Name: Ex vivo Obrazowanie wapnia w modelu padaczki Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Poznaj technikę obrazowania wapnia ex vivo w mózgu Drosophila do badania padaczki. Metoda umożliwia monitorowanie aktywności neuronalnej i identyfikację genów związanych z epilepsją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fundację Podstawowych i Stosowanych Badań Podstawowych Guangdong (grant nr 2022A1515111123 dla Jing-Da Qiao) i planuje rozszerzyć badania naukowe w GMU (Jing-Da Qiao). Prace te były również wspierane przez Plan Zapobiegania Innowacyjności Studentów Uniwersytetu Medycznego w Kantonie (nr finansowania 02-408-2304-02038XM).

1. Protokół dla testu wrażliwego na uderzenie
<ol>
	<li>Ustal eksperymentalne muchy, przecinając linię sterownika tub-Gal4 z linią UAS-cac-RNAi za pośrednictwem systemu Gal4/UAS21. Zbierz dziewicze muchy z linii tub-Gal4 i samce much z linii UAS-cac-RNAi. Następnie przenieś dziewicę i samca muchy do tej samej fiolki, aby zebrać potomstwo. 
	UWAGA: Linia sterownika tub-Gal4 pozwoli na osiągnięcie globalnego knockdownu genu cac. Użyj linii UAS-cac-RNAi jako grupy kontrolnej.</li>
	<li>Po 3-5 dniach od eclosji delikatnie znieczulij muchy za pomocą 100% CO2 (sprzęt do znieczulenia CO2) i zbierz zarówno muchy tub-Gal4>UAS-cac-RNAi, jak i muchy UAS-cac-RNAi za pomocą pędzla. Przenieś te muchy do nowych, czystych fiolek z żywnością na 1 dzień przed badaniem, aby upewnić się, że są dobrze przygotowane.</li>
	<li>Delikatnie znieczulić muchy za pomocą CO2. Po znieczuleniu ostrożnie umieść 4-6 much w pojedynczych świeżych fiolkach. Pozwól muszkom dojść do siebie po znieczuleniu przez około 1 godzinę przed przystąpieniem do testowania. 
	UWAGA: Dla każdego genotypu przetestowano co najmniej pięć prób, a każde badanie składało się z sześciu fiolek much.</li>
	<li>Skonfiguruj urządzenie nagrywające. Ustaw aparat (720-1080P, co najmniej 30-60 kl./s, zablokowany AF) na statywie przed tablicą. Ręcznie wyreguluj ostrość aparatu za pomocą pustej fiolki, aby zapewnić wyraźny i dokładny materiał filmowy.</li>
	<li>Użyj mieszalnika wirowego, aby wykonać mechanicznie indukowane zachowanie podobne do napadu. Umieść każdą fiolkę zawierającą 4-6 much na mieszalniku wirowym i uruchom go na najwyższym ustawieniu (2800 obr./min) dokładnie przez 10 sekund. Po wirowaniu należy niezwłocznie umieścić fiolkę na tablicy.</li>
	<li>Obserwuj muchy i rejestruj wszelkie zachowania podobne do napadów, które wykazują. 
	UWAGA: Zachowanie podobne do napadu zaobserwowane u much składa się z trzech etapów: napad (objawiający się wibrującymi skrzydłami), paraliż i powrót do zdrowia24. Stosunek much napadowych do badanych much zdefiniowano jako częstość napadów.
	<ol>
		<li>Zmierz czas rekonwalescencji jako czas wymagany po wirowaniu, aż muchy odzyskają zdolność stania w pozycji pionowej25.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Protokół obrazowania wapniowego mózgu ex vivo
<ol>
	<li>Ustal odpowiednio muchy liniowe tub-Gal4>UAS-GCaMP6m i tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi. Wygeneruj muchy za pomocą systemu wyrażeń binarnych Gal4/UAS21, aby umożliwić monitorowanie aktywności wapnia w mózgu ex vivo.</li>
	<li>Przygotuj roztwór do rozwarstwiania zgodnie z opisem w dostarczonym przepisie (Tabela 1)26.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór zewnętrzny zgodnie z opisem w tabeli 1. Dostosuj do pH 7,2 za pomocą NaOH i dostosuj osmolarność do 250-255 mOsm/L. 
		UWAGA: Roztwór zewnętrzny można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień.</li>
		<li>W celu przygotowania roztworu preparacyjnego dodać 9 jednostek zawiesiny papainy i L-lizyny (2 mg/ml) do 600 μl roztworu zewnętrznego. Odwiruj roztwór i odczekaj 15 minut, aż roztwór będzie klarowny. 
		UWAGA: Zaleca się zużyć roztwór preparacyjny w ciągu 4 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór zewnętrzny należy przelać natlenioną solą fizjologiczną (95% tlenu i 5% dwutlenku węgla) przez 5 minut przed użyciem. Za pomocą pipety przenieś około 10 μl roztworu preparacyjnego na szalkę Petriego. Takie rozwiązanie zapewni niezbędne warunki do przeprowadzenia sekcji i obrazowania mózgu.</li>
	<li>Ostrożnie przeprowadź sekcję mózgów zarówno linii tub-Gal4>UAS-GCaMP6m, jak i tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi za pomocą igieł strzykawkowych i mikroskopu. Postępuj zgodnie z ustalonym protokołem sekcji mózgu27.</li>
	<li>Za pomocą pipety przenieś przygotowany mózg do naczynia rejestrującego zawierającego 5 ml świeżego roztworu zewnętrznego i unieruchamij mózg za pomocą uchwytu C-sharp w naczyniu nagrywającym na 3-5 minut w celu odzyskania sprawności. 
	UWAGA: Uchwyt C-sharp został wykonany z metalowego półkola o średnicy 7 mm skrzyżowanego równoległymi włóknami oddalonymi od siebie o 0,5 mm.</li>
	<li>Konfiguracja i akwizycja obrazowania konfokalnego
	<ol>
		<li>Aby uzyskać obrazowanie konfokalne, uchwyć każdy mózg za pomocą obiektywu 20x i trybu skanowania xyt. Zidentyfikuj neurony ciała grzyba za pomocą dodatkowego 4,5-krotnego wzmocnienia cyfrowego opartego na 20-krotnym wzmocnieniu optycznym. 
		UWAGA: Każdy mózg ex vivo może być obrazowany przez ponad 1 godzinę.</li>
		<li>Uzyskaj całą emisję mózgu-GCaMP6m przy wzbudzeniu laserowym 488 nm o mocy lasera 16 μw. Ustaw parametry skanowania na szybkość 400 pikseli przy rozmiarze piksela 256 x 256 pikseli. Użyj częstotliwości akwizycji 5,3 Hz i nagrywaj przez 3 minuty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zidentyfikuj 5-8 ROI w każdym mózgu i przeanalizuj fluorescencję. Ręcznie określ ciało komórkowe neuronów ciała grzyba jako obszar zainteresowania28.
	<ol>
		<li>Oznacz zidentyfikowane neurony i zmierz ich intensywność fluorescencji za pomocą ImageJ. Przeanalizuj dane fluorescencji GCaMP6m za pomocą %ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B). Zdefiniuj fluorescencję wewnątrzkomórkową, zwiększającą się od 2 do 2,5 odchylenia standardowego powyżej linii podstawowej, jako małe skoki, oraz fluorescencję wewnątrzkomórkową, zwiększającą się o więcej niż 2,5 odchylenia standardowego powyżej linii podstawowej, jako duże skoki. Przeanalizuj częstotliwość skoków wapnia za pomocą testu t-Studenta. 
		UWAGA: F0 zdefiniowano jako linię bazową na podstawie średniej intensywności fluorescencji początkowych 5 klatek w ROI, F1 jako intensywność fluorescencji w danym punkcie czasowym, a B jako tło bez fluorescencji. Czasowe czynności fizjologiczne neuronów są również pomocne w odróżnianiu ich od znaków szumu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Monitoring Epileptiform Events in Drosophila via Calcium Imaging

<ol><li>Thijs, R. D., Surges, R., O'brien, T. J., Sander, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epilepsy+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Epilepsy in adults.</a> Lancet. 393 (10172), 689-701 (2019).</li>
<li>Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epilepsy+genetics%3A+Clinical+impacts+and+biological+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights.</a> Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epilepsy-associated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Seizure%22%5BJournal%5D)">Epilepsy-associated genes.</a> Seizure. 44, 11-20 (2017).</li>
<li>Oliver, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes4epilepsy%3A+An+epilepsy+gene+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource.</a> Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).</li>
<li>Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+of+antiseizure+drugs+and+the+ketogenic+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780(2016).</li>
<li>Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+gated+sodium+channel+genes+in+epilepsy%3A+Mutations%2C+functional+studies%2C+and+treatment+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions.</a> Front Neurol. 12, 600050(2021).</li>
<li>Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+pentetrazol+on+neuronal+activity+and+on+extracellular+calcium+concentration+in+rat+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices.</a> Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).</li>
<li>Yang, W., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of neural activity.</a> Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).</li>
<li>Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+seizure+activity+in+a+novel+developmental+seizure+model%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model.</a> Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).</li>
<li>Ishimoto, H., Sano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+calcium+imaging+for+visualizing+brain+responses+to+endocrine+signaling+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila.</a> J Vis Exp. 136, 57701(2018).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+the+calcium-sensitive+photoproteins+aequorin+and+obelin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin.</a> Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).</li>
<li>Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoproteins+as+biological+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Photoproteins as biological calcium indicators.</a> Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+gcamp+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators.</a> Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spread+of+dendritic+excitation+in+layer+2%2F3+pyramidal+neurons+in+rat+barrel+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo.</a> Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).</li>
<li>Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+in+the+living+brain%3A+Prospects+for+molecular+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine.</a> Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).</li>
<li>Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+signals+in+vivo%3A+A+powerful+tool+in+physiology+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology.</a> Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).</li>
<li>Neher, E., Sakaba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+roles+of+calcium+ions+in+the+regulation+of+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release.</a> Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).</li>
<li>Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+neuronal+activity+in+drosophila+can+identify+anticonvulsive+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds.</a> PLoS One. 11 (2), 0148461(2016).</li>
<li>Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seizure+and+epilepsy%3A+Studies+of+seizure+disorders+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila.</a> Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).</li>
<li>Del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila.</a> Nat Methods. 9 (1), 47-55 (2011).</li>
<li>Liu, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+strategies+based+on+behavioral+and+electrophysiological+methods+for+epilepsy-related+gene+screening+in+the+drosophila+model%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model.</a> Front Mol Neurosci. 16, 1121877(2023).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+the+odor-evoked+distributed+neural+activity+in+the+drosophila+mushroom+body%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body.</a> Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unc13b+variants+associated+with+partial+epilepsy+with+favourable+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome.</a> Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).</li>
<li>Ganetzky, B., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+suppression+involving+behavioral+mutants+with+altered+nerve+excitability+in+drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster.</a> Genetics. 100 (4), 597-614 (1982).</li>
<li>Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O'dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+whole-cell+recordings+in+adult+drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain.</a> Bio Protoc. 8 (14), 2467(2018).</li>
<li>Gu, H., O'dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+cell+recordings+from+brain+of+adult+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole cell recordings from brain of adult drosophila.</a> J Vis Exp. (6), 248(2007).</li>
<li>Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input-timing-dependent+plasticity+at+incoming+synapses+of+the+mushroom+body+facilitates+olfactory+learning+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila.</a> Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).</li>
<li>Liu, C. -Q., Lin, Y. -M., Zhang, X. -X., Peng, R. -C., Qiao, J. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+CACNA1A+deficiency+against+seizure+in+the+CACNA1A-CELSR2+digenic+knockdown+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Research+Square%22%5BJournal%5D)">Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies.</a> Research Square. , (2023).</li>
<li>Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i, Guilmi, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cav2.1+voltage+activated+calcium+channels+and+synaptic+transmission+in+familial+hemiplegic+migraine+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis.</a> J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).</li>
<li>Le Roux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cacna1a-associated+epilepsy%3A+Electroclinical+findings+and+treatment+response+on+seizures+in+18+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Paediatr+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients.</a> Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).</li>
<li>Alehabib, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+molecular+spectrum+of+p%2Fq+type+calcium+channel+cav2.1+in+epileptic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients.</a> Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461(2021).</li>
<li>Li, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cacna1a+mutations+associated+with+epilepsies+and+their+molecular+sub-regional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications.</a> Front Mol Neurosci. 15, 860662(2022).</li>
<li>Indelicato, E., Boesch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+genotype+to+phenotype%3A+Expanding+the+clinical+spectrum+of+cacna1a+variants+in+the+era+of+next+generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing.</a> Front Neurol. 12, 639994(2021).</li>
<li>Saras, A., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+the+calcium+channel+gene+cacophony+suppress+seizures+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila.</a> Plos Genetics. 12 (1), e1005784(2016).</li>
<li>Cozzolino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+epileptiform+activity+in+zebrafish+by+statistical-based+integration+of+electrophysiology+and+2-photon+ca2%2B+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging.</a> Cells. 9 (3), 769(2020).</li>
<li>Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+seizure+induction+methods+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Characterization of seizure induction methods in drosophila.</a> eNeuro. 8 (4), (2021).</li>
<li>Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+joy+of+balancers%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genetics%22%5BJournal%5D)">The joy of balancers.</a> Plos Genetics. 15 (11), e1008421(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jon wapnia służy jako kluczowy drugi przekaźnik, odgrywając kluczową rolę w szeregu fizjologicznych i patofizjologicznych reakcji na zakłócenia zarówno chemiczne, jak i elektryczne. Ponadto zidentyfikowano element topologiczny presynaptycznych kanałów P/Q, kodowany przez ludzki gen CACNA1A, odpowiedzialny za pośredniczenie w wydzielaniu różnych neuroprzekaźników, w tym glutaminianu 30,31,32, i jest ściśle związany z padaczką<...

Padaczka, złożone przewlekłe zaburzenie neurologiczne charakteryzujące się nawrotami spontanicznych i niesprowokowanych napadów oraz nieprawidłową aktywnością sieci neuronalnej, dotknęło ponad 70 milionów osób na całym świecie, co czyni ją jedną z najczęstszych chorób neurologicznych1 i prowadzi do dużych obciążeń dla rodzin i społeczeństwa. Biorąc pod uwagę wpływ padaczki, przeprowadzono wiele badań mających na celu określenie etiologii napadów, których genetyka została zatwierdzona jako główna przyczyna wielu rodzajów padaczek lub zespołów padaczkowych2. W ciągu ostatnich dziesięcioleci postęp w technologiach genomicznych doprowadził do szybkiego wzrostu odkryć nowych genów związanych z padaczką, które odgrywają kluczową rolę w występowaniu napadów, w tym genów kanałów jonowych i niekanałów jonowych3,4. Jednak mechanizmy leżące u podstaw i analiza funkcjonalna między genami a fenotypami padaczkowymi nie są w pełni poznane. Identyfikacja genów i mechanizmów związanych z padaczką daje możliwość skutecznego leczenia pacjentów5,6.
Cytozolowe sygnały wapniowe są kluczowymi elementami aktywności neuronalnej i transmisji synaptycznej. Obrazowanie wapnia, w tym plastry mózgu7, in vivo8,9, i ex vivo10, jest wykorzystywane do monitorowania aktywności neuronalnej11 jako marker pobudliwości neuronalnej od lat 7012,13. Ostatnie postępy w technologii obrazowania, w połączeniu z genetycznie kodowanymi wskaźnikami wapnia (GECI), takimi jak GCaMP6, zrewolucjonizowały badanie padaczki zarówno na poziomie rozdzielczości całej mózgu, jak i pojedynczej komórki14,15,16, który charakteryzuje się wysokim poziomem precyzji czasoprzestrzennej. Zaobserwowano zmiany stężenia wapnia i stanów przejściowych odpowiednio w potencjałach czynnościowych i przekaźnictwie synaptycznym14, co wskazuje, że zmiana wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia wykazuje ścisłą korelację z pobudliwością elektryczną neuronów17,18. Obrazowanie wapnia zostało również zastosowane jako rozwojowy model napadów9 i przeprowadzone u Drosophila do badań przesiewowych związków przeciwdrgawkowych19.
Drosophila melanogaster wyłania się jako potężny organizm modelowy w badaniach naukowych, takich jak epilepsja, ze względu na swoją zaawansowaną genetykę molekularną i testy behawioralne20,21,22. Co więcej, zaawansowane narzędzia genetyczne u Drosophila przyczyniły się do ekspresji genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia GCaMP6. Na przykład binarne systemy transkrypcyjne oparte na Gal4 i UAS umożliwiają specyficzną ekspresję GCaMP6 w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo. Ponieważ Drosophila jest maleńkim organizmem, obrazowanie wapnia in vivo wymaga biegłych umiejętności operacyjnych w celu przeprowadzenia interwencji chirurgicznej, w której tylko niewielka część grzbietowej części mózgu została odsłonięta przez małe okno14,23. Jednocześnie obrazowanie ex vivo wapnia w nienaruszonym mózgu Drosophila może być wykorzystane do monitorowania obszarów zainteresowania (ROI) całego mózgu.
W tym badaniu prezentujemy obrazowanie ex vivo wapnia u dorosłych Drosophila z ekspresją GCaMP6 w celu monitorowania aktywności padaczkowej. CACNA1A jest dobrze znanym genem padaczki, CAC należy do kanału Cav2, który jest homologiem do CACNA1A. Zaczęliśmy od wypreparowania mózgów much cac knockdown tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi i zobrazowania ich za pomocą mikroskopu konfokalnego z trybem skanowania xyt. Następnie przeanalizowaliśmy zmiany w sygnałach wapniowych ROI, obliczając wskaźniki, które kwantyfikują spontaniczne zdarzenia podobne do napadów, takie jak wartość %ΔF / F i zdarzenia wapniowe fluorescencji GCaMP6. Dodatkowo przeprowadziliśmy bodziec mechaniczny za pomocą maszyny wirowej w celu wywołania testów zachowania napadowego na muchach z nokautem CAC, a także w celu walidacji wyników obrazowania wapnia. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten stanowi cenne narzędzie do badania zdarzeń moczowych u dorosłych Drosophila poprzez obrazowanie wapnia ex vivo, co pozwala na zbadanie potencjalnych mechanizmów padaczki na poziomie komórkowym.

<table><tbody><tr><td>Szczotki</td><td>Panera</td><td>AAhc022-2</td><td>do obsługi much</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>SP8; Zeiss, Jena, Niemcy.</td><td>Nie dotyczy</td> do <td>obrazowania wapnia</td></tr><tr><td>CO2 aparat anestezjologiczny</td><td>N/A</td><td>NIE DOTYCZY</td><td>do znieczulania muszek.</td></tr><tr><td>Uchwyt C-sharp</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>ręcznie robiony, do montażu mózgu</td></tr><tr><td>Fiolki do hodowli</td><td>Biologix</td><td>51-0500</td><td>Średnica 2,5 cm, wysokość 9,5 cm</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Fiji</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA</td><td>Wersja: 2.14.0</td><td>do analizy</td></tr><tr><td>Kostnica na muchy</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>ręcznie robiona, do obsługi much</td></tr><tr><td>Zapasy muchowe</td><td>cac-RNAi</td><td>27244</td><td>z Bloomington Drosophila Stock Center</td></tr><tr><td>Muchy</td><td>GCaMP6m</td><td>42750</td><td>z Bloomington Drosophila Stock Center</td></tr><tr><td>Muchy</td><td>tub-Gal4</td><td>N/A</td><td>z Sion-Frech Hoffmann Institute, Uniwersytet Medyczny w Kantonie</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Kamera o wysokiej rozdzielczości</td><td>NIE</td><td>DOTYCZY N/</td><td>A do rejestrowania zachowania przypominającego napad test</td></tr><tr><td>L-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5626</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorku magnezu (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Zawiesina papainy</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLW1480/02D</td><td>do rozwarstwienia</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Thermo Scientific</td><td>4640010, 4640030, 4640050, 4640060</td><td>do transportu odmierzonej objętości płynu i odłączonego mózgu</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie nagrywające</td><td>Thermo Scientific</td><td>150682- Szklane naczynie</td><td>do trzymania mózgu i obrazowania wapnia</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu ( NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25550</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy (NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>Stereo-mikroskop dwuokularowy</td><td>SHANG GUANG</td><td>XTZ-D</td><td>do obsługi much i preparacji</td></tr><tr><td>Igły strzykawkowe</td><td>pythonbio</td><td>HCL0693</td><td>do preparacji</td></tr><tr><td>Statyw</td><td>WEIFENG</td><td>45634732523</td><td>do nagrywania testu zachowań podobnych do napadów</td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>Tancerz laboratoryjny, IKA, Niemcy/Sigma-Aldrich</td><td>Z653438</td><td>do wykonywania testu zachowania podobnego do napadu</td></tr><tr><td>Tablica</td> suchościeralna <td>Nie</td><td></td> dotyczy <td>Ręcznie robione, podkładka piankowa lub papier jako tło</td></tr></tbody></table>

ex vivo obrazowanie wapnia w modelu padaczki drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Epilepsja to zaburzenie neurologiczne charakteryzujące się nawracającymi napadami, częściowo skorelowanymi z podłożem genetycznym, dotykające ponad 70 milionów osób na całym świecie. Pomimo klinicznego znaczenia padaczki, analiza funkcjonalna aktywności neuronalnej w ośrodkowym układzie nerwowym nie została jeszcze opracowana. Ostatnie postępy w technologii obrazowania, w połączeniu ze stabilną ekspresją genetycznie kodowanych wskaźników wapnia, takich jak GCaMP6, zrewolucjonizowały badania nad padaczką zarówno na poziomie rozdzielczości całej mózgu, jak i pojedynczej komórki. Drosophila melanogaster pojawiła się jako narzędzie do badania molekularnych i komórkowych mechanizmów leżących u podstaw padaczki ze względu na zaawansowaną genetykę molekularną i testy behawioralne. W tym badaniu przedstawiamy nowatorski i skuteczny protokół obrazowania wapnia ex vivo u dorosłych Drosophila z ekspresją GCaMP6 w celu monitorowania aktywności padaczkowej. Cały mózg jest przygotowywany z cac, dobrze znanego genu padaczki, muchy knockdown do obrazowania wapnia za pomocą mikroskopu konfokalnego w celu zidentyfikowania aktywności neuronalnej jako kontynuacji wrażliwego na huk testu zachowania podobnego do napadu. Muchy knockdown cac wykazywały wyższy wskaźnik zachowań podobnych do napadów padaczkowych i nieprawidłowych aktywności wapnia, w tym więcej dużych kolców i mniej małych kolców niż muchy typu dzikiego. Aktywność wapnia była skorelowana z zachowaniem podobnym do napadów. Metodologia ta służy jako skuteczna metodologia w badaniach przesiewowych genów patogennych dla padaczki i badaniu potencjalnego mechanizmu padaczki na poziomie komórkowym.

Stosując ten protokół, stwierdziliśmy, że muchy z wyciszeniem genu cac wykazywały znacznie wyższą częstość występowania zachowań przypominających napady drgawkowe niż muchy WT (17,00 ± 2,99 [n = 6] vs 4,50 ± 2,03 [n = 6]; P = 0,0061; test t Studenta, Rycina 1A). Większość much tub-Gal4&gt;UAS-cac-RNAi powróciła do stanu spoczynku w czasie 1-5 s, podczas gdy muchy UAS-cac-RNAi powróciły w czasie poniżej 2 s. Procent powrotu do stanu spoczy...

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania ex vivo wapnia u dorosłych Drosophila wykazujących ekspresję GCaMP6 w celu monitorowania aktywności epileptiformalnej. Protokół stanowi cenne narzędzie do badania zdarzeń moczowych u dorosłych Drosophila poprzez obrazowanie wapnia ex vivo, co pozwala na zbadanie potencjalnych mechanizmów padaczki na poziomie komórkowym.

Ex vivo Obrazowanie wapnia w modelu padaczki Drosophila

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...

Ostatnio odkryto wiele genów kandydujących na padaczkę, które muszą zostać zweryfikowane przez eksperymenty na zwierzętach. Dostarczamy zestaw technik do badania neuroaktywności związanej z padaczką, w tym zapis całych komórek, zapis wywołany EPSP oraz nowy, który tutaj przedstawimy, obrazowanie wapnia ex vivo. Ponieważ integralność mózgu i jego sieci neuronowych nie może być w pełni odtworzona w hodowli komórkowej lub wycinkach mózgu, główną zaletą obecnego eksperymentu jest uzyskanie nienaruszonej tkanki mózgowej chroniącej sieci neuronowe przed uszkodzeniem.Opracowaliśmy technikę obrazowania wapnia ex vivo wraz z wrażliwym na huk testem zachowania podobnego do napadów w celu skutecznego badania przesiewowego genów związanych z padaczką i zbadania mechanizmów leżących u podstaw padaczki na poziomie komórkowym. Wdrożyliśmy izolowane, nienaruszone tkanki mózgowe Drosophila do obrazowania wapnia, co pozwala uniknąć skomplikowanych technik chirurgicznych i zachować integralność sieci neuronowych. Podejście ex vivo może również wykorzystywać lepszy stosunek sygnału do szumu w porównaniu z technikami obrazowania in vivo.Na początek zbierz dziewicze muchy z linii hybrydowej tub-Gal4 i samce much z linii UAS-cac-RNAi. Przenieś muchy dziewicze i męskie do tej samej fiolki, aby zebrać potomstwo. Po trzech do pięciu dniach od eklacji użyj pędzla, aby zebrać potomstwo i muchy tub-Gal4>UAS-cac-RNAi.Dzień przed badaniem przenieś muchy do nowych, czystych fiolek z jedzeniem. Następnie ostrożnie umieść cztery do sześciu much znieczulonych dwutlenkiem węgla w pojedynczych świeżych fiolkach. Umieść aparat na statywie przed tablicą.Ręcznie wyreguluj ostrość aparatu za pomocą pustej fiolki. Teraz wiruj fiolki z muchami na najwyższym ustawieniu przez 10 sekund. Natychmiast umieść fiolkę na tablicy i obserwuj muchy pod kątem zachowań przypominających napady.Zmierz czas rekonwalescencji jako czas potrzebny muchom do odzyskania zdolności stania w pozycji pionowej. Muchy knockdown cac wykazywały znacznie wyższe wskaźniki zachowań podobnych do napadów niż muchy typu dzikiego. Odsetek odzyskanych much powalonych w ciągu jednej sekundy był znacznie niższy niż much typu dzikiego.Na początek wylej zewnętrzny roztwór z natlenioną solą fizjologiczną przez pięć minut. Za pomocą pipety przenieś 10 mikrolitrów roztworu preparacyjnego na szalkę Petriego. Teraz użyj igieł strzykawkowych i mikroskopu, aby dokładnie wypreparować mózgi znieczulonych much typu dzikiego i nokautującego.Za pomocą pipety przenieś przygotowany mózg do naczynia rejestrującego z pięcioma mililitrami roztworu zewnętrznego. Unieruchom mózgi za pomocą uchwytu C-sharp. Następnie uchwyć konfokalny obraz każdego mózgu z 20-krotnym powiększeniem.Użyj trybu skanowania XYT i zidentyfikuj neurony ciała grzyba przy dodatkowym 4,5-krotnym wzmocnieniu cyfrowym. Ustaw wzbudzenie lasera na 488 nanometrów z mocą lasera 16 mikrowatów, aby uzyskać emisję GCaMP6m całego mózgu. Następnie ustaw parametry skanowania na prędkość 1 400 przy rozmiarze piksela 256 na 256 pikseli.Ustaw szybkość akwizycji na 5,3 Hz i nagrywaj przez trzy minuty. Przeanalizuj fluorescencję od pięciu do ośmiu obszarów zainteresowania. Ręcznie określ ciało komórkowe neuronów ciała grzyba jako obszar zainteresowania.Użyj ImageJ, aby oznaczyć zidentyfikowane neurony i zmierzyć ich intensywność fluorescencji. Przeanalizuj dane fluorescencyjne GCaMP6m, jak pokazano. Zdefiniuj fluorescencję wewnątrzkomórkową zwiększającą się między dwoma a 2,5 odchyleniami standardowymi jako małe skoki, a te zwiększające się o więcej niż 2,5 odchylenia standardowego jako duże skoki.Sygnały wapniowe zaobserwowano w ciele grzybowym much. Muchy knockdown cac wykazywały więcej dużych kolców niż małych kolców.

ex-vivo-calcium-imaging-for-drosophila-model-of-epilepsy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film opisuje obrazowanie in vivo wapnia w neuronach Drosophila za pomocą GCaMP. Prezentowany klip protokołu pokazuje, jak rejestrować zmiany we fluorescencji GCaMP z neuronów ciała grzyba podczas eksperymentu kondycjonowania węchowego.

Drosophila In Vivo (Drosophila) in vivo (Drosophila) Obrazowanie wapnia: metoda funkcjonalnego obrazowania aktywności neuronalnej

Ten film demonstruje metodę obrazowania wapnia in vivo za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u muszek. Przedstawia etapy przygotowania muszek do mikroskopii, przeprowadzania kondycjonowania węchowego i wizualizacji napływu wapnia wywołanego zapachem.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u Drosophila melanogaster

Źródło: Ishimoto, H. et. al.,, Obrazowanie wapnia ex vivo do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila. J. Vis. exp. (2018) Ten film przedstawia obrazowanie wapnia do badaniaDrosophila reakcje mózgu na neuropeptydy. Neurony wyrażające fluorescencyjny wskaźnik wapnia ujawniają wewnątrzkomórkową dynamikę wapnia i funkcjonalne odpowiedzi na cząsteczki sygnałowe.

Obrazowanie wapnia ex vivo w celu zbadania reakcji mózgu Drosophila na neuropeptydy

Źródło: Lark, A. R., et. al., Podejście do funkcjonalnego obrazowania mózgu in vivo oparte na bioluminescencyjnym wskaźniku wapnia GFP-aequorin. J. Vis. exp. (2016)Ten film przedstawia obrazowanie dynamiki wapnia w czasie rzeczywistym za pomocą Greena bioluminescencja białka fluorescencyjnego i aequoryny w głębokich strukturach mózgu .

Obrazowanie bioluminescencyjne do badania stanów przejściowych wapnia w strukturach mózgu Drosophila

Ten artykuł opisuje adaptowalny protokół ex vivo do wizualizacji Ca2+ podczas aktywacji jaj u Drosophila.

Obrazowanie wapnia u Drosophila podczas aktywacji jaj

Ten artykuł opisuje protokół obrazowania ex vivo wapnia mózgu Drosophila. W tej metodzie do buforu można zastosować naturalne lub syntetyczne związki, aby przetestować ich zdolność do aktywacji określonych neuronów w mózgu.

Ex vivo Obrazowanie wapnia do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania sygnalizacji wapniowej w populacjach poszczególnych typów komórek w mysim złączu nerwowo-mięśniowym.

Ex vivo Obrazowanie specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy

Tutaj prezentujemy protokół, za pomocą którego można wizualizować wapń pre- i/lub postsynaptyczny w kontekście uczenia się i zapamiętywania Drosophila. Obrazowanie wapnia in vivo przy użyciu synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia jest połączone z klasycznym paradygmatem warunkowania węchowego, dzięki czemu można określić plastyczność synaptyczną leżącą u podstaw tego typu uczenia się asocjacyjnego.

Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster

Przedstawiamy protokoły obrazowania wapnia dla larwalnego neuronu węchowego Drosophila , wykorzystując miejscowy klej tkankowy do unieruchomienia. Ta metoda zwiększa stabilność, ułatwiając wiarygodne eksperymenty in vivo i ex-vivo . Niestandardowe skrypty R analizują sygnały wapnia, zapewniając efektywną platformę do szczegółowych badań neurofizjologicznych.

Obrazowanie wapnia in vivo i ex vivo neuronu obwodu węchowego u larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium

Opisujemy uznaną technikę pomiaru i analizy odpowiedzi wapniowych wywołanych zapachami w płacie antennym żywych Drosophila melanogaster.

Obrazowanie wapniowe odpowiedzi wywołanych zapachami w płacie antennym Drosophila

Poznaj technikę obrazowania wapnia ex vivo w mózgu Drosophila do badania padaczki. Metoda umożliwia monitorowanie aktywności neuronalnej i identyfikację genów związanych z epilepsją.

Ex vivo Obrazowanie wapnia w modelu padaczki Drosophila

Przeglądaj więcej filmów