Name: Obrazowa cytometria przepływowa do badania autoagregacji drobnoustrojów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 19 s
Description: Poznaj obrazową cytometrię przepływową do badania autoagregacji drobnoustrojów Lactobacillaceae. Ta metoda pozwala analizować wpływ węglowodanów pokarmowych na zachowanie bakterii w wysokiej przepustowości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Izraelską Fundację Naukową (Grant 119/16) i IMoh grant (3-15656) dla IKG. R.S. wspierany przez stypendium Kreitmana.

Plik .ast, z szablonem dla Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) jako przykładem, znajduje się w Dodatkowym Pliku Kodowania 1.
1. Przygotowanie mediów
<ol>
	<li>Przygotować bulion Lactobacilli MRS zgodnie z instrukcjami producenta (55 g w 1 l wody dejonizowanej) i płytki agarowe Lactobacilli MRS z 1,5% (w/v) agarem (patrz Tabela Materiałów). Po sterylizacji w autoklawie pożywka jest gotowa do użycia bezpośrednio lub może być przechowywana w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 50% (15 g w 1 l wody dejonizowanej) tryptycznego bulionu sojowego (TSB) (patrz tabela materiałów), TSB uzupełnionego 1% (w/v) D-(+)-glukozy i 1% (w/v) D-(+)-rafinozy, a następnie autoklaw w celu sterylizacji podłoża. Zaleca się przechowywanie go w temperaturze 4 °C, aby uniknąć zanieczyszczenia.</li>
	<li>Dla buforowanej pożywki z glukozą należy przygotować TSB uzupełniony 1% (w/v) D-(+)-glukozą, 5 mM jednozasadowego fosforanu potasu wraz z dwuzasadowym potasem i 100 mM MOPS (kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy, patrz tabela materiałów) pH 7. Następnie autoklaw w celu wysterylizowania pożywki.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek
UWAGA: Ten krok obejmuje ocenę agregacji komórek w odpowiedzi na fermentujący lub niefermentujący cukier z naszej diety. Schematyczne przedstawienie procesu przygotowania próbki przedstawiono na rysunku Rysunek 1.
<ol>
	<li>Szczep Lactobacillaceae z zamrożonego bulionu glicerolowego (50% glicerolu) rozprowadź na talerzu bulionowym Lactobacilli MRS (1,5% agaru). 
	UWAGA: W przedstawionym tutaj przykładowym eksperymencie wykorzystano szczepy probiotyczne Lactobacillus acidophilus (ATCC 4356), Lacticaseibacillus casei (ATCC 393), Lacticaseibacillus casei subsp. paracasei (ATCC BAA-52), Lactiplantibacillus plantarum (ATCC 8014) i Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) (LGG). Aby rozszerzyć tę metodologię na dodatkowych probiotycznych członków gromady firmicutes, wybrano Bacillus coagulans (ATCC 10545).</li>
	<li>Hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C w warunkach statycznych.</li>
	<li>Zaszczepić 5 ml bulionu Lactobacilli MRS pojedynczą kolonią i hodować ją w temperaturze 37 °C w warunkach statycznych przez noc.</li>
	<li>Rozcieńczyć kulturę komórkową z poprzedniego etapu (1:100) w 3 ml 50% tryptycznego bulionu sojowego (TSB), TSB uzupełnionego 1% (w/v) D-(+)-glukozy lub TSB uzupełnionego 1% (w/v) D-(+)-rafinozy.</li>
	<li>Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w warunkach statycznych.</li>
	<li>Przygotować próbkę, równomiernie mieszając komórki w pożywce i delikatnie przemieszać probówkę do hodowli komórkowej z kroku 2.5. Delikatnie odwróć probówkę, aż nastąpi całkowite wymieszanie. Przenieść 200-300 μl do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Istotne jest, aby nie poddawać próbki sonikacji, aby uniknąć rozbicia agregatów. Podczas zbierania danych z etapów 3.4 do 3.10 mogą wystąpić przypadki, w których próbki są zbyt zagęszczone. Jeśli zaobserwuje się, że próbka działa bardzo wolno lub w ogóle nie pracuje, można rozcieńczyć próbkę odpowiednią świeżą pożywką.</li>
</ol>
3. Akwizycja danych
<ol>
	<li>Ustawić obrazowy cytometr przepływowy zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Ustaw laser 785 nm na 5 mW w celu pomiaru ciemnego pola (odpowiednik rozpraszania bocznego w konwencjonalnej cytometrii przepływowej, w skrócie SSC). Użyj obiektywu 60x z przysłoną numeryczną (N.A) 0,9, wybierz wysoką czułość i ustaw szybkość na niską.</li>
	<li>Przed zebraniem jakichkolwiek danych należy upewnić się, że przepływ kulek kalibracyjnych w kanale SSC. Kliknij przycisk odtwarzania w polu "fluidics" i sprawdź jakość obrazów koralików. Obrazy koralików powinny być ostre i wyraźne.</li>
	<li>Naciśnij przycisk Load i umieść probówkę z próbką (z kroku 2.6) w uchwycie.</li>
	<li>Utwórz nowy wykres rozrzutu w polu "obszar roboczy". Kliknij Nowy wykres rozrzutu i wybierz obszar w kanale jasnego pola odpowiadający intensywności kanału SSC. Wyklucz koraliki kalibracyjne, które biegną w przyrządzie wraz z próbką. 
	UWAGA: Koraliki można wykluczyć, ładując próbkę tylko do bufora i identyfikując koraliki na obszarze vs. Działka SSC. Następnie narysuj bramę wokół populacji koralików za pomocą przycisku Utwórz region wielokąta.</li>
	<li>W polu "Ustawienia pozyskiwania" wprowadź nazwę próbki, określ lokalizację przechowywania danych, wybierz populację (wszystkie komórki bez koralików), z której chcesz nagrywać, i ustaw liczbę zdarzeń, które mają być zbierane. Zazwyczaj wystarczy 10 000-20 000 zdarzeń.</li>
	<li>Kliknij przycisk Nagraj znajdujący się w polu "Akwizycja", a proces akwizycji zakończy się automatycznie po osiągnięciu określonej liczby zdarzeń.</li>
	<li>Kliknij przycisk Powrót, aby rozładować rurkę i wyjmij rurkę z uchwytu, gdy pojawi się monit w małym oknie.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 3.5-3.9 dla każdej próbki.</li>
	<li>Zapisz szablon, aby zachować jednolitość pozyskiwania danych dla kolejnych powtórzeń.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Zmierz procent (%) autoagregacji od populacji.
	<ol>
		<li>Przeanalizuj dane uzyskane za pomocą obrazowego cytometru przepływowego za pomocą oprogramowania IDEAS (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Utwórz plik analizy danych (.daf) z pliku RAW (.rif), ładując plik (.rif) do oprogramowania analitycznego. Kliknij przycisk Plik i otwórz wymagany plik (.rif). W otwartym oknie kliknij użyj analizy akwizycji, a następnie kliknij OK.</li>
		<li>Utwórz histogram gradientu RMS (miara kontrastu i ostrości obrazu) w kanale jasnego pola, aby zidentyfikować zogniskowane zdarzenia. W obszarze analizy kliknij przycisk Nowy histogram. W oknie "Nowy histogram" wybierz populację z akwizycji do analizy, a w "funkcji osi x" wybierz Gradient RMS kanału jasnego pola.
		<ol>
			<li>Umieść bramkę, klikając przycisk Utwórz region linii w obszarze analizy, aby wykluczyć zdarzenia nieukierunkowane (Rysunek 2A). 
			UWAGA: Zazwyczaj obszar linii "Skoncentrowany" powinien obejmować 80%-90% zdarzeń z najwyższym wynikiem Gradient RMS, ale dla każdej konfiguracji eksperymentalnej należy określić konkretne progi dla komórek "ostrych".</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Utwórz wykres rozrzutu obszaru (μm2) w stosunku do proporcji (szerokość podzielona przez długość najlepiej dopasowanej elipsy) kanału jasnego pola. Naciśnij przycisk Nowy wykres rozrzutu w obszarze analizy. W oknie "Nowy wykres rozrzutu" wybierz Skoncentrowaną populację z kroku 4.1.3.
		<ol>
			<li>Wybierz Obszar kanału jasnego pola dla funkcji osi x i Współczynnik proporcji kanału jasnego pola dla elementu osi y. Ten wykres rozrzutu umożliwia bramkowanie na skoncentrowanej populacji w celu odróżnienia pojedynczych i małych zdarzeń zagregowanych od większych agregatów i łańcuchów mikrobiologicznych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Na tym wykresie rozrzutu narysuj bramkę za pomocą przycisku Utwórz region prostokąta (lub Utwórz region wielokąta) na podstawie wartości obszaru dla populacji zdarzeń agregacji i innej bramki dla populacji pojedynczych i małych agregatów (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). 
		UWAGA: W niektórych tłach oddzielenie małych agregatów od podkoszulków może być trudne, więc można je połączyć w tę samą bramę. To samo dotyczy większych agregatów i łańcuchów (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
		<li>Ręcznie przeglądaj i oceniaj obrazy zdarzeń w każdej bramce, aby zweryfikować niezawodność strategii bramkowania. W razie potrzeby dostosuj wartość powierzchni bramy. W tym celu należy wybrać recenzowaną populację z menu rozwijanego "Populacje". 
		UWAGA: Bramkowanie nie ma określonej wartości powierzchni, ponieważ może się różnić w zależności od charakterystyki analizowanych bakterii.</li>
		<li>Zapisz analizę danych jako szablon. Kliknij kartę Plik, wybierz pozycję Zapisz jako Template.ast i otwórz następny przykładowy plik (.rif) w tym samym szablonie, aby utworzyć plik analizy danych (.daf) (Obsługiwany plik .ast jako przykład dla LGG).</li>
		<li>Utwórz tabelę statystyk, aby wyliczyć kluczowe zdarzenia do dalszej analizy. Kliknij zakładkę Raporty, a następnie kliknij opcję Zdefiniuj raport statystyczny.</li>
		<li>W nowym oknie kliknij Dodaj kolumny. Dodaj liczbę wyróżnień/agregacji i statystyki %bramkowane. W sekcji "statystyki" wybierz %gated/count, a pod wybraną populacją wybierz singlets/aggregates. Kliknij przycisk Dodaj statystyki, aby dodać statystykę do listy i zapisać ją jako szablon.</li>
		<li>Kliknij Generuj raport statystyczny i wybierz szablon statystyk oraz pliki (.daf) do analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz rozkład wielkości agregatów.
	<ol>
		<li>Aby przeanalizować średnią wielkość zdarzeń agregacji, należy wykreślić histogram obszaru (μm2) populacji zdarzeń agregacji z kroku 4.1.5 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
		<li>Zapisz analizę danych jako szablon. Kliknij kartę Plik, wybierz pozycję Zapisz jako szablon i otwórz następny przykładowy plik (.rif) w tym samym szablonie dla pliku analizy danych (.daf).</li>
		<li>Powtórz kroki 4.1.7-4.19. W przypadku rozmiaru agregacji wybierz średnią w obszarze Statystyka i wybierz wartości zagregowane w obszarze wybranej populacji. W obszarze Obiekty wybierz opcję Obszar kanału jasnego pola. Kliknij Dodaj statystyki, aby dodać statystykę do listy i zapisać ją jako szablon.</li>
		<li>Powtórz krok 4.1.9, aby wygenerować raport statystyczny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Quantitative Analysis of Microbial Autoaggregation Using Imaging Flow Cytometry

<ol><li>Trunk, T., Khalil, H. S., Leo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+autoaggregation%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial autoaggregation.</a> AIMS Microbiology. 4 (1), 140-164 (2018).</li>
<li>Ishikawa, M., Nakatani, H., Hori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtaA%2C+a+new+member+of+the+trimeric+autotransporter+adhesins+from+Acinetobacter+sp.+Tol+5+mediating+high+adhesiveness+to+various+abiotic+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">AtaA, a new member of the trimeric autotransporter adhesins from Acinetobacter sp. Tol 5 mediating high adhesiveness to various abiotic surfaces.</a> PLoS One. 7, e48830(2012).</li>
<li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+low-molecular-weight+component+protein%2C+Flp%2C+in+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+fimbriae%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of low-molecular-weight component protein, Flp, in Actinobacillus actinomycetemcomitans fimbriae.</a> Medical Microbiology and Immunology. 42 (4), 253-258 (1998).</li>
<li>Boddey, J. A., Flegg, C. P., Day, C. J., Beacham, I. R., Peak, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-regulated+microcolony+formation+by+Burkholderia+pseudomallei+requires+pilA+and+enhances+association+with+cultured+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Temperature-regulated microcolony formation by Burkholderia pseudomallei requires pilA and enhances association with cultured human cells.</a> Infection and Immunity. 74 (9), 5374-5381 (2006).</li>
<li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+differences+in+the+functional+responses+of+Lactobacillaceae+strains+to+fermentable+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Context-dependent differences in the functional responses of Lactobacillaceae strains to fermentable sugars.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 949932(2022).</li>
<li>Isenring, J., Geirnaert, A., Lacroix, C., Stevens, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bistable+auto-aggregation+phenotype+in+Lactiplantibacillus+plantarum+emerges+after+cultivation+in+in+vitro+colonic+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bistable auto-aggregation phenotype in Lactiplantibacillus plantarum emerges after cultivation in in vitro colonic microbiota.</a> BMC Microbiology. 21, 268(2021).</li>
<li>Kos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+and+aggregation+ability+of+probiotic+strain+Lactobacillus+acidophilus+M92%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92.</a> Journal of Applied Microbiology. 94 (6), 981-987 (2003).</li>
<li>Zommiti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+the+probiotic+properties+and+bacteriocinogenic+potential+of+Pediococcus+pentosaceus+MZF16+isolated+from+artisanal+tunisian+meat+%26%2334%3BDried+Ossban%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of the probiotic properties and bacteriocinogenic potential of Pediococcus pentosaceus MZF16 isolated from artisanal tunisian meat &#34;Dried Ossban&#34;.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2607(2018).</li>
<li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+rewiring+of+the+probiotic+bacterium+rhamnosus%3C%2Fem%3E+GG+contributes+to+cell-wall+remodeling+and+antimicrobials+production%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Metabolic rewiring of the probiotic bacterium rhamnosus GG contributes to cell-wall remodeling and antimicrobials production.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Connell, J. L., Kim, J., Shear, J. B., Bard, A. J., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+quorum+sensing+in+3D-printed+bacterial+aggregates+using+scanning+electrochemical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of quorum sensing in 3D-printed bacterial aggregates using scanning electrochemical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18255-18260 (2014).</li>
<li>Misawa, N., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+characterization+of+autoagglutination+activity+by+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Detection and characterization of autoagglutination activity by Campylobacter jejuni.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6168-6175 (2000).</li>
<li>Sherlock, O., Schembri, M. A., Reisner, A., Klemm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+roles+for+the+AIDA+adhesin+from+diarrheagenic+Escherichia+coli%3A+cell+aggregation+and+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Novel roles for the AIDA adhesin from diarrheagenic Escherichia coli: cell aggregation and biofilm formation.</a> Journal of Bacteriology. 186 (23), 8058-8065 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry.</a> Nature Reviews Methods Primers. 2, 87(2022).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+characteristics+of+lactic+acid+bacteria+and+the+expanding+applications+in+food+industry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Metabolism characteristics of lactic acid bacteria and the expanding applications in food industry.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 612285(2021).</li>
<li>Turroni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dialogue+between+the+human+gut+microbiota+and+the+host%3A+a+Lactobacillus+and+Bifidobacterium+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular dialogue between the human gut microbiota and the host: a Lactobacillus and Bifidobacterium perspective.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 183-203 (2014).</li>
<li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W. Jr, Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageStream+System%3A+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochemica+et+Cytobiologica%22%5BJournal%5D)">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochemica et Cytobiologica. 45, 279-290 (2007).</li>
<li>Dashkova, V., Malashenkov, D., Poulton, N., Vorobjev, I., Barteneva, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry+for+phytoplankton+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry for phytoplankton analysis.</a> Methods. 112, 188-200 (2017).</li>
<li>Maan, H., Gilhar, O., Porat, Z., Kolodkin-Gal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+colonization+of+arabidopsis+thaliana+roots+induces+multiple+biosynthetic+clusters+for+antibiotic+production%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis colonization of arabidopsis thaliana roots induces multiple biosynthetic clusters for antibiotic production.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 722778(2021).</li>
<li>Maan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry+reveals+a+dual+role+for+exopolysaccharides+in+biofilms%3A+To+promote+self-adhesion+while+repelling+non-self-community+members%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry reveals a dual role for exopolysaccharides in biofilms: To promote self-adhesion while repelling non-self-community members.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 15-25 (2022).</li>
<li>Konieczny, M., Rhein, P., Czaczyk, K., Bialas, W., Juzwa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry+to+study+biofilm-associated+microbial+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry to study biofilm-associated microbial aggregates.</a> Molecules. 26 (23), 7096(2021).</li>
<li>Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attached+biofilms+and+suspended+aggregates+are+distinct+microbial+lifestyles+emanating+from+differing+hydraulics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics.</a> Nature Microbiology. 1, 16178(2016).</li>
</ol>

Cytometria przepływowa jest szeroko stosowaną metodą ilościowego określania intensywności fluorescencji w komórkach eukariotycznych, ale może nie zapewniać dokładnych pomiarów dla komórek bakteryjnych ze względu na ich większy rozmiar lub małe agregaty. Czynniki te mogą mieć znaczący wpływ na precyzyjną kwantyfikację autoagregacji i podstawowy poziom tworzenia agregatów w różnych warunkach. Aby rozwiązać ten problem, zastosowano obrazową cytometrię przepływową (IFC), aby uzyskać lepszą rozdzielczość wpływu węglowodanów n...

Autoagregacja bakterii jest uważana za podstawowy etap tworzenia biofilmu. W tym procesie (czasami nazywanym również autoaglutynacją lub flokulacją) bakterie tego samego typu tworzą wielokomórkowe grudki, które ostatecznie osiadają na dnie probówek hodowlanych lub przyczepiają się do docelowej tkanki lub powierzchni1.
Autoagregacja jest powszechnie obserwowanym zjawiskiem i do tej pory wykazano je w patogenach Gram-ujemnych, takich jak oportunistyczny patogen Acinetobacter baumannii2, patogen stomatologiczny Aggregobacter actinomycetemcomitans3, oraz pojawiający się patogen Burkholderia pseudomallei4. Autoagregacja została również opisana w kilku probiotycznych szczepach Gram-dodatnich 5,6,7,8. U Lactobacillus (L.) acidophilus autoagregacja była częściowo pośredniczona przez białka warstwy S i korelowała z adhezją do xylan7. Podobnie znaleźliśmy korelację między zależną od glukozy autoagregacją a indukcją właściwości adhezyjnych (ocenianych na podstawie adhezji do mucyny) gatunków probiotycznych Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei i Lactiplantibacillus plantarum5. Zwiększona autoagregacja najprawdopodobniej odzwierciedlała zmiany w ekspresji adhezyn komórkowych w odpowiedzi na glukozę i jej katabolity9. Podczas gdy molekularne mechanizmy autoagregacji pozostają do ustalenia, wykazano, że proces ten zmienia fenotyp zagregowanych bakterii i nadaje im zwiększoną tolerancję na stresory środowiskowe1, a także zwiększoną czułość na cząsteczki quorum sensing10.
Do pomiaru autoagregacji użyto kilku podejść; jednym z eksperymentalnych podejść jest pozostawienie kultur statycznie w wąskich probówkach hodowlanych przez określony czas. Kultury kontrolne pozostają mętne, podczas gdy kultury autoagregacji osadzają się na dnie probówki. Bardziej ilościowe podejście mierzy autoagregację za pomocą testu sedymentacji lub osiadania11.
Cytometria przepływowa jest również coraz częściej stosowana w ostatnich latach do badania autoagregacji bakterii. Ta metoda jest odpowiednia do analizy cząstek o wielkości od około 0,5 do 1000 μm. Pojedyncza bakteria lub utworzone agregaty są zawieszone w płynie, podawane do strumienia i mogą być wykrywane jeden po drugim11. Rejestrowanie światła rozproszonego do przodu pozwala na pomiar względnej wielkości komórki lub agregatu. Jest stosunkowo szybki i prosty, ale nie jest w stanie wykryć kilku parametrów, takich jak rozmiar agregacji lub średnia liczba komórek w agregatach. W związku z tym podejście to może być uzupełniane mikroskopijnie, co pozwala na sprawdzenie większej liczby parametrów12. Tradycyjna mikroskopia jest jednak czasochłonna, a tym samym ogranicza liczbę badanych próbek i moc statystyczną analizy. Ogólnie rzecz biorąc, obrazowa cytometria przepływowa zapewnia kilka funkcji w porównaniu z tradycyjną cytometrią przepływową, takich jak jednoczesna analiza morfologii i fenotypu komórek, przeprowadzanie analizy opartej na obrazie, wykrywanie rzadkich zdarzeń i walidacja danych cytometrii przepływowej13. Zalety te zwiększają możliwości cytometrii przepływowej i ułatwiają bardziej szczegółowe badanie populacji komórek.
To badanie dostarcza cennego protokołu do obrazowania cytometrii przepływowej w celu monitorowania autoagregacji u bakterii kwasu mlekowego (LAB). Te pałeczki Gram-dodatnie są fakultatywnymi beztlenowcami i należą do grupy LAB. Te wydajne fermentatory glukozy wytwarzają kwas mlekowy jako główny produkt końcowy metabolizmu węglowodanów14. Bakterie te są korzystnymi podstawowymi członkami mikrobiomu i naturalnie występują w przewodzie pokarmowym (GIT) ludzi i zwierząt, a także w drogach moczowo-płciowych samic15. W związku z tym dokładna charakterystyka ich właściwości autoagregacji ma duże znaczenie biotechnologiczne i kliniczne.
Nasze poprzednie odkrycia wskazywały, że podstawowy poziom autoagregacji różni się między różnymi szczepami probiotycznymi. Na tę niejednorodność mają wpływ różne węglowodany używane jako źródło węgla5. Aby przezwyciężyć tę fundamentalną właściwość bakterii probiotycznych, monitorowano wpływ węglowodanów z diety na autoagregację na poziomie pojedynczej komórki za pomocą IFC. To podejście oparte na IFC łączy moc i szybkość tradycyjnych cytometrów przepływowych z rozdzielczością mikroskopu. W związku z tym umożliwia wykonywanie złożonych pomiarów morfometrycznych o dużej szybkości w fenotypowo zdefiniowany sposób16,17. Podejście to można rozszerzyć na inne bakterie probiotyczne i chorobotwórcze, w połączeniu z fluorescencyjnymi reporterami w celu monitorowania ekspresji genów oraz szczepami znakowanymi fluorescencyjnie w celu monitorowania obecności i liczebności określonych gatunków bakterii w heterogenicznych agregatach.

<table><tbody><tr><td>14 ml probówki</td><td>hodowlane Falcon</td><td>352051</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówka wirówkowa</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Baeton, Dickinson and Company</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Typowy bulion sojowy</td><td>Baeton, Dickinson and Company</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-rafinoza pentahydrat</td><td>Sigma</td><td>83400-25G</td><td></td></tr><tr><td>Difco Lactobacilli MRS bulion</td><td>Baeton,Dickinson and Company</td><td>288130</td><td></td></tr><tr><td>EASY-LOCK MICROPR. 1,5 ml (Eppendorf)</td><td>FL medical</td><td>23053</td><td></td></tr><tr><td>IDEAS Oprogramowanie</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>&nbsp; Szczegóły dostępne na stronie: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1</td></tr><tr><td>ImageStream X Mark II</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>&nbsp; Szczegóły dostępne pod adresem: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>MOPS, kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy</td><td>Odczynniki Fisher</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Fisher Scientific, 174,18 g/mol</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma, 136,09 g/mol</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowa cytometria przepływowa do badania autoagregacji drobnoustrojów

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

Pożyteczne i probiotyczne bakterie odgrywają istotną rolę w swoich gospodarzach, zapewniając różne korzyści zdrowotne, w tym odporność na choroby zakaźne. Rodzina Lactobacillaceae składa się z bakterii Gram-dodatnich o potwierdzonych właściwościach probiotycznych. W badaniu wykorzystano gatunki Lactobacillaceae jako model w celu wykazania skuteczności wysokoprzepustowej analizy pojedynczej komórki w badaniu agregacji komórek. Nacisk kładziony jest na analizę reakcji tych pożytecznych gatunków na węglowodany proste z diety.
Badanie pokazuje, jak obrazowanie cytometrii przepływowej (IFC) może przezwyciężyć fundamentalne różnice w tworzeniu bakterii probiotycznych w obecności i braku węglowodanów. IFC łączy moc i szybkość konwencjonalnej cytometrii przepływowej z rozdzielczością przestrzenną mikroskopii, umożliwiając wykonywanie złożonych pomiarów morfometrycznych o wysokiej szybkości w zdefiniowany fenotypowo sposób w bibliotece pożytecznych szczepów i warunków bakteryjnych. Protokół ten zapewnia wgląd w automatyczną agregację gatunków Lactobacillaceae i rzuca światło na ich reakcję na węglowodany w diecie, przyczyniając się do zrozumienia mechanizmów stojących za korzystnym działaniem tych bakterii probiotycznych.

Wyniki dowodzą, że metoda ta pozwala na łatwy pomiar różnic w autoagregacji w odpowiedzi na cukry zawarte w diecie bakterii LAB. Dzięki oddzieleniu pojedynczych komórek od agregatów, metoda ta umożliwia obliczenie procentowego udziału zdarzeń agregacyjnych w całej populacji w odpowiedzi na fermentowalne lub niefermentowalne cukry z diety. Dodatkowo możliwe było zmierzenie, czy istnieją różnice w średniej wielkości populacji agregatów pomiędzy poszczególnymi wariantami doświadczalnymi.
Reprezen...

Ten protokół opisuje ilościowe podejście do pomiaru autoagregacji drobnoustrojów za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej.

Obrazowa cytometria przepływowa do badania autoagregacji drobnoustrojów

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...

W badaniu wykorzystano gatunki Lactobacillaceae jako model w celu wykazania skuteczności obrazowej analizy cytometrii przepływowej w badaniu autoagregacji drobnoustrojów. Nacisk położono na analizę reakcji autoagregacji gatunków Lactobacillaceae na węglowodany proste z diety. Najczęściej stosowanymi metodami pomiaru autoagregacji są spektrofotometria, która mierzy zawiesinę drobnoustrojów, zmętnienie lub gęstość optyczną, oraz tradycyjne techniki mikroskopowe, takie jak jasne pole, kontrast fazowy i mikroskopia fluorescencyjna.Mówiąc o obrazowaniu o wysokiej przepustowości, jednym z głównych wyzwań eksperymentalnych jest segmentacja pojedynczych zdarzeń. W tym protokole jest to pojedynczy agregat. Obrazowa cytometria przepływowa elegancko radzi sobie z tym wyzwaniem i daje naukowcom potężne narzędzie do badania autoagregacji.Zacznij od zaszczepienia pięciu mililitrów bulionu Lactobacilli MRS pojedynczą kolonią szczepu Lactobacillaceae. Inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza w warunkach statycznych przez noc. Rozcieńczyć kulturę komórkową w stosunku 1 do 100 w trzech mililitrach 50% wzbogaconego bulionu sojowego tryptycznego.Wiruj kulturę i inkubuj ją. Następnie odwróć probów

imaging-flow-cytometry-to-study-microbial-autoaggregation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym artykule opisujemy metodę wykorzystującą multispektralną przepływową cytometrię obrazową do ilościowego oznaczenia internalizacji nanocząstek polianhydrydowych lub bakterii przez komórki RAW 264.7.

Analiza internalizacji komórkowej nanocząsteczek i bakterii przy użyciu wielospektralnej obrazującej cytometrii przepływowej

Source: Barbero, A. M., et al. Fluorescence Assays for the Study of Mycobacterium tuberculosis Interaction with the Immune Receptor SLAMF1. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates the procedure for labeling host immune receptors that bind bacterial surface antigens, enabling their detection through flow cytometry.

Analysis of Macrophage Receptor Interactions with Pathogenic Bacteria Using Flow Cytometry

Prezentujemy metody badania wpływu PSM i innych toksyn wydzielanych przez Staphylococcus aureus na neutrofile za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej.

Badanie oddziaływań Staphylococcus aureus z neutrofilami za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii poklatkowej

Ta metoda demonstruje technikę oceny funkcji granulocytów poprzez jednoczesny pomiar fagocytozy bakterii i wybuchu oksydacyjnego. Cytometria przepływowa oparta na obrazie pozwoliła na zidentyfikowanie trzech odrębnych podzbiorów aktywowanych granulocytów, z których każdy różnił się względną zdolnością funkcjonalną.

Technika cytometrii przepływowej opartej na obrazie do oceny zmian w funkcji granulocytów in vitro

Cytometria przepływowa w połączeniu z wizualnym grupowaniem oferuje łatwą w użyciu i szybką metodę badania biofilmów wodnych. Może być stosowany do charakteryzowania biofilmu, wykrywania zmian w strukturze zbiorowiska biofilmu oraz wykrywania cząstek abiotycznych osadzonych w biofilmie.

Charakterystyka biofilmów wodnych za pomocą cytometrii przepływowej

Analiza cytometryczna przepływu okazała się przydatna do badania czystych kultur i monitorowania dynamiki społeczności mikroorganizmów. Przedstawiamy trzy kompleksowe przepływy pracy, od próbkowania po analizę danych, dla czystych kultur i złożonych społeczności, odpowiednio w przezroczystym podłożu, jak i w trudnych matrycach.

Charakterystyka dynamiki mikrobiomu – przepływy pracy oparte na cytometrii przepływowej od czystych kultur do naturalnych społeczności

Krzywe przełomu (BTC) są skutecznymi narzędziami do badania transportu bakterii w porowatych mediach. Tutaj przedstawiamy narzędzia oparte na urządzeniach fluidycznych w połączeniu z mikroskopią i zliczaniem metodą cytometrii przepływowej w celu uzyskania BTC.

Połączenie urządzeń fluidycznych z mikroskopią i cytometrią przepływową w celu badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych w skalach przestrzennych

Celem tego protokołu jest ilościowe określenie wiązania eukariotycznego patogenu ludzkiego norowirusa z bakteriami. Po wykonaniu wstępnego testu przyłączenia wirusa-bakterii, cytometria przepływowa jest stosowana do wykrywania bakterii związanych z wirusem w populacji.

Ilościowe określanie cząstek wirusopodobnych do ludzkiego norowirusa wiążących się z bakteriami komensalnymi za pomocą cytometrii przepływowej

Izolacja komórek z wypreparowanych implantów i ich charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej może znacząco przyczynić się do zrozumienia wzorca odpowiedzi immunologicznej przeciwko implantom. W pracy opisano dokładną metodę izolacji komórek z wypreparowanych implantów i ich barwienia do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Wysokowymiarowa cytometria przepływowa do analizy funkcji immunologicznej wypreparowanych tkanek implantów

Syntetyczne podłoże do mukowiscydozy (SCFM2) może być używane w połączeniu zarówno z konfokalną laserową mikroskopią skaningową, jak i aktywowanym fluorescencją sortowaniem komórek, aby obserwować agregaty bakteryjne w wysokiej rozdzielczości. W tym artykule szczegółowo opisano metody oceny zagregowanych populacji podczas leczenia przeciwdrobnoustrojowego jako platformę dla przyszłych badań.

Narzędzia do oceny w czasie rzeczywistym modelu zakażenia Pseudomonas aeruginosa

Poznaj obrazową cytometrię przepływową do badania autoagregacji drobnoustrojów Lactobacillaceae. Ta metoda pozwala analizować wpływ węglowodanów pokarmowych na zachowanie bakterii w wysokiej przepustowości.

Obrazowa cytometria przepływowa do badania autoagregacji drobnoustrojów

Przeglądaj więcej filmów