Name: Izolacja, identyfikacja behawioralna i ocena chorobotwórczości grzybów entomopatogenicznych z omacnicy leśnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Poznaj metodę izolacji i identyfikacji grzybów entomopatogenicznych z omacnicy leśnej Monochamus alternatus. Protokół obejmuje hodowlę, PCR, sekwencjonowanie i ocenę aktywności chorobotwórczej w modelu chrząszczy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te były wspierane przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2021YFC2600100) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Zhejiang (LY21C040001).

1. Izolacja grzybów z M. alternatus (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
<ol>
	<li>Zbierz próbkę chrząszcza
	<ol>
		<li>Zbierz chrząszcze sosnowe M. alternatus przy użyciu pułapek handlowych (patrz tabela materiałów) zanęconych atraktantami przed przewidywanymi okresami pojawienia się populacji chrząszczy w naturalnie zakażonych lasach sosnowych. 
		UWAGA: W tym badaniu chrząszcze zebrano z pięciu regionów geograficznych południowych Chin (Huzhou/Zhejiang, Liangshan/Sichuan, Xiamen/Fujian, Shaoguan/Guangdong, Yulin/Guangxi). Ustawienie pułapki od góry do dołu jest następujące: okrągły blat (50 cm średnicy), panel w kształcie krzyża (35 cm szerokości i 66 cm długości), lejek (35,5 cm średnicy górnej i 5,5 cm średnicy dolnej okrągłej), kubek zbiorczy (10,5 cm średnicy i 26,5 cm długości). Jako przynętę stosuje się substancje lotne żywiciela (np. etanol i α-pinen) oraz feromon agregacyjny (2-undecyloksy-1-etanol) jako przynętę30.</li>
		<li>Oznacz próbkę przed przekazaniem jej do laboratorium. Umieść każdego chrząszcza w osobnych wysterylizowanych rurkach ze świeżymi gałązkami. Wymieniaj gałązki na świeże co 2 dni.</li>
		<li>Żywe chrząszcze należy hodować w temperaturze 25 ± 1 °C w nienawilżanym inkubatorze (16-8 cykli L/D) i obserwować je codziennie.</li>
		<li>Rejestruj próbki wykazujące zmniejszone karmienie i mobilność. Przenieś martwego M. alternatus, które stają się stwardniałe i sztywne do mokrych komór, aby obserwować wzrost grzybni grzybni i konidii. 
		UWAGA: Po zakażeniu przez grzyby entomopatogeniczne chrząszcze wykazywały spadek żerowania i mobilności w początkowej fazie infekcji31,32. Po śmierci ich ciała stawały się stwardniałe i sztywne, a grzybnia i konidia pojawiały się kilka dni po przechowywaniu w wilgotnej komorze33.</li>
		<li>Zwłoki chrząszczy z infekcjami grzybiczymi należy przechowywać w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, należy przetworzyć próbki natychmiast w ciągu kilku godzin, aby uniknąć zanieczyszczenia większą ilością grzybów saprotroficznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie podłoża wzrostowego
	<ol>
		<li>Dodać 39 g sproszkowanego agaru z dekstrozą ziemniaczaną (PDA) do 1 l czystej wody i sterylizować w autoklawie przez 30 minut w temperaturze 121 °C.</li>
		<li>Schłodzić do temperatury operacyjnej (~50 °C), dodać 0,05 g streptomycyny, 0,05 g penicyliny G i 0,05 g tetracykliny i wstrząsnąć w celu rozprowadzenia pożywki.</li>
		<li>Umieść podłoże na szalkach Petriego pod czystą ławą i użyj po zestaleniu. 
		UWAGA: Pożywka PDA z antybiotykami służy do izolacji od chrząszczy, co zapobiega rozwojowi bakterii bez wpływu na wzrost grzybów podczas izolacji. Jednak pożywka PDA bez antybiotyków jest używana do codziennej uprawy i konserwacji.</li>
		<li>Umieścić 35 g bulionu z dekstrozy ziemniaczanej (PDB) w proszku w 1 l ddH2O i sterylizować w autoklawie przez 30 minut w temperaturze 121 °C. Schłodzić do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekcja próbki chrząszcza z objawami infekcji grzybiczej
	<ol>
		<li>Przygotuj wysterylizowane nożyczki, skalpele i szpilki do owadów, a następnie pracuj pod czystą ławką z palnikiem alkoholowym. 
		UWAGA: Użycie narzędzi preparacyjnych można dostosować do osobistych preferencji. Szpilki do owadów są ostrzejsze niż standardowe igły preparacyjne, a różne specyfikacje mogą zaspokoić potrzebę sekcji.</li>
		<li>Rozciąć powłoki ciała chrząszcza za pomocą narzędzi na sterylnych i jednorazowych szalkach Petriego. Uważaj, aby uniknąć możliwego uszkodzenia tkanek jelita środkowego i tylnego, które mogą wydzielać zawartość wewnętrzną.</li>
		<li>Podziel ciała chrząszcza na główne pozycje w następujący sposób: czułki, głowa, klatka piersiowa, brzuch, skrzydła (każda para) i nogi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie z grzybów
	<ol>
		<li>Pokrój powłoki każdej pozycji na małe kawałki nożyczkami. Delikatnie dociśnij zewnętrzną powierzchnię do powierzchni płytek PDA za pomocą antybiotyków. 
		UWAGA: Upewnij się, że grzybnia grzybów na powłokach została zaszczepiona na płytce.</li>
		<li>Ostrożnie uszczelnić parafilmem i hodować w inkubatorze w temperaturze 25 ± 1 °C, aż tkanki zostaną dokładnie pokryte grzybnią.</li>
		<li>Przenieść pojedyncze kolonie zgodnie z właściwościami fenotypowymi (kolor, kształt) na nowy PDA z antybiotykami do hodowli w temperaturze 25 ± 1 °C.</li>
		<li>Powtórzyć krok 1.4.3 dwa lub trzy razy na PDA z antybiotykami, aż czyste kolonie zostaną wyizolowane oddzielnie. 
		UWAGA: Jeśli na oryginalnych płytkach rośnie wiele szczepów grzybów, należy dokładnie wybrać grzybnię, aby ułatwić sortowanie większej liczby gatunków grzybów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przechowywanie izolatów grzybów
	<ol>
		<li>Przenieś bloki agaru (o średnicy ~5 mm) z kolonii na nowe płytki PDA.</li>
		<li>Hodowla w inkubatorze w temperaturze 25 ± 1 °C przez 1-2 tygodnie.</li>
		<li>Umieścić w lodówce o temperaturze 4 °C do codziennego przechowywania do dalszego wykorzystania.</li>
		<li>Zaszczepić szczepy grzybów w 50 ml sterylnego PDB w kolbie o pojemności 250 ml, wstrząsając z prędkością 180 obr./min w temperaturze 25 °C przez 5-7 dni.</li>
		<li>Zbierz 1 ml świeżo wyhodowanej grzybni grzybów i zawieś ją w 1 ml wysterylizowanego 20% glicerolu w sterylnych probówkach do zamrażania o pojemności 2 ml (końcowe stężenie glicerolu wynosi 10%).</li>
		<li>Uszczelnić probówki parafilmem i schłodzić je w temperaturze -20 °C i -40 °C. Następnie utrzymuj probówki w temperaturze -80 °C jako zapasy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Molekularna i morfologiczna identyfikacja izolatów grzybów
<ol>
	<li>Ekstrakcja genomowego DNA grzybów
	<ol>
		<li>Hodowla grzybów w PDB zgodnie z opisem w kroku 1.5.4.</li>
		<li>Zbierz grzybnię i przefiltruj ją, aby oddzielić ją od PDB. Homogenizować w ciekłym azocie za pomocą wstępnie schłodzonego moździerza i tłuczka.</li>
		<li>Wyodrębnij genomowe DNA za pomocą zestawu do izolacji genomowego DNA grzybów zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Amplifikacja PCR i sekwencjonowanie DNA
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR w następujący sposób: 25 μl polimerazy DNA Taq, 1 μl matrycy, 2 μl starterów do przodu i do tyłu oraz ddH2O do całkowitej objętości 50 μL.</li>
		<li>Amplifikować region rDNA-ITS próbki DNA za pomocą par starterów ITS1 i ITS434 (patrz Tabela 1) zgodnie z następującą procedurą: wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 4 minuty, a następnie 35 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 60 s, wyżarzanie w temperaturze 58 °C przez 60 s, wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 2 min, i końcowe wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 min.</li>
		<li>Elektroforeza amplifikowanych produktów przy użyciu 1,5% żelu agarozowego przy napięciu 100 V, 100 mA.</li>
		<li>Sekwencjonuj PCR.</li>
		<li>Wyrównaj sekwencję za pomocą Clustal X2.0 i MEGA 6.0. 
		UWAGA: Podczas wyrównywania sekwencji miejsca o niejednoznacznym wyrównaniu są wykluczane, a przerwy są traktowane jako brakujące dane.</li>
		<li>Porównaj uzyskaną sekwencję z tymi w bazie danych sekwencji ITS w GenBank za pomocą BLAST na stronie internetowej National Center for Biotechnology Information (NCBI). Wstępnie zidentyfikuj informacje o gatunkach szczepów grzybów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identyfikacja morfologiczna
	<ol>
		<li>Użyj aparatu, aby uchwycić morfologię dojrzałej czystej kolonii grzybów zarówno na przedniej, jak i na tylnej stronie płytek PDA.</li>
		<li>Zerwij konidia z kolonii grzybów czystej kultury za pomocą igły do zaszczepiania i przenieś je na szklane szkiełko z kroplą sterylnej wody.</li>
		<li>Przytrzymaj szkiełko nakrywkowe i powoli odłóż je pod kątem ~45°, tak aby szkiełko nakrywkowe mogło przykryć próbkę bez pęcherzyków.</li>
		<li>Wytnij skalpelem blok agaru o średnicy5 mm 2 z kolonii na skraju kolonii grzybów i przenieś go do czystego szklanego szkiełka z kroplą sterylnej wody. Ostrożnie rozdziel grzyby cienką igłą, aby zobaczyć konkretne struktury.</li>
		<li>Powtórz krok 2.3.3.</li>
		<li>Obserwuj bezpłciowy morf grzybów pod mikroskopem optycznym (OM), w tym kształt, przezroczystość i postawę strzępek, konidioforów, fialidów i konidiów. Zapisz i zmierz kształt i rozmiar cech bezpłciowych, aby odróżnić od siebie różne izolaty grzybów. 
		UWAGA: Aby zmaksymalizować możliwość obserwacji struktur grzybowych, użyj plam i podłoża montażowego35.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Indukcja objawów infekcji grzybiczej u M. alternatus w celu obserwacji ich fenotypów behawioralnych
<ol>
	<li>Przygotowanie zawiesiny konidialnej
	<ol>
		<li>Przygotować 0,01% Tween-80 z czystą wodą i sterylizować w autoklawie przez 25 minut w temperaturze 121 °C. Stosować po schłodzeniu.</li>
		<li>Dodaj odpowiednią ilość sterylnych małych szklanych kulek i 0,01% roztworu Tween-80 do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Zeskrob kolonie grzybów do probówki i potrząśnij nią wystarczająco za pomocą wytrząsarki wirowej, aż kolonia zostanie rozbita. Przefiltruj przez dwie warstwy gazy, aby usunąć grzybnię. 
		UWAGA: Wytrząsanie odbywa się w celu zapewnienia zawieszenia konidiospor w 0,01% roztworze Tween-80.</li>
		<li>Policz liczbę zarodników pod OM za pomocą hemocytometru, dostosuj do 1 × 108 konidiali/ml ze sterylnym 0,01% Tween-80 i utrzymuj w temperaturze 4 °C do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie chrząszczy
	<ol>
		<li>Gałązki sosny (mniej więcej tej samej wielkości) przeksmarować w autoklawie i wysuszyć w piekarniku (~ 60 °C).</li>
		<li>Zachowaj zebrane w terenie M. dorosłe osobniki alternatus z gałązkami sosny w inkubatorze w temperaturze 25 ± 1 °C.</li>
		<li>Głodzić chrząszcze przez 24 godziny i wysterylizować powierzchnię chrząszczy wybielaczem, etanolem i wodą destylowaną [10:10:80 (v:v)] przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukcja infekcji grzybiczej
	<ol>
		<li>Pracuj pod czystą ławką, zanurz gałązki sosny w zawiesinie konidialnej na 10 s i wysusz je na powietrzu.</li>
		<li>Zanurz chrząszcze w zawiesinie konidialnej na 10 s, a następnie przenieś do sterylnych probówek o pojemności 50 ml (jeden chrząszcz i jedna gałązka na probówkę). Wymieniaj gałązki na nowe co 2 dni.</li>
		<li>W celu kontroli ujemnej należy zmienić zawiesinę konidialną na sterylny 0,01% roztwór Tween-80. Wykonać pięć powtórzeń dla każdego szczepu grzyba i grupy kontrolnej.</li>
		<li>Oceń aktywność chrząszczy na podstawie ilości wiórów wytwarzanych na gałązkach sosny. Kiedy karmienie ustaje, uważaj je za martwe.</li>
		<li>Przenieś martwe chrząszcze do nowych sterylnych probówek o pojemności 50 ml i umieść kawałek sterylnej, wilgotnej bawełny. Inkubować w temperaturze 25 ± 1 °C. 
		UWAGA: Mokrą bawełnę służy do utrzymania wilgotności, ponieważ rozwój grzybów wymaga odpowiedniej wilgotności, ale nie za dużo.</li>
		<li>Obserwuj i fotografuj zmianę powierzchni chrząszczy o tej samej porze każdego dnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponowna izolacja i potwierdzenie gatunków grzybów
	<ol>
		<li>Dopóki na powierzchni chrząszczy nie pojawią się wyraźne fenotypy infekcji grzybiczych, zbieraj grzybnię z różnych tkanek indywidualnie na nowe płytki PDA.</li>
		<li>Hodowlę w temperaturze 25 ± 1 °C i obserwować, aby upewnić się, że morfologia jest zgodna z morfologią zaszczepionych grzybów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie chrząszcza modelowego
	<ol>
		<li>Powtórz kroki 3.2.1-3.3.6 na modelu chrząszcza Tribolium castaneum, używając otrębów pszennych jako pokarmu, i wysterylizuj otręby pszenne światłem UV.</li>
		<li>Delikatnie dotknij chrząszczy sterylną pęsetą. Załóżmy, że nie żyją, jeśli nie ma odpowiedzi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Potwierdź fenotypy infekcji grzybów na M. alternatus i chrząszczu modelowym
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki do obserwacji
	<ol>
		<li>Przeprowadź sekcję zainfekowanego M. Alternatus zwłoki ostrożnie, jak w kroku 1.3.</li>
		<li>Wybierz T. ciała kacaneum z oczywistymi objawami infekcji grzybiczej.</li>
		<li>Wytnij 5-milimetrowe zatyczki dyskowe z czterech dojrzałych kolonii grzybów rosnących na PDA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obróbka wstępna próbki
	<ol>
		<li>Umieść zatyczki, zakażone tkanki chrząszczy i ciała we wstępnie schłodzonym 2,5% aldehydzie glutarowym w temperaturze 4 °C na 2 dni.</li>
		<li>Przemyć próbki trzykrotnie w 0,1% buforze fosforanowym (pH 7,2-7,4) przez 5 minut i odwodnić w 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% etanolu przez 10 minut.</li>
		<li>Wysuszyć próbki w liofilizatorze próżniowym. 
		UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas całego procesu obróbki wstępnej, w tym cięcia, namaczania, odwadniania, mycia i suszenia, aby zapobiec uszkodzeniu próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwacja w skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)
	<ol>
		<li>Wstępnie poddane obróbce próbki pokryć platyną za pomocą powlekarki napylającej i obserwować pod skaningowym mikroskopem elektronowym36.</li>
		<li>Zapisz cechy morfologiczne strzępek i konidiów rosnących na PDA, M. tkanki alternatusa i modelowe ciała chrząszczy.</li>
		<li>Porównaj, czy wyniki są zgodne z wynikami w sekcji OM w kroku 2.3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ocena aktywności entomopatogenicznej
<ol>
	<li>Przygotowanie zawiesiny konidialnej
	<ol>
		<li>Przygotowanie zawiesiny konidialnej przebiega tak samo, jak w krokach 3.1.1-3.1.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obróbka wstępna chrząszcza modelowego
	<ol>
		<li>Hoduj, karm, sterylizuj i głodz T. Castaneum jak w kroku 3.5.1.</li>
		<li>Wysterylizuj otręby pszenne promieniami UV i umieść równą wagę na sterylnych szalkach Petriego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test aktywności entomopatogenicznej
	<ol>
		<li>Otręby pszenne potraktuj zawiesiną konidialną i wysusz je na powietrzu pod czystą ławką w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zanurz T. chrząszcze kastanowe w zawiesinie konidialnej przez 10 s i przenieść je na szalkę Petriego (n = 20 na każdej szalce Petriego). Zastąp nowe otręby pszenne tym samym zabiegiem konidialnym co 4 dni.</li>
		<li>W celu kontroli ujemnej należy stosować tylko sterylny 0,01% roztwór Tween-80. 
		UWAGA: Należy odłożyć co najmniej trzy kontrpróby dla każdej grupy badanej i grupy kontrolnej.</li>
		<li>Licz martwe chrząszcze codziennie. 
		UWAGA: Delikatnie dotykaj chrząszczy sterylną pęsetą. Załóżmy, że nie żyją, jeśli nie ma odpowiedzi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wielogenowa analiza filogenetyczna
	<ol>
		<li>Wyodrębnić entomopatogeniczny genomowy DNA grzybów zgodnie z opisem w kroku 2.1. 
		UWAGA: Identyfikacja wielogenowa jest przeprowadzana dla pasożytniczych EPF, które wykazują znaczące fenotypy infekcji i silne działanie entomopatogeniczne przeciwko modelowemu chrząszczowi.</li>
		<li>Amplifikacja następujących genów, w tym regionu obejmującego jądrowy rybosomalny gen SSU34, segment dużego podjednostkowego genu rRNA (LSU37,38), część genu czynnika elongacji 1-alfa (tef-1α39), drugie co do wielkości sekwencje podjednostkowe polimerazy RNA ІІ (rpb240) i część β-tubuliny41, używając par starterów NS1/NS4, LR7/LROR, EF-983F/EF-2218R, RPB2-5'F/RPB2-5'R i TUB1/TUB22 (patrz Tabela 1).
		<ol>
			<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR jak w kroku 2.2.1.</li>
			<li>Amplifikację przeprowadzić w następujący sposób: wstępne denaturowanie w temperaturze 95 °C przez 4 minuty, następnie 35 cykli (tef-1α, rpb2, SSU), 38 cykli (LSU) lub 39 cykli (β-tubulina) denaturacji w temperaturze 94 °C przez 60 s, wyżarzanie w temperaturze 47 °C przez 60 s (LSU), 55 °C przez 60 s (tef-1α), 54 °C przez 40 s (β-tubulina) i 50 °C przez 30 s (rpb2, SSU), wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 1 minutę i końcowe wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Uporządkuj i wyrównaj, wykonując te same czynności, jak pokazano w krokach 2.2.4-2.2.5.</li>
		<li>Wykonaj analizę filogenetyczną za pomocą MEGA 6.0 w oparciu o metodę maksymalnego prawdopodobieństwa (ML)42.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Exploring Entomopathogenic Fungi Resources from Forest Wood Borers

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Różne populacje geograficzne FWB mogą rozwijać zróżnicowane interakcje z naturalnymi grzybami entomopatogenicznymi, ze względu na długotrwałą adaptację środowiskową gatunków EPF do lokalnych czynników klimatycznych i specyficznej populacji genotypowej owada żywiciela 44,45. Rozszerzenie miejsc pobierania próbek na wiele regionów występowania owadów pomaga zwiększyć możliwość pozyskiwania różnych szczepów lub gatunków EPF od ich naturalnych żywicieli, jak opisano ...

Dewastacja spowodowana przez szkodniki owadzie doprowadziła do ogromnych strat ekologicznych i ekonomicznych zarówno w ekosystemach leśnych, jak i rolniczych. Większość szkodników rolniczych naraża się na naturalnych wrogów lub sztuczne środki kontrolne, uszkadzając rośliny żywicielskie. Zamiast tego świdry leśne (FWB) prawie kończą swoje cykle rozwojowe w pniach drzew żywicielskich1, co stwarza duże wyzwania dla zbadania wydajnych organizmów kontroli biologicznej z FWB na dzikim polu. Jeszcze gorsze jest to, że FWB przenoszą dużą liczbę fitopatogenów2 lub mają bliski związek z tymi patogenami jako ich potencjalnymi wektorami3,4, co znacznie zwiększa negatywny wpływ FWB na zdrowie lasów. Nadmierne stosowanie chemicznych środków owadobójczych może złagodzić nasilenie FWB, ale pojawienie się odporności na środki owadobójcze5,6 ogranicza ich zastosowanie w środowisku. W niektórych przypadkach parazytoidy owadów, drapieżne stawonogi, a także mikroorganizmy entomopatogeniczne zostały uwolnione jako środki kontroli biologicznej do obszarów dystrybucji FWB7 i udowodniono, że są one skuteczną i ekonomicznie akceptowalną alternatywą dla kontroli chemicznej8,9,10.
Uważa się, że grzyby entomopatogeniczne (EPF) mają przewagę w zwalczaniu FWB nad większością innych grup mikroorganizmów. Ich zarodniki mogą być przenoszone przez owadzich gospodarzy i stabilnie utrwalane na powierzchni ciała poprzez penetrację naskórka lub powłoki8,11. EPF wykazuje również doskonałe zdolności adaptacyjne do stresów środowiskowych, a niektóre gatunki dobrze kolonizują tkanki drzew jako endofity12,13, ułatwiając ich wzrost, przetrwanie i przenoszenie. Jednak w porównaniu z branżą rolniczą, różnorodność gatunkowa EPF stosowanego w naturalnych ekosystemach leśnych jest znacznie ograniczona14,15,16. Beauveria bassiana (szczep PPRI 5339) został uznany za najbardziej obiecujący szczep promujący program IPM dla ryjkowców eukaliptusowych w RPA17 i połączenie dwóch obiecujących izolatów B. Bassiana stworzyła okazję do praktycznej kontroli mikrobiologicznej ryjkowca palmowego, Rhynchophorus ferrugineus, na różnych etapach życia na polach palmowych18. Oprócz Beauveria i dobrze znanego Metarhizium, inne rodzaje EPF z rzędu Hypocreales, zwłaszcza gatunki Lecanicillium (z których wiele jest obecnie klasyfikowanych do rodzaju Akanthomyces19,20), wykazały silną chorobotwórczość i wysoki potencjał w zwalczaniu szkodników leśnych, takich jak mszyca cyprysowa w Chile21.
Chrząszcz sosnowy Monochamus alternatus jest znanym szkodnikiem lasu sosnowego w Chinach i sąsiednich krajach, który grzebie w gałęziach i pniach sosen, aby utrudnić transport składników odżywczych i wody22,23,24. Ponadto M. Alternatus sprzyja również inwazji pasożytującego na roślinach nicienia sosnowego (Bursaphelenchus xylophilus, PWN) jako głównego chrząszcza wektorowego. Inny gatunek pokrewny chrząszcza, M. galloprovincialis, rozpowszechnił węgorka sosnowca w kilku krajach Europy w ostatnich latach25. Wcześniejsze badania wykazały kilka rodzajów naturalnych EPF z Monochamus spp., takich jak Beauveria, Metarhizium i Lecanicillium (Verticillium, nawet dawna nazwa Lecanicillium), w Hiszpanii, Japonii i prowincjach Anhui/Zhejiang w Chinach26,27,28,29. Niemniej jednak wydaje się, że te zbiory EPF są powszechnie ograniczone w pewnym miejscu, w porównaniu z szerokim występowaniem chrząszczy Monochamus na naturalnych polach. Ponieważ chrząszcz M. alternatus ma szerokie rozmieszczenie geograficzne w Chinach, można go uznać za reprezentatywny świdrowiec w celu zbadania większej liczby potencjalnych EPF w różnych populacjach.
W obecnym protokole wprowadzamy specyficzną procedurę badającą EPF z kilku geograficznych populacji M. alternatus w południowych Chinach. W protokole tym wykorzystano modelowego chrząszcza Coleopteran jako substytut do przeprowadzania testów entomopatogeniczności, pod warunkiem, że badany gatunek grzyba ma spójny fenotyp behawioralny dla obu gatunków chrząszczy. Protokół ten może również dostarczyć informacji na temat eksploracji EPF w przypadku innych świdrowców leśnych, w których różnorodność ich entomopatogenicznych gatunków grzybów jest niedoceniana lub mniej zbadana.

<table><tbody><tr><td>Probówki wirówkowe 1,5 mL, 2 ml</td><td>Biosharp</td><td>BS-15-M</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L końcówki do pipet</td><td>Sangon Biotech</td><td>F601216</td><td></td></tr><tr><td>10 & L, 20 i mikro; L, 100 i mikro; L, 200 i mikro; L, 1,000 i mikro; Pipety L</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 000 &micro; Końcówki do pipet</td><td>L Sangon Biotech</td><td>F630102</td><td></td></tr><tr><td>2 ml fiolki kriogeniczne</td><td>Corning</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>20x bufor PBS</td><td>Sangon Biotech</td><td>B548117-0500</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; Końcówki do pipet L</td><td>Sangon Biotech</td><td>F601227</td><td></td></tr><tr><td>2,000 bp Ekspres</td><td>TaKaRar</td><td>SD0531</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 50 ml</td><td>Nest</td><td>602052</td><td></td></tr><tr><td>50% roztwór aldehydu glutarowego</td><td>Sangon Biotech</td><td>G916054</td><td></td></tr><tr><td>50x bufor TAE</td><td>Sandon, Biotech</td><td>B548101</td><td></td></tr><tr><td>6x bufor ładujący</td><td>TaKaRar</td><td>SD0503</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610013</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodny etanol</td><td>Jkchemical</td><td>LB10V37</td><td></td></tr><tr><td>Biochemia Gabinet uprawowy</td><td>Shanghaiyiheng</td><td>LRH-250F</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Juhua</td><td>61553</td><td></td></tr><tr><td>Komercyjne pułapki na chrząszcze</td><td>FEIMENGDI</td><td>BF-8</td><td>www.yinyouji.com</td></tr><tr><td>Imager żelowy</td><td>Bio-Rad</td><td>GelDoc XR+</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sangon Biotech A600232</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem o dużej prędkości</td><td>Sigma</td><td>D-37520</td><td></td></tr><tr><td>Garnek do sterylizacji parowej pod wysokim ciśnieniem</td><td>Mettler Toledo</td><td>JA5003</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>Odczynnik ogólny</td><td>G75885B</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik kwasu nukleinowego</td><td>Sangon Biotech</td><td>A616696</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop optyczny, OM</td><td>Leica</td><td>DM2000</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td> Miernik PCR <td>Parafilm</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Heal</td><td>Force</td><td>Trident960</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina G</td><td>Marklin</td><td>GB15743</td><td></td></tr><tr><td>Agar z dekstrozą ziemniaczaną, PDA</td><td>Oxoid</td><td>CM0139</td><td></td></tr><tr><td>Bulion z dekstrozy ziemniaczanej, PDB</td><td>Solarbio</td><td>P9240</td><td></td></tr><tr><td>Startery</td><td>Sangon Biotech</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Primers Taq</td><td>TaKaRar</td><td>RR902A</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do szybkiej izolacji genomowego DNA grzybów</td> Skaningowy mikroskop elektronowy <td>Sangon Biotech</td><td>B518229</td><td></td></tr><tr><td>, SEM</td><td>Hitachi</td><td>S-3400N</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycyna</td><td>Marklin</td><td>S6153</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>Marklin</td><td>T829835</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Marklin</td><td>T6336</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator próżniowy</td><td>Yamato</td><td>DC801</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka wirowa</td><td>HLD</td><td>WH-861</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Marklin</td><td>M6230</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja, identyfikacja behawioralna i ocena chorobotwórczości grzybów entomopatogenicznych z omacnicy leśnej

Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer

Świdry leśne (FWB) powodują poważne uszkodzenia drzew i straty ekonomiczne na całym świecie. Uwalnianie grzybów entomopatogenicznych (EPF) w okresie pojawienia się FWB jest uważane za akceptowalną alternatywę dla kontroli chemicznej. Zasoby EPF zostały jednak znacznie mniej zbadane w odniesieniu do FWB, w przeciwieństwie do agrofagów owadzich. W artykule przedstawiono protokół badania zasobów EPF z FWB na przykładzie dzikich populacji Monochamus alternatus. W tym protokole przypisanie pułapek z przynętą M. Atraktanty Alternatus dla różnych populacji gwarantowały pobranie odpowiednich próbek z naturalnymi objawami infekcji w okresach pojawienia się chrząszcza. Po dokładnym rozwarstwieniu powłok i umieszczeniu ich na selektywnym podłożu, gatunki grzybów wyizolowano z każdej części ciał chrząszczy i zidentyfikowano je na podstawie cech molekularnych i morfologicznych.
Kilka gatunków grzybów zostało certyfikowanych jako pasożytnicze EPF poprzez ponowne zakażenie zdrowego M. alternatus zawiesinami zarodników. Ich fenotypy behawioralne na M. alternatus obserwowano za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, a następnie porównywano z tymi na modelowym owadzie Coleopteran Tribolium castaneum. W przypadku EPF, które wykazują spójne fenotypy pasożytnictwa na obu gatunkach chrząszczy, ocena ich aktywności na T. Castaneum dostarczyło cennych informacji na temat śmiertelności dla przyszłych badań nad M. alternatus. Protokół ten pomógł w odkryciu EPF nowo zgłoszonych w populacjach M. alternatus w Chinach, co może być zastosowane jako skuteczne podejście do eksploracji większej ilości zasobów EPF z innych FWB.

Izolacja i identyfikacja izolatów grzybów z M. alternatus 
Przy użyciu pułapek z atraktantami zebrano znaczną liczbę (łącznie około 500 chrząszczy) M. alternatus z pięciu regionów geograficznych. Wybrano trupie ciała chrząszczy z typowymi objawami infekcji grzybami entomopatogennymi; następnie powłoki ciała każdego chrząszcza przedzielono na kilka pozycji, zgodnie z opisem w kroku 1.3 protokołu. W wyniku tych działań z różnych pozycji ciała wyizolowano ponad 600 iz...

Tutaj prezentujemy protokół pozyskiwania entomopatogenicznych grzybów z omacnicy leśnej oraz zastępczy sposób oceny ich entomopatogenicznej aktywności za pomocą modelowego owada Coleoptera. Ta metoda jest skuteczna i wygodna w badaniu entomopatogenicznych zasobów grzybów ze szkodników owadzich drążących drewno w lasach naturalnych.

Izolacja, identyfikacja behawioralna i ocena chorobotwórczości grzybów entomopatogenicznych z omacnicy leśnej

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence ...

Badamy entomopatogeniczne zasoby grzybów z dzikich populacji Monochamus alternatus. Biorąc za przykład ten gatunek, możemy wzbogacić różnorodność grzybów entomopatogenicznych innych świdrowców leśnych do przyszłych zastosowań w kontroli biologicznej. Niedawno uzyskaliśmy trzy gatunki grzybów certyfikowane jako pasożytnicze grzyby entomopatogeniczne Monochamus alternatus, z których dwa nie są dobrze znane, ale okazały się silnymi patogenami owadów.Protokół ten pomaga w odkryciu większej liczby EPF Monochamus alternatus i zapewnia zastępczy sposób oceny ich aktywności entomopatogenicznej, co może również dostarczyć informacji na temat entomopatogenicznej eksploracji grzybów dla innych świdrowców leśnych. Po zebraniu chrząszczy sosnówki Monochamus alternatus umieść chrząszcza w sterylnej probówce zawierającej świeże gałązki. Chrząszcze należy hodować w nienawilżanym inkubatorze w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Po inkubacji rekordowe chrząszcze wykazujące zmniejszone żerowanie i ruchliwość. Przenieś sztywne martwe chrząszcze do wilgotnych komór. Wypreparuj chrząszcze z infekcjami grzybiczymi na główne pozycje, takie jak czułki, głowa, klatka piersiowa, brzuch, skrzydła i nogi.Za pomocą nożyczek pokrój powłoki każdej pozycji na małe kawałki. Delikatnie dociśnij zewnętrzną powierzchnię tych kawałków do płytki PDA zawierającej antybiotyki. Uszczelnij płytkę parafilmem i inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aż tkanki zostaną całkowicie pokryte grzybnią.Następnie przenieś pojedynczą kolonię zgodnie z właściwościami fenotypowymi na nową płytkę PDA. Wyodrębnij genomowe DNA za pomocą zestawu do izolacji genomowego DNA grzybów. Przygotuj mieszaninę PCR ze starterami ITS1 i ITS4 w celu amplifikacji regionu rDNA ITS DNA.Użyj aparatu, aby uchwycić morfologię dojrzałej czystej kolonii grzybów na przedniej i tylnej stronie płytki PDA. Zerwij konidia z czystych kolonii grzybów za pomocą igły do zaszczepiania i przenieś je na szklane szkiełko z kroplą sterylnej wody. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na próbce bez wprowadzania pęcherzyków.Odetnij pięciomilimetrowy blok agaru skalpelem od krawędzi kolonii grzybów i przenieś go na czyste szklane szkiełko z kroplą sterylnej wody. Za pomocą cienkiej igły ostrożnie oddziel grzyby od agaru, aby obserwować określone struktury. Pod mikroskopem optycznym obserwuj bezpłciowy morf grzybów, w tym postawę strzępek, konidioforów, fialidów i konidiów.Na początek wysterylizuj powierzchnię 24-godzinnych chrząszczy Monochamus alternatus i Tribolium castaneum za pomocą wybielacza, etanolu i wody destylowanej. Aby wywołać infekcję grzybiczą, najpierw zanurz gałązki sosny lub otręby pszenne w zawiesinie konidialnej na 10 sekund. Następnie zanurz chrząszcze w zawiesinie konidialnej.Po wysuszeniu umieść jednego chrząszcza i jedną gałązkę w sterylnej 50-mililitrowej tubce. Chrząszcze należy hodować w nienawilżanym inkubatorze w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po inkubacji przenieś martwe chrząszcze do nowej 50-mililitrowej probówki i umieść w niej kawałek sterylnej, wilgotnej bawełny.Rozkrój ciała zainfekowanych chrząszczy infekcjami grzybiczymi na pozycje takie jak czułki, głowa, klatka piersiowa, brzuch, skrzydła i nogi. Wytnij pięciomilimetrowe zatyczki dyskowe dojrzałych kolonii grzybów. Umieść zainfekowane tkanki chrząszcza we wstępnie schłodzonym 2,5% aldehydzie glutarowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza na dwa dni.Następnie przemyj próbki trzykrotnie w 0,1% buforze fosforanowym przez pięć minut i odwadniaj w zwiększającym się stężeniu etanolu przez 10 minut każda. Wysuszyć próbki w liofilizatorze próżniowym, a następnie obserwować struktury grzybów pod skaningowym mikroskopem elektronowym. Traktuj otręby pszenne zawiesiną konidialną przez 10 sekund, a po wysuszeniu przenieś je na szalkę Petriego.Zanurz chrząszcze T. castaneum w zawiesinie konidialnej na 10 sekund, przed umieszczeniem ich na szalce Petriego zawierającej otręby pszenne. Po inkubacji policz martwe chrząszcze z płytki. Ekstrakcja genomowego DNA pasożytniczych grzybów entomopatogenicznych za pomocą zestawu do izolacji genomowego DNA grzybów.Korzystając z podanych zestawów starterów, przygotuj mieszaninę reakcyjną PCR do amplifikacji specyficznej dla genu. Po sekwencjonowaniu wyrównaj sekwencję nukleotydów za pomocą ClustalX2. Na koniec przeprowadź analizę filogenetyczną za pomocą MEGA6, w oparciu o metodę maksymalnego prawdopodobieństwa.Grzyby pasożytnicze, takie jak Aspergillus oryzae, Akanthomyces attenuatus i Scopulariopsis alboflavescens, powodowały znaczące objawy infekcji u M. alternatus. Obserwacje SEM dodatkowo potwierdziły cechy morfologiczne tych pasożytniczych grzybów na powierzchni chrząszczy. Aktywność entomopatogeniczna wykazała istotnie wyższą śmiertelność grzybów pasożytniczych w porównaniu z grupą kontrolną.Wielogenowe drzewo filogenetyczne wykazało odległości genetyczne między trzema pasożytniczymi gatunkami grzybów a innymi gatunkami w obrębie ich odpowiednich rodzajów.

isolation-behavioral-identification-pathogenicity-assessment

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tutaj prezentujemy protokół oparty na systemie przynęty na mącznika mącznika (Tenebrio molitor), który był używany do izolowania i selekcji grzybów entomopatogenicznych (EPF) z próbek gleby. Skuteczna formuła liczby konidiów (ECN) jest stosowana do wyboru EPF o wysokiej tolerancji na stres w oparciu o cechy fizjologiczne do zwalczania mikrobiologicznego szkodników na polu.

Izolacja i selekcja grzybów entomopatogenicznych z próbek glebowych oraz ocena zjadliwości grzybów wobec szkodników owadzich

Entomopatogeniczne kolonie grzybów są izolowane z próbek gleby tropikalnej za pomocą przynęty Tenebrio, przynęty Galleria, a także selektywnego sztucznego podłoża, tj. agaru z dekstrozą ziemniaczaną wzbogaconego ekstraktem drożdżowym uzupełnionym chloramfenikolem, tiabendazolem i cykloheksymidem (pożywka CTC).

Porównanie metod izolowania grzybów entomopatogenicznych z próbek gleby

W tym filmie opiszemy jedną z metod oceny psychofizjologicznej reakcji człowieka na stres z wykorzystaniem biofeedbacku. Przedstawimy również ogólne wytyczne dotyczące planowania leczenia.

Psychofizjologiczna ocena stresu z wykorzystaniem biofeedbacku

Organizm modelowy C. elegans wykorzystuje płyn pseudocelomiczny jako pasywny układ krążenia. Bezpośrednia analiza tego płynu nie była wcześniej możliwa. Przedstawiamy tutaj nową technikę bezpośredniego badania przestrzeni zewnątrzkomórkowej, wykorzystując systemowe sygnały wyciszania podczas odpowiedzi RNAi jako przykład potwierdzający zasadność tej metody.

Wampiryczna izolacja płynu zewnątrzkomórkowego z Caenorhabditis elegans

W niniejszym raporcie opisujemy protokół izolacji wysoko oczyszczonych populacji leukocytów infiltrujących guzy. Protokół ten został opracowany na podstawie metody firmy Miltenyi Biotech w celu zwiększenia wydajności i czystości izolacji komórek z złożonej tkanki nowotworowej.

Izolacja komórek odpornościowych z guzów pierwotnych

Opisujemy metodę bezpośredniego pomiaru siły mięśniowej, mocy mięśniowej, kinetyki skurczu oraz podatności na zmęczenie izolowanych mięśni szkieletowych w układzie in vitro z wykorzystaniem stymulacji polowej. Dzięki zastosowaniu różnych protokołów stymulacji można uzyskać cenne informacje na temat właściwości gospodarki Ca2+ oraz mechanizmu skurczowego mięśnia.

Ex Vivo ocena kurczliwości, męczliwości i alternansu w izolowanych mięśniach szkieletowych

Porównanie potencjału błony mitochondrialnej między próbkami dostarcza cennych informacji o stanie komórek. Opisano szczegółowe etapy izolacji mitochondriów i oceny odpowiedzi na inhibitory i rozprzęgacze za pomocą fluorescencji. Metoda i użyteczność tego protokołu są zilustrowane przez zastosowanie hodowli komórkowej i zwierzęcego modelu stresu komórkowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy

Grzyby entomopatogeniczne zyskały na znaczeniu jako środki biologicznej kontroli szkodników rolniczych. W tym badaniu z powodzeniem przeprowadzono masową produkcję wystarczającej liczby odpornych zakaźnych propagul południowoafrykańskich izolatów zarówno Metarhizium robertsii, jak i M. pinghaense do komercyjnego stosowania przeciwko szkodnikom owadzim, przy użyciu rolnych produktów zbożowych.

Masowa produkcja grzybów entomopatogenicznych, Metarhizium robertsii i Metarhizium pinghaense, do komercyjnego stosowania przeciwko szkodnikom owadzim

Tutaj prezentujemy protokół badania różnorodności biologicznej gleby w poszukiwaniu szczepów grzybów biorących udział w degradacji opornych materiałów. Najpierw izoluje się szczepy grzybów, które mogą rosnąć na kwasach humusowych lub lignocelulozie. Ich aktywność jest następnie testowana zarówno w testach enzymatycznych, jak i na zanieczyszczeniach, takich jak węglowodory i tworzywa sztuczne.

Izolacja i badania przesiewowe pod kątem różnorodności biologicznej gleby pod kątem grzybów biorących udział w degradacji opornych materiałów

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę preparacji mysich magazynów tłuszczu oraz izolacji i trawienia odpowiednich tętnic w celu uwolnienia, a następnie zidentyfikowania populacji komórek śródbłonka. Świeżo wyizolowane komórki wykorzystywane w dalszych zastosowaniach przyczynią się do lepszego zrozumienia biologii komórek naczyniowych i mechanizmów dysfunkcji naczyń krwionośnych.

Izolacja i identyfikacja komórek śródbłonka naczyń krwionośnych z różnych magazynów tłuszczu do dalszych zastosowań

Poznaj metodę izolacji i identyfikacji grzybów entomopatogenicznych z omacnicy leśnej Monochamus alternatus. Protokół obejmuje hodowlę, PCR, sekwencjonowanie i ocenę aktywności chorobotwórczej w modelu chrząszczy.

Izolacja, identyfikacja behawioralna i ocena chorobotwórczości grzybów entomopatogenicznych z omacnicy leśnej

Przeglądaj więcej filmów