkach niewystarczająca. Większość kroków wymaga określonych działań, takich jak praca z dużą prędkością ze względu na parowanie wody z kropelek podczas przenoszenia. Zalecane są również delikatne ruchy, ponieważ brak takiej umiejętności może skutkować uszkodzeniem agregatu komórkowego31,32. Tak więc łatwiejsza metoda przygotowania kuli koncentruje się na ograniczeniu adhezji komórek. Brak dobrej powierzchni do przyczepiania komórek sprzyja wyższym interakcjom między komórkami. W konsekwencji generowane są agregaty komórek. Jego powtarzalność jest znacznie większa, ponieważ nie ma konieczności przenoszenia sfery. Dzięki tym metodom ustalono optymalną liczbę komórek skóry do stworzenia kuli na poziomie 1 x 104 komórki/kulę.
Następnie przedstawiono procedury opisujące przygotowanie odpowiedników skórnych. Ich wygląd i funkcjonalność w badaniach może być silnie uzależniona od elementów, z których są zbudowane, w tym komórek (tab. 2), rusztowań i pożywek. Rusztowania 3D wykorzystywane do przygotowania sztucznej skóry można podzielić na hydrożele syntetyczne oraz te powstałe ze źródeł naturalnych. W zależności od użytego materiału i jego właściwości do skomponowania hydrożelu może wystąpić konieczność dodatkowego uzupełnienia podłoża. Syntetyczne hydrożele wymagają włączenia bioaktywnych cząsteczek (białek, enzymów i czynników wzrostu) do sieci syntetycznego hydrożelu w celu pośredniczenia w określonych funkcjach komórek47. Główne podejścia prezentowane w literaturze w celu osiągnięcia kontrolowanego dostarczania czynników wzrostu do hydrożeli obejmują bezpośrednie obciążenie, oddziaływanie elektrostatyczne, wiązanie kowalencyjne i stosowanie nośników48. Hydrożele utworzone ze źródeł naturalnych, takich jak białka ECM i polimery, mogą generować płynne ścieżki w całym rusztowaniu 3D, przyspieszając dystrybucję składników odżywczych; Dzięki temu nie ma potrzeby dodatkowej suplementacji pożywki. Badania wykazały, że małe cząsteczki (takie jak cytokiny i czynniki wzrostu) i makrocząsteczki (w tym glikozaminoglikany i proteoglikany) mogą być transportowane przez ECM przez dyfuzję47. Jednak dyfuzja molekularna tlenu, składników odżywczych i innych bioaktywnych cząsteczek może być utrudniona przez właściwości samego hydrożelu ECM. Mniejsza dyfuzja była skorelowana z większą gęstością hydrożelu, ale także z bardzo wysokim stężeniem kolagenu37. W tym badaniu, aby stworzyć odpowiednik skóry, zastosowano niskie stężenie kolagenu równe 2 mg / ml, co sugeruje, że dyfuzja molekularna przez hydrożel powinna być dobra i szybka. W związku z tym nie zapewniono dodatkowej suplementacji do pożywki na tym etapie ani do samego hydrożelu. Aby naśladować skórę właściwą, komórki tuczne i fibroblasty (1:10) zostały osadzone w hydrożelu kolagenowym. Następnie melanocyty i keratynocyty (1:15) wysiano na hydrożel, a cały odpowiednik wyhodowano w pożywce. Warto wspomnieć, że podstawowa pożywka składa się z kilku aminokwasów, kwasów nieorganicznych i witamin, a dodatkowo jest uzupełniana surowicą (składającą się z wielu: czynników wzrostu i przyłączenia komórek, lipidów, hormonów, składników odżywczych i źródeł energii, nośników, białek wiążących i przenoszących itp.). Aby osiągnąć prawidłową strukturę naskórka, należy w określonym czasie dodawać do podłoża różne suplementy. Najważniejszym stymulatorem inicjującym różnicowanie naskórka jest wapń, który aktywuje sygnalizację wewnątrzkomórkową. Kwas askorbinowy stymuluje podobny szlak sygnałowy jak ten, w którym pośredniczy wapń, ale jego działaniu towarzyszy również zwiększony transport askorbinianu i zapobieganie wyczerpaniu hydrofilowych przeciwutleniaczy41. Co więcej, różnicowanie komórek uległo poprawie, gdy do pożywki dodano inne składniki (takie jak kofeina, hydrokortyzon, trójjodotyronina, adenina i toksyna)41,44. Ważne jest, aby przygotowane modele zawsze były sprawdzane pod kątem obecności danego typu komórek w odpowiedniej warstwie. Obecność wszystkich czterech typów komórek skóry została potwierdzona w strukturze stworzonego odpowiednika przez barwienie H&E.
Najczęstszym spotykanym problemem jest delikatność i intuicja w obchodzeniu się z uzyskanymi modelami. Pewne trudności mogą być związane z tworzeniem kuli komórkowej, a także z preparatem hydrożelowym. Podczas hodowli komórkowej może również wystąpić kilka innych problemów; Należą do nich infekcje mikrobiologiczne, niski współczynnik proliferacji komórek, starzenie się komórek pierwotnych wykorzystywanych w modelach, maksymalny czas hodowli modeli 2D i 3D zrekonstruowanych z komórek pierwotnych w porównaniu z liniami komórkowymi itp. W tabeli 10 zebrano kilka praktycznych porad dotyczących postępowania w przypadku wystąpienia jednego z poniższych problemów.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Najczęstsze problemy w hodowli komórkowej</td>
			<td colspan="4">Sugestie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zakażenie bakteryjne</td>
			<td colspan="4">Jeśli do zakażenia bakteryjnego dojdzie w jednej z kolb/szalek z komórkami, lepiej jest usunąć zakażoną kulturę tak szybko, jak to możliwe (aby nie zanieczyszczać pozostałych kolb/szalek komórkami). Ponownie zamrozić nową fiolkę z komórkami. Jeśli infekcja powróci, dobrze jest spróbować poszerzyć spektrum stosowanych antybiotyków i zwiększyć ich stężenie.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niski współczynnik proliferacji komórek</td>
			<td colspan="4">Niektóre ogniwa mają długi czas podwajania. Aby stymulować ich proliferację, do podłoża podstawowego można dodać kilka specyficznych dla komórek czynników wzrostu. Również zwiększenie stężenia FBS lub L-glutaminy w pożywce podstawowej może pomóc w stymulowaniu wzrostu komórek.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starzenie się komórek pierwotnych wykorzystywanych w modelach</td>
			<td colspan="4">Po kilku przejściach komórki pierwotne wchodzą w proces starzenia się i przestają się dzielić. Aby przezwyciężyć ten problem w modelach, zaleca się użycie komórek z jak najwcześniejszego przejścia do budowy modelu.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maksymalny czas hodowli modeli 2D i 3D zrekonstruowanych z komórek pierwotnych w porównaniu z liniami komórkowymi</td>
			<td colspan="4">Czas hodowli modelu zależy w dużym stopniu od rodzaju użytych komórek. W przypadku komórek pierwotnych czas hodowli będzie krótszy ze względu na ich krótką żywotność.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trudności w tworzeniu sfery komórkowej</td>
			<td colspan="4">Niektóre komórki mogą wymagać dłuższego czasu na uformowanie się kuli. Jeśli po kilku kolejnych dniach kulki nie zostaną uformowane, należy pobrać komórki z próbki i sprawdzić ich żywotność, na przykład za pomocą barwienia błękitem trypanowym.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Problemy ze stabilnością sfery</td>
			<td colspan="4">Jeśli kule nie są stabilne i ulegną zniszczeniu podczas przenoszenia, spróbuj utworzyć kule z mniejszej liczby komórek. Upewnij się, że zawsze delikatnie przenosisz naczynia, w których rosną kule.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trudności z przygotowaniem hydrożelu</td>
			<td colspan="4">Sprawdź, czy proporcje składników (woda, PBS [10x], NaOH, kolagen typu 1) były prawidłowe. Podstawowy roztwór kolagenu jest zwykle bardzo gęsty, dlatego należy go powoli pipetować. Pęcherzyki powietrza zaburzają morfologię hydrożelu, dlatego odwrotne pipetowanie żelu może pomóc w rozwiązaniu tego problemu.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 10: Rozwiązywanie problemów z hodowlami komórkowymi
Ustalone modele po wytworzeniu mogą być wykorzystywane w wielu dziedzinach, począwszy od (1) eksperymentów cytotoksyczności i genotoksyczności nowych związków o aktywności biologicznej do stosowania w lekach i kosmetykach49, (2) eksperymentów z różnymi czynnikami stymulacji50, (3) badań podstawowych zwiększających naszą wiedzę o komórkach skóry, ich funkcjach biologicznych, interakcjach z innymi komórkami i środowiskiem51, 52, (4) badania nad wybranymi jednostkami chorobowymi, w których do stworzonego modelu można wprowadzić określony typ komórki (komórki nowotworowe, komórki z mutacją w danym genie itp.14,53) i wiele innych. Nie trzeba dodawać, że stosowanie tych modeli pozostaje w zgodzie z zasadą 3R na rzecz bardziej etycznego wykorzystywania zwierząt w testowaniu produktów i badaniach naukowych oraz nie narusza prawa zakazu testowania produktów kosmetycznych na zwierzętach.

Skóra jest ciągłą strukturą z interakcjami wielokomórkowymi, które odzwierciedlają prawidłowe funkcjonowanie i homeostazę tego złożonego narządu. Składa się ona z morfologicznie odmiennych warstw: warstwy wewnętrznej – skóry właściwej oraz warstwy zewnętrznej – naskórka. Na powierzchni naskórka dodatkowo wyróżniamy warstwę rogową (składającą się z płaskich, martwych komórek – korneocytów), która zapewnia największą ochronę przed środowiskiem zewnętrznym. Do najważniejszych pasywnych i aktywnych funkcji skóry należą: ochrona organizmu przed czynnikami zewnętrznymi, udział w procesach immunologicznych, wydzielanie, wchłanianie, termoregulacja oraz czucie1,2,3. Ponieważ jest ona uznawana za jeden z największych narządów w organizmie, nie sposób uniknąć kontaktu z różnymi patogenami, alergenami, substancjami chemicznymi, a także promieniowaniem ultrafioletowym (UV). W związku z tym posiada strukturę złożoną z wielu typów komórek o specyficznych funkcjach. Głównymi typami komórek występującymi w naskórku są keratynocyty (niemal 90% wszystkich komórek, pełniące funkcje strukturalne i immunologiczne w głębszych częściach naskórka, które następnie podlegają procesowi keratynizacji, przekształcając się w korneocyty w warstwie zewnętrznej), melanocyty (stanowiące jedynie 3%-7% populacji komórek naskórka, które produkują melaninę – pigment chroniący przed UV) oraz komórki Langerhansa (pochodzące z układu odpornościowego). W przypadku skóry właściwej głównymi komórkami są fibroblasty (produkujące czynniki wzrostu i białka), komórki dendrytyczne oraz komórki tuczne (oba typy komórek należą do układu odpornościowego)4,5,6. Ponadto skóra jest wyposażona w szereg białek pozakomórkowych (takich jak kolagen typu I i IV, fibronektyna i laminina; Rycina 1) oraz włókna białkowe (kolagen i elastyna), które zapewniają specyficzną strukturę skóry, a także sprzyjają wiązaniu komórek, adhezji komórkowej i innym interakcjom7.
<img alt="Schemat struktury warstw skóry z typami komórek i białkami ECM; etykiety: naskórek, skórą właściwa, tkanka podskórna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65773/65773fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat przedstawiający strukturę skóry. Struktura skóry z zaznaczonymi czterema podstawowymi typami komórek występującymi w poszczególnych warstwach oraz wyróżnionymi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej. Rysunek został wykonany w programie MS PowerPoint. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65773/65773fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Bezpieczeństwo kosmetyków i produktów farmaceutycznych jest kwestią niezwykle istotną, a ochrona zdrowia konsumentów i pacjentów stanowi priorytet8. Do niedawna zakładano, że jest ono gwarantowane przez liczne testy, w tym badania prowadzone na zwierzętach. Niestety, często wymagały one stosowania drastycznych metod, powodując ból i cierpienie zwierząt wykorzystywanych do celów badawczych (najczęściej myszy, szczurów i świń). W 1959 roku wprowadzono Zasady Humanistycznej Techniki Eksperymentalnej (zasada 3R): (1 – Replacement/Zastąpienie) zastąpienie zwierząt w badaniach modelami in vitro, in silico lub ex vivo, (2 – Reduction/Ograniczenie) zmniejszenie liczby zwierząt wykorzystywanych w badaniach oraz (3 – Refinement/Udoskonalenie) poprawa dobrostanu zwierząt, które są nadal niezbędne w badaniach, a jednocześnie doskonalenie opracowanych metod alternatywnych9. Ponadto w Unii Europejskiej (UE) testowanie kosmetyków na zwierzętach jest regulowane prawnie. 11 września 2004 roku wszedł w życie zakaz wprowadzania do obrotu produktów kosmetycznych testowanych na zwierzętach. 11 marca 2009 roku UE zakazała testowania składników kosmetycznych na zwierzętach. Sprzedaż produktów kosmetycznych zawierających składniki nowo przetestowane na zwierzętach została zabroniona; dopuszczalne było jednak testowanie produktów na zwierzętach w przypadku złożonych problemów zdrowotnych człowieka, takich jak toksyczność przy wielokrotnym podaniu, toksyczność rozrodcza i toksykokinetyka. Od 11 marca 2013 roku w UE nielegalna jest sprzedaż kosmetyków, w których gotowy produkt lub jego składniki były testowane na zwierzętach10. W związku z tym obecnie w kosmetologii badania prowadzi się na trzech poziomach: in vitro (komórki), ex vivo (prawdziwe tkanki) oraz in vivo (ochotnicy)11. W przypadku produktów farmaceutycznych potrzeba testów na zwierzętach nadal istnieje, jednak jest ona znacznie ograniczona i ściśle kontrolowana12.
Jako alternatywne metody dla testów na zwierzętach oraz do wstępnej oceny skuteczności nowego składnika aktywnego stosuje się hodowle komórek skóry in vitro. Izolacja różnych typów komórek skóry i ich hodowla w sterylnych warunkach laboratoryjnych pozwala na ocenę bezpieczeństwa i toksyczności substancji aktywnych. Linie komórkowe skóry są również powszechnie uznanymi modelami badawczymi, ponieważ komórki są sprzedawane przez certyfikowane firmy, a wyniki mogą być porównywalne w różnych laboratoriach. Testy te są zazwyczaj przeprowadzane na prostych modelach 2D monokultur ludzkich komórek skóry. Do bardziej zaawansowanych modeli należą ich kokultury (takie jak keratynocyty z fibroblastami oraz keratynocyty z melanocytami), a także modele trójwymiarowe, w tym hodowle bez rusztowania (sferoidy) i ekwiwalenty skóry oparte na rusztowaniach dla naskórka, skóry właściwej, a nawet substytuty skóry o pełnej grubości13. Warto wspomnieć, że poza ostatnim typem (ekwiwalenty skóry), pozostałe nie są dostępne komercyjnie i w razie potrzeby naukowiec musi przygotować je samodzielnie.
Mimo że wiele z tych modeli jest utrzymywanych i rutynowo sprzedawanych obecnie (Tabela 1), do walidacji większości wyników stale potrzebne są dodatkowe modele. Zatem nowo opracowane modele powinny lepiej odwzorowywać rzeczywiste interakcje zachodzące w ludzkim organizmie. Dzięki zastosowaniu mieszaniny komórek różnych typów do tworzenia takich modeli można osiągnąć reprodukcję wielokomórkowego aspektu tkanki in vivo. W rezultacie powstaje kultura organotypowa (Rysunek 2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">Nazwa</td>
			<td colspan="4">Opis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="6">Zdrowa skóra</td>
			<td colspan="2">EpiSkin</td>
			<td colspan="4">Zrekonstruowany naskórek ludzki – keratynocyty na membranie kolagenowej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">SkinEthic RHE</td>
			<td colspan="4">Rekonstruowany ludzki naskórek – keratynocyty na membranie poliwęglanowej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">SkinEthic RHE-LC</td>
			<td colspan="4">Ludzki model naskórka z komórkami Langerhansa – keratynocyty i komórki Langerhansa na membranie poliwęglanowej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">SkinEthic RHPE</td>
			<td colspan="4">Rekonstruowany ludzki pigmentowany naskórek – keratynocyty i melanocyty na membranie poliwęglanowej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">T-Skin</td>
			<td colspan="4">Rekonstruowany model ludzkiej skóry pełnej grubości – keratynocyty na warstwie fibroblastów, które były hodowane na membranie poliwęglanowej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Model skóry Phenion FT</td>
			<td colspan="4">Keratynocyty i fibroblasty w hydrożelu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Skóra z chorobą</td>
			<td colspan="2">Model skóry FT z czerniakiem</td>
			<td colspan="4">Normalne keratynocyty i fibroblasty pochodzenia ludzkiego z ludzką linią komórkową czerniaka złośliwego A375</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Model tkankowy łuszczycy</td>
			<td colspan="4">Normalne ludzkie keratynocyty i fibroblasty</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Najpopularniejsze komercyjne ekwiwalenty skóry stosowane w różnych badaniach.
<img alt="Schemat złożoności hodowli komórkowych; od kokultury 2D/3D do oddziaływań w organizmie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65773/65773fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Złożoność różnych modeli in vitro. Zależność między złożonością różnych modeli in vitro odtwarzających organizm a rzeczywistymi oddziaływaniami zachodzącymi bezpośrednio w ludzkim organizmie. Rycina została zmodyfikowana na podstawie zestawu „Microbiology and cell culture” z Servier Medical Art opracowanego przez Servier (https://smart.servier.com/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65773/65773fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Jednym z najważniejszych ograniczeń odpowiedników komercyjnych jest dostępność jedynie bardzo ogólnych modeli badawczych z niewielką liczbą typów komórek (zazwyczaj 1-2, rzadziej 3). Tymczasem w skórze występuje znacznie więcej rodzajów komórek, a ich wzajemne oddziaływania mogą determinować lepszą lub gorszą tolerancję na różne składniki14. Brak niektórych komponentów odpornościowych może obniżyć wartość modelu w wielu rodzajach badań, w tym w immunoterapii. Jest to poważny problem, ponieważ czerniak jest zagrażającym życiu nowotworem skóry ze względu na wczesne pojawienie się przerzutów i częstą oporność na stosowane leczenie15. Aby udoskonalić sztuczny model skóry, badacze starają się wprowadzać ko-kulturę komórek odpornościowych z liniami komórkowymi i organoidami16, co uznaje się za istotne usprawnienie analizowanych modeli. Na przykład komórki tuczne biorą udział w wielu procesach fizjologicznych (gojenie ran, przebudowa tkanki) i patologicznych (stan zapalny, angiogeneza i progresja nowotworu) w skórze17. Zatem ich obecność w modelu może znacząco zmienić odpowiedź modelu na badany związek. Wreszcie, wciąż brakuje wielu informacji dotyczących skóry, które można pozyskać jedynie poprzez prowadzenie badań podstawowych. Dlatego tworzenie i udoskonalanie różnych sztucznych modeli skóry (Tabela 2) jest tak istotnym przedsięwzięciem. Niniejszy artykuł przedstawia kilka procedur tworzenia zaawansowanych modeli skóry, w tym sfer i odpowiedników skóry.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>In vitro model skóry</td>
			<td>Próba odtworzenia oddziaływań zachodzących w tkance</td>
			<td>Przykłady użytych komórek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="12">hodowla komórkowa 2D lub 3D</td>
			<td rowspan="3">Naskórek</td>
			<td>Keratynocyty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melanocyty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratynocyty + melanocyty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Kora skóry</td>
			<td>Fibroblasty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastocyty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblasty + komórki tuczne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="6">Skóra</td>
			<td>Keratynocyty + fibroblasty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratynocyty + komórki tuczne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melanocyty + fibroblasty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melanocyty + komórki tuczne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratynocyty + fibroblasty + melanocyty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratynocyty + fibroblasty + komórki tuczne</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Przykłady mieszanin typów komórek do odtworzenia tkanki skóry w hodowli 2D i 3D.

<table><tbody><tr><td>24-dołkowa płytka do adherentnej hodowli komórkowej</td><td>Biologix Europe GmbH</td><td>07-6024-35</td><td></td></tr><tr><td>%&ndash; 38% HCL</td><td>Chempur</td><td></td> <td>115752837-60</td></tr> <tr><td>mm kultura komórkowa szalka Petriego&nbsp;</td><td>Gniazdo</td><td></td> <td>705001-Awidin</td></tr> <tr><td>&minus; Sulforodamina 101</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2348-5MG-Mikroskop</td><td></td></tr> <tr><td>odwrócony jasnego pola</td><td>Olympus</td><td>CKX41-Chlorek</td><td></td></tr> <tr><td>wapnia</td><td>Avantor</td><td></td> <td>874870116-Kolba</td></tr> <tr><td>do hodowli komórkowych T75 do komórek przylegających</td><td></td><td></td> Probówka wirówkowa <td>Genoplast</td> G77080033</tr> <tr><td>15 ml</td> Inkubator <td></td><td>G66010522-CO2</td> <td>GoogLab Scientific</td></tr><tr><td></td><td>Przeciwciało Heal Force</td><td>Galaxy 170R-Col1A2</td><td></td></tr> <tr><td>wytwarzane w króliku</td><td>Novus</td><td>NBP2-92790-Corning</td><td></td></tr><tr><td>(R) Transwell(R) Poliwęglan</td><td>Corning</td><td>CLS3422-48EA-Przeciwciało</td><td></td></tr> <tr><td>cytokeratyny 14 wytwarzane u myszy</td><td>Novus</td><td>NBP1-79069-DPX</td><td></td></tr> <tr><td>Mountant do histologii</td><td>Sigma Aldrich</td><td>06522-100ML</td><td>-</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy DulbeccoVWR</td> <td>Chemicals</td><td>L0102-500-Eozyna</td><td></td></tr> <tr><td>Y</td><td>Kolchem-0,5</td><td></td> <td>% roztwór wodny</td></tr><tr><td>Probówka Eppendorfa 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001-Probówka</td><td></td></tr> <tr><td>Eppendorfa 2 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.691-Alkohol</td><td></td></tr> <tr><td>etylowy absolut 99,8%</td><td>Avantor</td><td>396480111</td><td>rozcieńczony w ultraczystej wodzie do potrzebnej ilości stężenia&nbsp;</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td></td> <td>10270106-fluorescencyjny</td></tr> <tr><td>mikroskop odwrócony&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>IX71-Goat</td><td></td></tr> <tr><td>drugorzędowe przeciwciało przeciw myszom sprzężone z FITC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0257-1mL</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikowi sprzężone z FITC</td><td>Novus</td><td>NB7159-Harris</td><td></td></tr> <tr><td>Hematoksylina</td><td>Kolchem-1</td><td></td> <td>mg/ml w 95% etanolu</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570-Laminar</td><td></td></tr><tr><td> komora</td><td>Heal Force</td><td>HFSafe-1200-Melan-A</td><td></td></tr> <tr><td>przeciwciało wytwarzane u myszy</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20032-Microtome</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Microm</td><td>HM355S-NaOH</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Avantor</td><td></td> <td>810981997-Pastylki</td></tr> <tr><td>parafinowe</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.07164-Paraformaldehyd</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td></td> <td>1581227-roztwór</td></tr> <tr><td>penicyliny/streptomycyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333-Końcówka</td><td></td></tr> <tr><td>do pipet, 1000 &mikro; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.305-Końcówka</td><td></td></tr> <tr><td>do pipet, 20 &mikro; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.3021-Końcówka</td><td></td></tr> <tr><td>do pipety, 200 &mikro; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.303-Pluronic</td><td></td></tr> <tr><td>F-127</td><td>BASF</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>50401036-Pipeta serologiczna 10 ml</td><td>GoogLab Scientific</td><td>Pipeta</td><td></td></tr> <tr><td>G33270011-serologiczna 25 ml</td><td>GoogLab Scientific</td><td>Pipeta</td> <td>G33280011-serologiczna</td></tr> <tr><td>5 ml</td><td>GoogLab Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>G33260011-Sodu Wodorowęglan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-Wodorowęglan</td><td></td></tr> <tr><td>sodu</td><td>Chempur</td><td>118105307</td><td></td></tr><tr><td>0,25% roztwór trypsyny-EDTA, czerwień fenolowa</td><td>Kolagen Sigma Aldrich</td><td></td> <td>25200072-Type</td></tr> <tr><td>1</td><td>IBIDI</td><td>50201-U-bottom</td><td></td></tr> <tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Sarstedt</td><td>83.3925500-Xylene</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>534056</td><td>-</td></tr></tbody></table>

tworzenie modeli skóry do wielu zastosowań - od dwuwymiarowej (2d) monokultury do trójwymiarowej (3d) wielokulturowości

Building Up Skin Models for Numerous Applications - from Two-Dimensional (2D) Monoculture to Three-Dimensional (3D) Multiculture

Ze względu na złożoną strukturę i ważne funkcje skóry, jest to interesujący model badawczy dla przemysłu kosmetycznego, farmaceutycznego i medycznego. W Unii Europejskiej obowiązuje całkowity zakaz testowania produktów kosmetycznych i ich składników na zwierzętach. W przypadku medycyny i farmaceutyków ta możliwość również jest stale ograniczana. Zgodnie z zasadą 3R coraz powszechniejsze staje się testowanie pojedynczych związków, jak i całych formulacji na sztucznie stworzonych modelach. Najtańsze i najczęściej stosowane są modele 2D, które składają się z monowarstwy komórki, ale nie odzwierciedlają rzeczywistych interakcji między komórkami w tkance. Chociaż dostępne na rynku modele 3D zapewniają lepsze odwzorowanie tkanki, nie są one wykorzystywane na dużą skalę. Dzieje się tak dlatego, że są one drogie, czas oczekiwania jest dość długi, a dostępne modele często ograniczają się tylko do tych typowo używanych. 
Aby przenieść prowadzone badania na wyższy poziom, zoptymalizowaliśmy procedury różnych preparatów 3D modeli skóry. Opisane procedury są tanie i proste w przygotowaniu, ponieważ mogą być stosowane w wielu laboratoriach oraz przez badaczy o różnym doświadczeniu w hodowlach komórkowych.

Tutaj prezentujemy niedrogie i proste procedury wprowadzania różnych modeli 3D skóry do rutynowych badań w laboratorium hodowli komórkowych. Badacze mogą tworzyć modele dostosowane do ich potrzeb bez konieczności polegania na modelach dostępnych na rynku.

Tworzenie modeli skóry do wielu zastosowań - od dwuwymiarowej (2D) monokultury do trójwymiarowej (3D) wielokulturowości

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical ...

Naszym wyzwaniem jest przetestowanie składników, cytotoksyczności przed zastosowaniem kosmetycznym lub medycznym. Komercyjne modele 3D skóry ograniczone do około wolnych typów komórek nie odzwierciedlają rzeczywistej złożoności skóry, a skóra ma różne typy komórek o podstawowych funkcjach, co stanowi wyzwanie w dokładnej ocenie wpływu składników. Nasze odkrycia wskazują, że metoda ograniczająca adhezję komórek wytwarza więcej dobrze ukształtowanych kulek w porównaniu z powszechnie stosowanymi metodami.Dodatkowo wymaga mniej manipulacji, zapewniając większą stabilność sfery. W naszym odpowiedniku skóry używamy do czterech rodzajów komórek skóry, w przeciwieństwie do modeli komercyjnych, które zazwyczaj zawierają maksymalnie trzy typy komórek. Typowe modele komórek 2D nie są dokładne w odwzorowywaniu rzeczywistej interakcji, podczas gdy komercyjna równoważność skóry 3D zapewnia lepszą reprezentację tkanek, co ogranicza ich powszechne zastosowanie.W związku z tym nasze własne modele pozwalają na wstępne, opłacalne eksperymenty na bardziej realistycznej platformie. Nasze protokoły przedstawiają niedrogie, proste sposoby tworzenia niestandardowych modeli 3D skóry, obejmujących sfery i równoważność. W przeciwieństwie do opcji komercyjnych, nasze modele oferują regulowany wygląd i kompozycję dostosowaną do wymagań badań, metody dostępne, nie wymagające specjalistycznych umiejętności czy sprzętu, dzięki czemu są możliwe do odtworzenia nawet przez początkujących badaczy.Naszym celem jest podkreślenie prostoty tworzenia różnych modeli komórkowych 3D. Podkreślając wartość certyfikowanych modeli komercyjnych w badaniach, podkreślamy znaczenie stosowania realistycznych modeli, takich jak sfery i równoważność, pokazując, w jaki sposób samodzielnie wykonane modele mogą pomóc we wstępnym wyborze warunków testowych przed zastosowaniem certyfikowanych modeli. Na początek należy usunąć odpowiednią pożywkę z kolb hodowlanych zawierających keratynocyty, fibroblasty i melanocyty.Delikatnie umyj komórki pięcioma do 10 mililitrami PBS. Teraz dodaj 0,5 do dwóch mililitrów roztworu trypsyny-EDTA do kolby, w zależności od jej wielkości. Inkubować kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Użyj mikroskopu, aby kontrolować odklejanie się komórek od powierzchni. Zawieś oderwane komórki w podwójnej objętości neutralizatora trypsyny, aby dezaktywować trypsynę, a następnie przenieś zawiesinę do 15-mililitrowej tubki. Teraz odpipetuj około 20 mikrolitrów zawiesiny komórek skóry do probówki o pojemności 1,5 mililitra.Za pomocą hemocytometru policz komórki. Następnie odwirować probówkę o sile 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie odpipetować większość supernatantu i ponownie zawiesić podniebienie komórkowe w niewielkiej ilości pozostałego płynu.Dodać równą objętość świeżej pożywki do zawieszonych komórek. W osobnej 15-mililitrowej probówce przygotuj zawiesinę komórek. Pierwotne komórki keratynocytów, melanocytów, fibroblastów i komórek tucznych prezentowały swoją typową morfologię, gdy były hodowane w odpowiednich pożywkach.Aby rozpocząć metodę wiszącej kropli, odpipetuj 20 mikrolitrów wcześniej przygotowanej zawiesiny komórek skóry na pokrywkę szalki Petriego. Teraz przykryj pokrywkę dolną połową szalki Petriego i delikatnie ją odwróć, aby utworzyć wiszące krople. Dodaj sterylną wodę do szalki Petriego, aby zapobiec parowaniu pełnego wyhodowanego podłoża z kropelek kropli.Inkubować kropelki przez 48 do 72 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie napełnij dołki nowej płytki pełnym podłożem wzrostowym. Za pomocą sterylnie wyciętych końcówek pipet przenieś kulki komórkowe do dołków płytki wielodołkowej.Inkubować przeniesione kulki przez jeden dzień na płytce wielodołkowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed eksperymentami. W przypadku metody ograniczającej adhezję komórek, najpierw dodaj 100 mikrolitrów 1% roztworu środka powierzchniowo czynnego w PBS do każdej studzienki płytki U-Bottom. Następnie inkubuj płytkę z roztworem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.Teraz przygotuj zawiesinę komórek i żądaną gęstość komórek. Odpipetować środek powierzchniowo czynny do roztworu ze studzienek, a następnie wysiać 50 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki. Na koniec inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny, aby osiągnąć agregaty komórkowe.Kule składające się z 10 000 komórek były łatwiejsze do manipulowania, ponieważ były widoczne w studniach. Większe kule wykazywały zmniejszoną stabilność. Różne typy komórek tworzyły kule o różnych kolorach.Idealnie zaokrąglone kule były podatne na utratę kształtu podczas przenoszenia w metodzie wiszącej kropli. Wymagana była dokładna obsługa, aby zmniejszyć deformację skutkującą nienaruszonymi agregatami komórkowymi. Niecelność i brak doświadczenia skutkowały uszkodzeniem kuli.Na początek wymieszaj wodę, 10-krotnie stężony PBS i jeden molowy wodorotlenek sodu w probówce. Następnie odpipetować 500 mikrolitrów odpowiednio gęstych roztworów komórek skórnych do dwumililitrowej probówki. Odwirować roztwór o sile 300 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.Po zakończeniu wirowania odpipetować supranatant i delikatnie zawiesić komórki w mieszaninie wody, PBS i wodorotlenku sodu. Teraz dodaj 200 mikrolitrów roztworu kolagenu do mieszanki. Odpipetować zawiesinę, aby dobrze ją wymieszać.Następnie odpipetować 500 mikrolitrów przygotowanej mieszaniny do wkładki w 24-dołkowej płytce. W przypadku modelu bez warstwy rogowej naskórka należy odpipetować 500 mikrolitrów mieszaniny do studzienki bez wkładki. Po inkubacji płytki przez 10 minut w temperaturze pokojowej przenieś ją do inkubatora na 30 minut.Odpipetować 500 mikrolitrów buforu PBS do każdej studzienki, aby spłukać powierzchnię hydrożelu. Następnie wymieszać 200 mikrolitrów zawiesiny keratynocytów z równą objętością zawiesiny melanocytów w uzupełnionym pożywce DMEM. Delikatnie odpipetować 500 mikrolitrów całkowitej zawiesiny komórek do każdej studzienki.Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa do pięciu dni. Wymieniaj pożywkę co 48 godzin i używaj mikroskopu optycznego do monitorowania wzrostu komórek. Stworzono równoważny model 3D z rozróżnialną skórą właściwą i naskórkiem, który mógł być monitorowany w czasie rzeczywistym.Zaobserwowano keratynocyty w różnych stadiach wzrostu komórek, które są wskaźnikami żywego odpowiednika. Zaobserwowano również komórki tuczne z rozpoznawalnymi ziarnistościami.

building-up-skin-models-for-numerous-applications-from-two

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym raporcie opisujemy trójwymiarowy model rekonstrukcji skóry, który naśladuje architekturę i skład ludzkiej skóry. Wykorzystując model rekonstrukcji skóry, badano fizjologię melanocytów, progresję czerniaka oraz losy dermalnych komórek macierzystych. Model ten jest również przydatny jako narzędzie przedkliniczne do oceny leków.

Trójwymiarowy model rekonstrukcji ludzkiej skóry: narzędzie do badania normalnej skóry i progresji czerniaka

Ten film opisuje szczegółowy protokół generowania organotypowych rekonstrukcji skóry in vitro 3D w celu zbadania progresji czerniaka. Ten model skóry naśladuje zarówno architekturę, jak i złożoność wielokomórkową narządów in vivo.

Generowanie organotypowych rekonstrukcji całej skóry: procedura tworzenia modelu 3D skóry na podstawie próbek ludzkiej skóry

Przedstawiamy protokół uzyskiwania matryc pochodzących z komórek bogatych w białka macierzy zewnątrzkomórkowej, przy użyciu makromolekularnych crowderów (MMC). Ponadto przedstawiamy protokół, który włącza MMC do generowania 3D organotypowych kokultur skóry, co skraca czas hodowli przy zachowaniu dojrzałości konstruktu.

Ulepszanie modeli 2D i 3D skóry in vitro za pomocą stłoczenia makromolekularnego

Ten protokół opisuje prostą metodę hodowli trójwymiarowego, zrekonstruowanego ludzkiego naskórka w powtarzalny i solidny sposób. Dodatkowo scharakteryzowano zależność struktura-funkcja modelu bariery naskórkowej. Przedstawiono również reakcje biologiczne zrekonstruowanego naskórka ludzkiego na bodźce prozapalne.

Hodowla trójwymiarowego zrekonstruowanego ludzkiego naskórka na dużą skalę

Tutaj prezentujemy protokół do generowania trójwymiarowego, uproszczonego i niezróżnicowanego modelu skóry za pomocą mikroobrabianej platformy mikroprzepływowej. Podejście oparte na przepływie równoległym pozwala na osadzanie na miejscu komory skórnej w celu wysiewu komórek nabłonka na wierzchu, a wszystko to kontrolowane przez pompy strzykawkowe.

Generowanie uproszczonego trójwymiarowego modelu typu skin-on-a-chip w mikroobrabianej platformie mikroprzepływowej

Opisano płaski oraz trójwymiarowy druk z użyciem przewodzących tuszy metalicznych. Nasze podejście otwiera nowe możliwości wytwarzania drukowanych urządzeń elektronicznych, optoelektronicznych i biomedycznych o nietypowych układach w skali mikro.

Planarny i trójwymiarowy druk atramentów przewodzących

Celem tego protokołu jest stworzenie trójwymiarowego odpowiednika skóry o pełnej grubości, który przypomina naturalną skórę. Dzięki specjalnie skonstruowanemu zautomatyzowanemu urządzeniu do nawijania można generować precyzyjne i powtarzalne rany przy zachowaniu bezpłodności.

Generowanie trójwymiarowego ekwiwalentu skóry o pełnej grubości i automatycznego nawijania

Ten protokół opisuje, jak przygotować mieszaną matrycę 2D, składającą się z żelatyny i kolagenu I, oraz wtyczkę 3D kolagenu I do badania liniowych inwadosomów. Protokoły te pozwalają na badanie liniowego tworzenia inwadosomu, aktywności degradacji macierzy oraz zdolności inwazji komórek pierwotnych i linii komórek rakowych.

Macierze 2D i 3D do badania liniowego powstawania i aktywności inwadosomów

Ten protokół służy jako kompleksowa wytyczna do wytwarzania rusztowań za pomocą elektroprzędzenia z polimerami stopionymi w trybie bezpośredniego zapisu. Systematycznie nakreślamy proces i definiujemy odpowiednie ustawienia parametrów w celu osiągnięcia docelowych architektur rusztowań.

Zapis elektroprzędzenia ze stopu trójwymiarowych rusztowań poli(ε-kaprolaktonu) z kontrolowanymi morfologiami do zastosowań w inżynierii tkankowej

Analogi chrząstki i skóry zostały wydrukowane biodrukiem za pomocą biotuszu na bazie nanocelulozy i alginianu. Biotusze zostały poddane celaryzacji przed drukowaniem za pomocą jednostopniowej pasywnej jednostki mieszającej. Wykazano, że konstrukty są jednolicie ukomórkowane, mają wysoką żywotność i wykazują korzystne markery różnicowania.

Bioprinting analogów chrząstki i tkanki skórnej z wykorzystaniem nowatorskiej techniki pasywnego mieszania do precelularyzacji biotuszu

Poznaj metody tworzenia trójwymiarowych modeli skóry z wykorzystaniem keratynocytów, fibroblastów i melanocytów. Proste protokoły umożliwiają badania cytotoksyczności składników na realistycznej platformie.

Tworzenie modeli skóry do wielu zastosowań - od dwuwymiarowej (2D) monokultury do trójwymiarowej (3D) wielokulturowości

Przeglądaj więcej filmów