Obrazowa cytometria przepływowa do badania autoagregacji drobnoustrojów
29 września 2023
Ten protokół opisuje ilościowe podejście do pomiaru autoagregacji drobnoustrojów za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej.
W badaniu wykorzystano gatunki Lactobacillaceae jako model w celu wykazania skuteczności obrazowej analizy cytometrii przepływowej w badaniu autoagregacji drobnoustrojów. Nacisk położono na analizę reakcji autoagregacji gatunków Lactobacillaceae na węglowodany proste z diety. Najczęściej stosowanymi metodami pomiaru autoagregacji są spektrofotometria, która mierzy zawiesinę drobnoustrojów, zmętnienie lub gęstość optyczną, oraz tradycyjne techniki mikroskopowe, takie jak jasne pole, kontrast fazowy i mikroskopia fluorescencyjna.
Mówiąc o obrazowaniu o wysokiej przepustowości, jednym z głównych wyzwań eksperymentalnych jest segmentacja pojedynczych zdarzeń. W tym protokole jest to pojedynczy agregat. Obrazowa cytometria przepływowa elegancko radzi sobie z tym wyzwaniem i daje naukowcom potężne narzędzie do badania autoagregacji.
Zacznij od zaszczepienia pięciu mililitrów bulionu Lactobacilli MRS pojedynczą kolonią szczepu Lactobacillaceae. Inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza w warunkach statycznych przez noc. Rozcieńczyć kulturę komórkową w stosunku 1 do 100 w trzech mililitrach 50% wzbogaconego bulionu sojowego tryptycznego.
Wiruj kulturę i inkubuj ją. Następnie odwróć probówkę, aby wymieszać komórki w pożywce przed przeniesieniem od 200 do 300 mikrolitrów próbki do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Aby rozpocząć analizę cytometrii przepływowej, najpierw ustaw laser 785-nanometrowy na moc pięciu miliwatów do pomiarów ciemnego pola.
Użyj obiektywu 60X z przysłoną numeryczną 0,9, a następnie wybierz ustawienie wysokiej czułości i ustaw szybkość na niską. Aby zapewnić stabilność koralika kalibracyjnego, naciśnij przycisk odtwarzania w pudełku fluidics i sprawdź obrazy koralików, które powinny być ostre i wyraźne. Wygeneruj nowy wykres rozrzutu w polu obszaru roboczego, wybierając pozycję Nowy wykres rozrzutu.
Następnie wybierz obszar w kanale jasnego pola, który odpowiada intensywności kanału SSC, i wyklucz kulki kalibracyjne, które biegną równolegle w próbce. Następnie naciśnij przycisk Load i umieść probówkę zawierającą próbkę Lactobacillaceae w uchwycie. W polu ustawień pozyskiwania wprowadź nazwę próbki i określ lokalizację przechowywania danych.
Ustaw liczbę zdarzeń do zebrania, zwykle w zakresie od 10 000 do 20 000 zdarzeń. Teraz rozpocznij proces nabywania, klikając przycisk Rekord znajdujący się w polu przejęcia. Proces zostanie zatrzymany po osiągnięciu określonej liczby zdarzeń.
Naciśnij przycisk Return, aby rozładować rurkę i wyjmij ją z uchwytu zgodnie z monitem w wyskakującym okienku. Po powtórzeniu procesu dla wszystkich próbek zapisz szablon, aby zachować jednolitość pozyskiwania danych. W celu analizy danych, aby załadować surowy plik do oprogramowania do analizy, kliknij Plik i otwórz plik rif.
W otwartym oknie wybierz Użyj analizy akwizycji, a następnie kliknij OK. Następnie, aby utworzyć histogram średniej kwadratowej pierwiastka gradientu, kliknij przycisk Nowy histogram i wybierz populację z akwizycji do analizy. W obszarze Funkcja osi X wybierz opcję Gradient RMS kanału jasnego pola. Następnie umieść bramkę, aby wykluczyć zdarzenia nieaktywne, klikając przycisk Utwórz obszar linii w obszarze analizy.
Utwórz wykres rozrzutu obszaru w funkcji współczynnika proporcji, klikając przycisk Nowy wykres rozrzutu w obszarze analizy. Wybierz skupioną populację w oknie Nowy wykres rozrzutu, a następnie wybierz obszar kanału jasnego pola dla elementu osi X. Wybierz współczynnik proporcji dla funkcji osi Y.
Narysuj bramkę na wykresie rozrzutu za pomocą przycisku Utwórz prostokąt na podstawie wartości obszaru dla zagregowanej populacji zdarzeń. Podobnie, narysuj kolejną bramę dla populacji singli i małych agregatów. Zapisz analizę danych jako szablon, klikając kartę Plik i wybierając opcję Zapisz jako szablon.
ast, a następnie otwórz następny przykładowy plik w tym samym szablonie, aby utworzyć plik analizy danych. Aby zmierzyć zagregowany rozkład wielkości, zacznij od wykreślenia histogramu obszaru populacji zdarzeń agregacji. Zapisz analizę danych, klikając zakładkę Plik i wybierając opcję Zapisz jako szablon.
Po zapisaniu otwórz następny przykładowy plik w tym samym szablonie dla pliku analizy danych. Pojedyncze komórki, małe agregaty, duże agregaty i łańcuchy obserwowano u LGG i L. paracasei. Nie można było jednak odróżnić łańcuchów od większych agregatów.
Zaobserwowano znaczące różnice w charakterystyce agregacji różnych szczepów LAB w odpowiedzi na cukry fermentujące lub niefermentujące.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie bada autoagregację mikroorganizmów z wykorzystaniem Lactobacillaceae jako modelowego układu, podkreślając skuteczność cytometrii przepływowej z obrazem w analizie. Badania koncentrują się na reakcji gatunków Lactobacillaceae na węglowodany pokarmowe i wykorzystują metody wysoko przepustowe z obrazem.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Autoagregacja mikroorganizmów
- Wpływ węglowodanów pokarmowych
- Analiza cytometrii przepływowej z obrazem
Tło
- Tradycyjne metody pomiaru autoagregacji obejmują spektrofotometrię i mikroskopię.
- Wyzwania w segmentacji pojedynczych zdarzeń w wysoko przepustowej mikroskopii.
- Znaczenie analizy zachowań mikroorganizmów w związku z odżywianiem.
Zastosowane metody
- Cytometria przepływowa z obrazem do badania autoagregacji mikroorganizmów
- Gatunki Lactobacillaceae jako model organizmu
- Protokoły kalibracji i pozyskiwania danych dla cytometrii przepływowej
Główne wyniki
- Różnice w charakterystyce agregacji różnych szczepów LAB w odpowiedzi na cukry.
- Obserwacja pojedynczych komórek, małych agregatów, większych agregatów i łańcuchów w badanych szczepach.
- Analiza danych ujawniła istotne wyniki dotyczące wpływu cukrów fermentowalnych i niefermentowalnych.
Wnioski
- Badanie wykazuje potencjał cytometrii przepływowej z obrazem w zrozumieniu autoagregacji mikroorganizmów.
- Wyniki oferują wgląd w sposób, w jaki składniki pokarmowe wpływają na zachowania mikroorganizmów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Imaging Flow Cytometry (IFC) enables high-throughput, quantitative analysis of microbial autoaggregation, addressing a key challenge in phenotypic screening of probiotic strains. This capability supports predictive confidence in early discovery by linking cellular aggregation behaviors to environmental variables such as dietary carbohydrates. Integrating IFC into discovery workflows enhances mechanistic de-risking and informs portfolio decisions for microbiome-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microbial aggregation mechanisms in response to defined environmental stimuli.
- Supports functional validation of probiotic strain behaviors relevant to host interaction.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying aggregation phenotypes across strain libraries.
- Improves predictive confidence for candidate selection in microbiome-based programs.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-throughput morphometric data for assay development.
- Enables reproducible quantification of single cells, small aggregates, and larger structures.
- Supports scalable screening of strain responses to dietary components.
- Provides robust templates for cross-sample and cross-study comparison.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro aggregation phenotypes with potential in vivo functional outcomes.
- Supports translational continuity by linking dietary modulation to microbial behavior.
- Enables risk-adjusted advancement of strains with desirable aggregation profiles.
- Facilitates biomarker discovery for probiotic efficacy studies.
Pipeline & Workflow Integration
IFC-based aggregation analysis fits within the early discovery to lead identification continuum for microbiome and probiotic R&D.
- Discovery Biology: Quantifies aggregation as a functional phenotype for hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Enables morphometric and statistical analysis of aggregation distributions across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro aggregation data to preclinical model selection and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical platform for diverse microbial strain libraries and dietary interventions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in probiotic candidate selection.
- Operational Value: Standardizes aggregation measurement and supports high-throughput, reproducible workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of strains with validated aggregation phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and morphometric data analysis.
- Demands access to high-resolution imaging flow cytometry instrumentation.
- Necessitates standardized gating and analysis templates for cross-study comparability.
- May require adaptation for different microbial species or dietary conditions.
- Distinguishing between certain aggregate morphologies (e.g., chains vs. large aggregates) may be limited by current resolution.
