Name: Biobankowanie płynnych biopsji ludzkich roztworów wodnych i ciała szklistego do analiz molekularnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 54 s
Description: Poznaj protokół standaryzowanego biobankowania płynnych biopsji oka — cieczy wodnistej i ciała szklistego — podczas chirurgii wewnątrzgałkowej. Metoda umożliwia analizy proteomiczne, glikomiczne i metabolomiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

VBM jest wspierany przez granty NIH (R01EY031952, R01EY031360, R01EY030151 i P30EY026877), Stanford Center for Optic Disc Drusen, oraz Research to Prevent Blindness, Nowy Jork, USA. JW i DR są wspierani przez Fundację Chirurgii Witreosiatkówkowej, USA. DR jest wspierany przez DARE Fellowship, który jest sponsorowany przez Fundację Lundbeck.

Protokół jest zgodny z wytycznymi Institutional Review Board for Human Subject Research (IRB) na Uniwersytecie Stanforda, USA.
UWAGA: Ten protokół jest przewodnikiem dla wykwalifikowanych chirurgów okulistycznych. W kontekście nowotworów złośliwych wewnątrzgałkowych nie można wykluczyć wysiewu guza poza gałką oczną w przypadku biopsji cieczy wodnistej lub płynnej biopsji ciała szklistego. Jednak ryzyko rozszerzenia zewnątrzgałkowego i zajęcia oczodołu jest niezwykle niskie w biopsji przezszklistkowej guza naczyniówkowego, która jest wykonywana w sposób zwiększony pod kątem bezpieczeństwa i z dokładnym uwzględnieniem miejsca wejścia6. Protokół ten nie obejmuje i może być przeciwwskazany w przypadku siatkówczaka lub guzów o wysokim ryzyku przerzutów.
1. Przed pobraniem próbki
<ol>
	<li>Zatwierdzenie przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem eksperymentu należy uzyskać zgody od lokalnego IRB i odpowiednio przeprowadzić pobieranie próbek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badana populacja
	<ol>
		<li>Kryteria włączenia: Uwzględnij wszystkich pacjentów (w wieku od 0 do 99 lat), którzy przechodzą operację wewnątrzgałkową w placówce, która zapewni odpowiednią ilość cieczy wodnistej lub płynu do ciała szklistego przekraczającą ilość wymaganą do odpowiednich badań diagnostycznych w celu oceny stanu pacjenta oraz pacjentów, którzy chcą wziąć udział w badaniu.</li>
		<li>Kryteria wyłączenia: Wykluczenie pacjentów, którzy odmawiają udziału w programie, oraz kobiet w ciąży.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol start="3">
	<li>Świadoma zgoda
	<ol>
		<li>Uzyskaj pisemną świadomą zgodę od każdego pacjenta zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IRB.</li>
		<li>Zarchiwizuj podpisaną zgodę w zabezpieczonej bazie danych.</li>
		<li>Szkolenie zaangażowanego personelu (chirurgów, techników laboratoryjnych, personelu sali operacyjnej, naukowców) zgodnie z opisem w niniejszym protokole.</li>
		<li>Skonfiguruj przykładową bazę danych do zarządzania. Użyj REDCap jako zgodnej z HIPAA przykładowej internetowej bazy danych, która została zaprojektowana do obsługi przechwytywania danych na potrzeby badań naukowych5. 
		UWAGA: W tym artykule opisano użycie interfejsu internetowego dostarczanego przez REDCap do projektowania formularzy, definiowania pól, konfigurowania logiki rozgałęziania i stosowania reguł sprawdzania poprawności danych bez konieczności posiadania rozległej wiedzy programistycznej. Alternatywnie odpowiednie może być również inne oprogramowanie, takie jak standardowe aplikacje do obsługi arkuszy kalkulacyjnych.</li>
		<li>Upewnij się, że dostępny jest pojemnik chłodzący, suchy lód, strzykawka do pobierania próbek i kriowiale (patrz Tabela materiałów). Używaj kriofiali z kodami kreskowymi, które są trwale wytrawione na fiolkach. Eliminuje to konieczność dodawania identyfikatorów pacjenta na fiolce i możliwość zgubienia etykiety w warunkach zamrożenia.</li>
		<li>Powiadom chirurga w sprawie oraz technika laboratoryjnego, który pomoże w pobraniu próbki na sali operacyjnej co najmniej 24 godziny przed planowanym zabiegiem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek chirurgicznych na sali operacyjnej
<ol>
	<li>Interfejs mobilnego laboratorium sali operacyjnej (MORLI)
	<ol>
		<li>Ułóż MORLI na sali operacyjnej. MORLI składa się z płaskiej powierzchni stołu laboratoryjnego, komputera/tabletu ze skanerem kodów kreskowych z dostępem do bazy danych REDCap oraz pojemnika chłodzącego z suchym lodem (patrz Tabela Materiałów). 
		UWAGA: Suchy lód jest bardzo zimny. Zawsze noś rękawice podczas pracy z suchym lodem i unikaj jego dotykania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie pobierania próbek na sali operacyjnej
	<ol>
		<li>Zaloguj się do komputera/tabletu na MORLI i otwórz bazę danych REDCap.</li>
		<li>Sprawdź, czy pacjent podpisał świadomą zgodę i potwierdź to z chirurgiem. Przypomnij mu, że wymagana jest nierozcieńczona próbka.</li>
		<li>Nosić rękawice. Uzyskać odpowiednią liczbę kriowialiów z kodami kreskowymi (0,5 ml dla cieczy wodnistej i 1,9 ml dla próbek szklistych) i umieścić je w łatwo dostępnym miejscu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbiór biopsji płynnych z cieczy wodnistej 
	UWAGA: Próbki tkanek ludzkich należy traktować jako materiał niebezpieczny biologicznie, który wymaga odpowiednich środków ostrożności, takich jak fartuch laboratoryjny i rękawice, aby zapewnić bezpieczeństwo zaangażowanemu personelowi. 
	UWAGA: Poniższe kroki powinny być wykonywane wyłącznie przez przeszkolonego chirurga okulisty. Biopsje cieczy wodnistej w płynie można uzyskać na przykład na początku operacji zaćmy, jednej z najczęstszych operacji na świecie. 
	UWAGA: Na sali operacyjnej utrzymywane jest sterylne pole zgodnie ze standardowymi protokołami opieki. Procedury przedoperacyjne związane ze znieczuleniem pacjenta są zgodne ze standardowymi krokami opieki w przypadku operacji przedniej komory i witreoretinalnej.
	<ol>
		<li>Przygotuj i udrapuj oko do operacji i umieść sterylny wziernik pokrywy, aby uzyskać optymalną wizualizację sterylnego pola.</li>
		<li>Użyj mikroskopu operacyjnego, aby wykonać paracentezę przedniej komory prostopadłej do rąbka za pomocą igły 30-32 G połączonej ze strzykawką o pojemności 1 ml. Użyj bawełnianej końcówki lub małych kleszczyków, aby ustabilizować oko podczas tego zabiegu. 
		UWAGA: Upewnić się, że igła i strzykawka są zablokowane i że nie ma nacisku w strzykawce (przesuwając tłok). Upewnij się, że końcówka igły pozostaje nad obwodową tęczówką w środkowej komorze przedniej, aby uniknąć uszkodzenia struktur wewnątrzgałkowych. W przypadku operacji zaćmy igła do uzyskania płynnej biopsji może również wejść do komory przedniej przez jedną z paracentez, które są tworzone do operacji zaćmy.</li>
		<li>Pod bezpośrednią wizualizacją za pomocą mikroskopu ręcznie odessać około 100 μl nierozcieńczonej cieczy wodnistej za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Przesuwać tłok strzykawki ręką niedominującą chirurga lub przez przeszkolonego asystenta bez przesuwania igły. 
		UWAGA: Uzyskać mniej niż 100 μl cieczy wodnistej na wypadek zapadnięcia się komory przedniej.</li>
		<li>Ostrożnie wyjąć igłę z komory przedniej. 
		UWAGA: W oku fakijnym trzymaj igłę nad tęczówką, aby uniknąć dotykania soczewki. Dodatnie ciśnienie na kuli ziemskiej może zwiększyć refluks. Zwolnienie bawełnianej końcówki przed wyjęciem igły pomaga zmniejszyć refluks</li>.
		<li>Odciągnąć tłok i zobaczyć, jak porusza się powietrze i zebrany płyn.</li>
		<li>Wstrzyknąć strzykawkę do kriowialu. Dodatkowe powietrze oczyszcza martwą przestrzeń strzykawki.</li>
		<li>Użyj kodu kreskowego na kriowiale, aby zeskanować próbkę do formularza REDCap na komputerze na sali operacyjnej (więcej szczegółów w krokach od 3.1 do 3.9).</li>
		<li>Natychmiast przenieś kriowial do suchego lodu w komorze chłodzącej.</li>
		<li>Kontynuuj zaplanowaną dla pacjenta operację (np. operację zaćmy, jak opisano wcześniej7 ).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbiór płynnych biopsji ciała szklistego 
	UWAGA: Poniższe kroki powinny być wykonywane wyłącznie przez przeszkolonego chirurga witreoretinalnego. Biopsje płynu do ciała szklistego można wykonać na początku witrektomii8. Ponieważ celem jest pobranie nierozcieńczonej próbki ciała szklistego, frez do witrektomii nie zostanie zagruntowany płynem1. 
	UWAGA: Na sali operacyjnej utrzymywane jest sterylne pole zgodnie ze standardowymi protokołami opieki. Procedury przedoperacyjne związane ze znieczuleniem pacjenta są zgodne ze standardowymi krokami opieki w przypadku operacji przedniej komory i witreoretinalnej.
	<ol>
		<li>Przygotuj i udrapuj oko do operacji i umieść sterylny wziernik pokrywy, aby uzyskać optymalną wizualizację sterylnego pola.</li>
		<li>Wykonaj sklerotomię za pomocą kaniuli trokarowej 23, 25 lub 27 G, postępując zgodnie ze standardowymi procedurami pielęgnacyjnymi. Wprowadzić kaniulę infuzyjną i wizualnie potwierdzić odpowiednie umieszczenie w jamie ciała szklistego.</li>
		<li>W jamie ciała szklistego aktywować nożownik do ciała szklistego bez infuzji, aby pobrać nierozcieńczoną próbkę ciała szklistego. Ręcznie odessać od 0,5 do 1,0 ml ciała szklistego za pomocą strzykawki podłączonej do kaniuli do wytłaczania ciała szklistego1.</li>
		<li>Wyjmij nóż do ciała szklistego z oka i włącz napar płynu.</li>
		<li>Odessać pozostały płyn z rurki do strzykawki.</li>
		<li>Odłączyć strzykawkę.</li>
		<li>Badać próbkę zgodnie z opisem dla próbki cieczy wodnistej w sekcji 2.3 (etapy od 2.3.5 do 2.3.9).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przetwarzanie próbek na sali operacyjnej i dodawanie próbek do bazy danych
<ol>
	<li>Poproś technika laboratoryjnego, aby wziął przygotowany kriowial (0,5 ml dla cieczy wodnistej i 1,9 ml dla próbek ciała szklistego) i poszedł do chirurga, nie dotykając żadnego sterylnego sprzętu OR.</li>
	<li>Poproś technika laboratoryjnego o otwarcie kriowiala.</li>
	<li>Rozładować strzykawkę bezpośrednio do kriowialu.</li>
	<li>Poproś technika laboratoryjnego o natychmiastowe ponowne zamknięcie kriowialu.</li>
	<li>Poproś technika laboratoryjnego, aby wrócił do MORLI i natychmiast przeniósł próbkę na suchy lód w komorze chłodzącej (-80 °C). Zamknij pokrywę pudełka.</li>
	<li>Otwórz nowy formularz pobierania próbki. W odpowiednim polu formularza należy wprowadzić następujące informacje: chirurg przypadku, miejsce i datę pobrania, numer identyfikacyjny pacjenta oraz inne podstawowe informacje, takie jak wiek, płeć, prawe lub lewe oko, diagnoza, historia przedoperacyjna (tekst dowolny), informacje o zabiegu (np. rodzaj zabiegu), a także informacje o próbkach, takie jak liczba pobranych próbek, rodzaj próbek (ciecz ciekła, ciało szkliste) oraz inne szczegóły, takie jak objętość. Dodaj kod kreskowy probówki za pomocą skanera kodów kreskowych.</li>
	<li>Kliknij Prześlij/Dalej.</li>
	<li>Powtórzyć kroki od 3.1 do 3.7, jeśli zostaną pobrane dodatkowe próbki.</li>
	<li>Gdy wszystkie próbki są zabezpieczone, kliknij przycisk Zapisz i prześlij w formularzu zbierania próbki REDCap. Następnie wyloguj się z bazy danych i komputera/tabletu.</li>
</ol>
4. Przenoszenie kriowiali do magazynu
<ol>
	<li>Próbki należy przetransportować na suchym lodzie w chłodziarce z sali operacyjnej do laboratorium i umieścić je na stole laboratoryjnym obok komputera laboratoryjnego.</li>
	<li>Zaloguj się do REDCap na komputerze laboratoryjnym przy użyciu swojego identyfikatora logowania i hasła.</li>
	<li>Nosić rękawice. Pobrać jedną z pobranych próbek i zeskanować kod kreskowy kriowialu do bazy danych (więcej szczegółów w sekcji 5). Natychmiast umieścić próbkę z powrotem na suchym lodzie.</li>
	<li>Zaopatrz się w drugi pojemnik wypełniony suchym lodem.</li>
	<li>Zaopatrz się w stojak na kriowiale z zamrażarki o temperaturze -80 °C. Umieść go w drugim pojemniku na suchym lodzie. 
	UWAGA: Stojak w formacie 96 będzie potrzebny na probówki do wody o pojemności 0,5 ml i stojak w formacie 48 na probówki do ciała szklistego o pojemności 1,9 ml.</li>
	<li>Zeskanuj kod kreskowy regału do bazy danych (więcej szczegółów w rozdziale 5).</li>
	<li>Przenieść próbkę do stojaka.</li>
	<li>Dodać pozycję fiolek w stojaku do bazy danych (więcej szczegółów w sekcji 5).</li>
	<li>Kliknij Zapisz i prześlij.</li>
	<li>Przetransportować ruszt z fiolkami na suchym lodzie do lodówki w celu przechowywania w temperaturze -80 °C. Dodać ruszt w określone miejsce w lodówce za pomocą układu współrzędnych. Umożliwi to późniejsze łatwe pobieranie próbek do dalszej analizy.</li>
</ol>
5. Przykładowy formularz przechowywania
<ol>
	<li>Należy wypełnić formularz przechowywania dla każdej próbki pobranej na etapie formularza zgłoszeniowego. Kliknij puste kółko lub znak "+" w obszarze Przechowywanie próbek, aby utworzyć i otworzyć nowy formularz przechowywania.</li>
	<li>Wprowadź datę wypełnienia tego formularza w polu Data archiwizacji rekordu.</li>
	<li>Zeskanuj lub wpisz kod kreskowy probówki w polu Kod kreskowy probówki z próbką. Natychmiast umieścić próbkę z powrotem na suchym lodzie.</li>
	<li>Umożliwia wybranie, czy próbka ma zostać przeniesiona na zewnątrz, czy też próbka ma być przechowywana w wewnętrznym repozytorium biologicznym.</li>
	<li>Sprawdź, czy pacjent uzyskał pisemną świadomą zgodę i zaznacz pole wyboru w obszarze Sprawdź zgodność zgody, a następnie wprowadź swoje imię i nazwisko w polu Zgoda zweryfikowana przez.</li>
	<li>Wybierz wolne i odpowiednie miejsce dla kriowialu w stojaku. Przenieś kriowial w tej pozycji do stojaka (np. pozycja A1). Trzymaj ruszt na suchym lodzie.</li>
	<li>W fazie Lokalizacja wprowadź następujące informacje: lokalizację zamrażarki w obszarze Zamrażarka, numer półki, na której próbka będzie przechowywana w obszarze Półka, kod kreskowy pudełka w polu Kod kreskowy pudełka, pozycję probówki w pudełku według wierszy (Pozycja probówki (wiersz)) i kolumnę (Pozycja probówki (kolumna)). 
	UWAGA: Opcjonalnie w polu Etykieta pudełka można również wprowadzić etykietę pudełka, co może ułatwić odnalezienie pudełka w zamrażarce.</li>
	<li>W sekcji Użycie wprowadź następujące informacje: nazwę projektu, w którym próbka jest używana (Nazwa projektu), objętość próbki w jednej z następujących kategorii: pełna, częściowa, prawie pusta lub pusta (Objętość próbki) oraz uwagi dotyczące przechowywania, jeśli ma to zastosowanie, w obszarze Uwagi do przechowywania. 
UWAGA: Data, godzina i użytkownik, który ostatnio korzystał z formularza, są wypełniane automatycznie, aby zapewnić łańcuch dowodowy, który można przeglądać i kontrolować w razie potrzeby.</li>
	<li>Upewnij się, że formularz został wypełniony, klikając przycisk Ukończono w obszarze Ukończono?.</li>
	<li>Kliknij Zapisz i wyjdź z formularza. Spowoduje to powrót do przeglądu pacjentów.</li>
	<li>Dla każdej pobranej probówki wygeneruj kolejny formularz pobierania próbki, klikając "+" w obszarze Przechowywanie próbek. Następnie powtórz kroki od 5.1 do 5.10.</li>
	<li>Kliknij Zapisz i wyjdź, aby wypełnić formularz i wylogować się z bazy danych oraz komputera/tabletu.</li>
	<li>Przenieść stojak na próbki (na suchym lodzie) do lodówki w określonej pozycji.</li>
</ol>
6. Pobieranie próbek chirurgicznych do dalszej analizy
UWAGA: Próbki są często archiwizowane przez kilka lat, zanim zostaną przeanalizowane. Kriowiale z kodami kreskowymi i przeszukiwalny system baz danych REDCap pozwalają łatwo znaleźć i zlokalizować każdą próbkę do dalszej analizy.
<ol>
	<li>Zidentyfikuj próbki interesujące dla eksperymentu, korzystając z funkcji wyszukiwania w bazie danych. Pozwoli to na odnalezienie m.in. wszystkich próbek cieczy wodnistej od pacjentów w wieku od 20 do 40 lat z retinopatią cukrzycową.</li>
	<li>Uzyskaj lokalizację interesujących nas kriowiali (zamrażarka, półka/stojak, stojak na próbki, współrzędne w stojaku). Zapisz je, wydrukuj lub miej pod ręką na komputerze przenośnym/tablecie, aby ułatwić odnalezienie próbek w zamrażarce.</li>
	<li>Oznacz próbki jako używane w bazie danych.</li>
	<li>Kliknij Zapisz i wyjdź, aby wypełnić formularz i wylogować się z REDCap oraz komputera/tabletu.</li>
</ol>

<ol><li>Mishra, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraoperative+complications+with+vitreous+biopsy+for+molecular+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Surgeries%2C+Lasers+Imaging+Retina%22%5BJournal%5D)">Intraoperative complications with vitreous biopsy for molecular proteomics.</a> Ophthalmic Surgeries, Lasers Imaging Retina. 54 (1), 32-36 (2023).</li>
<li>Velez, G., Bassuk, A. G., Colgan, D., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+drug+repositioning+using+personalized+proteomics+of+liquid+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Therapeutic drug repositioning using personalized proteomics of liquid biopsies.</a> JCI Insight. 2 (24), (2017).</li>
<li>Velez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsy+proteomics+of+uveal+melanoma+reveals+biomarkers+associated+with+metastatic+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsy proteomics of uveal melanoma reveals biomarkers associated with metastatic risk.</a> Molecular Cancer. 20 (1), 39(2021).</li>
<li>Wert, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+therapy+guided+by+liquid+biopsy+proteomics+delays+retinal+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Metabolite therapy guided by liquid biopsy proteomics delays retinal neurodegeneration.</a> EBioMedicine. 52, 102636(2020).</li>
<li>Harris, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+REDCap+consortium%3A+Building+an+international+community+of+software+platform+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Informatics%22%5BJournal%5D)">The REDCap consortium: Building an international community of software platform partners.</a> Journal of Biomedical Informatics. 95, 103208(2019).</li>
<li>Finn, A. P., Materin, M. A., Mruthyunjaya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroidal+tumor+biopsy%3A+A+review+of+the+current+state+and+a+glance+into+future+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Choroidal tumor biopsy: A review of the current state and a glance into future techniques.</a> Retina. 38 Suppl 1, S79-S87 (2018).</li>
<li>Tarantola, R. M., Graff, J. M., Somani, R., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+approach+for+small-gauge+pars+plana+vitrectomy+combined+with+anterior+segment+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Temporal approach for small-gauge pars plana vitrectomy combined with anterior segment surgery.</a> Retina. 32 (8), 1614-1623 (2012).</li>
<li>Mahajan, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sutureless+triplanar+sclerotomy+for+23-gauge+vitrectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Sutureless triplanar sclerotomy for 23-gauge vitrectomy.</a> Archives in Ophthalmology. 129 (5), 585-590 (2011).</li>
<li>Mitchell, B. L., Yasui, Y., Li, C. I., Fitzpatrick, A. L., Lampe, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+freeze-thaw+cycles+and+storage+time+on+plasma+samples+used+in+mass+spectrometry+based+biomarker+discovery+projects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Informatics%22%5BJournal%5D)">Impact of freeze-thaw cycles and storage time on plasma samples used in mass spectrometry based biomarker discovery projects.</a> Cancer Informatics. 1 (1), 98-104 (2005).</li>
<li>Velez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+insight+into+the+pathogenesis+of+CAPN5-vitreoretinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Proteomic insight into the pathogenesis of CAPN5-vitreoretinopathy.</a> Science Reports. 9 (1), 7608(2019).</li>
<li>Montgomery, M. R., Hull, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+glycome+after+HDAC+inhibition+impact+oncogenic+potential+in+epigenetically+plastic+SW13+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Alterations in the glycome after HDAC inhibition impact oncogenic potential in epigenetically plastic SW13 cells.</a> BMC Cancer. 19 (1), 79(2019).</li>
<li>Okamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+serum+metabolomics+pathways+and+patterns+between+patients+with+major+depressive+disorder+with+and+without+type+2+diabetes+mellitus%3A+An+exploratory+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrated+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Comparison of serum metabolomics pathways and patterns between patients with major depressive disorder with and without type 2 diabetes mellitus: An exploratory study.</a> Journal of Integrated Neuroscience. 22 (1), 13(2023).</li>
<li>Pang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetaboAnalyst+5.0%3A+narrowing+the+gap+between+raw+spectra+and+functional+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MetaboAnalyst 5.0: narrowing the gap between raw spectra and functional insights.</a> Nucleic Acids Research. 49 (W1), W388-W396 (2021).</li>
<li>Wolf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Eye+Transcriptome+Atlas%3A+A+searchable+comparative+transcriptome+database+for+healthy+and+diseased+human+eye+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">The Human Eye Transcriptome Atlas: A searchable comparative transcriptome database for healthy and diseased human eye tissue.</a> Genomics. 114 (2), 110286(2022).</li>
<li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110 (9), 3507-3512 (2013).</li>
<li>Wolf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptome+analysis+of+human+and+murine+choroidal+neovascularization+identifies+fibroblast+growth+factor+inducible-14+as+phylogenetically+conserved+mediator+of+neovascular+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimca+et+Biophysica+Acta+Molecular+Basis+of+Diseases%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptome analysis of human and murine choroidal neovascularization identifies fibroblast growth factor inducible-14 as phylogenetically conserved mediator of neovascular age-related macular degeneration.</a> Biochimca et Biophysica Acta Molecular Basis of Diseases. 1868 (4), 166340(2022).</li>
<li>Dowden, H., Munro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+clinical+success+rates+and+therapeutic+focus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Trends in clinical success rates and therapeutic focus.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (7), 495-496 (2019).</li>
<li>Li, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+DNA+methylation+signatures+of+retinoblastoma+using+aqueous+humor+liquid+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Characterizing DNA methylation signatures of retinoblastoma using aqueous humor liquid biopsy.</a> Nature Communication. 13 (1), 5523(2022).</li>
<li>Velez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+proteomics+for+precision+health%3A+identifying+biomarkers+of+vitreoretinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Vision+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Personalized proteomics for precision health: identifying biomarkers of vitreoretinal disease.</a> Translational Vision Science and Technology. 7 (5), 12(2018).</li>
<li>Skeie, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biorepository+for+ophthalmic+surgical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Applications%22%5BJournal%5D)">A biorepository for ophthalmic surgical specimens.</a> Proteomics Clin Applications. 8 (3-4), 209-217 (2014).</li>
<li>Rinsky, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+aqueous+humor+proteome+in+patients+with+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Analysis of the aqueous humor proteome in patients with age-related macular degeneration.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 62 (10), 18(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Próbki chirurgiczne pobrane od pacjentów pozwalają na bezpośrednią molekularną charakterystykę choroby u żyjących ludzi 2,3,4,14 i mogą pomóc w przezwyciężeniu ograniczeń modeli chorób komórkowych i zwierzęcych, które nie oddają w pełni choroby człowieka15,16. Analiza molekularna tkanek ludzkich może poprawić wybór nowych celów terapeutycznych i przyczynić się do zwiększenia wskaźnika powodzenia badań klinicznych i zatwierdzenia leku17. Ponadto podejście to oferuje potencjał dla medycyny spersonalizowanej, ponieważ uzyskana tkanka zachowuje unikalny genomowy, epigenomiczny, metabolomiczny, glikomiczny i proteomiczny odcisk palca każdej osoby 2,18,19.
Wysoka i stała jakość próbki ma fundamentalne znaczenie dla wszystkich zastosowań związanych z analizą molekularną. Wcześniejsze badania wykazały, że natychmiastowe zamrażanie po pobraniu próbki i unikanie powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania ma kluczowe znaczenie dla wysokiej jakości próbki 9,20. Długotrwałe przechowywanie przez kilka lat w temperaturze -70 °C nie wpłynęło znacząco na integralność profilu proteomicznego9. Ustandaryzowany protokół jest ważną podstawą do zmniejszenia stronniczości i poprawy porównywalności danych naukowych, zwłaszcza gdy w proces pobierania próbek zaangażowanych jest kilka osób (chirurgów, techników i innych) lub różne instytucje. Oprócz jakości próbki, adnotacja próbek jest kolejnym ważnym czynnikiem, który wymaga standaryzacji, aby umożliwić korelację wyników molekularnych z danymi klinicznymi. Aby to osiągnąć, nasz protokół opiera się na trzech podstawowych zasadach: 1) ustandaryzowana procedura pobierania próbek do biopsji cieczy wodnistej i płynu ciała szklistego przez chirurga okulistycznego, 2) natychmiastowe przetwarzanie i błyskawiczne zamrażanie próbek na sali operacyjnej przez personel laboratoryjny oraz 3) adnotacja metadanych każdej próbki w internetowej bazie danych, która umożliwia badaczom szybkie znalezienie próbek do późniejszych eksperymentów.
Oprócz próbek ciała szklistego20 w ramach tego procesu opracowywana jest również znormalizowana kolekcja biopsji płynnych z cieczy wodnistej do analizy molekularnej. Ciecz wodnista jest wysoce dostępnym, złożonym płynem w przedniej komorze oka, który odzwierciedla nie tylko choroby oka przedniego, ale także tylnego odcinka oka, w tym choroby siatkówki18,21. Wraz z faktem, że można pobrać dużą liczbę próbek cieczy wodnistej, np. podczas operacji zaćmy, jednej z najczęściej wykonywanych operacji na świecie, cechy te sprawiają, że jest to interesujące źródło płynnych biopsji ludzkiego oka. Ustandaryzowana adnotacja metadanych każdej próbki ustalona w tym przepływie pracy może również umożliwić korelację danych proteomu z prospektywnymi danymi z obserwacji klinicznej. Stwarza to ekscytującą okazję do zidentyfikowania nowych biomarkerów prognostycznych, które mogą pomóc w oszacowaniu rokowania dla przyszłych pacjentów.
Jednak analiza molekularna ludzkich próbek chirurgicznych ma również istotne ograniczenia. Na przykład złożone manipulacje eksperymentalne są często możliwe tylko w modelach zwierzęcych i komórkowych. Rozwiązaniem może być porównanie profilu molekularnego modeli zwierzęcych lub komórkowych z profilem choroby ludzkiej. Strategia ta może zidentyfikować nakładające się na siebie biomarkery białkowe i cele terapeutyczne, które można zwalidować na zwierzętach lub modelach komórkowych w celu zidentyfikowania najbardziej obiecujących kandydatów, którzy korelują z chorobą człowieka i mają szansę odnieść sukces w badaniach klinicznych 4,16.
Podsumowując, nasz przepływ pracy ustanawia praktyczny interfejs między salą operacyjną a laboratorium badawczym, który umożliwia ustandaryzowane i wysokowydajne gromadzenie, opisywanie i przechowywanie wysokiej jakości próbek chirurgicznych do dalszej analizy molekularnej, stanowiąc cenną podstawę dla przyszłych badań translacyjnych.

Profilowanie molekularne płynnych biopsji z ludzkiego oka może wychwycić lokalnie wzbogacone płyny zawierające cząsteczki takie jak DNA, RNA, białka, glikany i metabolity z wysoce wyspecjalizowanych tkanek oka. Płynne biopsje z ciała szklistego w tylnej komorze ludzkiego oka okazały się ogólnie bezpieczną procedurą1. Pozwalają one na molekularną charakterystykę chorób oczu u żyjących ludzi i oferują potencjał do identyfikacji nowych strategii diagnostycznych i terapeutycznych2,3,4. Ciecz wodnista w przedniej komorze oka jest jeszcze bardziej dostępna chirurgicznie i można ją uzyskać w dużych ilościach, np. podczas operacji zaćmy, która jest jedną z najczęściej wykonywanych operacji. Jednak do tej pory nie jest dostępny żaden znormalizowany protokół pobierania, opisywania i biobankowania biopsji ludzkiego cieczy wodnistej i płynu szklistego do dalszych analiz molekularnych, w tym proteomiki, metabolomiki i glikomiki.
Tutaj opracowaliśmy protokół pobierania i biobankowania wysokiej jakości płynnych biopsji do analiz molekularnych od pacjentów poddawanych operacji oka. Mobilny interfejs laboratoryjny sali operacyjnej (MORLI) umożliwia badaczowi natychmiastowe błyskawiczne zamrożenie pobranych próbek w kriowiach z kodami kreskowymi na suchym lodzie w temperaturze -80 °C na sali operacyjnej (OR). Procedura ta zapewnia wysoką i stałą jakość próbki do dalszej analizy molekularnej. Oprócz doskonałej jakości próbek, kluczowe znaczenie ma dokładna adnotacja próbek w biobanku. Korzystając z internetowej bazy danych REDCap (Health Insurance Portability and Accountability Act) zgodnej z HIPAA (Health Insurance Portability and Accountability Act)5, nasz przepływ pracy umożliwia przechowywanie szczegółowych metadanych dla każdej próbki, w tym wieku, płci, choroby, stadium choroby, rodzaju próbki i unikalnych cech operacji. Umożliwi to w przyszłości dokładne wyszukiwanie, np. próbek z określonej choroby lub określonej grupy pacjentów. Ponadto dokładna lokalizacja każdej próbki w zamrażarce jest archiwizowana za pomocą kartezjańskiego systemu siatkowego, który umożliwia efektywne pobieranie próbek na potrzeby dalszych eksperymentów. Pokazujemy przykłady analiz DNA, białek, glikanów i metabolitów.
Nasz przepływ pracy stanowi praktyczne i skuteczne połączenie między salą operacyjną a laboratorium badawczym i stanowi cenną podstawę dla badań translacyjnych.

<table><tbody><tr><td>Probówka trójkodowa 0,5 ml, format 96, gwint zewnętrzny</td><td>Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA</td><td>68-0703-12</td><td>używana do próbek cieczy wodnistej</td></tr><tr><td>1 ml strzykawka</td><td>chirurgiczna, niezależnie od dostępności w szpitalu</td> <td>-</td> <td>do biopsji cieczy wodnistej</td></tr><tr><td>1,9 ml Tri-coded, format 48, gwint zewnętrzny</td><td>Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA</td><td>65-7643</td><td>używana do próbek ciała szklistego</td></tr><tr><td>3 ml strzykawka</td><td>klasy chirurgicznej, niezależnie od dostępności w szpitalu</td> <td>-</td> <td>do biopsji ciała szklistego</td></tr><tr>Klasa chirurgiczna<td>igły 30-32</td><td>, cokolwiek jest dostępna w szpitalu</td> <td>-</td> <td>do biopsji cieczy wodnistej</td></tr><tr><td>Elektroforeza kapilarna sprzężona ze spektrometrią mas z transformacją Fouriera (CE-FTMS)</td> <td>Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japonia</td> <td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>System witrektomii konstelacji z systemem kaniuli trokarowej o rozmiarze 23, 25 lub 27 Alcon</td><td>Laboratories Inc, Fort Worth, TX, USA</td> <td>-</td> <td>do biopsji ciała szklistego</td></tr><tr><td>Pudełko chłodzące</td><td>Standardowe pudełko styropianowe, cokolwiek jest dostępne w laboratorium</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Suchy lód</td><td>Wszystko, co jest dostępne w laboratorium</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Zestaw głośnomówiący o standardowym zasięgu z ekranowanym USB</td><td>Symbol zebra&nbsp;</td><td>DS9208-SR4NNU21Z</td><td>Skaner kodów kreskowych</td></tr><tr><td>Ludzka matryca przeciwciał glikozylacyjnych L3&nbsp;</td><td>RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA</td><td>GAH-GCM-L3-Mac</td><td></td></tr> <tr><td>mini</td><td>Apple Inc., Cupertino, CA 95014, USA-</td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>Oprogramowanie MetaboAnalyst</td><td>Pang et al., 2021, PMID: 34019663</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Stojak na probówki 0,5 ml, format 96</td><td>Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA</td><td>66-51026</td><td>na próbki cieczy wodnistej</td></tr><tr><td>Stojak na probówki 1,9 ml, format</td> <td>48Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA</td><td>65-9451</td><td>dla próbek ciała szklistego</td></tr><tr><td>Baza danych próbek REDCap oparta na przeglądarce REDCap</td><td>Consortium, Vanderbilt University, https://www.project-redcap.org</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

biobankowanie płynnych biopsji ludzkich roztworów wodnych i ciała szklistego do analiz molekularnych

Biobanking of Human Aqueous and Vitreous Liquid Biopsies for Molecular Analyses

Kluczowym wyzwaniem w badaniach translacyjnych jest stworzenie realnego i efektywnego interfejsu między opieką nad pacjentem na sali operacyjnej (OR) a laboratorium badawczym. W tym miejscu opracowaliśmy protokół pozyskiwania wysokiej jakości płynnych biopsji do analiz molekularnych z cieczy wodnistej i ciała szklistego od pacjentów poddawanych operacji oka. W tym przepływie pracy wózek z interfejsem MORLI (Mobile Operating Room Lab Interface) wyposażony w komputer, skaner kodów kreskowych i przyrządy laboratoryjne, w tym pokładową chłodnię, jest używany do pozyskiwania i archiwizowania próbek biologicznych ludzi. Internetowa baza danych zgodna z przepisami o ochronie danych umożliwia dodawanie adnotacji do każdej próbki przez cały okres jej użytkowania, a kartezjański układ współrzędnych umożliwia śledzenie każdej próbki z kodem kreskowym w magazynie, umożliwiając szybkie i dokładne pobieranie próbek do dalszych analiz. Charakterystyka molekularna próbek tkanek ludzkich służy nie tylko jako narzędzie diagnostyczne (np. do rozróżnienia między zakaźnym zapaleniem wnętrza gałki ocznej a innym niezakaźnym zapaleniem wewnątrzgałkowym), ale stanowi również ważny element badań translacyjnych, umożliwiając identyfikację nowych celów leków, rozwój nowych narzędzi diagnostycznych i spersonalizowanych terapii.

Zebrane próbki z płynnej biopsji mogą zostać poddane różnym analizom molekularnym, w tym analizie DNA, białek, glikanów i metabolitów. Wykazano wcześniej, że długoterminowe przechowywanie przez kilka lat w temperaturze -70 °C nie wpływa znacząco na integralność profilu proteomicznego9. Baza danych REDCap umożliwia prosty i szybki odzysk próbek. W bazie można wyszukiwać próbki z konkretnej grupy pacjentów, np. wszystkich pacjentów z retinopatią cukrzycową. Baza danych dostarcza wówczas kody kreskowe probówek oraz ich pozycje w magazynie. Do chwili obecnej zebraliśmy i zarchiwizowaliśmy ponad 1 000 próbek z płynnej biopsji. Baza danych pozwoliła nam na szybkie odnalezienie próbek do dalszych analiz3,10 i pomogła w przeprowadzeniu następujących eksperymentów.
17-letnia pacjentka zgłosiła się z zapaleniem siatkówki i nerwu wzrokowego. Pacjentka była w stanie immunosupresji, co budziło obawy o wystąpienie infekcji. Z prawego oka pobrano ciecz wodnistą i wysłano ją do analizy DNA PCR. Wyniki były dodatnie w kierunku Cytomegalovirus i ujemne w kierunku Herpes simplex virus oraz toksoplazmozy. Wyniki te pokazują, że płynna biopsja cieczy wodnistej może pomóc w odróżnieniu zakaźnych od niezakaźnych form zapalenia wewnątrzgałkowego, co jest kluczowe dla wyboru odpowiedniej terapii.
Chromatografia cieczowa sprzężona z spektrometrią mas umożliwia nieobiektywną i półilościową analizę proteomu. W biopsji płynnej z ciała szklistego pacjenta poddawanego witrektomii, technika ta pozwoliła na zidentyfikowanie 484 unikalnych białek, w tym dopełniacza C3 (C3), optycyny (OPTC) oraz kolagenu typu II alfa 1 (COL2A1) (Rysunek 1A).
Przeprowadzono analizę trzech biopsji cieczy szklistej przy użyciu multipleksowego testu ELISA w glikoproteomice (patrz Tabela materiałów)11Analiza pozwoliła na wykrycie profili glikozylacji 500 białek ludzkich, obejmując szereg szlaków biologicznych, takich jak metabolizm, odpowiedź immunologiczna, adhezja komórkowa oraz organizacja aktyny (Rycina 1B).
Przesiewy metabolomiczne z wykorzystaniem elektroforezy kapilarnej sprzężonej z spektrometrią mas z transformacją Fouriera12 (patrz Tabela materiałów) pozwoliły zidentyfikować 292 różne metabolity w trzech próbkach płynnej biopsji ciała szklistego. Analiza szlaków (patrz Tabela materiałów)13 wykazała szereg szlaków metabolicznych, w tym metabolizm aminokwasów, cykl mocznikowy oraz syntezę karnityny (Rysunek 1C).
<img alt="Analiza danych proteomicznych, glikoproteomicznych i metabolomicznych; wykresy, diagramy sieci, wartości p." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65804/65804fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Reprezentatywne wyniki. (A) Analiza proteomiczna ludzkiego ciała szklistego z wykorzystaniem chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS) zidentyfikowała 484 unikalne białka w pojedynczej płynnej biopsji. Poziomy białek są przedstawione i uszeregowane na podstawie liczby widm. Reprezentatywne białka zaznaczono na niebiesko. (B) Multiplexowy test ELISA w glikoproteomice wykrył stopnie glikozylacji 500 unikalnych białek w trzech płynnych biopsjach ciała szklistego. Analiza oddziaływań białkowych STRING zidentyfikowała klastry interakcji białkowych (pokazano klastry zawierające co najmniej 10 białek). Dla każdego klastra przedstawiono najbardziej istotnie wzbogaconą ścieżkę. (C) Analiza metabolomiczna z wykorzystaniem spektrometrii mas zidentyfikowała 292 różne metabolity w trzech płynnych biopsjach cieczy wodnistej. Każdy punkt reprezentuje jedną próbkę. Wysokość słupka odpowiada średniej liczbie metabolitów, a słupek błędu reprezentuje odchylenie standardowe. Prawy panel przedstawia istotnie wzbogacone ścieżki. Pokazano liczbę wykrytych metabolitów (licznik) oraz całkowitą liczbę metabolitów w każdej ścieżce (mianownik). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65804/65804fig01large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>

Ten protokół przedstawia zintegrowaną platformę biorepozytorium do standaryzowanego zbierania, opisywania i biobankowania wysokiej jakości ludzkich biopsji cieczy wodnistej i płynu szklistego do dalszych analiz molekularnych, w tym proteomiki, metabolomiki i glikomiki.

Biobankowanie płynnych biopsji ludzkich roztworów wodnych i ciała szklistego do analiz molekularnych

A critical challenge in translational research is establishing a viable and efficient interface between patient care in the operating room (OR) and the ...

Profilowanie molekularne płynnych biopsji z ludzkiego oka może wychwycić lokalnie wzbogacone płyny zawierające tysiące różnych cząsteczek z wysoce wyspecjalizowanych tkanek oka. Pozwalają one na molekularną charakterystykę chorób oczu u żyjących ludzi oraz na identyfikację nowych strategii diagnostycznych i terapeutycznych. W tym miejscu opracowaliśmy protokół standaryzowanego pobierania i biobankowania wysokiej jakości biopsji cieczy wodnistej i płynu do ciała szklistego podczas operacji wewnątrzgałkowych.Częścią protokołu jest internetowa baza danych zgodna z przepisami o ochronie danych do opisywania każdej próbki przez cały okres jej życia oraz wykorzystanie układu współrzędnych, który umożliwia śledzenie lokalizacji każdej próbki oznaczonej kodem kreskowym w magazynie, co umożliwia efektywne pobieranie próbek do dalszych eksperymentów, takich jak analiza białek, glikanów i metabolitów. Użyj mikroskopu operacyjnego, aby wykonać paracentezę przedniej komory prostopadłej do rąbka za pomocą igły o rozmiarze od 30 do 32 podłączonej do strzykawki o pojemności jednego ml. Bawełniana końcówka może być użyta do ustabilizowania oka podczas tego zabiegu.Upewnij się, że końcówka igły pozostaje nad obwodową tęczówką w środkowej komorze przedniej, aby uniknąć uszkodzenia struktur wewnątrzgałkowych. Pod bezpośrednią wizualizacją za pomocą mikroskopu ręcznie odessać około stu mikrolitrów nierozcieńczonej cieczy wodnistej za pomocą strzykawki o pojemności jednego ml. Igła jest następnie ostrożnie wyjmowana z przedniej komory.W oku fakijnym trzymaj igłę nad tęczówką, aby uniknąć dotykania soczewki. Dodatnie ciśnienie na kuli ziemskiej może zwiększyć refluks. Zwolnienie bawełnianej końcówki przed wyjęciem igły pomaga zmniejszyć refluks.Cofnij hydraulika i zobacz, jak porusza się powietrze i zebrany płyn. Wstrzyknąć strzykawkę do fiolki z krio. Dodatkowe powietrze oczyszcza martwą przestrzeń strzykawki.Tutaj możesz zobaczyć kod kreskowy, który jest trwale wygrawerowany na fiolce. Kod kreskowy jest następnie używany do zeskanowania próbki do formularza REDCap na komputerze na sali operacyjnej. Fiolka kriogeniczna zostanie natychmiast przeniesiona na suchy lód w komorze chłodzącej.Biopsje płynu do ciała szklistego można uzyskać na początku witrektomii przez przeszkolonego chirurga witreoretinalnego. Należy pamiętać, że frez do witrektomii nie zostanie zalany płynem. W jamie ciała szklistego aktywować nożownik do ciała szklistego bez infuzji, aby pobrać nierozcieńczoną próbkę ciała szklistego.Ręcznie odessać od 0,5 do jednego ml ciała szklistego za pomocą strzykawki podłączonej do kaniuli do wytłaczania ciała szklistego. Próbka jest następnie przetwarzana, jak wykazaliśmy, w celu uzyskania dokładnej próbki kości ramiennej. Ten film wideo jest przewodnikiem po wypełnionym formularzu zbierania próbek w REDCap w widoku ankiety.Gdy pacjent wypełni e-zgodę w asyście koordynatora badania klinicznego, formularz ten jest wypełniany. Dostęp do niego można uzyskać na tym samym urządzeniu, na które pacjent otrzymał elektroniczną zgodę, lub można uzyskać do niego dostęp za pomocą dowolnego innego zatwierdzonego urządzenia. Kopia wypełnionej e-zgody jest dostępna tutaj w celu weryfikacji podpisów.Następnie koordynator wypełnia inne odpowiednie sekcje, w tym rodzaj zgody, a w tej niebieskiej sekcji szczegóły dotyczące samego przypadku, takie jak chirurg, miejsce wykonania zabiegu, data pobrania i inne istotne informacje. W następnej zielonej sekcji pacjenta mamy dane demograficzne pacjentów, w tym przykładowy MRN, imię i nazwisko pacjenta, jego płeć, datę urodzenia z automatycznym obliczeniem wieku, lateralizację chorego oka i kategorię diagnostyczną. Ten formularz zawiera logikę rozgałęziania, więc zaznaczenie pola wyboru ma wpływ na wygląd pól wyboru znajdujących się poniżej.W tym przypadku jest to przedni odcinek i przypadek siatkówki. Więc najpierw wypełnia się diagnostyczną skrzynkę siatkówki. Koordynator wybrał, że jest to otwór w plamce żółtej i wypełniono również pole diagnostyczne przedniego odcinka.W tym przypadku wygląda na to, że jest to zaćma. Formularz historii przed operacją jest również wypełniany jako wolne pole tekstowe. W tym miejscu można skopiować i wkleić informacje z EMR lub wprowadzić nowe informacje o historii przedoperacyjnej do wykorzystania w przyszłości.Następnie, w tej czerwonej sekcji, mamy pole procedury. W tym przypadku wygląda na to, że wybrano witrektomię pars plana wraz z soczewką wewnątrzgałkową typu phaco. Wszystko, co nie zostało wypełnione w żadnym z tych pól wyboru, można wprowadzić w dowolnym tekście, korzystając z tych innych pól, które są rozsiane po całym formularzu.Uzupełnione są również istotne szczegóły dotyczące samej sprawy. Wreszcie w tej sekcji złota mamy obszar zbiórki. W tym miejscu wpisano imię i nazwisko koordynatora pobierającego próbkę wraz z liczbą używanych probówek z próbkami.Ponownie, korzystając z logiki rozgałęziania, jesteśmy w stanie zebrać tyle próbek, ile jest potrzebnych w danym przypadku. W tym przypadku pobrano dwie próbki, wyglądające jak rdzeń szklisty i próbka płynu z przedniej komory. Kody kreskowe każdej z tych próbek zostały zeskanowane i zapisane w formularzu.Na koniec znajduje się sekcja notatek z pobierania próbek, w której koordynator może wprowadzić odpowiednie szczegóły, w tym objętość i jakość pobranego płynu. W tej ostatniej sekcji przesyłania plików wszelkie istotne zdjęcia, filmy lub dokumenty można przesłać do samego formularza i połączyć. Wreszcie, gdy wszystko zostanie zakończone, koordynator może kliknąć przycisk Prześlij dalej, a formularz zostanie zapisany ze wszystkimi istotnymi informacjami, pomyślnie łącząc próbkę z pacjentem.Próbki należy przetransportować na suchym lodzie z sali operacyjnej do laboratorium. Zaloguj się do REDCap na komputerze laboratoryjnym. Weź jedną z pobranych próbek i zeskanuj kod kreskowy do bazy danych.Teraz potrzebny jest drugi pojemnik z suchym lodem i stojak na fiolki kriogeniczne. Kod kreskowy regału zostanie również zeskanowany do bazy danych, a próbki zostaną przeniesione do regału. Pozycja fiolek w stojaku jest dodawana do bazy danych, a wpis jest zapisywany i zamykany.Stojak z fiolkami jest następnie transportowany na suchym lodzie do lodówki w celu przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Ruszt jest dodawany do określonej pozycji w lodówce za pomocą układu współrzędnych. Umożliwi to późniejsze łatwe pobieranie próbek do dalszej analizy.Ten film wideo jest przewodnikiem po przykładowym formularzu przechowywania. W tym miejscu widzimy rekord pacjenta. To zielone kółko oznacza, że formularz zgłoszeniowy pobrania próbki został już wypełniony.To puste kółko oznacza, że formularz przechowywania musi zostać wypełniony. Formularz przechowywania musi być wypełniony dla każdej próbki pobranej na etapie formularza zgłoszeniowego. Kliknięcie tego kółka przeniesie nas do pierwszego formularza przechowywania próbek.Tutaj widzimy, że PID został wygenerowany, a MRN został zamaskowany. Informacje te są nadal dostępne i można uzyskać do nich dostęp za pomocą poprzedniej strony, klikając zielone kółko w formularzu zgłoszeniowym. Tutaj migawka próbki zostanie wygenerowana po ukończeniu tej strony.W uwagach do kolekcji widzimy, że informacje zostały automatycznie zaimportowane z formularza zgłoszeniowego. Następnie, w polu data archiwizacji rekordu, możemy wpisać datę, w której ten formularz jest wypełniany. Pod kodem kreskowym probówki próbki skanujemy lub ponownie wprowadzamy kod kreskowy probówki, która jest archiwizowana.W czasie rzeczywistym ta migawka próbki jest aktualizowana. W tej sekcji możemy wybrać, czy próbka jest przenoszona na zewnątrz. Tutaj wprowadzamy te istotne informacje.Na potrzeby tego przykładu wskażemy, że jest to próbka trafiająca do wewnętrznego repozytorium biologicznego. W ramach weryfikacji koordynator badania może cofnąć się i zweryfikować, czy zgoda elektroniczna lub papierowa została pomyślnie zrealizowana i zgodnie z protokołami. Wprowadzane jest imię i nazwisko osoby przeprowadzającej tę weryfikację, a korzystając z tej listy rozwijanej, weryfikator dopasowuje tutaj kod kreskowy do tego, co właśnie zostało wpisane.Zapewnia to dokładność. Następnie, w tej fazie lokalizacji, widzimy zamrażarkę, w której próbka będzie przechowywana. Możemy wskazać półkę, na której będzie przechowywana próbka, a także zapisać kod kreskowy pudełka, który można zeskanować lub wpisać.W tym miejscu można również wpisać etykietę pudełka, a etykietę można umieścić na pudełku w celu dalszego dopasowania. Następnie rejestrowane są dwie pozycje w wierszu i kolumnie. Gwarantuje to, że każdy kod kreskowy jest powiązany z pozycją w pudełku, która jest rejestrowana w celu łatwego odzyskania w przyszłości.W tej sekcji użycia możemy wpisać nazwę naszego projektu lub wybrać jedną z listy rozwijanej. Zapisać objętość próbki. W tym przypadku data i godzina, a także użytkownik, który ostatnio korzystał z tego formularza, są wypełniane automatycznie, aby zapewnić łańcuch dowodowy, który można przejrzeć i skontrolować w razie potrzeby.Osoba archiwizująca formularz wpisuje tutaj swoje imię i nazwisko oraz wskazuje wszelkie istotne notatki, które mogą być zgodne z tym, co chce zapisać w tym formularzu zgłoszeniowym do przechowywania. Na końcu znajduje się kolejna sekcja, w której można przesłać plik, a gdy wszystko zostanie zakończone, ten formularz można wypełnić i przesłać, klikając Zapisz i wyjdź, co prowadzi nas z powrotem do przeglądu pacjenta. Dla każdego dodatkowego formularza, który musi zostać wypełniony, dla każdej probówki, która musi być przechowywana, możemy kliknąć ten przycisk plusa, aby wrócić do formularza przechowywania próbki i wygenerować kolejny rekord.Ten przegląd zapewnia dostęp do formularza zgłoszeniowego, który został wygenerowany, a także do wszelkich kolejnych formularzy przechowywania tego rekordu pacjenta. W ten sposób jest łatwy do odzyskania i dostępny dla każdego, kto ma dostęp do zaplecza lub inne uprawnienia w ramach REDCap. Pobrane płynne biopsje można poddać różnorodnym analizom molekularnym, w tym proteomice, glikomice i metabolomice.Baza danych REDCap umożliwia proste i szybkie pobieranie próbek, na przykład poprzez wyszukiwanie próbek od pacjentów z określoną chorobą. Jest to przypadek 17-letniej pacjentki z obniżoną odpornością, u której wystąpiło zapalenie siatkówki i nerwu wzrokowego. W obawie przed zakażeniem wykonano biopsję cieczy wodnistej, która została wysłana do analizy DNA PCR.Wyniki były dodatnie dla CMV i ujemne dla HSV i toksoplazmozy i miały kluczowe znaczenie dla odróżnienia zakaźnych i niezakaźnych postaci zapalenia wewnątrzgałkowego i wyboru odpowiedniej terapii. Spektrometria mas z chromatografią cieczową umożliwia bezstronną i półilościową analizę proteomu. W płynnej biopsji ciała szklistego pacjenta poddanego witrektomii technika ta była w stanie zidentyfikować 484 unikalne białka, w tym dopełniacz C3, optycynę i kolagen typu 2.Trzy płynne biopsje ciała szklistego analizowano przy użyciu multipleksowego analizatora glikoproteomicznego. W teście wykryto profile glikozylacji 500 ludzkich białek, wychwytując różne szlaki biologiczne, takie jak metabolizm, odpowiedź immunologiczna, adhezja komórek i organizacja aktyny. Przeanalizowaliśmy również profil metabolomiczny biopsji cieczy wodnistej przy użyciu specjalnej formy spektrometrii mas.Zidentyfikowaliśmy 292 różne metabolity w trzech wodnych biopsjach płynów u ludzi. Analiza szlaków pozwoliła zidentyfikować różne szlaki metaboliczne, w tym metabolizm aminokwasów, cykl moczowy i syntezę karnityny. Podsumowując, nasz przepływ pracy stworzył praktyczny interfejs między salą operacyjną a laboratorium badawczym, który umożliwia ustandaryzowane i wysokowydajne gromadzenie, opisywanie i przechowywanie wysokiej jakości próbek chirurgicznych.Próbki mogą być wykorzystywane do dalszych analiz molekularnych, w tym do badań proteomicznych, glikomicznych i metabolomicznych. Nasz protokół stanowi cenną podstawę dla przyszłych badań translacyjnych.

biobanking-human-aqueous-vitreous-liquid-biopsies-for-molecular

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Guzy skórne są często usuwane po operacji mikrograficznej Mohsa. Opisano tutaj protokół, który umożliwia personelowi pomocniczemu klinicznemu skuteczne przetwarzanie i przechowywanie próbek guzów skóry (np. raka płaskonabłonkowego, raka podstawnokomórkowego i czerniaka) do dalszych zastosowań laboratoryjnych bez zakłócania operacji klinicznych.

Utworzenie klinicznego repozytorium biologicznego

W poniższej pracy opisujemy kolejne kroki niezbędne do stworzenia dużego biobanku raka jelita grubego i trzustki.

Stworzenie i utrzymanie żywego biobanku - jak to robimy

Woda to wysokowydajna płynna biopsja w leczeniu retinoblastomy, czyli raka wewnątrzgałkowego, którego nie można pobrać in vivo ze względu na ryzyko rozprzestrzeniania się przez zewnątrzoczne. Przedstawiono tutaj metodę bezpiecznego wyodrębniania wody za pomocą przezroczystej paracentezy rogówki oraz kroki analizy genomowej w celu identyfikacji prognostycznych biomarkerów.

Humor wodny jako biopsja płynna w leczeniu retinoblastomy: przezroczysta paracenteza rogówki i analiza genomowa

Biobanki są kluczowymi zasobami dla badań biomedycznych, a Biobank dla Jednostki Medycyny Translacyjnej i Cyfrowej w Europejskim Instytucie Onkologii jest wzorem w tej dziedzinie. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis standardowych procedur operacyjnych biobanków w zakresie zarządzania różnymi rodzajami próbek biologicznych pobranych od ludzi.

Biobank medycyny translacyjnej: Standardowe procedury operacyjne dla optymalnego zarządzania próbkami

Płynna biopsja zrewolucjonizowała nasze podejście do badań translacyjnych w onkologii, a pobieranie, jakość i przechowywanie próbek są kluczowymi krokami dla jej udanego zastosowania klinicznego. W tym miejscu opisujemy ustandaryzowany i zwalidowany protokół dla dalszych zastosowań DNA wolnych od krążenia, który może być stosowany w większości laboratoriów badań translacyjnych.

Standaryzowany protokół przedanalityczny do biopsji płynnej do dalszych zastosowań DNA wolnych od krążenia

Ten protokół opisuje metodę ułatwiającą pobieranie próbek z próbek po radykalnej prostatektomii. Celem jest zmapowanie, scharakteryzowanie i mikro-makro wypreparowanie próbek tkanek z próbek w oparciu o kryteria anatomopatologiczne przed przechowywaniem ich w biobanku.

Zwiększenie wiarygodności biobankowania guzów gruczołu krokowego dzięki ulepszonej technice pobierania próbek i charakterystyce histologicznej

Procedura ekstrakcji bezkomórkowego DNA z ciała szklistego i cieczy wodnistej w celu przeprowadzenia badań molekularnych w celu diagnozowania chłoniaka szklistego jest tutaj. Metoda ta daje możliwość jednoczesnej ekstrakcji DNA ze składnika komórkowego próbki lub zarezerwowania go do badań pomocniczych.

Bezkomórkowa ekstrakcja DNA z próbek ciała szklistego i cieczy wodnistej w diagnostyce i monitorowaniu chłoniaka szklistkowo-siatkówkowego

W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół pobierania próbek raka piersi, zaprojektowany tak, aby zoptymalizować ich zastosowanie w biobankowaniu, medycynie spersonalizowanej i innych zastosowaniach badawczych. Szczegółowo opisano proces pobierania próbek, w tym biopsję piersi i mastektomii, koncentrując się na minimalizacji uszkodzeń tkanek i maksymalizacji jakości próbki.

Optymalizacja procedur biopsji piersi i pobierania próbek po mastektomii dla biobankowania, medycyny spersonalizowanej i zastosowań badawczych

Niniejszy film przedstawia skuteczną technikę różnicowania i preparowania poszczególnych półprzezroczystych struktur ciała szklistego ludzkiego oka w materiale pośmiertnym.

Disekcja elementów ludzkiego ciała szklistego do analizy proteomicznej

Komórki nabłonka płuc można wyizolować z dróg oddechowych myszy i hodować na granicy fazy powietrze-ciecz jako model zróżnicowanego nabłonka oddechowego. Opisano protokół izolacji, hodowli i narażania tych komórek na dym papierosowy z głównego strumienia w celu zbadania odpowiedzi molekularnych na tę toksynę środowiskową.

Izolacja komórek nabłonka dróg oddechowych myszy i ekspozycja na eksperymentalny dym tytoniowy w układzie interfejsu powietrze-ciecz

Poznaj protokół standaryzowanego biobankowania płynnych biopsji oka — cieczy wodnistej i ciała szklistego — podczas chirurgii wewnątrzgałkowej. Metoda umożliwia analizy proteomiczne, glikomiczne i metabolomiczne.

Biobankowanie płynnych biopsji ludzkich roztworów wodnych i ciała szklistego do analiz molekularnych

Przeglądaj więcej filmów