Name: Test aktywności czynnika tkanki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 3 min 53 s
Description: Poznaj test aktywności czynnika tkanki w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych z osocza ludzkiego. Ta metoda oferuje wyższą czułość i swoistość w porównaniu do tradycyjnych testów antygenowych ELISA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH NHLBI R35HL155657 (N.M.) i profesurę Johna C. Parkera (N.M.). Chcielibyśmy podziękować Pani Sierra J. Archibald za jej pomocne uwagi

Badania zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board Uniwersytetu Północnej Karoliny w Chapel Hill (numer protokołu: 14-2108).
1. Pobieranie krwi od dawców
<ol>
	<li>Pobrać krew pełną za pomocą czystego nakłucia dożylnego do żyły łokciowej za pomocą igły 21 G. Wyrzuć pierwsze 3 ml krwi, ponieważ ta część krwi może zawierać TF z komórek okołonaczyniowych.</li>
	<li>Pobrać 2,7 lub 1,8 ml (w zależności od wielkości probówek) krwi do urządzenia próżniowego zawierającego 3,2% cytrynianu sodu (0,109 mol/l). Nie przepełniaj ani nie przepełniaj rurek. Delikatnie odwróć probówki natychmiast po pobraniu krwi, aby rozproszyć cytrynian sodu.</li>
	<li>Unikaj mieszania, jeśli probówki są transportowane przed obróbką. Osocze należy przygotować w ciągu 2 godzin od pobrania krwi.</li>
</ol>
2. Przygotowanie osocza kontroli negatywnej
UWAGA: Próbki nie powinny być umieszczane na lodzie w żadnym momencie przed ostatecznym zamrożeniem.
<ol>
	<li>Przygotuj osocze kontroli ujemnej przy użyciu pełnej krwi od zdrowych ochotników. Bezpośrednio po pobraniu krwi należy przygotować osocze bezpłytkowe w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Przenieść próbki krwi z probówek próżniowych do probówek o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Odwirować próbki krwi o masie 2 500 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej (20-24 °C) bez hamowania.</li>
		<li>Przenieść supernatant (osocze ubogie w płytki krwi) do nowej probówki i powtórzyć wirowanie w tych samych warunkach.</li>
		<li>Przenieść supernatant (osocze zubożone w płytki krwi) do nowej probówki.</li>
		<li>Podzielić próbkę na podwielokrotności o objętości ≥100 μl. Pozostawić około 100 μl na dnie probówki.</li>
		<li>Natychmiast zamrozić osocze zubożone w płytki krwi w temperaturze -80 °C (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie osocza kontroli pozytywnej
UWAGA: Reakcja na lipopolisacharyd jest różna u poszczególnych osób.
<ol>
	<li>Przenieś próbki krwi z urządzeń próżniowych do probówek o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Przygotować osocze kontroli dodatniej przy użyciu pełnej krwi od zdrowych ochotników stymulowanej lipopolisacharydem (LPS) z Escherichia coli O111:B4 (10 μg/ml) przez 5 godzin w temperaturze 37 °C z mieszaniem.</li>
	<li>Po 5 godzinach inkubacji wykonaj kroki od 2.1.2 do 2.1.6.</li>
</ol>
4. Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza
UWAGA: Granulki EV mogą nie być widoczne. Czas rozmrażania zależy od objętości próbki, ale zazwyczaj rozmrażamy 100 μl osocza przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
<ol>
	<li>Rozmrażanie próbek osocza w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 1 ml HBSA bez buforu wapniowego [HBSA-Ca(-)] [137 mM NaCl, 5,38 mM KCl, 5,55 mM glukozy, 10 mM HEPES, 0,1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej] do każdych 100 μl próbki osocza w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odwirować próbki osocza o masie 20 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant do 20 μl bez naruszania osadu EV.</li>
	<li>Rozpuścić osad EV, dodając 1 ml buforu HBSA-Ca(-) do każdej probówki, pipetować w górę i w dół w miejscu osadu EV i wirować każdą probówkę przed odwirowaniem po raz drugi w temperaturze 20 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant do 20 μl bez naruszania osadu EV.</li>
	<li>Rozpuść osad EV w 80 μl HBSA-Ca(-) i pipetuj w górę iw dół w miejscu, w którym znajduje się osad EV (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>
5. Opcja: Izolacja małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą ultrawirówki
<ol>
	<li>Po wykonaniu czynności 4.3 zebrać supernatant i ultraodwirować w temperaturze 100 000 × g przez 70 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant do 20 μl bez naruszania osadu EV.</li>
	<li>Rozpuścić osad EV, dodając 1 ml buforu HBSA-Ca(-) do każdej probówki i wymieszać każdą probówkę przed ponownym ultraodwirowaniem w temperaturze 100 000 × g przez 70 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant do 20 μl bez naruszania osadu EV.</li>
	<li>Rozpuść osad EV w 80 μl HBSA-Ca(-).</li>
</ol>
6. Pomiar aktywności czynnika tkanki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych
UWAGA: Próbki EV powinny być pipetowane i dobrze zwirowane, aby wymieszać przed dodaniem do studzienek. EDTA-disód hamuje zdolność FXa do rozszczepiania substratu chromogennego. W związku z tym EDTA-disód nie może być stosowany jako zamiennik EDTA-tetrasodu w kroku 6.7.
<ol>
	<li>Dodać 40 μl próbki EV do dwóch dołków 96-dołkowej płytki.</li>
	<li>Dodaj 11 μl hamującej mysiej anty-ludzkiej TF IgG [(36,4 μg / ml, końcowe stężenie 7,8 μg / ml)] do jednego dołka próbki EV i 11 μl kontrolnej mysiej IgG [(36,4 μg / ml, końcowe stężenie 7,8 μg / ml)] do drugiego dołka.</li>
	<li>Inkubować 96-dołkową płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W czasie inkubacji należy przygotować 50 μl/basenik wzorców TF (0, 0,32, 0,63, 1,25, 2,5, 5, 10 i 20 pg/ml) w dwóch egzemplarzach, używając relipidowanego rekombinowanego TF.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę czynnikową, mieszając 4 ml HBSA z wapniem [HBSA-Ca(+)] [HBSA-Ca(-) + 10 mM CaCl2, stężenie końcowe 10 mM], 800 μl 900 nM FX w HBSA-Ca(+) (stężenie końcowe: 146,4 nM) i 120 μL 200 nM FVIIa w HBSA-CA(+) (stężenie końcowe: 4,8 nM).</li>
	<li>Dodać 50 μl roztworu mieszanki czynników do każdego dołka, przykryć płytkę folią i inkubować przez 2 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 2 godzinach zatrzymać wytwarzanie FXa przez dodanie 25 μl buforu HBSA kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) [HBSA-Ca(-) + 25 mM EDTA-tetrasod, końcowe stężenie 5 mM] i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozpuść substrat chromogenny, który jest rozszczepiany przez FXa do 4 mM (dodać 8,7 ml wody destylowanej do fiolki 25 mg).</li>
	<li>Dodać 25 μl roztworu substratu chromogennego do każdej studzienki, przykryć płytkę folią, a następnie folią aluminiową w celu ochrony przed światłem i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 15 minutach inkubacji usunąć pęcherzyki za pomocą igły lub przez odwirowanie w stężeniu 1 500 × g przez 1 minutę.</li>
	<li>Przed odczytem odczytać płytkę przy długości fali 405 nm za pomocą czytnika płytek z jedną mieszanką.</li>
	<li>Przelicz generację FXa każdego dołka na aktywność TF, korzystając z krzywej standardowej wygenerowanej przy użyciu relipidowanego rekombinowanego TF.</li>
	<li>Obliczać Generacja FXa zależna od TF (aktywność EVTF) za pomocą równania (1): 
	Generacja FXa zależna od TF (aktywność EVTF [pg/ml]) = Całkowita generacja FXa (dobrze kontrolna IgG) - Generacja FXa niezależna od TF (studnia anty-TF IgG) (<silna klasa="xfig">Rysunek 3) (1)</li>
</ol>

Improved Sensitivity for Tissue Factor Activity Assay in Extracellular Vesicles

<ol><li>Grover, S. P., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor%3A+an+essential+mediator+of+hemostasis+and+trigger+of+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue factor: an essential mediator of hemostasis and trigger of thrombosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 709-725 (2018).</li>
<li>Shaw, A. W., Pureza, V. S., Sligar, S. G., Morrissey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+local+phospholipid+environment+modulates+the+activation+of+blood+clotting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The local phospholipid environment modulates the activation of blood clotting.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6556-6563 (2007).</li>
<li>Tavoosi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+phospholipid+synergy+in+blood+clotting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of phospholipid synergy in blood clotting.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23247-23253 (2011).</li>
<li>Wang, J., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingomyelin+encrypts+tissue+factor%3A+ATP-induced+activation+of+A-SMase+leads+to+tissue+factor+decryption+and+microvesicle+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">Sphingomyelin encrypts tissue factor: ATP-induced activation of A-SMase leads to tissue factor decryption and microvesicle shedding.</a> Blood Advances. 1 (13), 849-862 (2017).</li>
<li>Kornhuber, J., Rhein, C., Muller, C. P., Muhle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+sphingomyelinase+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Secretory sphingomyelinase in health and disease.</a> Biological Chemistry. 396 (6-7), 707-736 (2015).</li>
<li>Versteeg, H. H., Ruf, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+coagulant+function+is+enhanced+by+protein-disulfide+isomerase+independent+of+oxidoreductase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tissue factor coagulant function is enhanced by protein-disulfide isomerase independent of oxidoreductase activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (35), 25416-25424 (2007).</li>
<li>Reinhardt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+disulfide+isomerase+acts+as+an+injury+response+signal+that+enhances+fibrin+generation+via+tissue+factor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Protein disulfide isomerase acts as an injury response signal that enhances fibrin generation via tissue factor activation.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (3), 1110-1122 (2008).</li>
<li>Langer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+activation+of+monocyte+tissue+factor+by+antithymocyte+globulin+is+dependent+on+complement+and+protein+disulfide+isomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Rapid activation of monocyte tissue factor by antithymocyte globulin is dependent on complement and protein disulfide isomerase.</a> Blood. 121 (12), 2324-2335 (2013).</li>
<li>Bogdanov, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatively+spliced+human+tissue+factor%3A+a+circulating%2C+soluble%2C+thrombogenic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alternatively spliced human tissue factor: a circulating, soluble, thrombogenic protein.</a> Nature Medicine. 9 (4), 458-462 (2003).</li>
<li>Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatively+spliced+tissue+factor+-+one+cut+too+many%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Alternatively spliced tissue factor - one cut too many.</a> Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 5-8 (2007).</li>
<li>Censarek, P., Bobbe, A., Grandoch, M., Schror, K., Weber, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatively+spliced+human+tissue+factor+%28asHTF%29+is+not+pro-coagulant%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Alternatively spliced human tissue factor (asHTF) is not pro-coagulant.</a> Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 11-14 (2007).</li>
<li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles%2C+current+state-of-the-art%3A+emerging+role+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).</li>
<li>Osterud, B., Bjorklid, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+in+blood+cells+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience+%28Elite+Edition%29%22%5BJournal%5D)">Tissue factor in blood cells and endothelial cells.</a> Frontiers in Bioscience (Elite Edition). 4 (1), 289-299 (2012).</li>
<li>Hisada, Y., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell-derived+tissue+factor-positive+extracellular+vesicles%3A+biomarkers+of+thrombosis+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Cancer cell-derived tissue factor-positive extracellular vesicles: biomarkers of thrombosis and survival.</a> Current Opinion in Hematology. 26 (5), 349-356 (2019).</li>
<li>Vatsyayan, R., Kothari, H., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Hydroxy-2-nonenal+enhances+tissue+factor+activity+in+human+monocytic+cells+via+p38+mitogen-activated+protein+kinase+activation-dependent+phosphatidylserine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">4-Hydroxy-2-nonenal enhances tissue factor activity in human monocytic cells via p38 mitogen-activated protein kinase activation-dependent phosphatidylserine exposure.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (7), 1601-1611 (2013).</li>
<li>Mackman, N., Sachetto, A. T. A., Hisada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+tissue+factor-positive+extracellular+vesicles+in+plasma%3A+strengths+and+weaknesses+of+current+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Measurement of tissue factor-positive extracellular vesicles in plasma: strengths and weaknesses of current methods.</a> Current Opinion in Hematology. 29 (5), 266-274 (2022).</li>
<li>Lee, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-analytical+and+analytical+variables+affecting+the+measurement+of+plasma-derived+microparticle+tissue+factor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Pre-analytical and analytical variables affecting the measurement of plasma-derived microparticle tissue factor activity.</a> Thrombosis Research. 129 (1), 80-85 (2012).</li>
<li>Claussen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicle-associated+tissue+factor+procoagulant+activity+for+the+preoperative+diagnosis+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Microvesicle-associated tissue factor procoagulant activity for the preoperative diagnosis of ovarian cancer.</a> Thrombosis Research. 141, 39-48 (2016).</li>
<li>Mackman, N., Hisada, Y., Archibald, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+and+its+procoagulant+activity+on+cancer-associated+thromboembolism+in+pancreatic+cancer%3A+Comment+by+Mackman+et+al%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Tissue factor and its procoagulant activity on cancer-associated thromboembolism in pancreatic cancer: Comment by Mackman et al.</a> Cancer Science. 113 (5), 1885-1887 (2022).</li>
<li>Sachetto, A. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+four+commercial+ELISAs+to+measure+tissue+factor+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Research+and+Practice+in+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of four commercial ELISAs to measure tissue factor in human plasma.</a> Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100133(2023).</li>
<li>Archibald, S. J., Hisada, Y., Bae-Jump, V. L., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+new+bead-based+assay+to+measure+levels+of+human+tissue+factor+antigen+in+extracellular+vesicles+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Research+and+Practice+in+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a new bead-based assay to measure levels of human tissue factor antigen in extracellular vesicles in plasma.</a> Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 6 (2), e12677(2022).</li>
<li>Tatsumi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+new+commercial+assay+to+measure+microparticle+tissue+factor+activity+in+plasma%3A+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a new commercial assay to measure microparticle tissue factor activity in plasma: communication from the SSC of the ISTH.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (11), 1932-1934 (2014).</li>
<li>Hisada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+microparticle+tissue+factor+activity+in+clinical+samples%3A+A+summary+of+two+tissue+factor-dependent+FXa+generation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Measurement of microparticle tissue factor activity in clinical samples: A summary of two tissue factor-dependent FXa generation assays.</a> Thrombosis Research. 139, 90-97 (2016).</li>
<li>Tatsumi, K., Hisada, Y., Connolly, A. F., Buranda, T., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patients+with+severe+orthohantavirus+cardiopulmonary+syndrome+due+to+Sin+Nombre+Virus+infection+have+increased+circulating+extracellular+vesicle+tissue+factor+and+an+activated+coagulation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Patients with severe orthohantavirus cardiopulmonary syndrome due to Sin Nombre Virus infection have increased circulating extracellular vesicle tissue factor and an activated coagulation system.</a> Thrombosis Research. 179, 31-33 (2019).</li>
<li>Schmedes, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Extracellular+Vesicle+Tissue+Factor+Activity+During+Orthohantavirus+Infection+Is+Associated+With+Intravascular+Coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Circulating Extracellular Vesicle Tissue Factor Activity During Orthohantavirus Infection Is Associated With Intravascular Coagulation.</a> Journal of Infectious Diseases. 222 (8), 1392-1399 (2020).</li>
<li>Rosell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patients+with+COVID-19+have+elevated+levels+of+circulating+extracellular+vesicle+tissue+factor+activity+that+is+associated+with+severity+and+mortality-Brief+report%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-Brief report.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).</li>
<li>Campbell, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+coagulopathies+associated+with+COVID-19+and+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Research+and+Practice+in+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Comparison of the coagulopathies associated with COVID-19 and sepsis.</a> Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), e12525(2021).</li>
<li>Guervilly, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+extreme+levels+of+extracellular+vesicles%3A+tissue+factor+activity+in+patients+with+severe+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">Dissemination of extreme levels of extracellular vesicles: tissue factor activity in patients with severe COVID-19.</a> Blood Advances. 5 (3), 628-634 (2021).</li>
<li>Hisada, Y., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+tissue+factor+activity+in+extracellular+vesicles+from+human+plasma+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Research+and+Practice+in+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Measurement of tissue factor activity in extracellular vesicles from human plasma samples.</a> Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3 (1), 44-48 (2019).</li>
<li>Sachetto, A. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+activity+of+small+and+large+extracellular+vesicles+in+different+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Research+and+Practice+in+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Tissue factor activity of small and large extracellular vesicles in different diseases.</a> Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100124(2023).</li>
<li>Bom, V. J., Bertina, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contributions+of+Ca2%2B%2C+phospholipids+and+tissue-factor+apoprotein+to+the+activation+of+human+blood-coagulation+factor+X+by+activated+factor+VII%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The contributions of Ca2+, phospholipids and tissue-factor apoprotein to the activation of human blood-coagulation factor X by activated factor VII.</a> Biochemical Journal. 265 (2), 327-336 (1990).</li>
<li>Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+activity+is+increased+in+a+combined+platelet+and+microparticle+sample+from+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue factor activity is increased in a combined platelet and microparticle sample from cancer patients.</a> Thrombosis Research. 122 (5), 604-609 (2008).</li>
<li>Gurung, S., Perocheau, D., Touramanidou, L., Baruteau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exosome+journey%3A+from+biogenesis+to+uptake+and+intracellular+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">The exosome journey: from biogenesis to uptake and intracellular signalling.</a> Cell Communication and Signaling. 19 (1), 47(2021).</li>
<li>Garnier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+induced+to+express+mesenchymal+phenotype+release+exosome-like+extracellular+vesicles+carrying+tissue+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cancer cells induced to express mesenchymal phenotype release exosome-like extracellular vesicles carrying tissue factor.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (52), 43565-43572 (2012).</li>
<li>Park, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor-bearing+exosome+secretion+from+human+mechanically+stimulated+bronchial+epithelial+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue factor-bearing exosome secretion from human mechanically stimulated bronchial epithelial cells in vitro and in vivo.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 130 (6), 1375-1383 (2012).</li>
</ol>

Nie ma żadnych sprzecznych interesów, które można by ujawnić.

W tym miejscu przedstawiono protokół naszego wewnętrznego testu aktywności EVTF. W protokole znajdują się trzy kluczowe kroki. Podczas rekonstytucji granulki EV ważne jest, aby pipetować w górę i w dół w miejscu, w którym znajduje się pelety EV, nawet jeśli nie jest ona widoczna. Niepełna rekonstytucja granulatu EV spowoduje fałszywie ujemny wynik lub niedoszacowanie wartości aktywności EVTF w próbkach. Po drugie, użycie HBSA-Ca(+) ma kluczowe znaczenie w kroku 6.5 protokołu, ponieważ nie można wygenerować generacji FXa ...

Krzepnięcie krwi rozpoczyna się od powiązania czynnika (F) VII/VIIa z czynnikiem tkankowym (TF)1. Kompleks TF/FVIIa aktywuje zarówno FIX, jak i FX, aby aktywować krzepnięcie krwi1. Istnieją dwie formy TF o pełnej długości, związanej z błoną: szyfrowana i aktywna. Ponadto istnieje alternatywna forma splicingu TF (asTF). Sfingomielina i fosfatydylocholina w zewnętrznej ulotce błony komórkowej utrzymują TF w stanie zaszyfrowanym2,3,4. Gdy komórki są aktywowane lub uszkodzone, scramblaza fosfolipidowa przenosi fosfatydyloserynę i inne ujemnie naładowane fosfolipidy do zewnętrznej ulotki1. Aktywacja komórek powoduje również translokację kwaśnej sfingomielinazy do zewnętrznego płatka, gdzie rozkłada sfingomielinę do ceramidu5. Te dwa mechanizmy konwertują zaszyfrowany TF na postać aktywną. Sugeruje się również, że izomeraza dwusiarczku białka pośredniczy w tworzeniu wiązań dwusiarczkowych między Cys186 i Cys209 w zaszyfrowanym TF, co powoduje deszyfrowanie TF6,7,8. asTF jest również obecny w krążeniu, ale brakuje mu domeny transbłonowej i dlatego jest rozpuszczalny9,10. Co ważne, asTF ma bardzo niski poziom aktywności prokoagulantu w porównaniu do pełnowymiarowego aktywnego TF10,11.
Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) są uwalniane z komórek gospodarza, które są w stanie spoczynku, aktywowane i umierają, a także z komórek rakowych12. EV wyrażają białka ze swoich komórek macierzystych12. Aktywne EV zawierające TF są uwalniane z aktywowanych monocytów, komórek śródbłonka i komórek nowotworowych do krążenia13,14,15. Poziomy TF w osoczu można mierzyć za pomocą testów opartych na aktywności i antygenach. Testy oparte na antygenach obejmują test ELISA i cytometrię przepływową16. Istnieją dwa różne testy oparte na aktywności: jedno- i dwuetapowe testy aktywności TF. Jednoetapowy test opiera się na teście krzepnięcia osocza opartym na osoczu. Próbkę zawierającą TF dodaje się do osocza i mierzy się czas do wytworzenia skrzepu po ponownym zwapnieniu. Dwuetapowy test mierzy generowanie FXa próbek poprzez dodanie FVII lub FVIIa, FX i wapnia. Poziomy FXa są oznaczane przy użyciu substratu, który jest rozszczepiany przez FXa.
Zarówno w jedno-, jak i dwuetapowych testach aktywności TF, stężenie TF jest określane za pomocą standardowej krzywej wygenerowanej z rekombinowanym TF. Testy dwuetapowe mają wyższą czułość i swoistość niż testy jednoetapowe. Wiele badań potwierdziło, że testy oparte na aktywności mają wyższą czułość i swoistość niż testy oparte na antygenach17,18,19,20,21. Ponadto nasz wewnętrzny test aktywności ma wyższą czułość i swoistość niż test aktywności komercyjnej22. Zdrowe osoby mają bardzo niski lub niewykrywalny poziom aktywności EVTF w osoczu. Natomiast osoby ze stanami patologicznymi, takimi jak rak, marskość wątroby, posocznica i infekcja wirusowa, mają wykrywalne poziomy aktywności EVTF, co jest związane z zakrzepicą, rozsianym wykrzepianiem wewnątrznaczyniowym, ciężkością choroby i śmiertelnością23,24,25,26,27,28. Tutaj opiszemy ten wewnętrzny dwuetapowy test aktywności EVTF.

<table><tbody><tr><td>Probówka 1,5 ml do wirówki 20 000 x g</td><td>dowolnej firmy</td><td>Nie dotyczy</td><td>Używamy tej firmy Fisher Scientific (numer katalogowy: 05-408-129).</td></tr><tr><td>Probówka 1,5 ml do ultrawirówki</td><td>dowolnej firmy</td><td>Nie</td> dotyczy <td>Używamy tej firmy Beckman Coulter (Numer katalogowy: 357448)</td></tr><tr><td>Probówka 15 ml</td><td>dowolnej firmy</td><td>Nie</td> dotyczy <td>Używamy tej firmy VWR (numer katalogowy: 89039-666)</td></tr><tr><td>21 G x .75 cala. BD Vacutainer Safety-Lok Zestaw do pobierania krwi z 12 calami. rurka i adapter luer</td><td>BD 367281</td><td></td><td></td></tr><tr><td>płytka 96-dołkowa</td><td>dowolnej firmy</td><td>Nie dotyczy</td><td>Używamy tego firmy Globe Scientific (numer katalogowy: 120338).</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Probówki z cytrynianem</td><td>BD</td><td>363083</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Fisher Scientific</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka do probówki 1,5 ml</td><td>dowolnej firmy</td><td>Nie dotyczy</td><td>Używamy wirówki 5417R (Eppendorf).</td></tr><tr><td>Wirówka do probówki 15 ml</td><td>dowolnej firmy</td><td>Nie</td> dotyczy <td>Używamy wirówki 5810R (Eppendorf).</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól tetrasodowa dwuwodna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6511</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Laboratorium Badań Enzymów</td><td>Ludzkich FVIIa</td><td>HFVIIa</td><td>Roztwór należy rozcieńczyć HBSA-Ca(+).</td></tr><tr><td>Laboratorium Badań Enzymów</td> <td>Ludzkich FX</td><td>HFX1010</td><td>Roztwór należy rozcieńczyć HBSA-Ca(+).</td></tr><tr><td>Hamujący mysi czynnik anty-tkankowy IgG, klon HTF-1</td><td>Fisher Scientific</td><td>550252</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharyd z Escherichia coli O111:B4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2630</td><td>Istnieje kilka lipopolisacharydów z różnych E. coli. Różne lipopolisacharydy mają różny potencjał do aktywacji monocytów.</td></tr><tr><td>Mysz IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5381</td><td></td></tr><tr><td>Pefachrome FXa 8595</td><td>Laboratorium Badań Enzymatycznych</td><td>085-27</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>dowolnej firmy</td><td>Nie dotyczy</td><td>Używamy SpectraMax i3x firmy Molecular Devices</td></tr><tr><td>Relipidowany rekombinowany czynnik tkankowy, Dade Innovin</td><td>Siemens</td><td>10873566</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman Coredlicer</td><td>Optima TLX</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka z wirnikiem</td><td>Beckman Coulter</td><td>TLA-55</td><td></td></tr></tbody></table>

test aktywności czynnika tkanki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Extracellular Vesicle Tissue Factor Activity Assay

Czynnik tkankowy (TF) jest transbłonowym receptorem dla czynnika (F) VII i FVIIa. Kompleks TF/FVIIa inicjuje kaskadę krzepnięcia, aktywując zarówno FIX, jak i FX. TF jest uwalniany z komórek do krążenia w postaci pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV). Poziom TF-dodatnich (+) EV jest zwiększony w różnych chorobach, w tym raku, infekcjach bakteryjnych i wirusowych oraz marskości wątroby, i jest związany z zakrzepicą, rozsianym wykrzepianiem wewnątrznaczyniowym, ciężkością choroby i śmiertelnością. Istnieją dwa sposoby pomiaru TF+ EV w osoczu: testy oparte na antygenach i aktywności. Dane wskazują, że testy oparte na aktywności mają wyższą czułość i swoistość niż testy oparte na antygenach. W tym artykule opisano nasz wewnętrzny test aktywności EVTF oparty na dwuetapowym teście generacji FXa. FVIIa, FX i wapń dodaje się do próbek zawierających TF+ EV w celu wytworzenia FXa w obecności i bez przeciwciała anty-TF w celu odróżnienia zależnej od TF generacji FXa od generacji TF niezależnej od TFa. Do określenia poziomu TFa stosuje się substrat chromogenny rozszczepiony przez FXa, natomiast do oznaczenia stężenia TF stosuje się krzywą wzorcową wygenerowaną za pomocą relipidowanego rekombinowanego TF. Ten wewnętrzny test aktywności EVTF ma wyższą czułość i swoistość niż komercyjny test aktywności TF.

Pomyślny wynik daje wartość kontroli pozytywnej ≥0.5 pg/mL oraz wartość kontroli negatywnej &lt;0.5 pg/mL. Jako kontrolę pozytywną najlepiej wybrać osobę z wysoką odpowiedzią na LPS, wykazującą aktywność EVTF &gt;1.0 pg/mL. Reprezentatywny wynik przedstawia aktywność EVTF w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EVs) wyizolowanych z osocza krwi pełnej 11 zdrowych dawców, z aktywacją LPS i bez niej (Rysunek 4). Sześciu z jedenastu dawców (Dawcy 2, 4, 5, 8, 10, 11) wykazało średnią lub wysoką odpow...

Tutaj opisujemy wewnętrzny test aktywności czynnika tkanki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Testy oparte na aktywności i testy oparte na antygenach zastosowano do pomiaru czynnika tkankowego w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych z próbek ludzkiego osocza. Testy oparte na aktywności mają wyższą czułość i swoistość niż testy oparte na antygenach.

Test aktywności czynnika tkanki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Tissue factor (TF) is a transmembrane receptor for factor (F) VII and FVIIa. The TF/FVIIa complex initiates the coagulation cascade by activating both FIX ...

Niski poziom pęcherzyków zewnątrzkomórkowych dodatnich pod względem czynników tkankowych jest obecny w osoczu pacjentów z różnymi chorobami. Jednak większość testów opartych na antygenach, w tym ELISA i cytometria przepływowa, nie ma czułości pozwalającej na wykrycie tych niskich poziomów. W wielu pracach wykorzystano test ELISA lub cytometrię przepływową do wykrywania czynnika tkankowego w osoczu.Nasz protokół mierzy aktywność czynnika tkankowego w osoczu z wysoką czułością i swoistością, chociaż istnieje pewna zmienność ze względu na zastosowanie testu funkcjonalnego. Istnieją komercyjne zestawy testowe, które mierzą poziom aktywności czynnika tkankowego w osoczu. Jednak zestawy te nie zawierają przeciwciał przeciwko czynnikom tkankowym, a zatem nie mogą rozróżnić generacji czynnika X zależnej od czynnika tkankowego i niezależnej od czynnika tkankowego.Na początek rozmrozić izolowane próbki osocza krwi w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przenieś 100 mikrolitrów każdej próbki osocza do probówek o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj jeden mililitr bezwapniowego buforu HBSA do każdej probówki.Odwirować próbki w temperaturze 20 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odessać supernatant do 20 mikrolitrów bez naruszania osadu. Następnie dodaj jeden mililitr bezwapniowego buforu HBSA do każdej probówki.Następnie pipetować w górę i w dół, aby rozpuścić osad. Wiruj każdą rurkę przez kilka sekund, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Następnie odwirować go w temperaturze 20 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Ponownie odessać supernatant do 20 mikrolitrów bez naruszania osadu. Następnie rozpuść osad w 80 mikrolitrach bezwapniowego buforu HBSA. Pipetować zawiesinę w górę i w dół, aby uzyskać równomierną zawiesinę.Aby zmierzyć aktywność czynnika tkanki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, najpierw odpipetuj 40 mikrolitrów próbki pęcherzyka zewnątrzkomórkowego do dwóch dołków z 96-dołkową płytką. Do pierwszej studzienki dodaj 11 mikrolitrów hamującego mysiego anty-ludzkiego TF IgG. Do drugiej studzienki dodaj 11 mikrolitrów myszy kontrolnej IgG.Po inkubacji dodać 50 mikrolitrów roztworu mieszanki czynników do każdej studzienki. Przykryj płytkę folią, a następnie inkubuj płytkę przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj 25 mikrolitrów buforu HBSA EDTA, aby zatrzymać wytwarzanie czynnika 10a.Rozpuść substrat chromogenny w wodzie destylowanej do stężenia czterech milimoli. Teraz dodaj 25 mikrolitrów substratu chromogenicznego do każdej studzienki. Przykryj talerz folią, a następnie zawiń go w folię aluminiową.Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie odwirować płytkę o sile 1 500 G przez jedną minutę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki. Następnie umieść płytkę w czytniku płytek o długości fali 405 nanometrów.Użyj krzywej standardowej wygenerowanej za pomocą relipidowanego rekombinowanego czynnika tkankowego, aby przeliczyć generację czynnika 10a w każdym dołku. Następnie oblicz zależne od czynnika tkankowego pokolenie czynnika 10a. Sześciu z 11 dawców miało średnią lub wysoką odpowiedź na lipopolisacharydy, podczas gdy pięciu z 11 dawców miało niską odpowiedź na lipopolisacharydy.

extracellular-vesicle-tissue-factor-activity-assay

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejsze badanie opisuje nowatorski test na mikropłytce, który mierzy aktywność krzepnięcia FV podczas tworzenia skrzepu fibrynowego w ludzkiej plazmie, co nie było wcześniej raportowane. Metoda ta wykorzystuje kinetyczny czytnik mikropłytek do ciągłego pomiaru zmiany absorbancji przy 405nm podczas tworzenia skrzepu fibrynowego w ludzkiej plazmie.

Pomiar aktywności czynnika V w ludzkiej plazmie przy użyciu mikropłytkowego testu krzepliwości

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z całych tkanek, w tym próbek mózgu i nowotworów. Metoda ta oferuje powtarzalną technikę ekstrakcji EV z tkanki stałej w celu dalszych analiz.

Ekstrakcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z całej tkanki

Obecny protokół opisuje metodę ekstrakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z krwi obwodowej i tkanek stałych z późniejszym profilowaniem antygenów powierzchniowych i ładunków białkowych.

Izolacja i analiza identyfikowalnych i funkcjonalizowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza i tkanek stałych

Tutaj opisujemy wzbogacanie małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z tkanki raka wątroby za pomocą zoptymalizowanej metody różnicowego ultrawirowania.

Metoda wzbogacania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z tkanki raka wątroby

Proponowany protokół zawiera wytyczne dotyczące unikania zanieczyszczenia endotoksyną podczas izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z supernatantów hodowli komórkowych oraz jak prawidłowo je ocenić.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych o niskiej zawartości endotoksyn pochodzących z linii komórek rakowych

Ten protokół bada użycie osocza bogatego w pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) jako wskaźnika zdolności krzepnięcia EV. Osocze bogate w EV uzyskuje się w procesie wirowania różnicowego, a następnie ponownego zwapnienia.

Oznaczanie aktywności prokoagulacyjnej pęcherzyka zewnątrzkomórkowego (EV) za pomocą czasu krzepnięcia aktywowanego przez EV (EV-ACT)

Niniejszy artykuł przedstawia protokół ilościowego określania procentu płytek krwi (TF) za pomocą cytometrii przepływu pełnej krwi, oceniając białko: (1) wewnątrzkomórkowo w warunkach spoczynku oraz (2) na powierzchni komórki, zarówno w stanie spoczynku, jak i aktywacji. Przedstawiono również wskazówki dotyczące oceny trombocytów TF-dodatnich w osoczu bogatym w płytki.

Analiza ekspresji tkankowych w ludzkich płytkach krwi przepływową za pomocą cytometrii przepływowej

Pomiar aktywności autonomicznego układu nerwowego zazwyczaj ogranicza badacza i uczestnika do laboratorium, które może stanowić onieśmielające środowisko dla dzieci. Urządzenie VU University Ambulatory Monitoring System (VU-AMS) może rejestrować autonomiczną kontrolę serca w dowolnym ustawieniu. VU-AMS okazał się bardzo podatny do testowania na dzieciach.

Pomiar aktywności autonomicznego układu nerwowego serca (ANS) u dzieci

Aby poszerzyć naszą wiedzę na temat komórkowego i molekularnego tworzenia się nowotworów, niedawno opracowano mysi model TEVG. Przeszczepy wszczepiono jako przeszczepy z interpozycją żyły głównej podnerkowej u myszy C57BL/6. Model ten osiąga wyniki podobne do tych osiągniętych w naszym badaniu klinicznym, ale w znacznie krótszym czasie.

Implantacja przeszczepu interpozycji żyły głównej dolnej w modelu mysim

Aby zrozumieć komórkowe i molekularne mechanizmy leżące u podstaw powstawania nowotworów i rozwoju zwężeń w zastawkach serca z inżynierii tkankowej, opracowano mysi model heterotopowego przeszczepu zastawki serca. Zastawkę płucną serca przeszczepiono biorcy przy użyciu techniki heterotopowego przeszczepiania serca.

Przeszczepienie zastawki płucnej z wykorzystaniem mysiego modelu heterotopowego przeszczepienia serca

Poznaj test aktywności czynnika tkanki w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych z osocza ludzkiego. Ta metoda oferuje wyższą czułość i swoistość w porównaniu do tradycyjnych testów antygenowych ELISA.

Test aktywności czynnika tkanki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Przeglądaj więcej filmów