Test aktywności czynnika tkanki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych
29 grudnia 2023
Tutaj opisujemy wewnętrzny test aktywności czynnika tkanki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Testy oparte na aktywności i testy oparte na antygenach zastosowano do pomiaru czynnika tkankowego w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych z próbek ludzkiego osocza. Testy oparte na aktywności mają wyższą czułość i swoistość niż testy oparte na antygenach.
Niski poziom pęcherzyków zewnątrzkomórkowych dodatnich pod względem czynników tkankowych jest obecny w osoczu pacjentów z różnymi chorobami. Jednak większość testów opartych na antygenach, w tym ELISA i cytometria przepływowa, nie ma czułości pozwalającej na wykrycie tych niskich poziomów. W wielu pracach wykorzystano test ELISA lub cytometrię przepływową do wykrywania czynnika tkankowego w osoczu.
Nasz protokół mierzy aktywność czynnika tkankowego w osoczu z wysoką czułością i swoistością, chociaż istnieje pewna zmienność ze względu na zastosowanie testu funkcjonalnego. Istnieją komercyjne zestawy testowe, które mierzą poziom aktywności czynnika tkankowego w osoczu. Jednak zestawy te nie zawierają przeciwciał przeciwko czynnikom tkankowym, a zatem nie mogą rozróżnić generacji czynnika X zależnej od czynnika tkankowego i niezależnej od czynnika tkankowego.
Na początek rozmrozić izolowane próbki osocza krwi w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przenieś 100 mikrolitrów każdej próbki osocza do probówek o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj jeden mililitr bezwapniowego buforu HBSA do każdej probówki.
Odwirować próbki w temperaturze 20 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odessać supernatant do 20 mikrolitrów bez naruszania osadu. Następnie dodaj jeden mililitr bezwapniowego buforu HBSA do każdej probówki.
Następnie pipetować w górę i w dół, aby rozpuścić osad. Wiruj każdą rurkę przez kilka sekund, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Następnie odwirować go w temperaturze 20 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Ponownie odessać supernatant do 20 mikrolitrów bez naruszania osadu. Następnie rozpuść osad w 80 mikrolitrach bezwapniowego buforu HBSA. Pipetować zawiesinę w górę i w dół, aby uzyskać równomierną zawiesinę.
Aby zmierzyć aktywność czynnika tkanki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, najpierw odpipetuj 40 mikrolitrów próbki pęcherzyka zewnątrzkomórkowego do dwóch dołków z 96-dołkową płytką. Do pierwszej studzienki dodaj 11 mikrolitrów hamującego mysiego anty-ludzkiego TF IgG. Do drugiej studzienki dodaj 11 mikrolitrów myszy kontrolnej IgG.
Po inkubacji dodać 50 mikrolitrów roztworu mieszanki czynników do każdej studzienki. Przykryj płytkę folią, a następnie inkubuj płytkę przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj 25 mikrolitrów buforu HBSA EDTA, aby zatrzymać wytwarzanie czynnika 10a.
Rozpuść substrat chromogenny w wodzie destylowanej do stężenia czterech milimoli. Teraz dodaj 25 mikrolitrów substratu chromogenicznego do każdej studzienki. Przykryj talerz folią, a następnie zawiń go w folię aluminiową.
Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie odwirować płytkę o sile 1 500 G przez jedną minutę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki. Następnie umieść płytkę w czytniku płytek o długości fali 405 nanometrów.
Użyj krzywej standardowej wygenerowanej za pomocą relipidowanego rekombinowanego czynnika tkankowego, aby przeliczyć generację czynnika 10a w każdym dołku. Następnie oblicz zależne od czynnika tkankowego pokolenie czynnika 10a. Sześciu z 11 dawców miało średnią lub wysoką odpowiedź na lipopolisacharydy, podczas gdy pięciu z 11 dawców miało niską odpowiedź na lipopolisacharydy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę pomiaru aktywności czynnika tkankowego w płaszczyznach pozakomórkowych z ludzkiej osocza. Metoda wykazuje wyższą czułość i swoistość w porównaniu z tradycyjnymi metodami opartymi na antygenach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
Tło
- Niskie poziomy dodatnich pod względem czynnika tkankowego płaszczyzn pozakomórkowych występują w osoczu z różnych chorób.
- Metody oparte na antygenach, takie jak ELISA i cytometria przepływowa, często nie mają wystarczającej czułości do wykrywania.
- Istniejące komercyjne zestawy nie rozróżniają pomiędzy generacją czynnika X zależną i niezależną od czynnika tkankowego.
Cel badania
- Pomiar aktywności czynnika tkankowego w osoczu z poprawioną czułością i swoistością.
- Dostarczenie funkcjonalnej metody, która może wykrywać niskie poziomy czynnika tkankowego.
- Rozwiązanie ograniczeń obecnych metod wykrywania opartych na antygenach.
Zastosowane metody
- Własna metoda pomiaru aktywności czynnika tkankowego w płaszczyznach pozakomórkowych.
- Porównanie metod opartych na aktywności i antygenach.
- Ocena czułości i swoistości w wykrywaniu czynnika tkankowego.
- Analiza zmienności wyników funkcjonalnej metody.
Główne wyniki
- Metody oparte na aktywności wykazały wyższą czułość w porównaniu z metodami opartymi na antygenach.
- Funkcjonalna metoda z powodzeniem wykryła niskie poziomy czynnika tkankowego w osoczu.
- Zmienność była zauważalna w wynikach ze względu na naturę funkcjonalnej metody.
- Komercyjne zestawy okazały się nieadekwatne do rozróżniania aktywności czynnika tkankowego.
Wnioski
- Własna metoda zapewnia niezawodny sposób pomiaru aktywności czynnika tkankowego.
- Oferuje znaczącą poprawę w porównaniu z tradycyjnymi metodami opartymi na antygenach.
- Ta metoda może poprawić rozumienie roli czynnika tkankowego w różnych chorobach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of tissue factor activity in extracellular vesicles is critical for de-risking thrombotic liability and understanding disease-associated coagulopathies in early drug discovery. The described activity-based assay enables sensitive and specific detection of TF-positive EVs, supporting mechanistic target validation and portfolio triage in indications where coagulation pathways are implicated. This capability enhances predictive confidence at the interface of discovery biology and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of tissue factor activity in disease-relevant plasma samples.
- Supports biological de-risking by distinguishing TF-dependent from TF-independent FXa generation.
- Improves predictive confidence for target validation in coagulation and inflammation pathways.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, quantitative readout for EV-associated tissue factor activity.
- Facilitates assay standardization and reproducibility through use of a chromogenic substrate and standard curve.
- Enables reliable evaluation of compound effects on TF activity in screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by quantifying TF-positive EVs linked to disease severity.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in models of thrombosis and coagulopathy.
- De-risks advancement decisions by providing mechanistic evidence of TF activity modulation.
Pipeline & Workflow Integration
This activity assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing, target validation, and translational biomarker alignment for coagulation-related programs.
- Discovery Biology: Supports mechanistic hypothesis testing and clarifies TF pathway involvement in disease models.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs for compound screening and assay development.
- Analytics: Provides sensitive FXa generation measurements and statistical discrimination of TF-dependent activity.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical biomarker strategies in thrombotic risk assessment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for functional EVTF activity measurement across multiple programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in TF-related target validation.
- Operational Value: Enhances assay standardization, reproducibility, and scalability for cross-program use.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in coagulation-focused portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of assets with TF pathway involvement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in coagulation biology and functional assay development.
- Needs access to plate readers, centrifugation infrastructure, and validated reagents.
- Demands cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- May require adaptation for different plasma sources or disease models.
- Functional assay variability should be managed through rigorous controls and standard curves.
