Tworzenie modeli skóry do wielu zastosowań - od dwuwymiarowej (2D) monokultury do trójwymiarowej (3D) wielokulturowości
20 października 2023
Tutaj prezentujemy niedrogie i proste procedury wprowadzania różnych modeli 3D skóry do rutynowych badań w laboratorium hodowli komórkowych. Badacze mogą tworzyć modele dostosowane do ich potrzeb bez konieczności polegania na modelach dostępnych na rynku.
Naszym wyzwaniem jest przetestowanie składników, cytotoksyczności przed zastosowaniem kosmetycznym lub medycznym. Komercyjne modele 3D skóry ograniczone do około wolnych typów komórek nie odzwierciedlają rzeczywistej złożoności skóry, a skóra ma różne typy komórek o podstawowych funkcjach, co stanowi wyzwanie w dokładnej ocenie wpływu składników. Nasze odkrycia wskazują, że metoda ograniczająca adhezję komórek wytwarza więcej dobrze ukształtowanych kulek w porównaniu z powszechnie stosowanymi metodami.
Dodatkowo wymaga mniej manipulacji, zapewniając większą stabilność sfery. W naszym odpowiedniku skóry używamy do czterech rodzajów komórek skóry, w przeciwieństwie do modeli komercyjnych, które zazwyczaj zawierają maksymalnie trzy typy komórek. Typowe modele komórek 2D nie są dokładne w odwzorowywaniu rzeczywistej interakcji, podczas gdy komercyjna równoważność skóry 3D zapewnia lepszą reprezentację tkanek, co ogranicza ich powszechne zastosowanie.
W związku z tym nasze własne modele pozwalają na wstępne, opłacalne eksperymenty na bardziej realistycznej platformie. Nasze protokoły przedstawiają niedrogie, proste sposoby tworzenia niestandardowych modeli 3D skóry, obejmujących sfery i równoważność. W przeciwieństwie do opcji komercyjnych, nasze modele oferują regulowany wygląd i kompozycję dostosowaną do wymagań badań, metody dostępne, nie wymagające specjalistycznych umiejętności czy sprzętu, dzięki czemu są możliwe do odtworzenia nawet przez początkujących badaczy.
Naszym celem jest podkreślenie prostoty tworzenia różnych modeli komórkowych 3D. Podkreślając wartość certyfikowanych modeli komercyjnych w badaniach, podkreślamy znaczenie stosowania realistycznych modeli, takich jak sfery i równoważność, pokazując, w jaki sposób samodzielnie wykonane modele mogą pomóc we wstępnym wyborze warunków testowych przed zastosowaniem certyfikowanych modeli. Na początek należy usunąć odpowiednią pożywkę z kolb hodowlanych zawierających keratynocyty, fibroblasty i melanocyty.
Delikatnie umyj komórki pięcioma do 10 mililitrami PBS. Teraz dodaj 0,5 do dwóch mililitrów roztworu trypsyny-EDTA do kolby, w zależności od jej wielkości. Inkubować kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Użyj mikroskopu, aby kontrolować odklejanie się komórek od powierzchni. Zawieś oderwane komórki w podwójnej objętości neutralizatora trypsyny, aby dezaktywować trypsynę, a następnie przenieś zawiesinę do 15-mililitrowej tubki. Teraz odpipetuj około 20 mikrolitrów zawiesiny komórek skóry do probówki o pojemności 1,5 mililitra.
Za pomocą hemocytometru policz komórki. Następnie odwirować probówkę o sile 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie odpipetować większość supernatantu i ponownie zawiesić podniebienie komórkowe w niewielkiej ilości pozostałego płynu.
Dodać równą objętość świeżej pożywki do zawieszonych komórek. W osobnej 15-mililitrowej probówce przygotuj zawiesinę komórek. Pierwotne komórki keratynocytów, melanocytów, fibroblastów i komórek tucznych prezentowały swoją typową morfologię, gdy były hodowane w odpowiednich pożywkach.
Aby rozpocząć metodę wiszącej kropli, odpipetuj 20 mikrolitrów wcześniej przygotowanej zawiesiny komórek skóry na pokrywkę szalki Petriego. Teraz przykryj pokrywkę dolną połową szalki Petriego i delikatnie ją odwróć, aby utworzyć wiszące krople. Dodaj sterylną wodę do szalki Petriego, aby zapobiec parowaniu pełnego wyhodowanego podłoża z kropelek kropli.
Inkubować kropelki przez 48 do 72 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie napełnij dołki nowej płytki pełnym podłożem wzrostowym. Za pomocą sterylnie wyciętych końcówek pipet przenieś kulki komórkowe do dołków płytki wielodołkowej.
Inkubować przeniesione kulki przez jeden dzień na płytce wielodołkowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed eksperymentami. W przypadku metody ograniczającej adhezję komórek, najpierw dodaj 100 mikrolitrów 1% roztworu środka powierzchniowo czynnego w PBS do każdej studzienki płytki U-Bottom. Następnie inkubuj płytkę z roztworem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.
Teraz przygotuj zawiesinę komórek i żądaną gęstość komórek. Odpipetować środek powierzchniowo czynny do roztworu ze studzienek, a następnie wysiać 50 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki. Na koniec inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny, aby osiągnąć agregaty komórkowe.
Kule składające się z 10 000 komórek były łatwiejsze do manipulowania, ponieważ były widoczne w studniach. Większe kule wykazywały zmniejszoną stabilność. Różne typy komórek tworzyły kule o różnych kolorach.
Idealnie zaokrąglone kule były podatne na utratę kształtu podczas przenoszenia w metodzie wiszącej kropli. Wymagana była dokładna obsługa, aby zmniejszyć deformację skutkującą nienaruszonymi agregatami komórkowymi. Niecelność i brak doświadczenia skutkowały uszkodzeniem kuli.
Na początek wymieszaj wodę, 10-krotnie stężony PBS i jeden molowy wodorotlenek sodu w probówce. Następnie odpipetować 500 mikrolitrów odpowiednio gęstych roztworów komórek skórnych do dwumililitrowej probówki. Odwirować roztwór o sile 300 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.
Po zakończeniu wirowania odpipetować supranatant i delikatnie zawiesić komórki w mieszaninie wody, PBS i wodorotlenku sodu. Teraz dodaj 200 mikrolitrów roztworu kolagenu do mieszanki. Odpipetować zawiesinę, aby dobrze ją wymieszać.
Następnie odpipetować 500 mikrolitrów przygotowanej mieszaniny do wkładki w 24-dołkowej płytce. W przypadku modelu bez warstwy rogowej naskórka należy odpipetować 500 mikrolitrów mieszaniny do studzienki bez wkładki. Po inkubacji płytki przez 10 minut w temperaturze pokojowej przenieś ją do inkubatora na 30 minut.
Odpipetować 500 mikrolitrów buforu PBS do każdej studzienki, aby spłukać powierzchnię hydrożelu. Następnie wymieszać 200 mikrolitrów zawiesiny keratynocytów z równą objętością zawiesiny melanocytów w uzupełnionym pożywce DMEM. Delikatnie odpipetować 500 mikrolitrów całkowitej zawiesiny komórek do każdej studzienki.
Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa do pięciu dni. Wymieniaj pożywkę co 48 godzin i używaj mikroskopu optycznego do monitorowania wzrostu komórek. Stworzono równoważny model 3D z rozróżnialną skórą właściwą i naskórkiem, który mógł być monitorowany w czasie rzeczywistym.
Zaobserwowano keratynocyty w różnych stadiach wzrostu komórek, które są wskaźnikami żywego odpowiednika. Zaobserwowano również komórki tuczne z rozpoznawalnymi ziarnistościami.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia proste i kosztowo efektywne procedury tworzenia spersonalizowanych 3D modeli skóry w laboratoriach hodowli komórkowych. Modele te mogą być dostosowane do konkretnych potrzeb badawczych, zapewniając bardziej realistyczną platformę do testowania składników oraz cytotoksyczności.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Hodowla komórkowa
- Modele skóry 3D
- Badanie cytotoksyczności
Wstęp
- Komercyjne 3D modele skóry charakteryzują się ograniczoną różnorodnością typów komórek.
- Rzeczywista złożoność skóry obejmuje różne typy komórek o kluczowych funkcjach.
- 2D modele komórkowe nie oddają precyzyjnie rzeczywistych oddziaływań.
- Koszty ograniczają powszechne zastosowanie komercyjnych modeli 3D.
Cel badania
- Opracowanie przystępnych cenowo i prostych metod tworzenia trójwymiarowych (3D) modeli skóry.
- Umożliwienie badaczom przeprowadzania wstępnych eksperymentów na realistycznych platformach.
- Podkreślenie znaczenia stosowania realistycznych modeli do testowania składników.
Zastosowane metody
- Przygotowanie zawiesin komórek skóry z keratynocytów, fibroblastów i melanocytów.
- Metoda wiszącej kropli w celu tworzenia sfer komórkowych.
- Metoda ograniczania adhezji komórek w celu tworzenia stabilnych agregatów.
- Monitorowanie wzrostu i morfologii komórek za pomocą mikroskopii optycznej.
Główne wyniki
- Własne modele mogą obejmować do czterech typów komórek.
- Metody ograniczania adhezji komórek pozwalają na uzyskanie bardziej stabilnych i dobrze uformowanych sfer.
- Zindywidualizowane modele umożliwiają lepsze odwzorowanie złożoności skóry.
- Modele są replikowalne nawet przez początkujących badaczy.
Wnioski
- Własne trójwymiarowe modele skóry stanowią kosztowo efektywną alternatywę dla opcji komercyjnych.
- Realistyczne modele są kluczowe dla dokładnego testowania składników.
- Proste protokoły sprawiają, że modele te są dostępne dla rutynowych badań.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Przejście od dwuwymiarowych monokultur do konfigurowalnych trójwymiarowych modeli skóry wielokulturowych zaspokaja zapotrzebowanie na fizjologicznie istotne i efektywne kosztowo platformy do testowania składników oraz cytotoksyczności. Modele te umożliwiają bardziej predykcyjny screening na wczesnym etapie i ograniczanie ryzyka, zwłaszcza w obliczu ograniczeń regulacyjnych i etycznych ograniczających testy na zwierzętach. Ich dostępność i adaptacyjność wspierają szersze wdrożenie w procesach odkrywania leków i badaniach przedklinicznych, co usprawnia podejmowanie decyzji dotyczących portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępna faza odkryć i walidacja celu
- Umożliwia badanie efektów związków w istotnym dla tkanki kontekście wielokomórkowym.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez modelowanie rzeczywistej złożoności skóry z wykorzystaniem do czterech typów komórek.
- Zwiększa pewność predykcyjną przy wczesnym wyborze składników lub kandydatów na leki.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane, powtarzalne systemy 3D do ilościowego badania cytotoksyczności oraz testowania składników.
- Poprawia standaryzację i skalowalność analiz w porównaniu z modelami komercyjnymi lub 2D.
- Umożliwia wiarygodny przesiew wstępny przed przejściem do modeli certyfikowanych lub zgodnych z wymogami regulacyjnymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia zgodność testów in vitro z architekturą skóry istotną dla danej choroby, co sprzyja ciągłości translacyjnej.
- Wspiera postępy w badaniach z uwzględnieniem analizy ryzyka dzięki umożliwieniu dokładniejszych przewidywań przedklinicznych.
- Zmniejsza zależność od modeli zwierzęcych, zgodnie z zasadami 3R i trendami regulacyjnymi.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Te konfigurowalne trójwymiarowe modele skóry znajdują zastosowanie od wczesnych etapów odkryć po ewaluację przedkliniczną, wypełniając lukę między prostymi testami komórkowymi a złożonymi badaniami in vivo.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych w środowisku wielokomórkowym.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki w celu oceny składników i cytotoksyczności.
- Analityka: Umożliwia analizę porównawczą żywotności komórek, morfologii i integralności tkanki w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Stanowi platformę do korelacji wyników in vitro z istotnością in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalny, adaptacyjny system do wielokrotnego użytku w wielu projektach i zespołach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach dotyczących skóry.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy i umożliwia powtarzalność bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową dzięki umożliwieniu wczesnego, realistycznego przesiewu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów o większej relewantności biologicznej.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga podstawowej wiedzy z zakresu hodowli komórkowych, jest dostępna zarówno dla początkujących, jak i doświadczonych badaczy.
- Wymaga standardowego wyposażenia laboratoryjnego; nie jest potrzebna specjalistyczna aparatura.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Możliwość adaptacji do różnych typów komórek i wymagań eksperymentalnych.
- Ograniczenia obejmują zmienność wynikającą z ręcznej obsługi oraz ryzyko deformacji sfer podczas przenoszenia.
