Ex vivo Obrazowanie wapnia w modelu padaczki Drosophila
13 października 2023
Tutaj prezentujemy protokół obrazowania ex vivo wapnia u dorosłych Drosophila wykazujących ekspresję GCaMP6 w celu monitorowania aktywności epileptiformalnej. Protokół stanowi cenne narzędzie do badania zdarzeń moczowych u dorosłych Drosophila poprzez obrazowanie wapnia ex vivo, co pozwala na zbadanie potencjalnych mechanizmów padaczki na poziomie komórkowym.
Ostatnio odkryto wiele genów kandydujących na padaczkę, które muszą zostać zweryfikowane przez eksperymenty na zwierzętach. Dostarczamy zestaw technik do badania neuroaktywności związanej z padaczką, w tym zapis całych komórek, zapis wywołany EPSP oraz nowy, który tutaj przedstawimy, obrazowanie wapnia ex vivo. Ponieważ integralność mózgu i jego sieci neuronowych nie może być w pełni odtworzona w hodowli komórkowej lub wycinkach mózgu, główną zaletą obecnego eksperymentu jest uzyskanie nienaruszonej tkanki mózgowej chroniącej sieci neuronowe przed uszkodzeniem.
Opracowaliśmy technikę obrazowania wapnia ex vivo wraz z wrażliwym na huk testem zachowania podobnego do napadów w celu skutecznego badania przesiewowego genów związanych z padaczką i zbadania mechanizmów leżących u podstaw padaczki na poziomie komórkowym. Wdrożyliśmy izolowane, nienaruszone tkanki mózgowe Drosophila do obrazowania wapnia, co pozwala uniknąć skomplikowanych technik chirurgicznych i zachować integralność sieci neuronowych. Podejście ex vivo może również wykorzystywać lepszy stosunek sygnału do szumu w porównaniu z technikami obrazowania in vivo.
Na początek zbierz dziewicze muchy z linii hybrydowej tub-Gal4 i samce much z linii UAS-cac-RNAi. Przenieś muchy dziewicze i męskie do tej samej fiolki, aby zebrać potomstwo. Po trzech do pięciu dniach od eklacji użyj pędzla, aby zebrać potomstwo i muchy tub-Gal4>UAS-cac-RNAi.
Dzień przed badaniem przenieś muchy do nowych, czystych fiolek z jedzeniem. Następnie ostrożnie umieść cztery do sześciu much znieczulonych dwutlenkiem węgla w pojedynczych świeżych fiolkach. Umieść aparat na statywie przed tablicą.
Ręcznie wyreguluj ostrość aparatu za pomocą pustej fiolki. Teraz wiruj fiolki z muchami na najwyższym ustawieniu przez 10 sekund. Natychmiast umieść fiolkę na tablicy i obserwuj muchy pod kątem zachowań przypominających napady.
Zmierz czas rekonwalescencji jako czas potrzebny muchom do odzyskania zdolności stania w pozycji pionowej. Muchy knockdown cac wykazywały znacznie wyższe wskaźniki zachowań podobnych do napadów niż muchy typu dzikiego. Odsetek odzyskanych much powalonych w ciągu jednej sekundy był znacznie niższy niż much typu dzikiego.
Na początek wylej zewnętrzny roztwór z natlenioną solą fizjologiczną przez pięć minut. Za pomocą pipety przenieś 10 mikrolitrów roztworu preparacyjnego na szalkę Petriego. Teraz użyj igieł strzykawkowych i mikroskopu, aby dokładnie wypreparować mózgi znieczulonych much typu dzikiego i nokautującego.
Za pomocą pipety przenieś przygotowany mózg do naczynia rejestrującego z pięcioma mililitrami roztworu zewnętrznego. Unieruchom mózgi za pomocą uchwytu C-sharp. Następnie uchwyć konfokalny obraz każdego mózgu z 20-krotnym powiększeniem.
Użyj trybu skanowania XYT i zidentyfikuj neurony ciała grzyba przy dodatkowym 4,5-krotnym wzmocnieniu cyfrowym. Ustaw wzbudzenie lasera na 488 nanometrów z mocą lasera 16 mikrowatów, aby uzyskać emisję GCaMP6m całego mózgu. Następnie ustaw parametry skanowania na prędkość 1 400 przy rozmiarze piksela 256 na 256 pikseli.
Ustaw szybkość akwizycji na 5,3 Hz i nagrywaj przez trzy minuty. Przeanalizuj fluorescencję od pięciu do ośmiu obszarów zainteresowania. Ręcznie określ ciało komórkowe neuronów ciała grzyba jako obszar zainteresowania.
Użyj ImageJ, aby oznaczyć zidentyfikowane neurony i zmierzyć ich intensywność fluorescencji. Przeanalizuj dane fluorescencyjne GCaMP6m, jak pokazano. Zdefiniuj fluorescencję wewnątrzkomórkową zwiększającą się między dwoma a 2,5 odchyleniami standardowymi jako małe skoki, a te zwiększające się o więcej niż 2,5 odchylenia standardowego jako duże skoki.
Sygnały wapniowe zaobserwowano w ciele grzybowym much. Muchy knockdown cac wykazywały więcej dużych kolców niż małych kolców.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół obrazowania wapnia ex vivo u dorosłych much Drosophila wykazujących ekspresję GCaMP6 w celu zbadania aktywności epileptyformnej. Metoda ta ma na celu monitorowanie zdarzeń iktalnych u Drosophila, co pozwala na lepsze zrozumienie mechanizmów komórkowych leżących u podstaw epilepsji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- badania nad epilepsją
- obrazowanie wapnia
Wprowadzenie
- Kandydackie geny epilepsji wymagają walidacji przy użyciu modeli zwierzęcych.
- Techniki ex vivo zachowują nienaruszone sieci neuronalne, co jest kluczowe dla badania epilepsji.
- Obrazowanie wapnia oferuje wyższą jakość sygnału w porównaniu do podejść in vivo.
- Drosophila służy jako odpowiedni organizm modelowy do badań nad aktywnością neuronów.
Cel badania
- Opracowanie technik obrazowania wapnia ex vivo u Drosophila.
- Przesiewanie genów powiązanych z epilepsją i badanie podstawowych mechanizmów neuronalnych.
- Ilościowy pomiar zachowań przypominających napady drgawkowe.
Zastosowane metody
- Główną platformą badawczą jest obrazowanie poziomu wapnia ex vivo w nienaruszonych tkankach mózgu Drosophila.
- Model biologiczny obejmuje dorosłe osobniki Drosophila wykazujące ekspresję GCaMP6.
- Przedstawiono szczegółowe protokoły dyssekcji mózgu, konfiguracji obrazowania oraz analizy danych.
- Zastosowano testy behawioralne w celu oceny aktywności przypominającej napady drgawkowe.
- Miary ilościowe, takie jak intensywność fluorescencji, analizowano przy użyciu programu ImageJ.
Główne wyniki
- Obserwowano sygnały wapniowe w neuronach ciał grzybkowatych, zwracając szczególną uwagę na różnice między muchami z knockdownem a muchami typu dzikiego.
- Muchy z knockdownem Cac wykazywały znacznie większą aktywność przypominającą drgawki oraz zmieniony czas regeneracji.
- Dane fluorescencyjne wskazują na zwiększoną liczbę dużych skoków w grupie z knockdownem, co dostarcza wglądu w mechanizmy padaczki.
Wnioski
- Niniejszy protokół umożliwia badaczom analizę mechanizmów napadów u Drosophila, co ułatwia walidację genów w badaniach nad epilepsją.
- Zrozumienie wzorców sygnałów wapniowych pozwala na uzyskanie wiedzy na temat pobudliwości neuronalnej oraz potencjalnych celów terapeutycznych.
- Otrzymane wyniki poszerzają wiedzę o mechanizmach epilepsji dzięki zastosowaniu rygorystycznego podejścia obrazowego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie wapnia ex vivo u muszek *Drosophila* wykazujących ekspresję GCaMP6 umożliwia bezpośrednią funkcjonalną analizę genów związanych z epilepsją w obrębie nienaruszonych sieci neuronalnych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych poprzez korelację zaburzeń genetycznych z mierzalną aktywnością neuronalną i zachowaniami przypominającymi napady drgawkowe. Metoda ta wspiera decyzje na wczesnym etapie budowania portfolio, dostarczając wglądu w mechanizmy szlaków istotnych dla przebiegu choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia walidację funkcjonalną genów kandydackich w epilepsji w modelu genetycznie podatnym na manipulacje.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie wyciszenia genów ze zmianami aktywności neuronalnej.
- Ułatwia wyjaśnienie szlaków sygnałowych dzięki ilościowemu obrazowaniu nienaruszonych obwodów neuronalnych.
- Zapewnia pewność prognostyczną w zakresie rozwoju celów genetycznych w zaburzeniach neurologicznych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Ustanawia odtwarzalną platformę do badania wpływu genów patogennych na aktywność neuronalną.
- Dostarcza ilościowe wyniki, takie jak częstotliwość impulsów i intensywność fluorescencji, w celu standaryzacji analizy.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów procesów przesiewowych związków chemicznych lub modyfikacji genetycznych.
- Umożliwia wiarygodne porównanie fenotypów typu dzikiego i mutantów w kontrolowanym środowisku ex vivo.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wzorce aktywności neuronalnej istotne dla choroby z fenotypami behawioralnymi w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Wspiera dostosowany do ryzyka postęp badań poprzez korelację mechanizmów komórkowych z obserwowalnymi zachowaniami drgawkowymi.
- Stanowi pomost między odkryciami genetycznymi a walidacją modeli przedklinicznych w badaniach nad epilepsją.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten protokół obrazowania ex vivo integruje się z kontinuum badawczym, od walidacji celu po przedkliniczne badania mechanistyczne, wspierając zarówno weryfikację hipotez, jak i ilościowe fenotypowanie.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących funkcji genów w obwodach neuronalnych istotnych dla epilepsji.
- Przesiewy: Zapewnia standaryzowane, ilościowe odczyty służące do porównywania interwencji genetycznych lub farmakologicznych.
- Analityka: Dostarcza mierzalne wyniki, takie jak klasyfikacja impulsów (spike classification) i intensywność fluorescencji, umożliwiając rzetelną analizę statystyczną.
- Badania translacyjne: Łączy zmiany w aktywności komórkowej z behawioralnymi fenotypami napadów, wspierając dopasowanie biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną, wielokrotnego użytku platformę do genomiki funkcjonalnej i przesiewowej analizy neuroaktywności w odniesieniu do wybranych genów docelowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje testy aktywności neuronalnej w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności na wczesnym etapie odkrywania.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) poprzez powiązanie perturbacji genetycznych z mierzalnymi efektami neuronalnymi.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację genetycznych celów terapeutycznych w epilepsji z uwzględnieniem ryzyka w celu ich dalszego rozwoju.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w genetyce Drosophila oraz w technikach obrazowania konfokalnego.
- Niezbędny jest dostęp do mikroskopii konfokalnej i narzędzi do ilościowej analizy obrazu.
- Wymagana jest standaryzacja klasyfikacji kolców oraz testów behawioralnych pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać optymalizacji protokołu w celu zachowania integralności tkanek i parametrów obrazowania.
- Interpretacja ogranicza się do obwodów neuronalnych i zachowań modelowanych u Drosophila, zgodnie z zakresem protokołu.
