Name: Przeprogramowanie gruczolakoraka przewodowego trzustki na pluripotencję (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Poznaj protokół przeprogramowania komórek gruczolakoraka przewodowego trzustki na komórki macierzyste iPSC. Metoda umożliwia badanie progresji raka trzustki i identyfikację markerów diagnostycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.S i J.K pragną podziękować Cancer Research UK i OHSU za finansowanie (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S jest wspierany przez nagrodę MRC za rozwój kariery (MR/N024028/1). AA jest finansowane ze stypendium doktoranckiego (stypendium nr ref. 1078107040) od Miasta Króla Abdulaziza na rzecz Nauki i Technologii. J.K jest finansowany przez MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) i grant Knight CEDAR (68182-933-000, 68182-939-000). Dziękujemy prof. Keisuke Kaji za uprzejme udostępnienie wektora przeprogramowania pSIN4-EF1a-O2S i pSIN4-CMV-K2M. Na potrzeby otwartego dostępu autor zastosował licencję Creative Commons Attribution (CC BY) do każdej wersji manuskryptu zaakceptowanej przez autora powstałej w wyniku tego zgłoszenia.

Reprogramming PDAC and Pancreatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Aby ułatwić wykorzystanie przeprogramowania iPSC do badania progresji raka, opracowano solidny protokół przeprogramowania komórek raka trzustki. Przeprogramowanie komórek rakowych na pluripotencję okazało się do tej pory bardzo trudne, ponieważ tylko kilka badań z powodzeniem wygenerowało iPSC z komórek rakowych 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46. W większości tych badań wykorzystano unieśmiertelnione linie komórek nowotworowych do generowania linii iPSC, a nie pierwotnych komórek pochodzących od pacjenta 36,37,38,40,42,43,44,46. Na przykład próbowano przeprogramować cztery różne linie komórkowe raka wątroby przy użyciu retrowirusowego wprowadzenia czynników OSKM, ale tylko jedna linia komórkowa została pomyślnie przeprogramowana41. Jednak wygenerowana linia iPSC raka wątroby wykazała utratę łodygi po kilku przejściach, co podkreśla wysoką odporność komórek rakowych na przeprogramowanie OSKM41. Wcześniej podjęto próby przeprogramowania komórek PDAC za pomocą indywidualnego dostarczania lentiwirusa OSKM; jednak wygenerowano tylko jedną linię iPSC, zależną od egzogennej ekspresji OSKM, a zatem nie w pełni przeprogramowaną37. W innym badaniu wykorzystano wektory epizodyczne do dostarczania czynników OSKM bez integracji genomowej, ale udało się wygenerować tylko pojedynczy klon iPSC z PDAC39. Ograniczony sukces w przeprogramowywaniu komórek nowotworowych stanowi kolejny powód do wielu wyzwań utrudniających wykorzystanie technologii iPSC w badaniach nad rakiem.
W tym miejscu wyjaśniono wytwarzanie iPSC z pierwotnych próbek PDAC pochodzących od dwóch różnych pacjentów i jednej ustalonej linii komórkowej PDAC (BxPc3). Co więcej, iPSC zostały również wygenerowane z H6c7, linii komórkowej nabłonka przewodowego trzustki. Według naszej wiedzy jest to pierwszy raport o pomyślnie uzyskanych stabilnych liniach iPSC z BxPc3 i H6c7. Zgodnie z tym protokołem, iPSC zostały również z powodzeniem wygenerowane z pierwotnych ludzkich fibroblastów pochodzących od zdrowych osób, co rozszerza zastosowanie tej metody poza badania nad rakiem.
Jednym z kluczowych elementów stojących za sukcesem protokołu jest wykorzystanie dwulicytronicznych wektorów lentiwirusowych do jednoczesnej ekspresji czynników OS i KM. Wektory te zawierają wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu 2 (IRES2) do ekspresji OCT4 i SOX2 w jednym wektorze oraz KLF4 i cMYC w drugim. Liczne badania z wykorzystaniem wektorów monocistronicznych, w których każdy czynnik przeprogramowujący był dostarczany indywidualnie, wykazały, że absorpcja każdego wektora jest inna, co wpływa na stechiometrię OSKM i wydajność przeprogramowania47. Korzystanie z wektorów bicistronic może pomóc złagodzić ten problem. Co więcej, zastosowanie IRES w wektorach lentiwirusowych wykazało znaczny wzrost wydajności przeprogramowania48. W tym systemie lentiwirusowym ekspresja OS jest sterowana przez promotor EF1a, podczas gdy ekspresja KM jest pod kontrolą promotora CMV. Wiadomo, że promotor CMV może być poddany wysoce wydajnemu wyciszaniu przez metylację DNA i deacetylację histonów, w przeciwieństwie do EF1a49,50. W związku z tym wczesne wyciszenie KM przed systemem operacyjnym podczas przeprogramowania może być kluczowym czynnikiem sukcesu protokołu. Jest to zgodne z wcześniejszymi badaniami pokazującymi znaczenie dynamiki ekspresji OSKM podczas przeprogramowania 51,52,53,54,55. Zatem wektor bicistroniczny jest również korzystniejszy niż wektor policistroniczny, w którym wszystkie czynniki OSKM są wyrażone z jednego promotora56. Inne czynniki, które przyczyniają się do sukcesu protokołu, to dawki infekcji lentiwirusem oraz liczba zakażonych komórek użytych do przeprogramowania, które zostały dostosowane do każdego typu komórki.
Podsumowując, przedstawiono zoptymalizowaną metodę przeprogramowania pierwotnych komórek PDAC wraz z innymi liniami komórkowymi i normalnymi komórkami. Metoda ta pomoże rozszerzyć zastosowanie przeprogramowania iPSC do modelowania progresji raka, a w tym przypadku do odkrycia wczesnych biomarkerów PDAC.

Gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC) jest jednym z najbardziej śmiertelnych nowotworów złośliwych, a wczesna diagnoza pozostaje wyzwaniem ze względu na bezobjawowy charakter choroby. Większość pacjentów z PDAC jest diagnozowana w zaawansowanym stadium przerzutowym, kiedy dostępne są bardzo ograniczone opcje leczenia1,2. Wynika to głównie z braku wiarygodnych biomarkerów dla wcześniejszych etapów, takich jak te, które można by wygodnie wykryć jako białka uwalniane do krwiobiegu.
PDAC może rozprzestrzeniać się bardzo wcześnie w trakcie swojej progresji, a lepsze rokowanie wiąże się z wczesnym wykrywaniem raka, gdy PDAC jest zlokalizowany w trzustce3. Jednak u mniej niż jednej dziesiątej pacjentów z PDAC diagnozuje się korzystne rokowanie, co pozwala na resekcję chirurgiczną. Niemniej jednak ci nieliczni z guzami resekcyjnymi są również podatni na nawroty guza w ciągu 12 miesięcy4.
W ciągu ostatnich pięćdziesięciu lat dokonano znacznych postępów w technikach chirurgicznych, opiece nad pacjentem i metodach leczenia5,6. Jednak 5-letni wskaźnik przeżycia u pacjentów z PDAC po operacji ledwo wzrósł do 17%. Niemniej jednak jest to i tak lepsze wynik niż u pacjentów bez resekcji, który pozostał prawie niezmieniony (0,9%)4,7. Chemioterapia jest jedynym innym alternatywnym sposobem leczenia PDAC. Jednak ta opcja jest bardzo ograniczona, ponieważ zdecydowana większość pacjentów z PDAC wykazuje silną oporność na leki chemioterapeutyczne, takie jak Gemcitabine7,8. Inne leki, takie jak erlotynib, są dostępne tylko dla niewielkiej grupy pacjentów z PDAC ze specyficznymi mutacjami, z których większość wykazuje oporność na erlotynib9. Niepożądane skutki uboczne związane z chemioterapią u większości pacjentów z PDAC są kolejną wadą tego leczenia10. Ostatnio obiecujące strategie wykazały, że inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych (ICI) i inhibitory kinaz małocząsteczkowych (SMKI) mogą być skuteczne w leczeniu PDAC, ale trwałe odpowiedzi na te terapie celowane pozostają ograniczone do mniejszości pacjentów11,12. Ogólnie rzecz biorąc, odkrycie wczesnych biomarkerów specyficznych dla PDAC może utorować nowe możliwości wczesnej diagnozy i leczenia.
PDAC rozwija się z zmian prekursorowych śródnabłonkowych nowotworów trzustki (PanIN), które wynikają z nieinwazyjnych proliferacji nabłonka przewodu trzustkowego13,14. Podczas gdy tworzenie PanIN jest inicjowane przez mutacje onkogenowe, takie jak KRAS, do progresji do PDAC wymagane są dodatkowe zmiany genetyczne i epigenetyczne. Przewiduje się, że postęp PanIN przez różne etapy inwazyjnego PDAC trwa około 10 lat13,15,16,17. Te ramy czasowe stanowią doskonałą okazję do skorzystania z wczesnej diagnozy PDAC. W związku z tym przeprowadzono szeroko zakrojone badania w celu ustalenia modeli zwierzęcych ksenoprzeszczepów nowotworowych i kultur organoidów w celu zbadania progresji PDAC18,19,20,21. Modele te okazały się bardzo przydatne do badania inwazyjnych stadiów PDAC, chociaż nie przejścia z wczesnych faz PanIN. Dlatego ważne jest opracowanie modeli eksperymentalnych, które mogą podsumować wczesną progresję etapów PanIN, aby umożliwić odkrycie biomarkerów wczesnego wykrywania.
Przeprogramowanie komórek somatycznych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) przy użyciu czterech czynników transkrypcyjnych OCT4, SOX2, KLF4 i c-MYC (OSKM) zilustrowało zakres plastyczności komórkowej22. Plastyczność komórek rakowych została dobrze udokumentowana, a przeprogramowanie ludzkich komórek rakowych w iPSC zostało z powodzeniem wykorzystane do zresetowania komórek do ich pierwotnego stanu komórkowego, usuwając wiele epigenetycznych zniewag, które nagromadziły się podczas progresji raka23,24,25,26,27,28,29. Możliwość wykorzystania tej strategii przeprogramowania do manipulowania tożsamością komórek nowotworowych jest zatem bardzo obiecująca w leczeniu raka30,31. Rzeczywiście, wcześniej wykazaliśmy, że różnicowanie iPSC pochodzących z PDAC może podsumować progresję PDAC przez wczesne etapy PanIN32. Identyfikując geny i szlaki specyficzne dla wczesnych i pośrednich stadiów PDAC, zidentyfikowano potencjalne biomarkery, które można klinicznie wykorzystać do wczesnej diagnozy PDAC32,33. Jednak biomarkery odkryte przy użyciu pojedynczej linii iPSC wykazały ograniczony zasięg u większości pacjentów z PDAC32. Wyzwania związane z generowaniem linii iPSC od innych pacjentów z PDAC zatrzymały możliwość odkrywania bardziej wiarygodnych biomarkerów. Wynika to z wielu czynników technicznych, w tym niejednorodności dostarczania OSKM, ponieważ tylko niewielka część ludzkich pierwotnych komórek PDAC zawierała wszystkie cztery czynniki i skutecznie reagowała na przeprogramowanie. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół przeprogramowania pierwotnych komórek PDAC przy użyciu bardziej wydajnego i spójnego dostarczania podwójnego lentiwirusa OSKM.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol (50 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anty-ludzki TRA-1-60-R</td><td>BioLegend</td><td>330613</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z przysadki bydlęcej (BPE)</td><td>Thermo Fisher</td><td>13028014</td><td></td></tr><tr><td>BxPc3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1687</td><td></td></tr><tr><td>Toksyna z Vibrio cholerae</td><td>Merck&nbsp;</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen, roztwór typu I z ogona szczura</td><td>Merck&nbsp;</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Ukończono zdefiniowany K-SFM</td><td>Thermo Fisher</td><td>&nbsp; 10744-019</td><td></td></tr><tr><td>Płytki wielodołkowe Corning Costar z powłoką TC Merck</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS3516</tr><tr><td>Filtry strzykawkowe Corning</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS431231</tr><tr><td>Naczynia hodowlane poddane kulturze tkankowej Corning</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLS430599 Dzień Impex&nbsp; Virkon Dezynfekujące tabletki wirusobójcze</td><td>Thermo Fisher</td><td>12328667</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Merck&nbsp;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Fugene HD&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>&nbsp; E2312</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór żelatyny typu B 2% w H2O</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Media (GMEM)</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie białko rekombinowane EGF</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie białko rekombinowane FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa), linia</td> komórek nabłonka ludzkiego przewodu trzustkowego PeproTech <td>Thermo Fisher</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>(H6c7)</td><td>Kerafast</td><td>ECA001-FP</td><td></td></tr><tr><td>Komórki zasilające iMEF&nbsp;</td><td>iXcells Biotechnologies</td><td>10MU-001-1V</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka wolna od keratynocytów w surowicy (KSFM)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17005-042</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM&nbsp;</td><td>Zamiennik serum Thermo Fisher</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HP 0,45 &mu; Jednostka filtrująca strzykawkę M (sterylna)</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>SLHP033RS</tr><tr><td>Opti-MEM Obniżona pożywka w surowicy&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>pMDG&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>187440</td><td></td></tr><tr><td>Polibren (bromek heksadimetryny)&nbsp;</td><td>Firma Merck&nbsp;</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-CMV-K2M&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>21164</td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-EF2-O2S&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>21162</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>AddGene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pWPT-GFP&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>12255</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (modyfikacja ATCC)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1049101</td><td></td></tr><tr><td>Sodym Pyrgronian</td><td>Thermo Fisher</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne strzykawki do jednorazowego użytku (60 ml)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>15899152</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x), czerwień fenolowa</td><td>Thermo Fisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Dichlorowodorek)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr></tbody></table>

przeprogramowanie gruczolakoraka przewodowego trzustki na pluripotencję

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) za pomocą czynników transkrypcyjnych zostało osiągnięte z prawie każdego zróżnicowanego typu komórek i okazało się bardzo cenne dla badań i zastosowań klinicznych. Co ciekawe, wykazano, że przeprogramowanie iPSC komórek rakowych, takich jak gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC), odwraca inwazyjny fenotyp PDAC i zastępuje epigenom raka. Różnicowanie iPSC pochodzących z PDAC może podsumować progresję PDAC od jego wczesnego prekursora śródnabłonkowej neoplazji trzustki (PanIN), ujawniając zmiany molekularne i komórkowe, które zachodzą na wczesnym etapie progresji PDAC. W związku z tym iPSC pochodzące z PDAC mogą być wykorzystywane do modelowania najwcześniejszych etapów PDAC w celu odkrycia markerów diagnostycznych wczesnego wykrywania. Jest to szczególnie ważne dla pacjentów z PDAC, którzy są zwykle diagnozowani w późnych stadiach przerzutów z powodu braku wiarygodnych biomarkerów dla wcześniejszych stadiów PanIN. Jednak przeprogramowanie linii komórek nowotworowych, w tym PDAC, na pluripotencję pozostaje trudne, pracochłonne i bardzo zmienne między różnymi liniami. W tym miejscu opisujemy bardziej spójny protokół generowania iPSC z różnych ludzkich linii komórkowych PDAC przy użyciu dwubitycznych wektorów lentiwirusowych. Powstałe w ten sposób linie iPSC są stabilne, nie wykazują zależności od egzogennej ekspresji czynników przeprogramowujących lub leków indukowalnych. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten ułatwia generowanie szerokiej gamy iPSC pochodzących z PDAC, co jest niezbędne do odkrycia wczesnych biomarkerów, które są bardziej specyficzne i reprezentatywne dla przypadków PDAC.

Reprezentatywne obrazy przedstawiające morfologię kolonii iPSC pochodzących z komórek PDAC, BXPc3, H6C7 i hFib pokazano na Rysunku 1. Kolonie PDAC-iPSC zaczęły tworzyć się w 25. dniu reprogramowania. Wyraźne kolonie iPSC o bardziej utrwalonej morfologii przypominającej ESC zidentyfikowano w 40. dniu reprogramowania (Rysunek 1). Podobnie formowanie BxPc3-iPSCs rozpoczęło się w 23. dniu i stało się bardziej utrwalone do 35. dnia. Tworzenie H6C7-iPSC przebiegało podobnie jak w przypadku PDAC-iPSCs i zaczęło się utrwalać w 45. dniu. Kolonie hFib-iPSC zaczęły tworzyć się w 15. dniu reprogramowania.
<img alt="Reprogramowanie komórek macierzystych, obrazy mikroskopowe przedstawiające iPSC na różnych etapach, morfologia komórkowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65811/65811fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Reprezentatywne obrazy kolonii iPSC. Obrazy przedstawiają ukształtowaną morfologię typu hESC pochodzącą z (A>) PDAC, (B>) BxPc3, (C>) H6c7 oraz (D>) hFib. Dni reprogramowania są zaznaczone nad każdym obrazem. Paski skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65811/65811fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Klonalne linie iPSC ustanowiono z każdej reprogramacji komórek PDAC, BxPc3, H6C7 oraz hFib. Wszystkie ustanowione linie iPSC wykazały pozytywne barwienie na TRA-1-60, marker powierzchniowy niediferencjonowanych komórek hESC, co potwierdziło ich reprogramowanie do stanu pluripotencji (Rysunek 2).
<img alt="Różnicowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, marker TRA-1-60, obraz mikroskopowy, analiza komórkowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65811/65811fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywne obrazy klonalnych linii iPSC. Obrazy pochodzą z (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 oraz (D) hFib, wykazujące morfologię przypominającą ESC (panele górne) oraz pozytywne barwienie na TRA-1-60 (panel dolny). Paski skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65811/65811fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Obecny protokół opisuje przeprogramowanie gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC) i normalnych komórek nabłonka przewodowego trzustki na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC). Zapewniamy zoptymalizowaną i szczegółową procedurę krok po kroku, od przygotowania lentiwirusa do ustanowienia stabilnych linii iPSC.

Przeprogramowanie gruczolakoraka przewodowego trzustki na pluripotencję

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...

Jednym z najtrudniejszych aspektów badania PDAC, czyli raka trzustki, jest dostępność modelu eksperymentalnego, który może podsumować postęp PDAC od wczesnych stadiów PanIN do stanu agresywnego. Innym wyzwaniem jest eksperymentalne uchwycenie plastyczności i niejednorodności PDAC. Tak więc wykorzystanie komórek iPS PDAC pomoże nam uporać się z niektórymi z tych wyzwań i poszerzyć nasze narzędzia eksperymentalne do badania tej choroby.Opracowaliśmy solidny protokół do przeprogramowania PDAC na komórki iPS. Generując więcej linii iPS od znacznie większej liczby pacjentów z PDAC, możemy badać przejście raka trzustki od wczesnych do zaawansowanych stadiów i zobaczyć podobieństwa i różnice między tymi liniami. Pomoże nam to odkryć wczesne markery diagnostyczne, które obejmują większą liczbę pacjentów i generować leki ukierunkowane na różne stany choroby.Interesującym pytaniem, które pojawiło się w wyniku przeprogramowania PDAC na komórki iPS, jest to, co sprawia, że ten rak jest tak odporny na konwersję losu komórki w porównaniu z normalnymi komórkami. Czy jest to spowodowane konkretnymi genami lub mutacjami genetycznymi, które mówią nam coś o tożsamości komórek rakowych? Na początek zobacz HEK293T komórek na 24 godziny przed transfekcją w 15-centymetrowej naczyniu zawierającej GMEM.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż osiągną 40 do 50% zgrywki. Oznacz trzy 15-mililitrowe plastikowe probówki odpowiednią nazwą lentiwirusa. Do każdej probówki dodać 1,710 mililitra zredukowanej pożywki surowicy i 90 mikrolitrów odczynnika do transfekcji.Wymieszaj zawartość przez wirowanie przed inkubacją probówek w temperaturze pokojowej. Po pięciu minutach dodać mieszaninę wektorów opakowaniowych do pożywki transfekcyjnej i wirować. Następnie dodać 7,5 mikrograma wektora przeprogramowania i kontrolki pWPT-GFP do odpowiedniej mieszaniny transfekcyjnej.Wiruj probówki przez dwie sekundy przed inkubacją przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Aby transfekować komórki 293T z każdym lentiwirusem, kroplami dodaj mieszaninę DNA transfekcji do naczynia. Inkubuj transfekowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Po 14 do 16 godzinach zastąp pożywkę 30 mililitrami świeżej pożywki 293T i kontynuuj inkubację przez 60 do 72 godzin. Codziennie obserwuj komórki i sprawdzaj skuteczność transfekcji. Następnie przenieś kulturę transfekcji wirusa do 15-mililitrowych probówek i wiruj w temperaturze 1 932 G przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Przefiltruj supernatant lentiwirusa za pomocą filtra strzykawkowego o średnicy 0,45 mikrona do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Na dzień przed transdukcją lentiwirusa przygotuj dwie studzienki z sześciodołkową płytką zawierającą 100 000 komórek PDAC na dołek. Przygotuj dwie 15-mililitrowe probówki z 2 mililitrami podgrzanego podłoża PDAC.W pierwszej probówce dodaj 12 mililitrów przeprogramowania lentiwirusa. Następnie dodaj 12 mikrolitrów polibrenu i wymieszaj pipetując. Do drugiej probówki dodaj 2 mikrolitry polibrenu.Teraz ostrożnie wyjmij pożywkę z każdej studzienki sześciodołkowej płytki i przemyj raz PBS w temperaturze pokojowej. Dodaj pożywkę infekcyjną do przeprogramowania z pierwszej probówki do pierwszego dołka. Dodaj mieszaninę z probówki drugiej do drugiego dołka.Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i 5% tlenem. Następnego dnia należy zastąpić pożywkę z obu studzienek świeżą pożywką PDAC i kontynuować inkubację przez okres do 48 godzin, jak pokazano. Na początek pokryj sześciodołkową płytkę 2 mililitrami 0,2% roztworu żelatyny na dołek.Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 30 minut. Następnie kroplami dodaj IMEF do 15-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów wstępnie podgrzanego ludzkiego podłoża do wydmuchiwania włókien i wymieszaj, delikatnie odwracając rurkę. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 309 G przez trzy minuty i usunąć supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 12 mililitrach ludzkiego podłoża z fibroblastów.Umieścić 2 mililitry zawiesiny komórkowej w każdym dołku pokrytej żelatyną sześciodołkowej płytki i inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Wyrzucić pożywkę z zakażonego lentiwirusem i niezakażonego PDAC i dwukrotnie przemyć komórki PBS. Następnie dodaj 500 mikrolitrów trypsyny, aby zdysocjować komórki i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i 5% tlenem przez 15 minut.Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 300 G przez pięć minut i ponownie zawiesić osad w 1 mililitrze pożywki PDAC. Umyj płytkę IMEF pożywką PDAC. Następnie dodaj 50 000 komórek PDAC zakażonych lentiwirusem na studzienkę do pięciu dołków płytki IMEF i inkubuj przez noc, jak wykazano wcześniej.Po przygotowaniu pożywki przeprogramowującej dodać 100 mikrolitrów podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów do 100 mililitrów pożywki przeprogramowującej. Następnego dnia umyj komórki rosnące na podajnikach IMEF dwukrotnie podgrzanym pożywką do przeprogramowywania. Następnie dodaj 2 mililitry pożywki do każdej studzienki i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i 3% tlenem.Po pięciokrotnym przejściu przez pulę iPSC obserwuj silne kolonie zachowujące morfologię podobną do ESC. PDAC, BxPC-3, H6c7 i ludzki fibroblast wykazują różne dni przeprogramowania, aby utworzyć dojrzałą morfologię podobną do ESC. Klonalne linie iPSC ustalono z każdego przeprogramowania PDAC, BxPc3, H6c7 i ludzkich komórek fibroblastów.Wszystkie ustalone linie iPSC wybarwiały się pozytywnie na obecność TRA-160, potwierdzając ich przeprogramowanie na pluripotencję.

reprogramming-pancreatic-ductal-adenocarcinoma-to-pluripotency

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Komórki macierzyste raka trzustki (CSC) mogą być namnażane in vitro za pomocą techniki hodowli sferycznej niezależnej od zakotwiczenia, która stanowi potężne narzędzie do badania biologii CSC i może służyć jako pierwszy krok do opracowania nowych terapii ukierunkowanych na CSC. W tym miejscu przedstawiono metodologię rozszerzania, analizowania i celowania w CSC trzustki.

Badanie charakterystyki komórek macierzystych raka trzustki w celu opracowania nowych strategii leczenia

Tutaj opisujemy 4-etapowy protokół różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do komórek progenitorowych trzustki NKX6-1+ in vitro. Protokół ten może być stosowany do różnych linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Skuteczne różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do progenitorów trzustki NKX6-1+

Ten protokół opisuje przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i błonowych mezenchymalnych komórek macierzystych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste przy użyciu nieintegrującego podejścia epizodycznego w pełni zdefiniowanych chemicznie warunkach. Szczegółowo opisano procedury ekstrakcji, hodowli, przeprogramowania i charakterystyki powstałych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą rygorystycznych metod.

Przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i komórek błonowych do pluripotencji w warunkach wolnych od ksenotypów

Ten protokół szczegółowo opisuje generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) bez śladu z ludzkich komórek trzustki w warunkach wolnych od karmienia, a następnie edycję za pomocą rybonukleoprotein CRISPR/Cas9 i charakterystykę zmodyfikowanych klonów pojedynczych komórek.

Wydajne generowanie i edycja IPSC bez zasilania z ludzkich komórek trzustki przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w komórki białka homeobox 1+ trzustki/dwunastnicy (PDX1+) w celu wytworzenia linii trzustki w oparciu o jednowarstwowy wzrost pojedynczych komórek bez typu kolonijnego. Metoda ta jest odpowiednia do wytwarzania jednorodnych komórek pochodzących z hPSC, manipulacji genetycznych i badań przesiewowych.

Wydajne wytwarzanie białka homeobox trzustki/dwunastnicy 1+ w tylnym odcinku jelita przedniego/trzustki z hPSC w kulturach adhezyjnych

Tutaj opisujemy klinicznie istotną, wysoce wydajną, bezkarmową metodę przeprogramowania ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste za pomocą zmodyfikowanych mRNA kodujących czynniki przeprogramowujące i dojrzałe mimiki mikroRNA-367/302. Uwzględniono również metody oceny efektywności przeprogramowania, ekspansji klonalnych kolonii iPSC i potwierdzenia ekspresji markera pluripotencji TRA-1-60.

Oparte na RNA przeprogramowanie ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Pierwotna izolacja komórek groniastych, ekspresja białka lub modulacja aktywności, hodowla i dalsze zastosowania są bardzo przydatne w badaniach ex vivo metaplazji acinar-przewodowej (ADM), wczesnego zdarzenia w rozwoju raka trzustki.

Naśladowanie i manipulowanie metaplazją pęcherzowo-przewodową trzustki w trójwymiarowej hodowli komórkowej

Hodowle organoidowe gruczolakoraka przewodowego trzustki pochodzące od pacjentów są szybko ustalonym trójwymiarowym modelem, który z dużą wiernością przedstawia przedziały komórek nowotworowych nabłonka, umożliwiając badania translacyjne nad tą śmiertelną złośliwością. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe metody tworzenia i rozmnażania organoidów, a także wykonywania odpowiednich testów biologicznych przy użyciu tych modeli.

Izolacja i charakterystyka modeli organoidowych gruczolakoraka przewodowego trzustki pochodzących od pacjenta

Obecny protokół opisuje ulepszoną metodę zwiększania koekspresji czynników transkrypcyjnych PDX1 i NKX6.1 w progenitorach trzustki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w płaskich monowarstwach. Osiąga się to poprzez uzupełnienie świeżej macierzy, manipulowanie gęstością komórek i dysocjację komórek endodermalnych.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w prekursory komórek beta trzustki w systemie hodowli 2D

Ten artykuł przedstawia protokół ukierunkowanego różnicowania i analizy funkcjonalnej komórek podobnych do komórek β. Opisujemy optymalne warunki hodowli i pasażki dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przed wytworzeniem komórek trzustki produkujących insulinę. Sześcioetapowe różnicowanie postępuje od ostatecznego tworzenia endodermy do funkcjonalnych komórek podobnych do komórek β wydzielających insulinę w odpowiedzi na glukozę.

Zoptymalizowany protokół generowania funkcjonalnych komórek wydzielających insulinę trzustkową z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

Poznaj protokół przeprogramowania komórek gruczolakoraka przewodowego trzustki na komórki macierzyste iPSC. Metoda umożliwia badanie progresji raka trzustki i identyfikację markerów diagnostycznych.

Przeprogramowanie gruczolakoraka przewodowego trzustki na pluripotencję

Przeglądaj więcej filmów