Name: W Planta Ekspresja genów i edycja genów w liściach bambusa Moso (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Poznaj metodę ekspresji i edycji genów in planta w liściach bambusa Moso z wykorzystaniem Agrobacterium. Technika ta przyspiesza weryfikację funkcji genetycznych w badaniach nad hodowlą bambusa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Narodowemu Programowi Badań i Rozwoju Chin (Grant nr 2021YFD2200502), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 31971736) za wsparcie finansowe.

1. Przygotowanie sadzonek bambusa
<ol>
	<li>Przygotuj sadzonki bambusa moso (Phyllostachys edulis) z nasion zebranych w Guilin, Guangxi, Chiny. Zacznij od namoczenia nasion w wodzie przez 2-3 dni, pamiętając o codziennej wymianie wody. Następnie utwórz podłoże, mieszając glebę i wermikulit w stosunku 3:1.</li>
	<li>Zasiej namoczone nasiona do podłoża w celu kiełkowania. Utrzymywać siewki w warunkach laboratoryjnych, utrzymując temperaturę w zakresie 18-25 °C. Zapewnić 16 godzin światła/8 godzin ciemnego fotoperiodu o natężeniu światła 250-350 μmol/m2/s w fazie światła.</li>
	<li>Utrzymuj wilgotność względną na poziomie około 60%. W przypadku zakażenia Agrobacterium należy używać sadzonek, które mają 15 dni i wysokość 2-10 cm, co jest najlepszym etapem transformacji. 
	UWAGA: Ponieważ kwitnienie bambusa jest nieprzewidywalne, nasiona nie są dostępne co roku. Nasiona są zwykle przechowywane przez 2-3 lata w temperaturze 4 °C w suchym środowisku i mogą nadal utrzymywać żywotność na poziomie ponad 20%.</li>
</ol>
2. Przygotowanie plazmidów i Agrobacterium
<ol>
	<li>Plazmidy: Aby zweryfikować efekt ekspresji przejściowej, należy zastosować konstrukt pHDE-35S::RUBY zawierający widoczny gen reporterowy sterowany przez promotor CaMV 35S10. Do edycji genów użyj konstruktu pCambia1300-Ubi::Cas9, który przenosi gen Cas9 sterowany przez promotor Ubi kukurydzy 11. Wstaw sekwencje prowadzące sgRNA PeVDE i innych docelowych genów między dwoma miejscami AarI w pCambia1300-Ubi::Cas9 construct9.</li>
	<li>Wstaw sekwencje RNA przewodnika CRISPR/Cas9 między dwoma miejscami endonukleazy restrykcyjnej AarI konstruktu pCambia1300-Ubi::Cas9, w tym genami docelowymi PeVDE i PeCCR5.</li>
	<li>Dodaj GGCA do końca 5' sekwencji 20-nukleotydowej i zsyntetyzuj jednoniciową sekwencję DNA. Odwróć dopełnienie sekwencji 20-nukleotydowej i dodaj AAAC do końca 5', a następnie zsyntetyzuj kolejną jednoniciową sekwencję DNA.</li>
	<li>Rozcieńczyć obie jednoniciowe sekwencje DNA do stężenia 10 nM/l w rozcieńczonej wodzie, dokładnie wymieszać i ogrzewać w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Pozostawić mieszaninę do ostygnięcia do temperatury pokojowej, co spowoduje powstanie dwuniciowych łączników.</li>
	<li>Połącz adaptery z liniowym fragmentem pCambia1300-Ubi::Cas9 trawionym przez endonukleazę AarI przy użyciu ligazy DNA T4 i sekwencjonuj skonstruowany wektor CRISPR/Cas9, aby uzyskać pożądany konstrukt ukierunkowany na gen.</li>
	<li>Aby przekształcić plazmidy w Agrobacterium, należy zastosować metodę zamrażania i rozmrażania w następujący sposób: Wymieszaj 1 μl plazmidów (stężenie: 10 - 1 000 ng/μL) ze 100 μl komórek kompetentnych dla Agrobacterium (wydajność translacji: > 1 x 104 jednostki tworzące kolonie/μg) i delikatnie je wymieszaj. Umieść mieszaninę na lodzie na 5 minut. Przenieść mieszaninę do ciekłego azotu na 5 minut.</li>
	<li>Rozmrażać mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dodać 500 μl pożywki Luria-Bertani (LB) do mieszaniny i inkubować ją w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 28 °C przy 200 obr./min przez 2-3 godziny. W przypadku plazmidów pHDE-35S::RUBY wprowadź je pojedynczo do szczepów AGL1, GV3101, LBA4044 i EHA105 Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens)12. W przypadku plazmidów CRISPR/Cas9 wprowadź je do szczepu GV3101 A. tumefaciens.</li>
	<li>Hodować Agrobacterium w pożywce z peptonu z ekstraktem drożdżowym (YEP) (10 g ekstraktu z wołowiny, 10 g ekstraktu drożdżowego i 5 g NaCl na L) z odpowiednimi antybiotykami (spektynomycyna dla 35S::RUBY i kanamycyna dla CRISPR/Cas9) w temperaturze 28 °C. Pojedyncze rodziny obserwowano po 36-48 godzinach od uprawy.</li>
	<li>Zbierz i przenieś kolonie do płynnej pożywki YEP (z odpowiednimi antybiotykami) w celu dalszego wzrostu. Po 24-36 godzinach użyj starterów RUBY-F i RUBY-R (Tabela 1) do wykonania PCR w celu potwierdzenia pomyślnego przeniesienia plazmidów do Agrobacterium.</li>
	<li>Przenieść 1 ml pomyślnie przekształconego Agrobacterium do 100 ml świeżej płynnej pożywki YEP (z odpowiednimi antybiotykami), a następnie rosnąć przez noc w temperaturze 28 °C do OD600 0,8.</li>
	<li>Zawiesinę bakteryjną odwirować w stężeniu 4 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, przepłukać osad bakteryjny raz pożywką do infiltracji zawiesin (10 mM MgCl2 i 10 mM MES-KOH [pH 5,6]), a następnie ponownie odwirować. Zawiesić osad bakteryjny w podłożu infiltracyjnym zawiesiny do OD600 0,6 w celu przemiany bambusa.</li>
</ol>
3. Agrobacterium -pośredniczy w systemie transformacji planta
<ol>
	<li>Przygotuj się do transformacji; ostrożnie usuń sadzonki z korzeniami przyczepionymi do gleby z podłoża, upewniając się, że korzenie pozostają nienaruszone. Owiń sadzonki folią aluminiową, aby utrzymać wilgoć i zapobiec oderwaniu gleby (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Przenieś owinięte sadzonki do środowiska o wyższej wilgotności (wilgotność względna powietrza >90%) i niższym oświetleniu (intensywność mniejsza niż 50 μmol/m2/s) przez 2 godziny.</li>
	<li>Za pomocą ostrej igły ze strzykawki nawiń górną część zwiniętych niedojrzałych liści (około 1-2 cm od góry) sadzonek bambusa raz lub dwa razy (jak wskazują czerwone trójkąty w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Następnie zanurz zranioną górną część sadzonek w zawiesinach Agrobacterium. Cały proces, od zranienia do zanurzenia w Agrobacterium, należy szybko przeprowadzić, ponieważ świeża rana zwiększy skuteczność inokulacji.</li>
	<li>Natychmiast przenieś sadzonki do komory próżniowej o ciśnieniu 25-27 mmHg na 2 minuty (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Po odkurzeniu ostrożnie rozpakuj sadzonki i przesadź je do podłoża. Sadzonki należy umieścić w słabym świetle lub ciemności (<50 μmol/m2/s) o wysokiej wilgotności (RH>90%) w temperaturze pokojowej (18-25 °C) na 2 dni. Następnie hoduj sadzonki w normalnych warunkach wzrostu, podlewając je co 5-7 dni. Obserwuj ich fenotypy, aby dostarczyć materiału do kolejnych eksperymentów.</li>
</ol>
4. Projektowanie jednoprzewodnikowych RNA (sgRNA) do edycji genów
<ol>
	<li>Zidentyfikuj miejsce motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM) znajdujące się w pobliżu określonej i konserwatywnej domeny docelowej sekwencji genu. Upewnij się, że określona sekwencja PAM to NGG w tym systemie CRISPR/Cas9. Sprawdź swoistość wybranej sekwencji w miejscu docelowym, przeprowadzając wyszukiwanie BlastN w bazie danych genomu bambusa. Upewnij się, że sgRNA jest unikalny, szczególnie w regionie upstream i blisko PAM9,11. 
	UWAGA: To porównanie skutecznie zmniejszy potencjalne miejsca poza celem w genomie, na które wpływa proces edycji genów.</li>
	<li>Zaprojektuj dwa sgRNA (sgRNA-1 i sgRNA-2) na pierwszym eksonie genu PeVDE 13. Uwzględnij miejsca ograniczenia wiekuI przed PAM w sgRNA-1 i miejsca restrykcyjne XbaI przed PAM w sgRNA-2. Zaprojektuj jedno sgRNA na czwartym eksonie genu PeCCR5, który koduje konserwatywny motyw KNWYCYGK. Ten motyw ma kluczowe znaczenie dla katalizy CCRs14.</li>
	<li>Zaprojektuj sekwencję dystansową 20 nukleotydów przylegającą do miejsca PAM. Ta sekwencja dystansowa poprowadzi enzym Cas9 do miejsca docelowego w celu rozszczepienia DNA i późniejszej edycji genów. 
	UWAGA: Wskazane jest wybranie regionu docelowego przed miejscem rozszczepienia enzymu endonukleazy w miejscu PAM. Ułatwi to walidację efektywności edycji genów.</li>
</ol>
5. Projekt startera i PCR
<ol>
	<li>Ręczne projektowanie specjalnych starterów do amplifikacji fragmentów PeVDE i PeCCR5. Startery przed i za nimi należy zaprojektować tak, aby znajdowały się co najmniej 100 pz poza miejscem docelowym, z różnicą długości ponad 100 pz, aby umożliwić wyraźną separację pasm podczas elektroforezy. Zaprojektuj startery do amplifikacji RUBY w ciągu pierwszych 500 pz genu. Wykaz wszystkich użytych starterów znajduje się w tabeli 1.</li>
	<li>Użyj polimerazy DNA o wysokiej wierności do PCR. W takim przypadku wykorzystaj polimerazę DNA o wysokiej wierności i wydajnej amplifikacji w klonowaniu genów.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR w następujący sposób: 5x bufor (Mg2+ Plus): 4 μL; mieszanina dNTP (po 2,5 mM): 1,6 μL; Startery do przodu i do tyłu (po 10 pmol): po 1 μL; DNA genomu bambusa (około 50 ng); Polimeraza DNA (2,5 U/μL): 0,2 μL; Rozcieńczyć wodę do całkowitej objętości 20 μl.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z warunkami pracy PCR: wstępna denaturacja w temperaturze 98 °C przez 5 minut; denaturacja w temperaturze 98 °C przez 10 s; Wyżarzanie w temperaturze 56 °C przez 5 s; Przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 30 s; Powtórz denaturację do wydłużenia przez 32 cykle; Końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 min; Utrzymywać w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony. 
	UWAGA: Warunki PCR są podane jako przykład i mogą wymagać optymalizacji pod kątem określonych zastosowań lub celów.</li>
</ol>
6. Ekstrakcja DNA, trawienie enzymów endonukleazy i sekwencjonowanie
<ol>
	<li>Oddziel obszar o niższych wartościach NPQ od świeżych blaszek liściowych bambusa za pomocą nożyczek, zgodnie z identyfikacją fluorometru obrazowania PAM (patrz krok 7.4). Próbki liści należy zamrozić ciekłym azotem i przenieść zamrożone próbki liści do moździerza. Zmiel próbki na drobny proszek za pomocą tłuczka, dodając wystarczającą ilość ciekłego azotu podczas procesu mielenia. Ten krok pomaga w uwalnianiu zawartości komórkowej, w tym DNA.</li>
	<li>Ekstrahować genomowe DNA ze sproszkowanego liścia przy użyciu metody bromku amonu cetyltrimetyloamoniowego (CTAB). Dodać 50 mg próbek proszku z liści do 800 μl 2% roztworu CCAB. Dokładnie wymieszać próbkę i inkubować w temperaturze 65 °C przez 30 minut, delikatnie wstrząsając co 5 minut.</li>
	<li>Dodać równą objętość chloroformu/alkoholu izoamylowego (24:1, v/v) i energicznie wstrząsnąć mieszaniną. Po odwirowaniu w stężeniu 8 000 g przez 8 minut, przenieść supernatant do nowej probówki.</li>
	<li>Dodać równą objętość chloroformu/alkoholu izoamylowego i powtórzyć krok 6.3. Dodać równą objętość lodowatego izopropanolu i kilkakrotnie odwrócić probówkę przed umieszczeniem jej w temperaturze -20 °C na 30 minut. Po odwirowaniu przy 8 000 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant.</li>
	<li>Przemyć osad DNA 2x 75% etanolem w temperaturze 4 °C, a następnie rozpuścić w 50 μl wody.</li>
	<li>Amplifikować genomowe DNA zawierające miejsce docelowe genów zarówno z liści bambusa typu dzikiego, jak i zakażonych Agrobacterium, za pomocą protokołu opisanego w kroku 5.4.</li>
	<li>Przeprowadzić trawienie enzymatyczne endonukleazy produktów PCR. Wybierz konkretny enzym, który rozpoznaje pożądane miejsca restrykcyjne w amplifikowanych fragmentach DNA. Do trawienia używaj endonukleaz wiekuI i XbaI.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną składającą się z AgeI lub XbaI (20 jednostek/μL)-1 μL, 1 μg produktów PCR, 10x buforu - 5 μL, i dodać wodę do całkowitej objętości 50 μL. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przeanalizuj proporcję strawionych fragmentów DNA za pomocą elektroforezy żelowej. Porównaj strawione fragmenty z próbek typu dzikiego i zakażonych Agrobacterium, aby ocenić skuteczność edycji genów.</li>
	<li>Oznacz sekwencje adaptera transpozazy TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG i GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG do końca 5' starterów do przodu i do tyłu, odpowiednio, w celu amplifikacji fragmentów PeVDE i PeCCR59,15. Użyj protokołu opisanego w kroku 5.4 w celu wzmocnienia. Przygotuj produkty PCR (przed trawieniem) do głębokiego sekwencjonowania.</li>
</ol>
7. Pomiar fluorescencji chlorofilu wartości NPQ w liściach
<ol>
	<li>Przed pomiarami należy wystawić sadzonki bambusa na działanie warunków dużego natężenia światła 1200 μmol/m2/s przez 2 godziny. Ekspozycja ta zwiększa ilość pochłoniętego kwantu światła i aktywuje system fotoprotekcji w liściach.</li>
	<li>Użyj fluorometru obrazowania PAM, aby zmierzyć fluorescencję chlorofilu PS II in vivo liści bambusa. Ustaw natężenie światła aktynicznego na 800 μmol/m2/s dla 6 minut pomiarów fluorescencji. W tym okresie należy stosować impuls nasycający co 30 s, aby uzyskać krzywe fluorescencji chlorofilu. Stabilne wartości krzywych zostaną użyte do obliczeń13.</li>
	<li>Obliczyć hartowanie niefotochemiczne (NPQ) za pomocą wzoru: 
	NPQ = (Fm - Fm') / Fm' 
	gdzie Fm oznacza maksymalną fluorescencję w stanie przystosowanym do ciemności, a Fm' oznacza maksymalną fluorescencję w dowolnym stanie przystosowanym do światła.</li>
	<li>Monitoruj wartości NPQ za pomocą interfejsu wizualnego oprogramowania do obrazowania. Oprogramowanie umożliwia analizę w czasie rzeczywistym i wyświetlanie danych fluorescencji, w tym wartości NPQ.</li>
</ol>

Developing Gene Transformation and Editing Methods in Bamboo

<ol><li>Jiang, Z. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJiang%2C+ZH+%22World+Bamboo+and+Rattan+%28in+Chinese%29%22">World Bamboo and Rattan (in Chinese)</a>. , Liaoning Science and Technology Publishing House. Shenyang, China. (2002).</li>
<li>Ye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+plant+regeneration+and+transformation+system+of+ma+bamboo+%28Dendrocalamus+latiflorus+Munro%29+started+from+young+shoot+as+explant%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">An efficient plant regeneration and transformation system of ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) started from young shoot as explant.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 1298(2017).</li>
<li>Ye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+CRISPR%2FCas9+mediated+genome+editing+and+its+application+in+manipulating+plant+height+in+the+first+generation+of+hexaploid+Ma+bamboo+%28Dendrocalamus+latiflorus+Munro%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Robust CRISPR/Cas9 mediated genome editing and its application in manipulating plant height in the first generation of hexaploid Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro).</a> Plant Biotechnology Journal. 18 (7), 1501-1503 (2020).</li>
<li>Xiang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+purple+Ma+bamboo+%28Dendrocalamus+latiflorus+Munro%29+with+enhanced+drought+and+cold+stress+tolerance+by+engineering+anthocyanin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Production of purple Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) with enhanced drought and cold stress tolerance by engineering anthocyanin biosynthesis.</a> Planta. 254 (3), 50(2021).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+genetic+transformation+and+CRISPR%2FCas9-based+genome+editing+system+for+moso+bamboo+%28Phyllostachys+edulis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">An efficient genetic transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing system for moso bamboo (Phyllostachys edulis).</a> Frontiers in Plant Science. 13, 822022(2022).</li>
<li>Lee, M. W., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+assay+by+agroinfiltration+of+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transient expression assay by agroinfiltration of leaves.</a> Methods in Molecular Biology. 323, 225-229 (2006).</li>
<li>Canto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+systems+in+plants%3A+potentialities+and+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Transient expression systems in plants: potentialities and constraints.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+production+and+expedient+screening+of+CRISPR%2FCas9-mediated+non-transgenic+mutant+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulture+Research%22%5BJournal%5D)">A method for the production and expedient screening of CRISPR/Cas9-mediated non-transgenic mutant plants.</a> Horticulture Research. 5, 13(2018).</li>
<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+biotechnology+for+in-planta+gene+editing+and+its+application+in+promoting+flavonoid+biosynthesis+in+bamboo+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A new biotechnology for in-planta gene editing and its application in promoting flavonoid biosynthesis in bamboo leaves.</a> Plant Methods. 19 (1), 20(2023).</li>
<li>He, Y., Zhang, T., Sun, H., Zhan, H., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reporter+for+noninvasively+monitoring+gene+expression+and+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulture+Research%22%5BJournal%5D)">A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation.</a> Horticulture Research. 7 (1), 152(2020).</li>
<li>Wang, C., Shen, L., Fu, Y., Yan, C., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+CRISPR%2FCas9+system+for+multiplex+genome+editing+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">A simple CRISPR/Cas9 system for multiplex genome editing in rice.</a> Journal of Genetics and Genomics. 42 (12), 703-706 (2015).</li>
<li>McCormick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leaf+disc+transformation+of+cultivated+tomato+%28L.+esculentum%29+using+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Leaf disc transformation of cultivated tomato (L. esculentum) using Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Cell Reports. 5 (2), 81-84 (1986).</li>
<li>Lou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+violaxanthin+de-epoxidase+gene+from+moso+bamboo%2C+confers+photoprotection+ability+in+transgenic+Arabidopsis+under+high+light%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">a violaxanthin de-epoxidase gene from moso bamboo, confers photoprotection ability in transgenic Arabidopsis under high light.</a> Frontiers in Plant Science. 13, 927949(2022).</li>
<li>Zhou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cinnamoyl+CoA+reductases+involved+in+parallel+routes+to+lignin+in+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct cinnamoyl CoA reductases involved in parallel routes to lignin in Medicago truncatula.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17803-17808 (2010).</li>
<li>De Roeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleterious+ABCA7+mutations+and+transcript+rescue+mechanisms+in+early+onset+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Deleterious ABCA7 mutations and transcript rescue mechanisms in early onset Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica. 134 (3), 475-487 (2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Metoda ta znacznie skraca wymagany czas w porównaniu z tradycyjnymi metodami transformacji genetycznej, które zwykle trwają 1-2 lata, i pozwala osiągnąć przejściową ekspresję genów egzogennych i edycję genów endogennych w ciągu 5 dni. Jednak ta metoda ma ograniczenia, ponieważ może przekształcić tylko niewielką część komórek, a liście edytowane genami są chimeryczne i nie mają zdolności do regeneracji w kompletne rośliny. Niemniej jednak, ta technologia ekspresji genów i edycji genów w roślinie zapewnia potężne ...

Badanie funkcji genów w bambusie jest bardzo obiecujące dla zaawansowanego zrozumienia bambusa i uwolnienia jego potencjału do modyfikacji genetycznych. Skuteczny sposób na to można osiągnąć poprzez proces infekcji liści bambusa, w którym pośredniczy Agrobacterium, w którym fragment T-DNA zawierający egzogenne geny jest wprowadzany do komórek, co następnie prowadzi do ekspresji genów w komórkach liścia.
jest cennym i odnawialnym zasobem o szerokim zakresie zastosowań w produkcji, sztuce i badaniach. posiada doskonałe właściwości drewna, takie jak wysoka wytrzymałość mechaniczna, wytrzymałość, umiarkowana sztywność i elastyczność1, który jest obecnie szeroko stosowany w różnych artykułach gospodarstwa domowego i przemysłowego, w tym szczoteczkach do zębów, słomkach, guzikach, jednorazowej zastawie stołowej, podziemnych rurociągach i wypełniaczach chłodni kominowych do wytwarzania energii cieplnej. Dlatego hodowla bambusa odgrywa kluczową rolę w uzyskiwaniu odmian bambusa o doskonałych właściwościach drewna w celu zastąpienia tworzyw sztucznych i zmniejszenia zużycia plastiku, ochrony środowiska i przeciwdziałania zmianom klimatycznym, a także generowania znacznej wartości ekonomicznej.
Jednak tradycyjna hodowla bambusa napotyka wyzwania ze względu na długą fazę wzrostu wegetatywnego i niepewny okres kwitnienia. Chociaż techniki hodowli molekularnej zostały opracowane i zastosowane w hodowli bambusa, proces transformacji genów bambusa jest czasochłonny, pracochłonny i skomplikowany ze względu na procesy indukcji i regeneracji kalusa2,3,4,5. Stabilna transformacja genetyczna często wymaga metod za pośrednictwem Agrobacterium, które obejmują procesy hodowli tkankowej, takie jak indukcja i regeneracja kalusa. ma jednak niską zdolność do regeneracji kalusa, co znacznie ogranicza zastosowanie stabilnej transformacji genetycznej w bambusie. Po tym, jak Agrobacterium zainfekuje komórki roślinne, fragment T-DNA dostaje się do komórek roślinnych, przy czym większość fragmentów T-DNA pozostaje niezintegrowana w komórkach, co powoduje przejściową ekspresję. Tylko niewielka część fragmentów T-DNA losowo integruje się z chromosomem, prowadząc do stabilnej ekspresji. Przejściowe poziomy ekspresji pokazują krzywą akumulacji, która może się różnić dla każdego genu wyrażonego z T-DNA dostarczonego przez Agrobacterium. W większości przypadków najwyższe poziomy ekspresji występują 3-4 dni po infiltracji i szybko spadają po 5-6 dniach6,7. Wcześniejsze badania wykazały, że ponad 1/3 mutacji w roślinach z edytowanymi genami uzyskanych bez presji selekcyjnej na odporność pochodzi z przejściowej ekspresji CRISPR/Cas9, podczas gdy pozostałe mniej niż 2/3 pochodzi ze stabilnej ekspresji po integracji DNA z genomem8. Wskazuje to, że integracja T-DNA z genomem rośliny nie jest konieczna do edycji genów. Co więcej, presja selekcyjna na odporność znacznie hamuje wzrost komórek nietransgenicznych, bezpośrednio wpływając na proces regeneracji zakażonych eksplantatów. W związku z tym, stosując przejściową ekspresję bez presji selekcyjnej na odporność w bambusie, możliwe jest osiągnięcie niezintegrowanej ekspresji genów egzogennych i badanie funkcji genów bezpośrednio w organach roślinnych. W związku z tym można opracować łatwą i oszczędzającą czas metodę egzogennej ekspresji genów i edycji w bamboo9.
Opracowana metoda egzogennej ekspresji genów i edycji genów charakteryzuje się prostotą, opłacalnością oraz brakiem drogiego sprzętu czy skomplikowanych procedur9. W tej metodzie endogenny gen deepoksydazy wiolaksantyny (PeVDE) bambusa został wykorzystany jako reporter do ekspresji egzogennego genu bez presji selekcyjnej. Dzieje się tak, ponieważ edytowany PeVDE w liściach bambusa zmniejsza zdolność fotoprotekcji w silnym świetle i wykazuje spadek wartości niefotochemicznego hartowania (NPQ), którą można wykryć za pomocą obrazowania fluorescencji chlorofilu. Aby zademonstrować skuteczność tej metody, inny endogenny gen bambusa, gen reduktazy cynamonoilo-CoA (PeCCR5)9, został znokautowany przy użyciu tego systemu i z powodzeniem wygenerował mutanty tego genu. Technika ta może być wykorzystana do funkcjonalnej charakterystyki genów, które pełnią funkcje w liściach bambusa. Poprzez nadekspresję tych genów przejściowo w liściach bambusa, ich poziom ekspresji może zostać zwiększony lub poprzez edycję genów, ich ekspresja może zostać zmniejszona, co pozwala na badanie dalszych poziomów ekspresji genów, fenotypów liści i zawartości produktu. Zapewnia to bardziej efektywne i wykonalne podejście do badań nad funkcjami genów w bambusie. Technikę tę można zastosować do funkcjonalnej charakterystyki genów funkcjonujących w liściach bambusa. Poprzez nadekspresję tych genów przejściowo w liściach bambusa, ich poziom ekspresji może zostać zwiększony lub poprzez edycję genów, ich ekspresja może zostać zmniejszona, co pozwala na badanie dalszych poziomów ekspresji genów, fenotypów liści i zawartości produktu. Ponadto ważne jest, aby zauważyć, że ze względu na rozległą poliploidyzację większość ważnych komercyjnie genów w genomach bambusa jest obecna w wielu kopiach, co skutkuje redundancją genetyczną. Stanowi to wyzwanie dla przeprowadzenia multipleksowej edycji genomu w bambusie. Przed zastosowaniem stabilnych technik transformacji genetycznej lub edycji genów kluczowe znaczenie ma szybka walidacja funkcji genów. Rozwiązując problem wielu kopii genów, jednym z podejść jest analiza profili ekspresji transkryptomu w celu zidentyfikowania genów, które są aktywnie wyrażane na określonych etapach. Co więcej, celowanie w konserwatywne domeny funkcjonalne tych kopii genów pozwala na projektowanie wspólnych sekwencji docelowych lub włączenie wielu miejsc docelowych do tego samego wektora CRISPR/Cas9, umożliwiając jednoczesny nokaut tych genów. Zapewnia to bardziej efektywne i wykonalne podejście do badań nad funkcjami genów w bambusie.

<table><tbody><tr><td>35S::RUBY</td><td>Addgene, Stany Zjednoczone</td><td>160908</td><td>Plamid construct</td></tr><tr><td>Agrobacterium kompetentne komórki GV3101, EHA105,LBA4404 i AGL1</td><td>Biomed, Chiny</td><td>BC304-01, BC303-01, BC301-01 i BC302-01</td><td>Do zakażenia Agrobacterium</td></tr><tr><td>CTAB</td><td>Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>57-09-0</td><td>Ekstrakcja DNA</td></tr><tr><td>Obrazowanie-PAM fluorometr</td><td>Walz, Effeltrich, Niemcy</td><td></td><td>Wykrywanie fluorescencji chlorofilu liści bambusa</td></tr><tr><td>ObrazowanieWin</td><td>Walz, Effeltrich, Niemcy</td><td></td><td>Oprogramowanie do obrazowania - PAM fluorometr</td></tr><tr><td>Paq CI lub Aar I</td><td>NEB, Stany Zjednoczone</td><td>R0745S</td><td>Włącz sekwencję docelową do wektora CRISPR/Cas9.</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA PrimeSTAR Max</td><td>Takara, Japonia</td><td>R045Q</td><td>Do klonowania genów</td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>NEB, Stany Zjednoczone</td><td>M0202V</td><td>Włącz sekwencję docelową do wektora CRISPR/Cas9.</td></tr></tbody></table>

w planta ekspresja genów i edycja genów w liściach bambusa moso

In Planta Gene Expression and Gene Editing in Moso Bamboo Leaves

Nowatorska metoda transformacji genów planta została opracowana dla bambusa, co pozwala uniknąć konieczności czasochłonnych i pracochłonnych procesów indukcji i regeneracji kalusa. Metoda ta polega na ekspresji genów za pośrednictwem Agrobacterium poprzez zranienie i podciśnienie w przypadku sadzonek bambusa. Udało się zademonstrować ekspresję genów egzogennych, takich jak gen reporterowy RUBY i gen Cas9, w liściach bambusa. Najwyższą efektywność przemiany dla akumulacji betalainy w siewkach RUBY osiągnięto przy użyciu szczepu GV3101, z odsetkiem 85,2% po zakażeniu. Chociaż obce DNA nie zintegrowało się z genomem bambusa, metoda była skuteczna w ekspresji genów egzogennych. Co więcej, przy użyciu tej metody opracowano również system edycji genów z natywnym reporterem, z którego powstaje mutant in situ wygenerowany przez edytowany gen de-epoksydazy wiolaksantyny bambusa (PeVDE) w liściach bambusa, ze wskaźnikiem mutacji 17,33%. Mutacja PeVDE spowodowała zmniejszenie wartości niefotochemicznego wygaszania (NPQ) w silnym świetle, co można dokładnie wykryć za pomocą fluorometru. To sprawia, że edytowany PeVDE jest potencjalnym natywnym reporterem zarówno dla egzogennych, jak i endogennych genów bambusa. W przypadku reportera PeVDE udało się edytować gen reduktazy cynamonoilo-CoA ze wskaźnikiem mutacji 8,3%. Operacja ta pozwala uniknąć procesu hodowli tkankowej lub indukcji kalusa, który jest szybki i skuteczny w ekspresji genów egzogennych i endogennej edycji genów w bambusie. Metoda ta może poprawić skuteczność weryfikacji funkcji genów i pomoże ujawnić mechanizmy molekularne kluczowych szlaków metabolicznych w bambusie.

Agrobacterium-pośrednia ekspresja genów in planta w liściach bambusa 
Wykazano, że gen reporterowy RUBY jest skuteczny w wizualizacji przejściowej ekspresji genów dzięki zdolności do produkcji intensywnie czerwonej betalainy z tyrozyny10. W niniejszym badaniu wykorzystano transformację za pośrednictwem Agrobacterium do przejściowej ekspresji egzogennego genu RUBY w liściach bambusa (Rysunek 1). W 3c...

W tym badaniu, w bambusie opracowano nowatorską metodę ekspresji genów planta i edycji genów, w której pośredniczy Agrobacterium. Metoda ta znacznie poprawiła skuteczność walidacji funkcji genów w bambusie, co ma znaczące implikacje dla przyspieszenia procesu hodowli bambusa.

W Planta Ekspresja genów i edycja genów w liściach bambusa Moso

A novel in planta gene transformation method was developed for bamboo, which avoids the need for time-consuming and labor-intensive callus induction and ...

W tym badaniu używamy go jako wektora do wprowadzenia obcych fragmentów DNA do liści bambusa. Większość fragmentów DNA nie jest zintegrowana z chromosomami i nie ma dobrej przeniesionej ekspresji. Podjęliśmy aktywację tej przeniesionej ekspresji, aby przeprowadzić edycję genów.Głównym wyzwaniem jest ograniczenie edycji genów liści bambusa, które nie mogą się regenerować. Stwarzają one trudności w przeprowadzaniu edycji w narządach regeneracyjnych, takich jak młode pędy, a możliwość dodania ławek to kolejne pokolenia z pożądanymi wyzwaniami genetycznymi. Główną zaletą jest oszczędność czasu.Dzięki możliwości edycji genów bambusa bezpośrednio w liściach bambusa, pozwala na szybką weryfikację frakcji genów. Eliminuje to konieczność stosowania czasochłonnych procedur, takich jak hodowla tkankowa lub transformacja, co znacznie przyspiesza badania nad infekcjami genów bambusa. Podstawowe badania będą skoncentrowane na zbadaniu molekularnego mechanizmu powstawania biomasy bambusowej.Będzie to wymagało zrozumienia, dlaczego rośnie szybko, i wykorzystania tej wiedzy do opracowania odmian bambusa, które nadają się do substytutu plastiku. Na początek wysiej wstępnie namoczone nasiona bambusa w podłoże z gleby i wermikulitu w celu kiełkowania. W przypadku infekcji agrobacterium ostrożnie usuń z podłoża 15-dniowe sadzonki z korzeniami przyczepionymi do gleby.Owiń sadzonki folią aluminiową, aby utrzymać wilgoć i zapobiec oderwaniu gleby. Przenieś owinięte sadzonki do komory wzrostu roślin o wyższej wilgotności i mniejszym oświetleniu na dwie godziny. Następnie, za pomocą ostrej igły z rany strzykawki, górna część zwiniętych niedojrzałych liści raz lub dwa razy.Szybko zanurz zranioną część liści w zawiesinie agrobacterium. Następnie natychmiast przenieś sadzonki do komory próżniowej o ciśnieniu od 25 do 27 milimetrów rtęci na dwie minuty. Po odkurzeniu ostrożnie rozpakuj sadzonki i przesadź je do podłoża.Pozwól sadzonkom rosnąć w komorze wzrostu roślin w słabym świetle, przy wysokiej wilgotności przez dwa dni. Następnie hoduj sadzonki w normalnych warunkach wzrostu, podlewając je co pięć do siedmiu dni. Zacznij od ekstrakcji genomowego DNA z liści bambusa zainfekowanych typem dzikim i agrobacterium.Amplifikować genomowe DNA zawierające miejsce docelowe genów docelowych z liści bambusa zakażonych typem dzikim i agrobacterium, stosując następujące warunki PCR. Po PCR przeprowadzić trawienie enzymu endonukleazy, przygotowując mieszaninę reakcyjną zawierającą jeden mikrolitr AGE1, jeden mikrogram produktów PCR i pięć mikrolitrów 10-krotnego buforu. Następnie dodaj wodę do końcowej objętości 50 mikrolitrów.Inkubować mieszaninę wytrawiającą w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Za pomocą elektroforezy żelowej przeanalizuj proporcję strawionych fragmentów DNA. Porównaj strawione fragmenty z próbek zakażonych typem dzikim i agrobacterium, aby ocenić skuteczność edycji genów.Wystaw sadzonki bambusa na warunki o dużym natężeniu światła, aby zwiększyć ilość pochłoniętego światła i aktywować system ochrony przed zdjęciem liści. Następnie włącz obrazowanie fluorymetru pam i ustaw natężenie światła aktynowego do pomiaru systemu fotograficznego in vivo dwa, fluorescencja chlorofilu liści bambusa Czerwony kolor beta linii wytwarzany przez gen rubinu wskazywał na udane agrobacterium, w którym pośredniczyła ekspresja genów w liściach bambusa. Spośród czterech szczepów agrobacterium, szczep GV3101 spowodował najbardziej znaczącą, beta-pasową akumulację w zakażonych liściach bambusa.Po zakażeniu konstruktami CRISPR CAS9 i zabiegach przy silnym oświetleniu, niektóre obszary blaszek liściowych wykazywały niższe, niefotochemiczne wartości gaszenia. Co więcej, analiza trawienia enzymatycznego i sekwencjonowania potwierdziła udaną mutację genu PeVDE w edytowanych regionach. Wyniki sekwencjonowania Sangera fragmentu PeVDE, po edycji zarówno przez sgRNA1, jak i sgRNA2 wykazały delecję długiego fragmentu w genie PeVDE.Po 30 dniach zakażenia agrobacterium obszary liści transfekowane sgRNA zarówno dla PeVDE, jak i PeCCR5 wykazywały niższe, niefotochemiczne wartości gaszenia.

in-planta-gene-expression-and-gene-editing-in-moso-bamboo-leaves

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisany tutaj protokół hybrydyzacji in situ umożliwia bezpośrednią lokalizację ekspresji mRNA i małych RNA na poziomie komórkowym z wysoką czułością i swoistością. Procedura została zoptymalizowana dla przekrojów tkanek roślinnych zatopionych w parafinie, ma zastosowanie do szerokiego zakresu roślin i tkanek oraz może zostać ukończona w ciągu dziesięciu dni.

Hybrydyzacja in situ w celu precyzyjnej lokalizacji transkrypty w roślinach

Technika dwuniciowej interferencji RNA (dsRNAi) jest stosowana do obniżania poziomu genu reduktazy cynamoylokoenzymu A (ZmCCR1) w kukurydzy w celu obniżenia zawartości ligniny roślinnej. Regulacja w dół ligniny ze ściany komórkowej jest wizualizowana za pomocą analiz mikroskopowych i określana ilościowo metodą Klasona. Analizowane są zmiany składu hemicelulozy i celulozy krystalicznej.

Regulacja ligniny w dół Zea mays za pomocą dsRNAi i analizy ligniny Klason

Wiele ważnych rozwojowo genów ma specyficzne dla komórek lub tkanek wzorce ekspresji. W artykule opisano eksperymenty LM RNA-seq w celu identyfikacji genów, które ulegają zróżnicowanej ekspresji na granicy blaszki liściowej kukurydzy i pochwy oraz w mutantach lg1-R w porównaniu z typem dzikim. Omówione tu rozważania eksperymentalne odnoszą się do analiz transkryptomicznych innych zjawisk rozwojowych.

Eksperymentalny projekt mikrodysekcji laserowej RNA-Seq: wnioski z analizy rozwoju liści kukurydzy

Opracowaliśmy prosty i efektywny protokół do przygotowania dużych ilości protoplastów soi do badania złożonych mechanizmów regulacyjnych i sygnalizacyjnych w żywych komórkach.

Prosta metoda izolacji protoplastów soi i zastosowanie do analiz przejściowej ekspresji genów

Opracowaliśmy nową metodę współekspresji wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach, aby przezwyciężyć trudności konwencjonalnych metod. Wykorzystuje wykorzystanie plazmidu o pojedynczej ekspresji, który zawiera wiele funkcjonalnie niezależnych kaset z ekspresją białek, aby osiągnąć koekspresję białka.

Efektywna koekspresja wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach

Przedstawiona metoda tworzy naturalną tkankę roślinną uszkodzoną przez roślinożerców poprzez zastosowanie larw Manduca sexta do oderwanych liści ziemniaka. Tkanka roślinna jest badana pod kątem ekspresji sześciu homologów czynników transkrypcyjnych biorących udział we wczesnych reakcjach na roślinożerność owadów.

Testy oderwanych liści w celu uproszczenia badań ekspresji genów u ziemniaków podczas porażenia owadem żującym Manduca sexta

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę przesiewową, która może być szeroko stosowana do szybkiego badania przesiewowego supresorów wyciszających RNA u patogenów roślinnych.

Badania przesiewowe i identyfikacja supresorów wyciszających RNA z wydzielanych efektorów patogenów roślinnych

Prezentowany tutaj jest protokół do laserowego mikrodyparowania (LCM) tkanek roślinnych. LCM to mikroskopowa technika izolowania obszarów tkanki w sposób wolny od zanieczyszczeń. Procedura obejmuje utrwalenie tkanek, zatopienie parafiny, cięcie, ekstrakcję LCM i RNA. RNA jest wykorzystywane w dalszej, specyficznej tkankowo, czasowo rozdzielczej analizie transkryptomów.

Sekwencjonowanie RNA z mikrodysekcją laserową do przestrzennej i czasowej analizy ekspresji genów specyficznych dla tkanek u roślin

Przedstawiono protokół iniekcji (agroiniekcji) oparty na Agrobacterium do inokulacji wirusa mozaiki czyńca i klonów wirusa mozaiki trzciny cukrowej do siewek kukurydzy. Inokulacja w ten sposób prowadzi do infekcji wirusowej, wywołanego przez wirusa wyciszenia genów markerowych i nadekspresji wirusa GFP.

Bezpośrednia agroinokulacja siewek kukurydzy przez wstrzyknięcie rekombinowanym wirusem mozaiki wyczyńca i zakaźnymi klonami wirusa mozaiki wyczyńca cukrowego

Tutaj prezentujemy protokół o wysokiej przepustowości do przejściowego transfekcji milionów protoplastów kukurydzy do testowania dużych bibliotek plazmidów w komórkach mezofilu kukurydzy.

Skalowalna transfekcja protoplastów mezofilu kukurydzy

Protokół opisuje hodowlę odpornych odmian ryżu skrobiowego za pomocą technologii edycji genomu w precyzyjny, wydajny i technicznie prosty sposób.

Hodowla według projektu funkcjonalnego ryżu z technologiami edycji genomu

Poznaj metodę ekspresji i edycji genów in planta w liściach bambusa Moso z wykorzystaniem Agrobacterium. Technika ta przyspiesza weryfikację funkcji genetycznych w badaniach nad hodowlą bambusa.

W Planta Ekspresja genów i edycja genów w liściach bambusa Moso

Przeglądaj więcej filmów